Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ КОКСАКИ В-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СУБСТАНЦИЯМИ, ЭКСТРАГИРОВАННЫМИ ИЗ ПЯТИЛИСТНИКА КУСТАРНИКОВОГО PENTHAPHYLLOIDES FRUTICOSA (L.) О. SCHWARZ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ КОКСАКИ В-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СУБСТАНЦИЯМИ, ЭКСТРАГИРОВАННЫМИ ИЗ ПЯТИЛИСТНИКА КУСТАРНИКОВОГО PENTHAPHYLLOIDES FRUTICOSA (L.) О. SCHWARZ"



На правах рукописи

Бурова Любовь Георгиевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ КОКСАКИ В-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СУБСТАНЦИЯМИ, ЭКСТРАГИРОВАННЫМИ ИЗ ПЯТИЛИСТНИКА КУСТАРНИКОВОГО Penthaphylloides fruticosa (L.) О. Schwarz

03.00.06 - вирусологах

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Кольцо во-2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии с вирусологией и иммунологией Новосибирской государственной медицинской академии

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор А.Н. Евстропов

Официальные оппоненты; доктор медицинских наук,

профессор АР. Покровский

доктор медицинских наук,

профессор М.Р. Карпова

Ведущая организация:

Институт вирусологии им Д.И. Ивановского РАМН, Москва

Защита состоится 14 мая 2004 года в 9.00 часов на заседании диссертационного совета Д. 20^,020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотєхнологгі'л «Вектор» МЗ РФ по адресу: Кольцове Новосибирской области, 630559

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан 13 апреля 2004 года Ученый секретарь

диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на ряд успехов в создании противовирусных лекарственных средств, остается актуальным поиск препаратов с наименьшей токсичностью, не вызывающих образование резистентных штаммов вирусов и, обладающих широким спектром антивирусной активности.

В случаях «^специфической симптоматики, обусловленной возможной ре про дующей разных вирусов, значительный интерес могут представлять вещества растительного происхождения, поскольку ряд из них, являясь относительно малотоксичными, обладает достаточной широтой биологических свойств,

Наше внимание привлек нятклиегник кустарниковый (PentbaphyLloides fruticosa (L.) О. Schwarz), известный под названием "курильский чай " и пользующийся популярностью у народов Сибири и Дальнего Востока как повседневный напиток. У растения отмечены антимикробные, антиаллергические, органопротекторные, противовоспалительные, иммуностимулирующие, протв-водиабетические и другие свойства (Телятьев В.В., 1991). Биологическая активность пятгошетоика кустарникового обусловлена присутствием разных химических соединений, Это - полифенояьные соединения, сахара, алкалоиды, сапонины, терпеноиды, эфирные масла, метадлорганические соединения; витамины - С, К, Р; макро- и микроэлементы (Триль В.М., 1977, Гаиешсо Т.В., 1991).

Вирусы Коксаки группы В широко распространены в человеческой популяции и способны вызывать ряд состояний варьирующих от бессимптомно протекающих форм до смертельного менингита и энцефалита (Яворовская В.Е., 1974, CaplanN.L., 1996). Общепризнана роль вирусов Коксаки в патологии сер-дечно-сосудиетой системы (Покровский В.И., 2000, Kawai С., 1999), предполагается их участие в развитии ипсулинзависимого сахарного диабета, патологии плода и других заболеваний человека. Однако до сих пор нет рекомендованных препаратов для профилактики и лечения Коксаки-вирусной инфекции.

Цель исследования. Изучение противовирусной, иммуномодулирующей и нотерфероиогенной активности субстанций, экстрагированных из пятилнет-ника кустарникового (Penthaphylloides fruticosa (L.) О, Schwarz) для экспериментального обоснования возможности их применения при лечении и профилактике Коксаки В-вирусноЙ инфекции.

1. Провести скрининг различных субстанций, экстрагированных из пяти-листника кустарникового, в культуре клеток для выявления противовирусной активности.

2. Изучить возможное антивирусное действие наиболее активных суб^

Задачи:

станций в культуре клеток.

РГАУ-МСХА нменн К.А. Тимирязева ЦНБ имени Н И. Железнова

3, Исследовать интерферон индуцирующие и иммуномодулирующие свойства наиболее активных экстрактов пятилистника кустарникового.

4. Выяснить возможность лечебного и профилактического действия наиболее активных субстанций на динамику экспериментального инфекционного процесса, обусловленного вирусом Коксаки ВЗ.

Научная новизна работы.

1. Впервые выявлены преимущества водного экстракта пятилистника кустарникового перед водно-спиртовыми, выражающиеся а его способности подавлять репродукцию Коксаки В вирусов в культуре клеток, а также оказывать вируяицидное действие.

2. Впервые па экспериментальной модели Коксаки ВЗ-вирусноЙ инфекции получены данные о защитном действии водного экстракта пятилистника кустарникового при его лечебном и профилактическом применении,

3. Впервые установлено иммуностимулирующее и ингерфероногенное действие водного экстракта пятилистника кустарникового.

Практическая значимость работы

Получен патент на изобретение «Способ получений водорастворимого фитоэкстракта, обладающего противовирусной активностью» (10],

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях молодых ученых Новосибирской государственной медицинской академии (Новосибирск, 2000, 2001, 2002 гг.), XIV Российской научной конференции: «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях» (Челябинск, 2000), II Российской конференции молодых ученых: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001), Научной сессии, посвященной 65-детию НГМА (Новосибирск, 2000), Научно-практической конференции; "Инновации в охране здоровья людей" (Новосибирск. 2001), Пироговской студенческой конференции (Моы.та, 2002), VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и тразитологов (Москва, 2002), III Международном Конгрессе Молодых Ученых «Науки о человеке» (Томск, 2002, 2003). По материалам диссертации опубликоы. ¿¡о 7 статей, 9 тезисов, из них 1 в зарубежной печати.

Структура диссертации. Текст диссертации изложен на 162 страницах машинописного текста, включая 22 таблицы, 22 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, выводов и указателя литературы — 330 наименований (110 отечественных и 220 иностранных научных источников).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы.

1.1. Изучаемы« вещества. В работе были исследованы свойства пяти экстрактов пятилистншса кустарникового (Pentaphylloides fruticosa (L.) O.Schwarz, полученных лабораторией фитохимии Центрального Сибирского ботанического сада СО РАН и любезно иредоставленых с.н.с., к.б.н. Волхон-ской Т. А. Изучаемые субстанции отличаются между собой по способу получения и по количественному составу биологически активных компонентов, опре» деленных методом жидкостной хроматографии. Для водного экстракта татили-стника кустарникового, полученного по оригинальной методике [10], характерно содержание 21,45% дубильных веществ, 1,86% каггехинов, 4,75% флавоно-лов, 41,4% Сахаров. В составе четырех водно-спиртовых экстрактов присутствуют дубильные вещества, кзтехины и флавоколы соответственно : 41,57%, 13,65% à 29,37%; 24,94%, 9,2% и 35%; 29,1%. 10,24% и 14,37%; 38,2%, 6,23% и 53,75% (Волхонская Т. А., 2000, Храмова EIL, 1999,2000).

1.2. Вирусы. В работе были использованы вирусы Коксаки грушш В. Коксаки В1, штамм Connecticut-5 (титр-5,5 lg ТЦД jcro.iwiX Коксахя В2, штамм Ohyo-1 (титр=5,5 lg ТЦД swo.ima), Коксаки ВЗ, штамм Nancy (ютр=5,5 Ig ТЦД jwo.ii«). Коксаки В4, штамм Powers (титр=5,5 Ig ТЦД яициш), Коксаки В5, штамм Faulkner (титр=5,5 Ig ТЦД иуо,ыЛ Коксаки Вб, штамм 1-51-21 (титр=5,5 lg ТЦД jcvojiut) были использованы для скрининга изучаемых веществ в культуре клеток (КК). Вирус Коксаки ВЗ, штамм Nancy (титр=4,5 lg ЛД *мм-л> был использован в витальном эксперименте. Вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС) (пггр=5,5-6,0 lg ТДД использовался для титрования мышиного интерферона. Все штаммы вирусов получены из Государственной коллекции музея штаммов Института вирусологии РАМН им. ДЛ. Ивановского.

13. Культуры клеток и экспериментальные -животные. В работе использовалась клеточные линии Нер-2 u L-929, полученные из коллекции культур Института вирусологии РАМН им. Д.И. Ивановского. Для моделирования Коксаки ВЗ-вирусной инфекции использовались 1-2 суточные новорожденные мыши обоего пола, массой 1-1,5 г, линии BALB/c. В иммунологических исследованиях использованы мыши-самцы гибриды Fi/C57BL/6 * DBA/2/ и Fi/CBAxC57BL/6/, 2-3 месячного возраста, массой 18-20г, разведения экспериментально-биологической клиники животных ИКИ СО РАМН. Для определения интерфероногенной активности изучаемого вещества использовались нелинейные мыши обоего пола, 2-3 месячного возраста, массой 18-20 г.

1.4. Методы вирусологического скрининга. За максимальную переносимую дозу (МПД) для культуры клеток (КК) принимали наибольшую дозу изучаемого вещества (ИВХ не вызывавшую токсической дегенерации клеток.

$

Противовирусная активность ИВ б КК определялась следующими методиками; а) предварительная адсорбция 100 ТДД50 вируса в КК в течение часа с последующим внесением ИВ (De Clercq et al, 1980); б) оценка действия ИВ на внеклеточные внрионы при контакте 100 ТЦД 50/0,1 мл вируса И исследуемой дозы ИВ в течение I часа с последующим внесением в КК; в) предварительная обработка клеточной культуры препаратом в течение 24 часов с последующим внесением 100 ТЦД50 вируса. Проводилась оценка дозозависимого снижения инфекционного титра вируса в сравнении с контролем. Для ИВ отмечалась ин-гибирующая доза (ИД50), выражающаяся в наименьшей дозе вещества, подавляющей 1ЩД вируса на 50% или снижающая его инфекционный титр не менее чем на 1,5 lg. Критерием эффективности противовирусного действия ИВ служил химиотерацевтический индекс (ХТИ). являющийся отношением МПД к ИД50. Активным считалось вещество, имеющее ХТИ равное 4 и более. Изучалась динамика снижения инфекционного титра вируса Коксаки ВЗ под влиянием водного экстракта пятилистника кустарникового в методике предадсорбщш.

1.5. Методы изучения противовирусной активности в эксперимент«.

ИВ вводилось животным внутриже лудочно. Доза вещества, вызывавшая

гибель 50% взятых в опыт животных принималась за ЛДю- Противовирусная активность ИВ определялась по схемам лечебного и профилактического действия. Вирус Коксаки ВЗ вводился новорожденным животным однократно подкожно в область бурого жира в инфицирующих дозах 10 и 100 ЛД*х>,05мл- При оценке лечебного действия ИВ вводилось В течение 7 дней после инфицирования, При оценке профилактического действия экстракт вводился животным дважды с интервалом в 24 часа, и спустя 1 час после последнего введения животных инфицировали. При оценке возможности влияния на постваталънуто экзогенную вирусную инфекцию, ИВ вводилось беременным самкам в последние 3-5 дней беременности, после чего новорожденных мышат инфицировали 100 ЛД^О! ым вируса.

Во всех случаях были использованы следующие контрольные группы животных: 1) шг-актные, 2) инфицированные, 3) нотифицированные животные, которым вводилось 0,05мл фшиологического раствора внутрижелудочно в качестве "плацебо"

На 3, 5, 7,10 и 15 сутки эксперимента оценивались показатели: динамика выживаемости, средняя продолжительность ждади, динамика массы тела, показатели изменения инфекционного титра вируса в тканях сердца, головного мозга, печени. Pernoлироваиные штаммы вируса идентифицировались в реакции нейтрализации со стандартной противо-Коксаки ВЗ сывороткой производства Московского НИИ вирусных препаратов МЗ РФ,

1.6. Методы определения интерферон индуцирующей активности. Продукция интерферона (ИФ) была индуцирована внутрижелудочным введением разнополым беспородным мышам массой 18-20 г различных доз ИВ. Про-

б

бы крови забирались через б, 12. 24, 48, 72 часа от момента введения. Титровался сывороточный ИФ, оценивалась кнтерфероновая реакция лейкоцитов (ИРЛ) по методике Соловьева В.Д. и Бектемирова Т.А. (1979). В качестве индуктора интерферона использовался полину клеотид poIy-G-poly-C. За единицу противовирусной активности штгерферона принималась величина, обратная его конечному разведению, при котором наблюдается защита 50% клеток от 100 ТЦД» вируса ЕМС в ЮС L-929.

1.7. Метилы определения имму ном адуляру ющен активности. Влияние ИВ на гуморальный иммунный ответ определяли по количеству антитело-образующих клеток (АОК) селезенки в методе Jeme N.K. (1963) в модификации Cunningham A.J. (1965).

Реахция гаперчувствительности замедленного типа при изучении клеточного иммунного ответа проводилась по методу Yoshikai У., Milki S., Matsuraoto Т. ctal.(1979) Результат - индекс реакции (ИР) расчитывался по формуле; ИР = (Ро - Рк) + Рк, где Ро — размер опытной стопы, Рк - размер контрольной стопы.

1.8. Методы статистической обработки. Результаты титрования вируса по ЦПД в КК обрабатывали по методу Reed L.J., Muench Н. (1938). За титр вируса принималось его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в 50% зараженных культур. Значения ИД» И ЛД» рассчитывались по методу КйгЬег G. (1931). Результаты показателей экспериментальной инфекции обработаны с использованием пакета программ Statist:са 5,0 for Windows 95 .

2. Результаты н обсуждение

2.1. Скрининг противовирусной активности -экстрактов пятнлнетни-ка кустарникового.

2-1.1. Изучение переносимости экстрактов пятилистннка кустарникового.

Наибольшая устойчивость клеточной культуры Нер-2 отмечена для водного экстракта курильского чая кустарникового - его МПД оказалась равной 1500 мкг/мл. Спиртовые экстракты пятияистника кустарникового оказались более токсичными. Так, для экстракта 2 МПД для Нер-2 составила 125 мшУмл, а для веществ 3,4,5 она составила 62.5 мкт/мл.

2.1.2. Скрининг противовирусной активности экстрактов пятилист-ника кустарникового в отношении Коксаки В вирусов

При исследовании экстрактов курильского чая кустарникового были получены следующие результаты. Внесение вещества в КК по методике De Clercq задерживало репродукцию вирусов Коксаки группы В в следующем диапазоне показателей (таблица 1): для водного экстракта ИД» составила 31,25-62,5 мкг/мл и ХТИ 24-48; для спиртовых, соответветственно, 3,9-83,3 мкг/мл и 1,516. При изучении вирулицидного действия выявлено, что для водного экстракта ИДзо н ХТИ принимали значения в диапазоне 15,6-62,5 мкг/мл и 24-96; для дру-

rax веществ эти показатели варьировали: 7,8-62,5 мкг/мл и 1,5-8. Предобработка КК до внесения вируса показала следующие значения ИД» и ХТИ соответственно: для водного экстракта - 31,25-62,5 мкг/мл и 24-48; для других - 3,962,5 и 1,5-16. Анализируя полученные результаты первичного скрининга противовирусной активности различных экстрактов пятшшстника кустарникового, можно отметить, что в сравнении со спиртовыми водный экстракт обладал наименьшей токсичностью, максимальными, а также, наиболее равномерными показателями активности в отношении вирусов Коксакн труппы В. Это послужило основанием для его более детального изучения.

Таблица 1

Противовирусная активность водорастворимой субстанции пятилистннка кустарникового в культуре клеток

Вирусы Коксакн группы В Метод предадсорбции Изучение внрулмцндного действия Метод предобработки

КВ1 ИД5» 31,25*3,82 15,6*2,42 31,25*4,58

ХТИ 4S 96 48

КВ2 ИД« 31,25*4,17 62,5*4,27 3U5*4,S3

ХТИ 48 24 48

квз 1Щ» 31,2514,25 31,25*4,36 31Д5±4,36

ХТИ 48 48 48

КВ4 ид» 62,5*5,14 62,S*5,00 31.25*4,53

ХТИ 24 24 48

КВ5 ид» 62, J± 5,08 62,5*5,06 31,25*4,53

ХТИ 24 24 4S

КВ6 ВД50 62,5*5,02 62,5*4,53 б2,5±5,14

ХТИ 24 24 24

2.1.3. Изучение противовирусной активности водного экстракта пятилистннка кустарникового в отношении вирусов Коксакн В

Для более детального изучения влиянии водного экстракта пятилистннка кустарникового на репродукцию вирусов Коксакн группы В в культуре клеток, была исследована зависимость изменения величины их инфекционного титра от применяемой дозы экстракта. Максимально эффективным оказывается снижение инфекционного титра вирусов при использовании метода предадсорбции (рис. I). Для доз 7,8-15,6 мкг/мл отмечается его уменьшение на 0,5-2,0 ^ от исходного, а в дозе 62,5 мкг/мл уровень репродукции вирусов принимает значения 1-2,5

При изучении вирулицидного действия снижение титра на 0,5-2 отмечается для дозы 15,6 мкг/мл. При дозе 62,5 мхг/мл инфекционный титр вирусов Коксаки группы В принимает значения 2-3

При предобработке ЮС веществом в течение 24 часов и последующим внесением вируса снижеиие его титра для доз 3,9-7,8 мкг/мл не наблюдается. При увеличении используемых концентраций экстракта снижение вирусного титра на 1,5 ^ и более регистрируется в основном для большей дозы - 62,5 мхг/мл.

К81

К В 2

КВЗ

КВ 4

КВ5

КВ 6

Рис. 1. Влияние водного экстракта на снижение инфекционного тигра Коксаки В-вирусов в методике предадсорбцин

2.1.4. Изучение репродукции вируса Коксаки ВЗ при применении вещного экстракта пятилнетника кустарникового в условиях одно циклового опыта

Учитывая, что вирус Коксаки ВЗ достаточно часто встречается при патологии человека, была изучена репродукция вируса под действием ИВ в условиях одноциклового опыта в методике предадсорбщш вируса. Было отмечено до-зозависимое торможение репродукции вируса (рнс. 2). Значение титров опытных проб и контрольных начинал значительно отличаться после 8 часов от момента инфицирования клеточной культуры. На отметках 24 и 48 часов тигр в опыте с 31,25 мкг/мл держался одинаковым — 1,75 1ё и повышался до 2,0 к 72 часам. В опыте с дозой 15,6 мкг/мл титр вируса к 24 часам поднимался до 3,0 1&, к 48 часам - до 3,25 , а к 72 часам - до 3,5 1$. Тогда как в контроле он составил соответственно - 4,25 4,5 и 5,5

1

г — — -

Х- V 1 1"

, „1 \ - ' * — ' 1 - — - - 4 1- '

< * " - '

16

24

48

11

время, час

"• Контроль вируса —15,6 мкг/мл - И- 31.24 мкНм л Рис. 2. Влияние водорастворимого полифенольного комплекса пятилист-ника кустарникового на динамику репродукции вируса Коксакн ВЗ

Таким образом, была показана активность водорастворимого экстракта пятшшстника кустарникового в отношении вирусов Коксакн группы В в КК

2.2. Применение водного экстракта нятплнспшка кустарникового в качестве лечебного н профилактического средства при экспериментальной Коксакн ВЗ-впрусной инфекции

Результаты изучения переносимости ИВ показали, что у взрослых животных ЛД>осоставила 540*14,57 мг/кг, для мышат-сосунков-307,5±18,23 мг/кг.

2.2.1. Лечебное применение

Введение животным 40 мг/кг вещества по лечебной схеме эксперимента после их инфицирования 100 ЛДя> вируса достоверно увеличило показатели выживаемости, средней продолжительности жизни, массы тела, снизилось содержание вируса Коксаки ВЗ в тканях органов по сравнению с контрольной инфицированной группой. Так, выживаемость в опытной группе составила 77,15%, в контрольной инфицированной - 4,22%; средняя продолжительность жизни приняла значения соответственно - 12,37 и 5,0 суток (таблица 2). Инфекционный титр вируса в тканях органов начинает значительно различаться -на 1,5-2 уже на 5 сутки эксперимента, что приходится на момент наибольшей гибели животных в контрольной инфицированной группе. К концу опыта вирусный титр в органах опьггной группы определялся на уровне 0,75-1 тогда как в >руппе контрольной он остается на уровне 2-3,25 (рис. 3).

ш

Таблица 2

Изучение лечебного действия 40 нг/кг водного экстракта пятнлкстняка кустарникового у животных, инфицированных 100 ЛД» вируса Коксакн ВЗ

Выживаемость и средняя продолжительность жизни

Группы животных Выживаемость, % СПЖ, сутки

Опытны Т7,15±9,70* Ш7±0,91*

Контрольная инфицированная 4,22+1,79 5,00±0,64

Контрольная интактная 94,2516,51 14,20±1,03

Динамика массы тела

Группы 0 сутки 3 сутки 5 сутки 7 сутки 10 сутки 15 сутки

Опытная 1,36 ±0,03 1,83 ±0,11* 1,96 ±0,09* 2,70 ±0,18* 3.94 ±0,07* 7,85 ±0,25*

Контрольная инфицированная 1,36 ±0,08 1,56 ±0,08 1,63 ±0,75 2.15 ±0,07 2,58 ±0,04 6,08 ±0,11

Контрольная интактная 1,37 ±0,08 2,35 ±0,24 2,02 ±0,09 2,99 ±0,12 4,86 ±0,08 9,32 ±0,16

* - достоверные отличия с контрольной инфиц ированной группой при Р£0,05 В 7

Я> в £

I 5

!«

1

I» в

ь

1 о

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Ткани головного Ткани сердца Ткани печени

мозга

Рис. 3. Динамика содержания вируса в тканях органов животных, инфицированных 100 ЛДзд вируса Коксаки ВЗ при лечебной схеме эксперимента при использовании 40 мг/кг вещества

п

2.2.2. Профилактическое применение

При изучении профилактического действия водорастворимый полифе-кольный комплекс пятилистника кустарникового вводился в дозе 40 мг/кг, животных инфицировали 10 ЛДзо вируса. Было отмечено, что достоверно улучшились показатели выживаемости, динамики массы тела животных, средней продолжительности жизни в опытной группе (таблица 3), Показано снижение накопление вируса в тканях органов. Так, в тканях головного мозга на 5-10 сутки в опытной и контрольной группах титр вируса различается на 2,5 В тканях сердца эти различия в то же время несколько меньше, соответственно: 2,5; 1,75; 1,5 В тканях печени на 5-7 сутки эксперимента разница составила 3 К 13 дню наблюдения в тканях органов опытной группе вирус обнаруживался в титре 0,75-1,5 тогда как, в группе контрольной он приходился назначения 1,52,5 ^ (рис. 4). Предложенная схема эксперимента показывает эффективность профилактического применения изучаемой субстанции при условии инфицирования животных меньшей дозой вируса.

Таблица 3

Изучение профилактического действия 40 мг/кг воли ого экстракта пятилистника кустарникового у животных, инфицированных 10 ЛДзо вируса Коксаки ВЗ

Выживаемость и средняя продолжительность жизни

Группы животных Выживаемость, "А СПЖ. сутки

Опытная 39,26 ±8,54* 9,91 ±0,59*

Контрольная 12,64 6,55

инфицированная ±1,43 ±0,19

Контрольная 94,25 14,20

нитакткая ±6.51 ±1,03

Динамика массы тела

Группы 0 сутки ' 3 сутки 5 сутки 7 сутки 10 сутки 15 сутки

Опытная 1,38 2,27 2,21 3,05 4,91 8,94

±0,02 ±0.06» ±0,06* ±0,09* ±0,03* ±0,17*

Контрольная 1,36 1,91 1,71 2,33 2,60 6,77

инфицированная ±0,09 ±0,08 ±0,05 ±0,09 ±0,09 ±0,17

Контрольная 1,37 2,35 2,02 2,99 4,86 9,32

иктактхая ±0,08 ±0.24 ±0.09 ±0,12 ±0.08 ±0,16

*-достоверные различия с контрольной инфицирован ной группой при Р£0,05

в 7 it в

t.

Л

Í4

2

1

О

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Ткани головного Ткани сердца Ткани печени

мозга

Рис. 4. Динамика содержания вируса в тканях органов животных, инфицированных 10 ЛДэд вируса Коксаки ВЗ при профилактической схеме эксперимента

Z2.3. Применение водного экстракта пятилпстника кустарникового для профилактики пос-шатальпой экзогенной Коксакн ВЗ-вирусной инфекции

В ходе эксперимента было предположено возможное профилактическое действие ИВ в опыте с новорожденными мышатами при введении экстракта курильского чая кустарникового беременным самкам за несколько дней перед родами. ИВ вводилось внутрижелудочно мышам в дозе 40 мг/кг/сут, мышата инфицировались 100 ЛДМ Коксаки ВЗ.

Было обнаружено (таблица 4), что показатели выживаемости, средней продолжительности жизни, динамики массы тела животных в опытной группе животных достоверно отличаются от таковых контрольной инфицированной группы.

Вирусологические исследования тканей органов показали значительные отличия содержания вируса в головном мозге, сердце, печени животных изучаемых групп (рис. 5). К концу эксперимента в тканях сердца и печени вирусный титр оказался равным 1-0,75 lg, в тканях головного мозга вирус обнаружить не удалось у животных опытной группы, тогда как у мышей контрольной труппы он продолжал выделяться в титре равном 2,0 lg -3,25 lg.

Таблица 4

Изучение действия водного экстракта шггилнстника кустарникового у животных,инфицированных 100 ЛД» вируса Коксяки ВЗ при профилактике экзогенной нодтнатальной инфекции

Выживаемость и средняя продолжительность жизни

Группы животных Выживаемость. % СПЖ. сутки

Опытная 72,14 ±1,89* 11,96 ±1,04*

Контрольная ныфици роеанная 4,22 ±1,79 5,00 ±0,64

Контрольная интактная 94,25 ±6.51 14.20 ±1,03

Динамика тсеытела

Группы 0 сутки 3 сутки 5 сутки 7 сутки 10 сутки 15 сутки

Опытная 1,37 ±0,05 !,63 ±0.09 1,80 ±0,11 2,4$ ±0,13 3,77 ±0,18 7,49 ±0,13*

Контрольная инфицированная 1,36 ±0,08 1,56 ±0,08 1,63 ±0,75 2,15 ±0.07 2,58 ±0,04 6,08 ±0,11

Контрольная витали ая 1,37 ±0,08 2,33 ±0,24 2,02 ±0,09 2,99 ±0,12 4,86 ±0,08 9,32 ±0,16

• достоверные различия с контрольной инфицированной группой при Р50.05

из га5 от ою СН5 сутки

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Ткапи головного Ткани сердца Ткани печени

мозга

Рис. 5. Применение водного экстракта пятилистника кустарникового при профилактике экзогенной лостиаталыюй Коксаки ВЗ-вирусной инфекции

Таким образом, исследования водного экстракта пяшлистнака кустарникового в витальном эксперименте выявили возможность его применения как средства для профилактики илечения Коксаки ВЗ-вирусной инфекции.

2,3. Исследование ннтер фе ро имнду циру ющей и имму номодулирую-щей активности водного экстракта пятплнстника кустарникового

Для того, чтобы изучить широту биологического эффекта, вызываемого введением водорастворимой субстанцией штилистннка кустарникового животным, а так же оценить комплексное воздействие на организм пря вирусной инфекции была юучена ее интерфероиогенная и иммуномодулирующая активность.

2.3.1. Интерферон индуцирующие свойства водного экстракта пятплнстника кустарникового

В результате было установлено (таблица б), что содержание ИФ в сыворотке крови мышей на фоне введения водорастворимого полифенолыюго комплекса пятиилистнн ка кустарникового 8 дозе 23 мг/кг к 24 часам находилось на уровне 16 МЕ/мл, при применении дозы 50 мг/кг продукция ИФ к 12 часам составила - 1 б МЕ/мл, а к 24 часам - 64 МЕ/мл, что достоверно отличается от показателей контрольной группы животных. При анализе полученных данных был отмечен прямой до'зо зависимый эффект икгерферониндуцирующего влияния ИВ. Так при введении животным 100 мг/кг экстракта гатилиепшка кустарникового уровни сывороточного ИФ были значительно выше и определялись как 32 МЕ/мл через 12 часов, через 24 часа формировался пик продукции ИФ при значении его титра 160 МЁ/мл. В пробе взятой через 48 часов после индуцирующего введения ИВ титр ИФ ниже и составляет 24 МЕ/мл, а к 72 часам снижается до I б МЕ/мл.

Таблица 6

Влияние водного экстракта ютклистникв кустарникового на продукцию сывороточного интерферона

Дада, Титр интерферона в МЕ эд» часы

мг/кг « \г 24 4а 72

25,0 8 % 16 8 8

50,0 8 1« 64* 8 &

100,0 8 32 160* 24 16

контроль 4-8

• - достоверные рапмчия с контрольной группой при Р0.05

При использовании методики ИРЛ, взвесь лейкоцитов инкубировалась с полигуацилом. Контроль-1 - лейкоциты, инкубированные с полигуацилом; контроль-2 - интактные пробы.

Как отмечено в данных таблицы 7 в контрольных пробах 1 продукция ИФ составила 160 МЕ/мл. В опытных пробах выявлена следующая динамика образования ИФ: при использовании дозы ИВ 50 мг/мл в пробе, взятой через 6 часов от момента введения животным экстракта, титр ИФ продуцируемого лейкоцитами не отличается от контрольной 1 пробы, однако уже через 12 часов он поднимается до 640 МЕ/мл, к 24 часам составляет 1280 МЕ/мл достоверно отличаясь от контроля. В пробе, взятой через 48 часов от введения животным ИВ, тигр принимает значение 320 МЕ/мл, но в 72 часовой пробе совпадает с контрольным. Более высокие значення титров лейкоцитарного ИФ отмечаются при введения животным дозы 100 мг/кг. Так, в пробе, взятой через 6 часов послевведе-ния полифенольного комплекса значения титра ИФ в культуралъной жидкости эставляют 640 МЕ/мл, через 12 часов - 1280 МЕ/мл и достоверно отличаются от контрольных. Них образования ИФ выявлен в пробе, взятой через 24 часа от введения ИВ, он соответствует 2560 МЕ/мл. В 48 часовой пробе уровень ИФ снижается до 640 МЕ/мл, а в 72 часовой - до 320 МЕ/мл.

Таблица 7 .

Влияние водного экстракт» пятил неганка кустарникового на продукцию лейкоцитарного интерферона

Доза, Тнтр интерферона в ME яш, часы

мг/кг 6 12 24 48 72

50,0 160 640 12S0* 320 160

100,0 640 1280* 2560* 640 320

Контроль 1 160

контроль 2 4-8

* • достоверные различия с контрольной группой при Р<0,05

Таким образом, была установлена возможность водорастворимого комплекса, экстрагированного из пятюшетника кустарникового, индуцировать продукцию ИФ >: гиком его образования через 24 часа от момента введения индуктора.

2.3.2. Иммук-.^адуліірующиі: свойства водного экстракта пятнлмст-ннка кустарникового

Для выяснения влияния водорастворимого полифенольного комплекса пятилистника кустарникового на первичный гуморальный ответ определялось содержание антителообразующих клеток в селезенке мышей после введения гетерогенного антигена - эритроцитов барана и ежедневного введения вещества в дозе 100 мг/кг. В результате установлено, что водный экстракт способен повышать п'моральный ответ, поскольку приводит к достоверному увеличению

количества антителобразующих клеток (таблица 8). Так, среднее их показатель в опытной группе составил 147,35, тогда как в группе контрольной 119,56.

Для характеристики изменения клеточного иммунного ответа под влиянием изучаемого вещества была проведена реакция ГЗТ: животных сенсибилизировали эритроцитами барана, в течение 5 суток вводили полифенольный комплекс, после чего вводили разрешающую дозу антигена под апоневроз задней стопы. Индексом реакции считалась разница отека опытной стопы и контрольной, под апоневроз которой вводилась питательная среда ЯРМІ-1640. Результат показывает преобладание индекса реакции в опытной группе но отношению к контрольной: соответственно 37% и 29%, что обнаруживает стимулирующее влияние изучаемой субстанции на клеточный иммунный ответ (таблица 9).

Таблица 8

Влияние водного экстракта пятилисткика кустарникового на первичный гуморальный иммунитет

Группы животных Среднее количество ЛОК па селезенку ХІ01 Процент к контролю Среднее количество ЛОК относительна» Процент к контролю

Опытная 147,35 ± 27,7* 123,24 664,43 ± 109,7" 134,15

Контрольная 119,56131,2 100 495,30 ±65,28 100

* - достоверные различия с контрольной группой при Р<0,05

Таблиц»9

Влияние водного экстракта пятил »стаи кі кустарникового на клеточный ответ

Группы животных Индекс реакции (средняя на группу), % Процент к контролю

Опытная 37 ±1,10* 127,59

Контрольная 29 ±0,80 100

* - достоверные различия с контрольной группой при Р<0,05

Таким образом, можно заключить, что водорастворимый полифенольный комплекс пятнлистника кустарникового способен оказывать противовирусное действие в отношении Коксаки-вирусов группы В, а также проявлять интерфе-роногенные и иммуностимулирующие свойства.

3. Выводы

1. В результате первичного скрининга в культуре клеток экстрактов гогтн-лвстника кустарникового в отношении вирусов Коксаки группы В установлена наибольшая активность водного экстракта, который оказывает влияние па внеклеточные вирионы и на ранние стадии взаимодействия вируса с клеткой.

2. На экспериментальной модели Коксаки ВЭ-вирусной инфекции выявлено лечебное действие водного экстракта пятнлистника кустарникового, проявляющееся увеличением средней продолжительности жизни, выживаемости животных, снижением тигра вируса в тканях головного мозга, печени, сердца.

3. Водный экстракт пятшшетника оказывал профилактическое действие при экспериментальной Коксаки ВЗ-вирусной инфекции, улучшая показатели выживаемости, средней продолжительности жизни животных« снижая накопление вируса в тканях органов.

4. Водный экстракт пяти лист иика кустарникового обладает игггерфероио-генноЙ И иммуномодулирующей активностью, индуцируя образование позднего интерферона, увеличивая количество антителобразующих клеток в селезенке, усиливая реакцию гиперчувствительности у экспериментальных животных.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих paGorai:

1.Бурова Л.Г., Захарова Л.Н., Грек O.P., Евстропов АН. Противовирусная и иммуностимулирующая активность комплекса полифенолов из лапчатки кустарниковой,- Тезисы докладов XIV Российской научной конференцию!: "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" - Челябинск. — 2000. - С. 18-19.

2. Evstropov A., Burova L., Zacharova L., Greek О. Antiviral and Immunostimulating Effects of Polypfenol Complex Extracted from Poteiitilla Fmticosa L. - 10th European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases. - Stockholm. - Sweden. - 2000 (28-31 May)-Abstract number-3/1312. -Programme № Wc. P. 223:5/13.

3. Бурова Л.Г. Изучение противовирусной активности полафенольных комплексов лапчатки кустарниковой в культуре клеток, — Тезисы докладов 60-й и 61-й итоговой конференции студентов и молодых ученых НГМЛ. - Новосибирск. - 2000. - С, 283.

4. Бурова Л.Г. Изучение противовирусной активности водорастворимого полифенольного комплекса лапчатки кустарниковой в отношении Коксаки ВЗ вируса.- Материалы II Российской конференции молодых ученых: "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". — Москва. —2001. - С. 331.

5. Бурова Л.Г,, Захарова Л,Н, Грек O.P., Евстропов АН. Противовирусная активность водорастворимого полифенольного комплекса лапчатки кустарниковой в отношении Коксаки В-вирусов. — Тезисы докладов научной сессии, посвященной 65-летию НГМА. - Новосибирск. - 2000. - С. 116.

6. Бурова Л.Г. Изучение комбинации полифенольного комплекса лапчатки кустарниковой с йодаитипирином в отношение Коксаки ВЗ-вируса. - Тезисы докладов 62-й итоговой конференции студентов и молодых ученых НГМА. -Новосибирск. -2001, -С, 53.

7. Волконская Т.А., Траль В.М., Грек O.P., Бурова Л.Г., Евстропов А.Н., Захарова Л.Н. Перспективы создания и применения лечебно-профилактических продуктов из курильского чая кустарникового. — Сборник трудов: "Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты". — Москва. -2001, -В, 5.-С. 173-179.

S. Евстропов А.Н., Бурова Л.Г,, Грек O.P., Захарова Л.Н., Болконская Т. А Противовирусная активность полифенольного комплекса ш лапчатки кустар-

никовой. - Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва. - 2002. —Т. 4. - С. 87-88.

9. Евстропов А.Н., Грек O.P., Волконская Т.А., Колпаков М.А., Бурова Л.Г., Шишканова A.B., Захарова Л.Н., Равилова Ю.В. Препараты го растений Сибири — перспективные лекарственные средства. — Материалы научно-практической конференции: "Инновации в охране здоровья людей". - Новосибирск. - 2001.-С. 45-46.

10. Грек O.P., Волконская Т.А, Бурова Л.Г., Захарова Л.Н., Евстропов А.Н. Способ получения водорастворимого фитоэкстрагга, обладающего противовирусной активностью И Патент 2203080. - 27.04.2003. - Бюя. 12.

11. Бурова Л.Г. Применение водорастворимого экстракта гоггилистшоса кустарникового для лечения экспериментальной Коксахи ВЗ-вирусноЙ инфекции. - Вестник Российского Государственного Медицинского Университета. — 2002. — №](22). — С. 121-122.

12. Бурова Л.Г, Применение водорастворимого экстракта пятилистника кустарникового для профилактики и лечения экспериментальной Коксаюс ВЗ-внрусной инфекции. // Материалы Ш Международного конгресса молодых ученых и специалистов "Науки о человеке**. — Томск. — 16-17 мая 2002. —С. 16J.

13. Бурова Л.Г. Применение водного экстракта пятилистника кустарникового для профилактики экзогенной постнатальной Коксахи ВЗ-вирусной инфекции в эксперименте. - Тезисы докладов 63-й итоговой конференции студентов и молодых ученых ПГМА. - Новосибирск. - 2002. - С. 32-33

14. Бурова Л.Г., Евстропов АН. Д~рек O.P.. Захарова Л.Н., Волховская Т.А- Применение поли фенолы юго комплекса экстрагированного из пятилистника кустарникового (Penthaphylloides fruticosa <Ъ.) O.Schwarz) для профилактики Коксаки-вирусной инфекции // Бюллеттень сибирской медицины. — 2002. -Ks 4. - С. 27-31

15. Евстропов А.Н., Бурова Л.Г., Орловская ILA., Грек O.P., Захарова Л.Н., Волхонская Т.А. Противовирусные и иммуномодулирукяцие свойства водорастворимого полифенояьного комплекса, экстрагированного из пятилистника кустарникового (Penthaphylloides fruticosa (L.) O.Schwaiz) H Журнал клинической и экспериментальной медицины. - 2003. - № I,- С. 6-8.

16. Бурова Л.Г. Возможность применения водорастворимого полифе-нольного комплекса, экстрагированного из пятилистника кустарникового, для профилактики и лечения эшеровирусной инфекции // Материалы IV Междунаго

родного конгресса молодых ученых и специалистов "Науки о человеке". -Томск. - 15-16 мая 2003,- С. 192

17. Волхонская Т.А., Триль В.М., Бурова Л-Г., Захарова Л.Н., Грек O.P., Евстропов А.Н. Penthaphylloides fiuticosa (L.) O.Schwarz как основа для создания фитопрепаратов широкого спектра действия И Материалы VU Международного съезда - Фитофарм 2003: "Актуальные проблемы сшдания новых лекарственных препаратов природного происхождения"- Санкт-Петербург. -Пушкин. - 3-5 июля 2003. - С. 157-159.

Подписано в печать 27.02,04 г. Формат 60x84/16 Усл. печ, л. 1.0. Тираж 100 экз. Закат № 67-п

Отпечатано в типографии издательства «Сибмедндат»

630091, г. Новосибирск, ул. Красный проспект, 52. Тел.: (383-2) 29-10-83'. Е-гоаіІ: ыЬшеаЫа!@гатЫет.го