Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенность популяций вирусов Коксаки В по физико-химическим свойствам.

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность популяций вирусов Коксаки В по физико-химическим свойствам."

НАЦЮНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИИ УН1ВЕРСИТЕТ ¡м. акад. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

РГб од

1 3

На правах рукопису МЕЛЬНИК Володимир Володимирович

ГЕТЕРОГЕННЮТЬ ПОПУЛЯЦ1Й В1РУС1В КОКСАК1 В ЗА Ф13ИКО-Х1МГЧНИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ

о з, ее, ас

-1^0^06— В1русолопя

Автореферат дмсертацп па здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

КиТв 1996

Дисертащею е рукопис.

Робота виконана в Национальному медичному ушверситет1 ¡м. акад. О. О. Богомольця.

Науковий KepiBiiiiK: чл.-кор. HAH та АМН Украши, д.м.н.,

професор ШИРОБОКОВ В. П.

ОфшШш опоненти: чл.-кор. HAH Украши, доктор

бюлопчних наук ДЯЧЕНКО Н. С.

доктор медичних наук ДЗЮБЛИК I. В.

Провшт установа: Одеський НД1 Bipyconorii i ешдомюлогй

¡м. I. I. Мечшкова

Захист дисертаци вщбудеться "Т^/г7 *". . 1996 р.

о годиш на заоданш спещал!зованоГ ради Д.01.21.03 при Нацю-

нальному медичному ушверситет1 iM. академжа О. О. Богомольця за ад-ресою: 252004, Ки1в, б. Шевченко, 13.

3 дисертащею можна ознайомитись у б1блютещ Нацтнального ме-дичного ушверситету ¡м. акад. О. О. Богомольця за адресою: 252057, м. Khib-57, вул. Зоолопчна, 1.

Автореферат розшланий

й Ä . 1996 р

Вчений секретар спецтлЬовано! ради

доктор медичних наук В. Г. БОРДОНОС

АктуадьШсть пробдеми.

Проблема генетично! неоднор!дност! Bipycmx популяц!й мае очевидне теоретичне i практичне значения, аде, незважаючи на значну KiJibKicTb досл!джень що до питания гетерогенност1 niKop-нав!рус1в, зокрема ентёров1рус!в, деяк1 сторони uie'i проблеми потребують подальшого вивчення та уточнения. 1снукш в сучаапй л1тератур1 данн1 св1дчать про гетерогенн1сть ентеров1русних попу лящй за рядом генотипових i фенотипових ознак. Встановлена можлив!сть вид!лення з вих!дних популяц1й штам1в BipyciB, як1 розр1зняються за бляшкоутворюючою активы1стю /Soda К., 1971; Hartlg P.C. et al., 1983,1986; Jlmes S. et al., 1983,1984/, в1д-ношенгао до температури/Wallis С., Melnlck J.L., 1963; King

A.M.Q. et al., 1980/, адсорбц!йно- елюц1йними властивостями /Ши-робоков В.П., 1977; Szenasi Zs. et al., 1988/, плавучою щ1льн1с-тю /Кусов Ю.Ю. та 1н. 1986,1991; Рюкерт P.P., 1989/ тощо. Очевидно, що присутн1сть у популяцП р!зних BaplaHTiB BipyciB мае суттевий вплив на патогенез ентеров!русних 1нфекц1й. Зокрема встановлено, що при репродукцП в орган1зм! чутливих лабораториях тварин в1дбувавться селекц!я з вих1дно'1 популяцП BapiaHTiB BipyciB Коксак! В з низьким афШтетом до бентонхту /Широбоков

B.П., 1977; Журба Т.Б., 1985/. В1домо, що вар1анти BipyciB Коксак!, як! розр1зняються за спор1днен1стю до цього природного сорбенту, мають суттеву диференц!ац1ю за !ншими б!олог1чними оз-наками. Але до цього часу не проведено пор1вняльне вивчення <$i-эикох1м1чних властивостей селекц1йованих вар!ант1в BipyciB Кок-caKi В, не встановлен! законсм1рност1 взаемозв'язку ф1"ико- xl-м!чних характеристик з в1рулентн!стю та !ншими видами б1олог!ч-

но! активности Вивчення цього питания дозволить глибше зрозум!-ти законом1рност1 адаптац1йно! м!нливост1 1 пластичност1 в1рус-них популяц!й, розробити нов! Шдходи до диференц1ац!1 в!рус!в за ступеней 1х в!рулентност1, сприятиме розробц! нових, б1льш ефективних, простих 1 доступних метод!в вид1лення в!рус1в а об'ект!в навколишнього середовишд 1 8 орган1зму людей та 1х 1дентиф1кац11.

Мета 1 эавдання роботи. Мета дисертащйно! роботи полягала . в обгрунтуванн! можливих механ1зм!в диферешцацП в!рус1в Кокса-к! групи В за афШтетом до бентон!ту шляхом пор1вняльного вивчення 1х $1зико-х1м1чних властивостей.

Шд час виконання роботи були поставлен! так1 завдання:

1. Визначити 1зоелектричн1, хроматограф!чн1, адсорбц1йн! властивост1 вих!дних популяц!й в1рус1в Коксак! В.

2. Встановити ф1зико-х!м1чн1 особливост! селегаЦйованих ва-р!ант!в в1рус1в Абент+ та Абент-.

3. Вивчити д!ю на в1руси Коксак1 В 1 1х селекц!йован1 вар!-' анти орган1чних розчинник1в, детергент1в 1 перйодату кал1я.

Наукова иови8на: Вперше проведено досл1дкення по пор!вняль-ному вивченню ф1эико-х!м1чних властивостей в1рус1в Коксак! В, що розр1зняються за аф1н1тетом до бентон!ту. Встановлен1 эаконом1р-н1 в1дм1ни досл!джених в!рус!в та '1х селекШйованих вар1ант!в 8а 1зоелектричними та хроматограф1Чними характеристиками, чутлив1с-тю до перйодатного окисления, д!1 детергент!в 1 орган1чних ров-чин ник1в.

Теоретична значим!сть роботи виэначаеться тим, що вперше проводилося . прр1вняльке вивчення <Нзико-х1м1чних властивостей

в1рус1в Коксак! групи'В та '¡я селекц!йованих бентон!тових вар1-ант!в • 1 встановлен1 можлив! механ!зми диферешДацП в!рус!в еа афШтетом до бентон!ту. Вивчення цього питания дозволить глибше зрозум1ти ваконом1рност1 адаптац1Йно"1 м1нливост! 1 пластичност! в1русних популящй. Одержан! дан1, що св!дчать про наявн1сть на поверхн! капсид1в в1рус!в э високим аф!н!тетом до бентошту л1-п1дних компонент1Е, можливо шптинного походження. ЛШдн! ком-поненти зб1льшують стШпсть в1рус!в до дП перйодату кал1я, гальмують к!нетику !нактивац!1 в!руснейтрал!зуючими антит!лами.

Практична ц!нн!сть: Одержан! дан! про гетерогеннЮть в!рус-них популяц!й за !зоелектричними властивостями в1р1он1в ыожуть бути врахован! при розроОц! адсорбЩйно-елюц!йних метод!в вид1-лення 1 конценграцП в!рус!в. 1ндив!дуальн!сть !зоелектричних профилей ентеров1рус1в дозволяе використовувати !зоелектрофоку-сування як метод оц1нки чистоти в!русних препарат!в , а також як один з п!дход1в у таксономП.

Дисертац1я е фрагментом грантово! теми з приоритетним ф!нан-суванням МОЗ Укра!ни "П0ПУЛЩ1ЙНА М1НЖВ1СТЬ ЕНТЕР0В1РУС1В ТА I I ЗНАЧЕНИЯ В ПАТОЛОГ I I ТА ПР0Ф1ЛАКТИЦ1 ЕНТЕРОВIРУСНИХ ШФЕКЦ1Й".

Декларац!я конкретного особистого внеску дисертанта в роз-

робку наукових результат!в: Робота виконана самост!йно на баз! кафедри м1кроб!ологП, в!ру-сологП ! !мунологП Нац!онального медичного ун1верситету !м. акад .0.0. Богомольця.

На захист виносяться так1 положения:

1. Внутр!шньо- ! Шжпопуляц^йна неоднор1дн1сть в!рус!в Кок-

сак! В за 1зоелектричними властивостями, хроматограф1чною рухо-м1стю BipioHiB, чутлив!стю до перйодатного окисления.

2. Взаемозв'явки Mi ж адсорбгЦйними властивостями в!рус!в до бентон!ту ! !шпими ф1еико-х!м!чними характеристиками.

3. Асоц!ац!я BipioHiB BipyclB Коксак! групи В з л!п!дними компонентами.

4. Умови 1нактивацП ентеров1рус!в п!д д1ею перйодату кал1я.

Апробац1я роботи. OchobhI положения дисертацН допов!далися на:

- Всесоюзна конференцП "Ентеров1руси. Эагальнотеоретичн! 1 практичн1 аспекти" /КиЗв, 1991/

- М!лшародн!й конференц!1 з питань медидини катастроф /Ки1в, 1992/

- М1жвуз1вський науков!й конференц!! молодих вчених та сту-дент!в "1нфекц!йний процес. Теор!я та практика" /Ки!в, 1994/

- дисертац1йна робота апррбована на сп!льному вас!данн1 кафедр м1кроб!ологП, еп!дем!олог!1, 1нфекц!йних хвороб 1 НДЛЦ Нац!онального медичного ун1верситету 1м. акад. О.О.Богомоль-ця /1994/

За матер!алами дисертацП надруковано 6 праць, 4 статт! подан! до друку.

Об'ем 1 структура роботи. Робота викладена на 127 стор1нках машинописного тексту, 1люстрована 22 малюнками 1 14 таблицями. Б1бл1ограф!чний покажчик складаеться з 188 найменувань праць в1тчизкяних 1 8аруб1жних автор!в.

Дисертац1йна робота побудована з вступу, глави огляду л!те-ратури, 3 глав власних досл1джень, обговорення результат1в, вис-' HOBKiB, покажчика л1тератури.

3MICT РОБОТИ Матер1али 1 методи.

t BipycH.

В poöoTi використан! прототипн1 штами BipyciB Коксак1 B-l /штам Connecticut-5/, Коксак! В-3 /штам Nancy/, KoKcaKi В-5 /штам Faulkner/, nojiioaipyca 1 типу /LSC 2 ab/, отриман! з Московского НД1 Bipycwix препарат!в , адаптован1 до перещеплювано'! культури кл!тин НЕр-2. Прототипн1 штами BipyciB Коксак! В-1 /штам Connecticut-5/, Коксак! В-3 /штам Nancy/Ta Blpyc ECHO-11, адаптован! до первинноЧ культури кл!тии ф16робласт!в ембр!ону людини /ФЕЛ/, отриман! з науково-досл1дного 1нсгитуту в!русних 1нфекц1Й /м. 6катер1кбург/. Серотип ycix BipyciB п!дтверджено в реакцП в1руснейтрал!8ацП, або в реакцП гальмування гамаглюти-нацП.

В1руси пасажували на культурах кл1тин з використанням середовища п1дтримки 199 або 1гла MEM.

Одержання бентон1тових вар!ант!в BipyciB 1 визначення бенто-

HlTQBoro маркера.

Селекц!» бентон!тових вар!ант1в Абент+ 1 Абент- з вих!дних популяц1й ентеров!рус!в проводили зг!дно. з методикою одержання бентон1тових вар!ант1в /Широбоков В,П., 1977,1978/. Бентон1говий маркер BipyciB влзначали за 'ix эдатн!стю адсорбува-i-6-МЗ

тися на бентон1т1 при слабколужних значениях pH.

Кудьтури кл!тин.

В досл!дженнях використовували píBHl культури кл!тин:

НЕр-2 - перещеплювана культура кл1тин карциноми гортан! людини /Мооге A. et al., 1955/;

Vero - перещеплювана культура кл1тин нирок африкансько! зелено! мавпи /Yasumura X., Kawaklta X., 1963/;

Ф1бробласти ембр1она людини /ФЕЛ/ - лервинна культура кл1тин, яку одердували за загальновизнаною методикою /Н.П.Глинских, 1977/.

Маточн! культури кл!тин вирощували в 0,5- л!трових матрацах. В запежност! в1д методу титрацП або мети експерименту культивування кл!тин проводилося в проб1рках, пен1цил!нових флаконах або в 96-лункових пол!стиролових планшетах в плоским дном /ф!рми Microtex, Linbro/ в атмосфер!, що м!стить 5% СОг-

Титрац1я BlpyciB.

Титрац1ю BlpyciB, адаптованих до перещеплюваних культур кл1-тин, ед!йснювали методом Оляшок п1д бентон!товим покриттям /Ши-робоков В.П., 1973/. Blpycn, як1 пасажували на первинн!й культу-pl кл!тин ФЕЛ, титрували методом к1нцевих розведень /Смородинцев Ал.А., 1985/ . Кожним десятикратним розведенням в!руса 1нф1кува-ли 4 кл1тинних моношара. 0бл1к зд1йсшовали через 72 години за методикою Р1да i Менча /1938/. 1нфекц!йний титр BlpyciB виэнача-ли також м1крометодом за ТЦЦ50 /Майнор П., 1988/. Ус1 роботи по кулътивуваншо кл1тин 1 титрацП BlpyciB проводили у лам1нарному боксi БП-4-005 /ВО "Тисса", м.Ужгород/.Гемаглютинуючий титр BlpyciB виражали в гемаглютинуючих одиницях /ГАО/ i визначали у

реакцП гемаглютинацП /РГА/, яку зд Сетовали Mi крометодом за допомогою м1кротитратора "Таккачи".

1зоелектрофокусування BlpyclB.

Електрофоретичн! характеристики BipyciB визначали методом iзоелектрофэкусуванння у амфол1новому град1ент! pH /Butler М. et al.t 1985; Mandel В., 1971/. Електрофокусування проводили при 400V протягом 0,5 години, а пот!м при 500V протягом 5,5 годин. Початковий струм складав бдизько 10 мА. Ншшя електродна посудина /анод/ Micmia 40% вага/об'ем сахарози в 1% с!рчан1й кислот1, верхтй резервуар /катод/ м1стив 2% 2-ам1ноетанол. Через 6 годин в д!ал1зн1й мембран! робили oTBip 1 вбирали фракцП /близько 25 по 0,1 мл кожна/. У фракц!ях визначали pH", !нфекц1йн1сть i ге-маглютинуючу активн1сть. Процентний bmIct BipyciB в п1ках !нфек-ц!йно1 активност1 визначали шляхом вим1рювання площини цих ni-к!в.

Електронна м!кроскоп1я.

Електронно-м!кроскоп!чн1 досл1дження проводили за допомогою електронного м1кроскопу "ЭМ-125К" /Сумське ВО "Электрон"/ методом i му носорбен тно i електронно'1 MlKpocKoni'i /1СЕМ/ /Королев М.Б., 1980; Носков Ф.С., 1985; Cohen J. et al., 1982/. ВщЦлення групоспециф1чного 1муноглобул1на Коксак1 В для ICEM зд!йснювали за методикою Брок Й.,1987..

Визначення чутлибост! bipycib до перйодатного окисления.

Зм1шували piBHi об'еми Blpyca i 0,03 мМ свшовиготовленого розчину перйодату кал!я /КЮ4/ у ФБР pH 7,0-7,2. 1нкубац1ю проводили при к1мнатн!й температур!. Д!ю KIO4 зупиняли чепез певн1 1нтервали часу додаванням 100 мМ гл1церину. Про чутлив!сть Bipy-

У

с1в до КЮ4 судили по зменшенню 1нфекц1йно'1 та гемаглютинуючо! активност! препарату п!сля окисления /Финдлей Джон Б., 1990/.

Хроматограф!я в!рус!в.

Використовували йонообм!нну колонкову хроматографию на ДЕАЕ-целюлов1 /Овод В.В., 1989/. Використовували колонки !з сп!вв1д-ношенням висоти до внутр!шнього д!аметру 10:1 /5,0 см х 0,5 см/. Колонку встановлювали вертикально 1 эаповнювали" на 2/3 0.01 М кал!йфосфатним буферним розчином, рН 8,0. На дно колонки пом!ща-ли вату, попередньо оброблену хромовою сум!шкою. Вносили до колонки суспенв!ю ДЕАЕ-целюлози у вих!дному буферному розчин!. Шсля заповнення колонки, пропускали кр!зь 1он!т вих!дний буфер поки рН елююючого розчину не досягав 8,0. ШвидкЮть прот1кання буферу регулювзди за допомогою перистальтичного насосу НП-1М /ДВ 1нституту ф!8!ологП !м.акад. О.О.Богомольця, м.Ки!в/ 1 встановлювали в межах 30 мл/год.

Введения проси зд!йснювали за допомогою насосу, эанурюючи його вводну трубку у розчин препарату /100-150 мкл./. Шсля повного вбирания проби трубку переносили у розчин вих!дного буфера 1 промивали колонку протягом 30 хв. Елюц!ю проводили ступ!нчастим град!ентом концентрацП хлор!ду натр!я /0,02-0,2 М/.

У фракц!ях /0,1 мл./ визначали 1нфекц!йну та гемаглютинуючу активн1сть в1рус!в.

Вивчення дП детергенг!в 1 орган!чних розчинник!в на

адсорбц!йн1 властивост! в!рус!в по в1дношенню до бентон!ту.

Для виэначення впливу орган!чних розчинник!в на адсорбц!йн! влэстивост1 в!рус!в проводили екстракЩю в!русвм1сного матер1алу р!вним об'емом хлороформу або еф1ру при 4°С, вилучали водну фа-

зу, п1сля чого визначали аф!н!тет в!руса до бентон1ту у пор1в-няин1 з вих1дним препаратом.

Вивчення впливу детергент!в 1 орган!чних розчинник!в на - десорбц!ю в!рус1в та 1х гемагшотинин1в з бентон!ту. До в!русвм1сного матер1алу у середовнвд 199 /0,5 мл, рН 7,2/ додавали 50 мкл 5% гелю бентон1ту, сумш 1нтенсивно струшу вал и, п1сля чого комплекс в1рус-бентон!т осаджували центрифугуванням при 5000 об-1 протягом 20 хв. Шсля видалення надосадово! р1дини у проб1рки вносили 0,5 мл середовшца 199 з в!дпов1дними детергентами, диспергували осад 1 вилучали бентон1т центрифугуванням. У надосадов1й р!дин1 визначали гемаглютинуючу активн1сть 1 1нфекц1йн1сть в1рус1в. Вм1ст в1руса в елюент1 пор!внювали з таким при елюцП лише середовищем 199, а також стандартним 0.01М трис-буфером /рН 9,0/.

Вивчення впливу орган1чних розчинник!в на ступ!нь нейтрал!за-ц!1 в!рус!в в1руснейтрал!зуючими антит!лами. Використовували реакцш кинетично'1 в1руснейтрал!зацП /McBгide И.О., 1959; Уопеуаша Т. е1 а1., 1981/. В1русвм1сну р1дину зм1шували з в1дпов1дною типоспециф1чною 1мунною в!руснейтрал1зуючою сироваткою у розведенн! 1:100. Для зупинки реакцп сум!ш розбодйли у холодному /4°С/ середовщ! 199 в1дразу п1сля зм1туваннй' 1' через 15 хв. Визначали 1нфекц1йний титр в1рус1в 1' рЫ^аховув'али константу нейтрал1зац11 вих!дного в1руса 1 вируса'п1сля'екстракцП, хлороформом за формулою: к - й х г,з1е(Уо/УЬ), де О - в'елйчина обернена розведенню сироватки Уо, - титри в!руса в1дразу п1сля зм1шуЕання 1 через 15 хв. 3 --¿-Ш

Для оц!нки BiporiflHOCTl була проведена статистична обробка експериментального матер1алу а використанням метод!в вар!ац1йно'1 статистики.

РЕЗУЛЬТАТИ Д0СЛ1ДЖЕНЬ.

Для пор1внялыюго вивчення ф1эико-х1м!чних властивостей ми обрали штами BipyciB , як! мають р!зну спор!днен1сть до бентон1-ту: Bipyc KoKcaKi В-1 /штам Connecticut- 5/, який не адсорбуеть-ся на бентон!т1 при слабколужних значениях pH, в1руси Коксак! В-5 /штам Faulkner/ i пол!ов!рус 1 типу /штам LSC 2 ab/ з висо-ким афШтетом до сорбенту а також . Bipyc Коксак! В-3 /штам Nancy/, що займае пром1жне положения /табл.1/. Ц! в!руси були адаптован! до перещеплювано! культури кл!тин НЕр-2.

Таблица 1. Адсорбц1йн1 властивост1 в!русних штам!в.

Bipyc Аф1н!тет до бентон!ту Вм1ст вар!анту Абент-

Коксак! В-1 Коксак! В-3 Коксак! В-Б Полю-1 Низький Пром1жний Високий Високий 100Z 1,457. 0,37. 0,027.

Вивчення ф1зико-х1м!чних властивостей проводили як на р!вн! вих!дних популяц!й BipyciB, так i на р!вн! селекц!йованих вар!-ант!в.

Експерименти показали, що популяцП досл1джуваних BipyciB характеризуются виракеною гетерогенн!стю BiploHiB за !зоелект-ричними властивостям1. При цьому в!руси мають характерн1 iaoe-лектричн! прск}>!л1 ! фокусуються в певних зонах pH град!енту

/табл.2/.

Стугпнь гетерогенност! може бути р!зним 1 залежить в1д серо-типу в!руса. Найб1лып вираженою гетерогенн1стю в1р!он!в за 1зое-лектричними властивостями характеризуеться в1рус Коксак1 В-3. У випадку цього в!руса п1ки ¡.нфекидйност! розташован! у зонах рН 4,0. /16,5% в1д загально! 1нфеквдйност1/, рН 6,0-6,4, рН 7,0 1 рН 8,6 /в1дпов1дно 38,52%, 28,15%, 16,77% Батально! 1нфекц1йнос-т1/. ПопуляцП 1нших в1рус!в виявилися б1льш гомогенними.

Таблица 2. 1зоелектричн1 характеристики ентеров1рус!в та IX бентон1тових вар1ант1в.

В1рус Аф1н1тет до бентон!ту Зона рН при електрофокусуванн!

Коксак; В-1 вих1дна популяц1я Коксак1 В-3 вих!дна популявдя Коксак1 В-5 вих1дна популяц!я Пол1ов1рус 1 типу вйх!дна популяц1я Коксак1 В-3 вар1ант Абент+ Коксак1 В-3 вар1ай Абент-КоКсак! В-5 ва01ант Абент+ Пол1ов1рус 1 типу вар1ант Абент+ Пол1ов1рус 1 типу вар1ант Абент- Низький Пром1жний Високий Високий 6,5 - 6,0 6,0 - 7,0 1 4,0 4,75 7,0 1 4,0 7,0 1 4,0 5,5 - 6,0 4,75 7,0 1 4,0 5,5 - 6,0

Гетерогенн1сть в1рус1в пов'язана, на наш погляд, з р!зним

вм1стом в вих1дн1й популяцП вар1ант1в Абент-»- 1 Абент-. Резуль-• тати досл1дження 1зоелектричних властивостей вар!ант1в, як! були селекц1йовач! з вих1дних популящй в!рус1в, показали, що вар1ант

Абент+ утворюе два п!ки !нфекц!йно! активност! в зон1 рН 4,0 1 7,0, Вар1анти АЗент- досл!джених в1рус1в фокусуються в вон! рН 5,5-6,0.

Аф1н!тет в!рус!в до бентон1ту залежить в!д умов культивуван-ня. Так. штам в1руса Коксак! В-1 СоппесЫсиЬ-Б практично не ад-сорбуеться на бентон!т1 при культивуванн! в перещеплюваних кл!-тинах НЕр-2, але при вирощуванн1 в первишпй культур! ФЕЛ вияв-ляв високий аф!н!тет до сорбенту. Отриман! результати св!дчать також про те, що умови культивування впливають на !зоелектричн1 властивост! в!руса.

Сл!д вданачити, що для в!рулентних штам1в в!рус!в Коксак! В характерний б!льший вм!ст в популяцП в!р!он!в з 1ЕТ в зон! рН 5,5-6,0 1, в!дпов!дно, низький аф!н!тет до бентон1ту.

Гемаглютинуюча активн!сть властива лише в1русам з !зоелектричною точкою в зон! рН 3,5-4,0.

При Еивченн1 хроматограф!чно"1 рухо'мост! вих!дних !юпуляц!й в!рус!в'Коксак! В-1, В-3 ! В-5 встановлено, що в!руси з р!зним а£>1н1тетом до бентон!ту мають р1зн1 хроматограф1чн! проф!л! на ДЕАЕ целюлоз1 1 в!др1зняються за м!цн1стю зв'язку э сорбентом. Хроматограф!чн! проф!л! досл!джуваних в1рус1в добре корелюють з !зоелектричними точками цих в!рус1в, знаходячись у зворотньо пропорцшпй залежност!: чим вище !зоелектрична точка в!русу !, в1дпов1дно, менший в!д'емний заряд часток при рН елоента 8,2, тим легше в!дбуваеться елюЩя в1русу з сорбента.

Виявлено значну диференц!ац!ю ентеров!рус!в за чутлив!стю до пермодатного окисления. Найбыьша чутлив!сть характерна для в!-руса Коксам! В-1, наймэнша - для Коксак! В-3. В!рус Кокса!?! В-5

займае пром!жне положения, що витхкае з анал!зу констант !накти-вац!1 в!рус1в /табл.3/.

Таблиця 3. Константа швидкост! !нактивацП в1рус1в п1д д1ею перйодату кал1ю*

31рус Вих!дний !нфекц1й-нии титр в!рус1В,Со /1ЕТЦД50/ 20мкл/ Титр Р1рус1в, С1 1ИСЛЯ окисления ЧасД ХВ Коне- ' танта швидкост! !накти-вац1!

Коксак1 В-1 Коксак! В-3 Коксак! В-5 5,5±0,44 4,33+0,35 4,0+0,36 3,33+0,34 4,0+0,32 3,0+0,48 15 15 15 0,22x10? 0,34x10;; 0,1х102

* окисления проводили при рН 5,5-6,0

При вивченн! дП перйодату калш на 1нфекц1йну та гемагглю-тинуючу активи!сть встановлено, що чутлив1сть в1рус!в до перйо-датного окисления залежить в1д рП середовища. В1рул1цидна актив-н1сть реагенту по в1Дношенню до досл!джуваних в!рус1в найб1лып виражена при кислих рН /3,5-4,5/ та при рН, близьких до "1х 18ое-лектричних точок. Так виявилося, що в!рус Коксак! В-1 найб!льш чутливий при рН 5,5-6,0, в!руси Коксак1 В-3 1 пол!ов!рус 1 типу при рН 7,0, в1рус Коксак! В-5 при рН 5,0. Перйодатне окисления в !нших межах рН призводить до значно меншо'1 !нактивац!1 в!ру-с!в. При цьому виявлена !стотна р1зниця в чутливост! до КЮ4 се-лекц1йованих вар!ант!в в!русу Коксак! В-3. В1рул1цидна актив-н!сть КГО4 по в1дношенню до вар!ант!в, як 1 у випадку вих!дних штам1в найб!льш виражена в зонах рН, близьких до !зоелектричних точок в!рус!в.

3 метою з'ясування питания про механ1зми д 11 перйодату кал1я на в1русн1 частки проведено електронно-м1кроскоп1чне досл1дження препарат1в в1русу Коксак! В-3 п1сля перйодатного окисления.

Показано, що при окисленн! в кислих рН /4-5/ вже в перш1 хвилини спостер1гаеться ф1зичне руйнування в1рус1в. Через 1-2 хвилини в препарат! з'являеться велика к!льк!сть в!р1он1в 1з зниженою електронною щ1льн!стю /в!русн1 т1н1/ а також деформован! 1 частково зруйнован1 в1русн! частки. На п'ят!й хвилин1 окисления в1р1они в препарат! вже не виявляються. Ф1зичне руйнування в!р1он!в корелюе з швидким зникненням !нфекц!йно! активност1 в1-руса. При окисленн1 в нейтральних рН, тобто при значениях рН близьких до 1зоелектрично'1 точки досл1джуваного в!руса, не в1д-м1чалось будь-яких зм!н у морфолог1! та к!лькост1 в!русних час-ток протягом тривалого часу. В1русн1 частки збер!гають морфоло-г1ю протягом 10, 20, 30 хвилин, 1 години, доби, але, незважаючи на це, 1нфекщйя1сть в1русного препарату знижувалась на 3-4

За даними л1тератури в1домо, що р1зноман!тн1 л!п!двм1сн! структура характеризуются високими адсорбц1йними властивостями по в1дношенню до бентон!ту. Отже, не можна виключати, що частки в1рус!в з високою спор1днен1стю до бентон!ту м!стять л1п1дн1 компоненти. В тому випадку якщо аф1н!тет в1руса до бентон!ту обумовлений присутн!стю л!п1дних структур у склад! в1р1он1в сл1д чекати, що обробка в1русвм!сно'1 р!дини оргайчними розчинникамй або детергентами буде призводити до зменщення сорбЩйних властй-востей в1рус1в.

Для п1дтвердження цього припущення проведено вивчення впливу деяких детергент!в та орган1чних розчинник1в' на ' адсорбщйн!

властивост! ентерсшруспв /Коксак1 В-1, В-3, В-5, пол1ов1руса 1 типу/ по В1Дношению до бентон!ту.

Спостер!гаються р!зн1 механ!зми дП детергент!в окремих труп на ентеровгруси. Так, полярний детергент /додецилсульфат натрш/ зникув аф!н!тет в!рус!в до сорбенту. В присутност! 0,11% детергента ус1 досл1джен! в1руси втрачають здатн1сть адсорбу-вагися на бенгон1т1. В присутност! нейопиого детергенту здат-н1сть адсорбуватися на бентон1т1 втрачають в1руси, !зоелектричн! точки яких знаходяться у зон! рН 6,0-7,0, зокрема в1рус Коксак! В-3 ! пол!ов1рус 1 типу. У випадку в!рус1в, що мають !зоелект-ричн1 точки у зон1 рН 3,5-4,75, Тритон Х-100 не вьанював !х спо-р!дненост! до бентон!ту. При цьому ус\ в!руси збер!гають вих1д-ний аф!н!тет до бентонгху п!сля повторних екстракЩй еф1ром ! хлороформом. Наступним тестом на лш!двм!сн! структури в склад! в!р!он!в досл!джуваних в1рус!в було вивчення впливу екстракцП орган!чними розчинниками /хлороформом/ на стугпнъ нейтрал!зац11 в1рус!в Коксак! групи В антит!лами та на чутлив!сть !х до перйо-датного окисления.

Встановлено, що екстракц!я хлороформом призводить до зб!ль-шення констант нейтрал!зацП в!рус!в Коксак! В-1 1 В-5 /в1дпо-в1дно на 17 1 50%/, тобто ефективност1 нейтрал!зац!'1 цих в1ру-с!в, що, можливо, св!дчить про асоц!ац!ю в!р!он!в цих в1рус!в э л1п1дними компонентами. Сл1д зауважити, що статистично доптов1р-ним /р<0,05/ зростання константи нейтрал1эшЦ1 було лише у випадку в!руса Коксак! В-5. Константа нейтрал!эацП в!руса В-3 не эм!нюеться п!сля екстракц!! /табл.4/.

яз tr Я g го со Еч Ч о cd г а о в sc« 4) « N N (S (M (N IN оооооо 1-* Т-* г-» T-t t-i XSOSXiO! CDWMSOOCVJ -из о о со m ^ - . . . . из со со сою

со as- cu . а.» я 6« s s и ч ¡-"*н S о я ä* •il lo яп сосоо-ччлю со сч2 тч тч aacîaoa +1 +1 -Н -Н +1 +1 U3 О cd cd О О - -сою - . - -с\2тн оо

1 \ >>Я I О ГО cu (h ю cd m язч чвон D.-Í-Iw аьи е* « г s^nuw f- са О ta О к ГО> X г* ч --i - a 0.0 яо •-i-^ч mow « с я s: WTfcoaiQw ст-^мгаст-ч1 ооаооо +1 -н +1 +1 +1 +1 оооооо "ч1 ^ч1 -ч" •ч' -ч1 -ч1

N N \ г-<1-<СТС5ЮЮ'

и юаэспазсасо

а. аз ч-t -г* -гч тн fh § «i § S iâ § SSSSSS оооооо sc s: sex sc sc

03

о

« я

в

о о а

со

8&

Is

asi о _

4 я

X g

's i=c s о

5 ra ¡3 го m s o a

О.«

О Ef

S M

а

0 ь

as

•fH 0) д «

1 со

\ И

X s \ а

а

о

1 ■ s 1 A3 1 и о ei ам К-ч sssoog О та я о я to ^ на К'Н и W CJ г( н CJ W оооооо TÍTITHV^THH X X X X X X N to -g; in т-i с: NN со со - -... .о о оооо

jj «я s х юююшюю •п тН tH Vi -гН чН

Титр BlpyCiB, Ct пЮля окисления •g'M'NíDCON ОООООО -И +1 +1 +1 -Н +1 соооюоо со ..... •CO^COCON 00

О 1 «■К о. -О SrtВЯШ\ я як-п«« t=cü si ütjaí •гн 0> >sf-. S x-e-s аьоо s к s'i-it-lim о-няяч -=f со ю со (d ■ч< со со-ф со со о"о*о*о*о"о" -+Н 1-1 +1 +t +t +1 ююсоеооо - -coco - - 1xdld « -"^-ч1

о > о, i-i со \ \ ^ xxx n, \ т< -с-1 со со lo ю mmcQmmcû •w -r—f ■>—i t-i .rt -w ni аЗ nî a! oÍ Èâ o o ü o q о s x x к £ x ООО ООО

Ш>(

о сх с

i >>

и s о. с

а н s о о

Q. m

л в я к ч о я го

о «

а

е-<

о

2 о

s

наявн1сть на поверхн1 в!рус!в з високим афШтетом до бентон1ту л1п1дних компонента, можливо кл!тинного походження. Л1п1дн1 компоненти зб1лыпують ст1йк1сть в1рус!в до д11 перйодату кал1я, гальмують 1нактивац1ю в!рус1в в1руснейтрал!зуючими антит1ламй.

висновки

1. Вивчен! 1эоелектричн1 властивост1 в!рус!в Коксак! В 1 '¡х сеяекц1йованих вар1ант!в. Досл1джуван1 в1руси мають 1зоелектрич-н! точки, залежн! в!д 1х типу 1 фо1«усуються в певних зонах рН: 5,5-6,0 у випадку в!руса В-1, 4,0 1 6,0-7,0 у випадку в!руса В-3, 4,75 у випадку в1руса В-5.

2. Встановлено, що для в!рус1в характерна виражена внут-р1шньотипова гетерогенн!сть за 1.зоелектричними властивостями в1-р1он!в. Ступ1нь гетерогенност! може бути р!зним 1 залежить в1д серотипу. Найб1льш гетерогенним виявився в!рус Коксак1 В-3.

3. Встановлена кореляц!я м1ж адсорбц!йними характеристиками в1рус1в, 1зоелектричними властивостями, чутлив!стю до перйодату кал1я 1 в1рулентн!стю. Так штами в1рус1в з низьким афШтетом до бентон!ту 1 високою в1рулентн1стю для тварин фокусуються в зон1 рН 6,5-6,0 1 б!льи чутлив! до КЮ4 при рН 5,0-6,0. В1руси э високим афШтетом до бентон1ту, як! менш в1рулентн1 для тварин фокусуються в зонах рН 4,0 1 6,0-7,0 1 б1льш чутлив1 до дП реагенту при даних значениях рН.

4. 1нактивуюча д1я КЮ4 на в1русн1 частки найб1льш в1рог1дно пов'язана в пошкодженням 61лк1в капсиду. Про це св1дчать дан1 електронно-м1кроскоп1чного досл1дження, залежн1сть чутливост!

в1рус1в до КЮ4 в1д рН середовшца при якому проводиться окисления та 1зоелектрично1 точки в1русу.

5. Обгрунтовуеться припущення, що на поверх^ капсщцв в1ру-с1 в з високлм афШ тегом до бентонгту знаходяться лпадн1 струк-тури. Ц1 структури можуть бути видаленг за допомогою орган!чних розчиншшв 1 дегергент!в, що призводить до Шдвищення чутливос-т1 в!рус!в до д!1 перйодату кал1я 1 в1руснейтрал!зуючих антит!л.

ПЕРЕД Ж Р0Б1Т 0ПУБЛ1К0ВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦП

1. Чувствительность к перйодатному окислению органных штаммов вируса Коксаки В-3 и его генетических вариантов//Материалы Всесоюзной конференции "Энтеровирусы. Общетеоретические и медицинские аспекты". - Киев. 1991. - с.48 /Соавт.: Т.В.Журба/.

2. Оптимизация методов иммунной электронной микроскопии для изучения Коксаки В вирусов/УМатериалы Всесоюзной конференции "Энтеровирусы. Общетеоретические и медицинские аспекты". - Киев. 1991. - с.45-46 /Соавт.: А.А.Егоров, Н.В.Вишневская, О.Н.Егорова/.

3. Изучение изозлектрических характеристик вирусов полиомиелита и их субпопуляций, различающихся по аффинитету к бентони-ту//Теэисы докладов Международной конференции по вопросам медицины катастроф. - Киев. - 1992. - т.2 - с.207-208 /Соавт.: В.П.Широбоков, Ю.В.Загороднюк, А.И.Евтушенко/

4. Вивчення явища гетерогенност1 популяц1й ентеров1рутв за 1зоелектричними властивостями в1рЮн1в//Матер1али М1жвуз1всько'1 науково! конференщ! молодих вчених та студент1в "1нфекц1йний процес. Теор1я та практика". - Кшв. - 1994. - с. 12

5. Пор1вняльна ф!вико-х1м1чна характеристика ентеров1рус1в та ix субпопулящй з р18ним аф!н1тетом до 0ентон1ту //Матер1али М1жвуз1всько'1 науковоТ конференцП молодих вчених та студент1в 'Чнфекщйний процес. Теор1я та практика". - Ки1в. - 1994. - с. 12

6. Експериментальне обгрунтувення ефективного збереження Пбр1дом-продуцент1в та моноклональних антит1л, що дифереиц!юють в1руси пол1ом!ел1ту//Сборник "Идеи И.И.Мечникова в развитии современного естествознания". Международная конференция, посвященная 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова. Тезисы докладов. -Харьков. - 1995. - с.265-266 /Сп1вавт.: 0.В.Салата, К.I.Л1патн1-кова, Т.Н.Тарасов, ЬВ.Школавнко/

7. Дисоц1ац1я eHTepoBipyciB - новий генетичшш феномен//В1с-ник АМН Укра'1ни. - подано до друку /СШвавт.: В.П.Широбоков, О.М.Корнюшенко, Т.Б.Журба, М.В.Шилов/

8. Гзоелектричне фокусування ентеров1рус!в та "ix генетичних вар1ант1в//Укра'1нський науково-медичний молод!дний журнал. - подано до друку

9. Гетерогенн1сть п1корнав!рус1в за ф1зико-х1м1чними власти-востями//1нфекц1йн1 хвороби. подано до друку /Сп1вавт.: В.П.Широбоков/

10. Enteroviruses dlssotlatlon phenomenon: physicochemlcal and biological properties of dissociants//Abstracts of Xth International Congress of Virology. Virology Division, International Union of Microbiological Societies /IUMS/. -Jerusalem, Israel. - 1996. - no. 0326 /V.P.Shlrobokov, O.M.Komushenko, T.B.Gurba, M.V.Shilov/

22 РЕЗШЕ

В.В.Мельник.

Гетерогенность популяций вирусов Коксаки В по физико-химическим свойствам.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.02.06 - вирусология. Рукопись.

Национальный медицинский университет им. акад. А.А.Богомольца. Киев. 1996 г.

Проведено сравнительное изучение физико-химических свойств прототипных штаммов вирусов Коксаки группы В и их селекционированных вариантов, различающихся по аффинитету к бентониту.

Показано, что для популяций энтеровирусов характерна выраженная гетерогенность по физико-химическим свойствам вирионов. Результаты проведенных исследований с использованием изоэлектри-ческого фокусирования, ионообменной хроматографии, иммун-но-электронной микроскопии и других методов свидетельствуют о существовании стабильных закономерных отличий между популяциями энтеровирусов с различным аффинитетом к бентониту и селекционированными вариантами Абент+ 1 Абент- по характеристике поверхности вирионов, чувствительности к перйодатному окислению, действию детергентов и органических растворителей. Обосновывается предположение, что на поверхности вирионов энтеровирусов с высоким аффинитетом к бентониту находиться липидсодержащие структуры клеточного происхождения. Эти структуры могут быть удалены.с помощью органических растворителей и детергентов, что приводит к

повышению чувствительности вирусов к действию перйодата калия и вируснейтрализующих антител.

SUMMARY

V.V.Melnick.

Coxackie B viruses populations heterogeneity with

physico-chemical properties.

The thesis for the Medical Sciences Candidate degree on

speciality 14.02.06 - Virology-

Manuscript.

National Medical University. Kiev. 1996.

Comparative study of physico-chemical properties of coxackievlruses B prototype strains and their selected variants with different adsorbtion on bentonite characteristics have been performed.

Enteroviruses populations was shown to be extremely heterogenous with physico-chemical properties of virions. The results obtained with isoelectrofocusing, ion-exchange chromatography, immune-electrone microscopy and other methods of investigation revealed that stable regular differences occured between enteroviruses populations with different affinity to bentonite as well as between selected variants Abent+ and Abentwich seems to have different virions surface characteristics, sensitivity to potassium periodat oxydation, detergents and organic solvents treatment. Enteroviruses with high affinity to

bentonite supposed to have cell-derived lipid-containing structures on the virions surface. Virus pretreatment . with organic solvents and detergents lead to extraction of these structures and increasing of viruses sensitivity to potassium periodate and neutralising antibodies.

KJIKHOBI CJIOBA: eHiepoBipycH, BipycHi nonyjiaijii, reTeporeu-HicTB, $l8HKo-xiMliHi BaacTHBocTi BipyclB