Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ гемагглютинирующих свойствэнтеровирусов (на модели вируса ECHO 11)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ гемагглютинирующих свойствэнтеровирусов (на модели вируса ECHO 11)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

РГ §-Ьк-

^ На правах рукописи

НОВОСЕЛОВ Алексей Владимирович

Генетический анализ гемагглютинирующих свойств

энтеровирусов (на модели вируса ECHO 11)

03.00.06 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА —1994

Работа выполнена в УралЬском государственном ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте Министерства здравоохранения Российской Федерации.

НаучнЫй руководитель: кандидат медицинских

наук доцент А. Г. СЕРГЕЕВ.

ОфициалЬнЫе оппонентЫ: доктор медицинских

наук профессор Я. Я. ЦИЛИНСКИЙ;

доктор медицинских наук профессор Л. Г. КАРПОВИЧ.

Ведущее учреждение: Государственный Институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Гарасевича.

Защита состоится « JJL АН-США. 1Q04 г.

пЮ .часов на заседании Специализированного Совета Д 001.27.01 при Институте полиомиелита и вируснЫх энцефалитов Российской АМН по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией моЖпо ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вируснЫх энцефалитов Российской АМН.

Автореферат разослан «

Л » LvVI MLLU-b 1 оод j-.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук О. А. МЕДВЕДКИНА

йктуальность проблемы. Вирусы ECHO являются самой большой по количества серотипов группой, входящей в род Enterovirus семейства Picornaviridae, и характеризуются широким спектром клинических проявлений инфекции .Вместе с тем, несмотря на большое клиническое значение, молекулярная биология вирусов ECHO остается малоизученной по сравнению с вирусами полиомиелита.

Феномен гемагглитинации, выявляемый у болыинства представителей знтеровирусов (за исключением полиовирцсов),'' является хорошо известным, но не понятным в биологическом смысле. Остаются неясными как взаимоотношения рецепторов гемаг-глютинина с зклиптирующими рецепторами на чувствительных клетках [Рюкерг Р.Р.,1989], так и взаимоотношения соответствующих антирецепторов на поверхности вирионов. Кроме того, в отношении химической природы гемагглютининов знтеровирусов существует гипотеза о том, что они являются гликопротеинами [Ыиробоков В.П. и соавт.,1974: Halperen S. et al.,1973; Lerner ft.M. et al., 1965, 1966]. Следовательно, не исключается возмонность кодификационной изменчивости гемагглютинируюцих свойств. контролируемой клеткой-хозяином.

Исследования гемагглютинируюцих свойств вирусов ECHO, известные к настоящему времени, касались связи данного признака с серологическими типами ЕПодоплекин В.Д., 1974; Чердаков В.В., 1967; Goldfield et al.,1957 и др.]. выявления гем-агглютинирующей активности при репродукции в различных клеточных культурах [Подоплекин В.Д., 1964; Толстокорова Я.Е., 1975; Cova L., flyimrd М.. 1980 и др.], вариабельности штаммов по способности к адсорбции на эритроцитах и гемагглитинации [Lahelle 0., 1958;. Maurseth ft. et al.,1960; Mutanda L. N. et al., 1974; Simon M., Domok I.. 1963], а также выделе-

ния, очистки и изучения эритроцитарных рецепторов [Philipson L. et al.,1962, 1964], М.Simon и I.Doiok (1963) было показано, что гемагглютинирующие свойства являются генетическим признаком вирусов ECHO, однако, детального генетического анализа изменчивости данного признака не проводилось.

Известно, что эритроцитарные нембраны и очищенные зрит-роцитарные рецепторы блокируют инфекционность гемагглютини-рущих энтеровирусов in vitro [ Philipson L. et al.. 1962; 1964]. В условиях естественного инфекционного процесса связывание гемагглютинирующих энтеровирусов с эритроцитами может иметь определенное патогенетическое значение, являясь как фактором, препятствующим гематогенному распространению инфекции, .так и фактором, вызывающим селекцию негемагглютинирую-щнх вариантов с измененным клеточным тропизмом.

Выбор вируса ECHO И в качестве экспериментальной модели обусловлен тем, что данный вирус актуален как один из доминирующих серотипов, циркулирующих среди здорового населения [Ошерович Й.Н. с соавт.,1991], так и в качестве частого возбудителя серозных менингитов [Архангельская Э.И. и соавт., .1991; Резник В.И. и соавт.,1991 и др.] и заболеваний новорожденных [Modlin 3.F., 1988]. Кроме того, геном вируса наиболее подробно изучен на молекулярном уровне [ftuvinen Р., Нуу-pia Т.. 1930].

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенных фактов, целью диссертационной работы явилось выяснение молекулярной основы проявления гемагглютинирующих свойств энтеровирусов на модели вируса ECHO 11.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Частотно-мутационный анализ изменчивости вируса по

Н признаку (способности адсорбироваться на эритроцитах человека и вызывать гемагглютинацию).

2. Интерпретация результатов генетического анализа Н признака в отношении молекулярных изменений генома, приводящих к утрате и восстановлению признака.

3. Изучение возможности модификационного типа изменчивости гемагглютинирувцмх свойств при адаптации вируса с первичной на перевиваемые культуры клеток.

4. Исследование возможности Я-гликозилирования капсид-ных белков и связи Н признака с включением глгакозамина в состав вирионов.

5. Сравнительный анализ изоэлектрических точек гемаг-глютинирувщих и негемагглатинирующих вариантов.

Научная новизна.

1. Впервые сформулирован метод интерпретации частоты спонтанных мутантов для оценки молекулярных изменений в геноме РНК-содерзацих вирусов.

2. Впервые получены данные о генетической изменчивости вирусов ECHO 11 по Н признаку, свидетельствующие о точковом характере мутации, приводящей к утрате и восстановлению гем-агглютинирующих свойств.

3. Впервые показано, что антирецептор на поверхности вириона вируса ECHO 11, ответственный за связывание с зри-троцитарным рецептором, не идентичен антирецептору, ответственному за взаимодействие с чувствительными клетками.

4. Гемагглютиннрукзщие свойства вируса ECHO 11 не связаны ни с наличием гликопротеинов в качестве структурных компонентов капсида," ни с нековалентным включением глюкозамин-содернацих соединений в состав вириона.

5. Впервые выявлены выракенные селективные свойства ку-

льтуры клеток RD в отношении гемагглютинируящих вариантов вирусов ECHO.- ; -

Практическая ценность работы. В соответствии с поставленной целью диссертационная работа имеет фундаментальную направленность. Вместе с тем. для использования в практической вирусологии мояно рекомендовать метод элюции энтеровирусов с эритроцитов при выделении вирусов из крови. Кроме того, обнаружение селективных свойств культуры клеток RD в отноыении гемагглатинируюцих вариантов вирусов ECHO, наряду с данными литературы о селективных свойствах в отноыении гемагглютини-руюцих вариантов вирусов Коксаки В [Reagan К.З. et al..19841, позволяет рекомендовать данную культуру для селекции и накопления гемагглютинируз^их энтеровирусов. . -

Материалы диссертационной работы и-спользуются в курсе лекций по вирусологии в Уральском государственном ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте. Основные полозения, выносимые на защиту.

1. Популяции гемагглатинирующих штаммов и клонов вируса ECHO 11 гетерогенны по Н признаку и содержат негемаггл'ютини-руацих мутантов со средней частотой 3,0x1..

2. Данные генетического анализа изменчивости вирусов ECHO 11 по Н признаку свидетельствуют о точковом характере мутации, приводящей к утрате и восстановления гемагглн-тини-руюдих свойств.

3. йнтирецептор на поверхности вириона вируса ECHO 11, ответственный за связывание с эритроцитарным рецептором, не идентичен антирецептору, ответственному за взаимодействие с чувствительными клетками.

4. Гемагглитинирующие свойства вируса ECHO 11 не связаны ни с наличием гликолротеинов в качестве структурных ком-

лонентов капсида, ни с нековалентным включением глвкозамин-содержацих соединений в состав вириона. Апробация работы. Основные полошения и результаты диссертационной работы дологены на Всесоюзной конференции "Знтерови-русы. Общетеоретические и медицинские аспекты" (Киев, 1991). итоговой годичной научной конференции студентов и молодых, ученых Свердловского государственного медицинского института (Свердловск, 1991). Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Уральского.государственного медицинского института (Екатеринбург,. 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками и 26 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы (1 глаза), описания материалов и методов, экспериментальной части (3 главы), обсугдения результатов, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, в том числе -'42 российских и государств СНГ, И? - зарубеяных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

В работе использованы прототипный штамм Gregory вируса ECHO И. полученный из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов (г.Москва) и штамм 7611 вируса ECHO 11, выделенный и идентифицированный в вирусологической лаборатории Областной санэпидстанции (г.Екатеринбург).

Эксперименты проводились с использованием следующих ку-

■ - б -

льтур клеток: 1) ФЭЧ - первичная культура фибробластов эмбриона человека, которую получали методом холодной трипсини-зации [Карыиева А.Ф., Сюрин В.Н., 1980],* 2) Л-41 - перевиваемая линия клеток (дериват линии 3-96, выделенной от больного моноцитарным лейкозом): 3) RD - перевиваемая линия клеток эмбриональной рабдомиосаркомы, Перевиваемые культуры были получены из Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (г.Москва).

Культивирование вирусов осуществляли общепринятыми методами. В качестве поддерживающей среды во всех опытах использовалась среда Игла. Гемагглютинируацую (ГА) активность определяли микрометодом, инфекционную активность - методом конечных разведений и в реакции бляшкообразования (РБО). Клонирование проводили методом бляиек под агаровым покрытием [Du— lbecco R., Uogt M.., 1954]. Покрытие состояло из 0.92 агара ("Difco"), раствора Эрла, 5'/. сыворотки теленка, 30 мМ хлорида магния; 0,18У, гидрокарбоната натрия; 0,037. глутамина; 0,4 мг/мл протамин сульфата ("Merck"); 1:60 000 нейтрального красного ("ICR Pharaaceuticals") в конечных концентрациях.

Выделение негемагглитинируюцих мутантов из популяций ГА штаммов и клонов, полученных на культуре клеток ФЭЧ, проводили с помощью обработки вирусных препаратов эритроцитами человека (0,001-0,09 БОЕ/эритроцит, 40 мин при 4вС), осазде-ния эритроцитов центрифугированием и анализа Ffi свойств потомства вирусных частиц, не связавшихся с эритроцитами. Выделение ГА ревертантов из популяции негемагглютинирующего мутантного клона осуществляли путем инкубации препарата вируса с эритроцитами человека (0,02 БОЕ/эритроцит. 1 час при 4'С), отмывания эритроцитов от не связавшегося вируса и зла-ции адсорбированных вирусных частиц с помощью лизиса зритро-

цитов в растворе Хеккса с 0,252 дезоксихолатом натрия.

Механизм изменчивости ГА свойств вируса ECHO 11 при адаптации с первичной культуры клеток ФЭЧ на перевиваемую культуру Л-41 изучали в опытах с одиночными циклами репродукции со сменой клеток-хозяев, аналогично схеме экспериментов для выявления феномена рестрикции-модификации у бактериофагов [Лурия С. и соавт.,1981; Drake 3.W.. 1970]. 9 исходных вирусов и уроная одиночных циклов репродукции определялась относительная эффективность образования бляшек в культурах ФЭЧ и Л-41.

Для радиоактивного мечения ГА и негемагглютинирукщих

клонов вируса ECHO 11, полученных на культуре клеток RD, ис-14 3

пользовали [1- С]- и [6- НШ]-Б-г'люкозамина гидрохлорид ("NEN") с конечной активностью в поддергивающей среде 3 мкКи в мл. Концентрирование вирусов на ПЭГ 6000 ("FERAK") и очистку с помощью зонального скоростного центрифугирования в 15-45У. градиенте сахарозы проводили по Ф.Йайнору ( 1988). Измерение радиоактивности во фракциях градиентов производилось зидкостно-сцинтилляционным методом [Остерман Л.А., 1983].

При изучении влияния туникамицина и глутамина на ГА активность вируса ECHO И использовали монослойные культуры клеток RD в 96-луночных планшетах с плоским дном. Инокулят индикаторного вируса разводили таким образом, чтобы при отсутствии репродукции вируса в поддерживающей среде определялось 2 ГАЕ, а после размножения вируса в контрольных лунках - 256 ГАЕ. Туникамицин (смесь изомеров: А-12, 0-322, С-452.

•D-182 "Sigiaa") растворяли в 502 (об/об) этаноле до концентрации 4 мг/мл и готовили 2-кратные разведения в среде Игла, начиная с 80 мкг/мл до 0,03? мкг/мл.

йзоэлектрофокусирование Гй и негемагглютинирующего кло-

нов проводили в градиенте сахарозы с 17. амфолинами ("LKB") pH 3,5 - 10 [Butler Н. et al., 1985].

Нами были подтверздены данные [Лашкевич В.Й. и соавт., 1980] о том, что распределение бляшек в РБО соответствует распределению Пуассона, поэтому для статистической обработки результатов измерений использовались общепринятые методы. Расчеты погреиностей приближенных величин проводили по специально разработанной программе для IBM-совместимых компьютеров.

Частота мутантов как операциональный критерий оценки молекулярных изменений в геноме РНК-содержащих вирусов.

В результате анализа данных литературы нами было показано [Новоселов A.B., Сергэез Й.Г.. 199П, что экспериментально наблюдаемая частота спонтанных мутантов является информативной в отношении молекулярного механизма мутации. Сопоставление частот спонтанных мутантов при известной молекулярной основе мутации с данными о скорости мутирования РНК-содержащих вирусов подтвердило теоретический вывод М.Eigen и С.К.Biebricher (1988) о том, что частота мутантов может быть мерой скорости мутирования при условиях равновесного состояния популяции и нейтральности мутации ( в отношении зизнеспособности мутантов). Возмсзные изменения в геноме, исходя из частоты мутантов, определенной экспериментально, представлены в таблице 1.

Сходство величин скорости мутирования у РНК-содеряащих вирусов, даае имеющих различную стратегию генома, обосновывает правомерность экстраполяции выявленных закономерностей, по крайней мере, на родственные вирусы. Кроме того, среди эн-теровирусов была выявлена как высокая гомология аминокислот-

Таблица 1.

Частота спонтанных мутантов как операциональный критерий молекулярной основы изменений генотипа

Частота Изменения генотипа

мутантов

-3 Мультилокусный признак, либо другие факторы,

> 10 ' влияющие на частоту мутантов: фенотипическая

маскировка, повышенная жизнеспособность мутантов, мутации в гене полимеразы. наличие "горячих" точек, криптическая рекомбинация

-4 Единственная точковая мутация по одному из

10 единичных (от 1 до 10) потенциальных сайтов,

вероятно - транзиция

-5 Единственная точковая мутация по одному из

10 единичных (от 1 до 10) потенциальных сайтов,

вероятно - трансверсия

-7

10 Двойная мутация по определенным сайтам

ных последовательностей в неструктурной части генома [fluvi-nen Р. et al.,1989, 1930; Herner G. et al.,19891, так и наличие у полимеразы 3D вируса ECHO И тех ке консервативных функциональных доменов, что и у других пикорнавирусов [ftuvi-nen Р. et al., 1990].

Частотно-мутационный анализ гемагглштинирущих свойств вируса ECHO 11 в первичной культуре ФЭЧ

В качестве одного из подходов к выяснению молекулярной основы проявления ГА свойств энтеровирусов был использован генетический анализ гетерогенности популяций клонов и штаммов вируса ECHO 11 по Н признаку. С целью выделения негемаг-глютиниругацих мутантов и определения их частоты в популяциях ГА штаммов и клонов были изучены оптимальные условия разделения популяции по фенотипу за счет адсорбции ГА вирионов на эритроцитах человека. Наиболее эффективное разделение популяции достигалось при проведении как адсорбции вируса, так и осаздения эритроцитов со связанным вирусом при 4'С (по сравнению с 22 и 374). Двухкратная обработка вирусных препаратов эритроцитами, при которой исключалась возможность насыщения эритроцитарных рецептороЕ, не приводила к дальнейшему сникению доли несвязанного вируса у ГА штамма 7611 и у выделенных из него ГА клонов, а также у ГА клона G2233, полученного из шт.Gregory. Однако, двухкратная обработка эритроцитами клона G3123, выделенного из шт.Gregory, привела к уменьшению доли несвязанного вируса в 10 раз, причем ее величина (0,0282) стала сопоставимой с таковыми у остальных .ГА клонов. В целом, от 0,015 до 0,075у. инфекционных вирионов в популяциях ГА клонов и зтаима 7611 не адсорбировались на эритроцитах, то есть имели Н- фенотип в условиях опыта. При исследовании кинетики адсорбции штамма Gregory и полученного из него клона G3123 было установлено наличие в популяции медленно адсорбирующихся вирусных частиц. Однако, увеличение времени инкубации с эритроцитами (более 4 часов) не приводило к дальнейшему сниаению доли несвязанного вируса. Расчет константы скорости адсорбции [по Р.Р.Рюкерту, 1989] показал, что при

одинаковых условиях взаимодействия с эритроцитами величина константы у ГА клонов находилась в пределах от 4,6x10"^ до ?,3х10~^ мл-мин^.

Разделение популяции Гй штаммов и кленов с помощью обработки эритроцитами оказалось недостаточным для выделения не-гемагглютинирукщих (h-) мутантов, так как фракция вирусных частиц, имевших Н- фенотип, при пассане в культуре ФЭЧ давала Гй потомство. Чтобы выяснить причину данного явления, было исследовано потомство отдельных блянек (бляшечных изоля-тов), полученных из не адсорбировавшихся на эритроцитах вирусных частиц. Материал бляшек пассировали в культуре ФЭЧ с высокой множественностью заражения (около 100 БОЕ/клетку), определяя Гй активность на каждом пассаже. Большая часть таких бляшек (88,1%), полученных из Гй клонов, давала Гй потомство на первом пассаже, а к четвертому пассажу 96,7% исследованных бляшек проявило Гй активность в потомстве. Следовательно, соответствовавшие таким йляикзм исходные вирусные . частицы имели h+ генотип и Н- фенотип. На пятом пассаже ни один из исследованных бляшечных изолятов не дал Гй потомство. Потомство бляшек, имевшее на 5-м пассане в культуре ФЭЧ инфекционную активность не менее 10^50Е/мл при отсутствии Гй активности, было представлено h- мутантами, не способными адсорбироваться на эритроцитах. При дальнейшем клонировании таких бляшечных изолятов такке были получены негемагглютини-рующие клоны. Результаты определения частоты h- мутантов в популяциях Гй штаммов и клонов вируса ECHO 11 представлены в таблице 2. Средняя частота h- мутантов составила 3.0x10"^. Отсутствие мутантов среди 47 исследованных бляшек из шт.Gregory, очевидно, было связано с тем. что не адсорбировавшиеся на эритроцитах вирусные частицы в действительности имели ме-

дленно адсорбирующийся Н+ фенотип и соответствующий ему h+ генотип.

Частота h- мутантов в популяциях Гй клонов не зависела от кратности клонирования и была одинаковой на двух последовательных пассажах Гй клонов 9.11 и G3123, что свидетельствовало о равновесном состоянии популяции в отношении частоты мутантов. Для подтверждения нейтрального характера мутации была исследована кинетика размножения Гй клонов и выделенных из них мутантных клонов в одиночных циклах репродукции. Статистически достоверных различий в кинетике репродукции выявлено не было.

Обнаруненная в наших экспериментах частота h- мутантов была близка к частоте спонтанных точковых мутантов у полно-вируса [De la Torre З.С. et al.,1990] и у риновируса [Heinz B.fi. et al.,1989]. С учетом того, что мутация по Н признаку •была практически нейтральной, при равновесном состоянии популяции найденное значение частоты h- мутантов характеризовало скорость мутирования по данному признаку. Следовательно, есть основание полагать, что утрата Гй свойств у вируса ECHO И была обусловлена точковой мутацией по определенной позиции в структурной части вирусного генома.

Восстановление Гй свойств нёгемагглютинирующих бляшеч-ных изолятов на 10 - 13-м пассажах С при высокой множественности заражения ) в культуре клеток ФЗЧ. а таете выделение ревертантов на раннем пассаже мутантного клона, указывало на то, что утрата Гй свойств не была вызвана крупной делецией. Частота ревертантов на второй пассаже h- клона составляла 9,ix 10-5 ( что свидетельствовало об ограниченном числе потенциальных сайтов обратной мутации.

Таблица 2. Частота негемагглщтинирующих мутантов в популяциях ГА штаммов и клонов вируса ECHO 11

Частота не Количество иссле- Частота мутантов Частота мутантов

Штамм Пас- адсорбировав- дованных бляшек среди не адсорби- в исходной попу-

саж Инфекционная активностьСБОЕ/мл) шихся частиц —:--ровавшихся частиц ляции

Клон N0. - (П-12/11) Всего Из них С Г2=п/И) (ГЗ=ПхГ2)

Исходная Остаточная ' (ь мутантов

11+ш 12±т • Н+Д N п Г2+ А ГЗ+Д

7611 0 L- С5.1+0,4 5x10 8 (1,5+0,1 )х10 5 (3,0+0,75x10' -4 19 3 (1,6+0,85x10 -1 (4,7+2.75x10" •5

01 2 (5,0±0,3)х10 7 (3,8+0,35x10 4 (7,5+2,1 )х10" ■4 16 1 (6,3+6,15x10' -г (4,7+4.75x10" 5

08 2 (7,6+0,55x10 7 (2,4+0,1)х10 4 (3,2+1,05x10" -4 17 2 (1,2+0,85x10' ■1 (3,8+2.85x10" 5

09 2 (6,6+0,45x10 G (2,2+0,25x10 3 (3,3±1,05x10" ■4 19 3 (1.6+0,85x10" •1 (5.3+3.25x10" 5

9.11 2 (2,7+0,25x10 8 (1,1±0,1)х10 5 (4,2+1,05x10" •4 39 2 (5,1+3,55x10" 2 (2,1+1,25x10" -5

9.11 3 (1,7+0,25x10 8 (2,8±0,5)х10 4 С1.6+0.? 5x10" 4 36 7 (2,0+0,75x10" 1 (3,2+1.85x10" 5

9.11.2 2 (8,3+1,45x10 7 (2,8+0,65x10 4 (3,3+2,25x10" 4 131 2 (1,5+1,15x10" 2 (5,1+4,95x10' 6

9.11.2.1 2 (4,7+0.35x10 8 (1,8+0,25x10 5 (3,7+0,75x10" 4 91 6 (6,6+2,65x10" -2 (2,6+1.15x10" 5

5.9.U.5 0 с. (1,0+0,1)х10 8 (5,1+1.0)х10 4 (5.1+0.65x10" 4 61 . 2 (3,3±2,35x10" 2 ' (1,7+1.25x10" 5

Gregory 2 (2,7+0,45x10 7 (6,9+0,75x10 6 (2,6+1,15x10" 1 47 0 < 2,1х10"2 < 5,5х10"3

G2233 2 (4,7+0,35x10 6 (2,7+0,35x10 3 С 5,6+2,S 5x10" ■4 96 0 < 1,0x10"2 < 5,8x10"6

G3123 2 С 5.5+1.0 )xl0 7 С i.5+0,15x10 5 С 2,7+1,0 5x10" 3 102 1 (9.8+9,75x10' 3 (2,7+2,75x10' 5

G3123 ' 3 (2.6+0,75x10 7 (2,6+0,55x10 4 С1,0+0.65x10" -3 99 2 (2,0+1,45x10" •2 (2.0+1,95x10" 5

Изучение механизма изменчивости гемагглвтинирущих свойств вируса ECHO 11 при адаптации с первичной культуры клеток ФЭЧ на перевиваемые культуры Л—41 и RD,

Обратимое восстановление Гй свойсте вируса ECHO 11 в культуре клеток ФЭЧ после одного пассажа Гй клона на культуре Л-41, а также ограничение инфекционной активности Гй кло-hos при адаптации с культуры клеток ФЭЧ ка культуру ¡1-41 за счет внутриклеточного блока репродукции (рестрикции), были аналогичны феномену рестрикции-модификации у бактериофагов. Это позволило предполокить механизм изменчивости Гй свойств по типу модификации, вызванной клеткой-хозяином. В экспериментах с одиночными циклами репродукции (ОЦР) Гй и негемаг-глютинирующего клонов со сменой клеток-хозяев (табл. 3) наблюдалось выравнивание инфекционной активности клонов для обеих культур, что было типичным для селекции мутантов с расширенным диапазоном клеток-хозяев (hr+) [Drake J.H., 1.970 Следовательно, собственно процесс адаптации Гй клона-к культуре Л-41 не был связан с модификационной изменчивостью вируса. Восстановление Гй активности при обратной адаптации первого пассажа и материала одиночного цикла репродукций кло на 9.11 с культуры клеток Л-41 на культуру ФЭЧ нашло объяснение при анализе вируса, остающегося инфекционным в стадии эклилса на культуре Л-41. Оказалось, что значительная часть исходного Гй вируса оставалась в связанной с клетками Л-41 форме, но не вступала в фазу депротеинизации, так как сохранялась инфекционная активность вируса для культуры ФЭЧ. Имеь но такие вирусные частицы могли в дальнейшем дать достаточный урожай на культуре ФЭЧ, чтобы выявилась Гй активность и> потомства.

Таблица 3. Относительная эффективность образования бляшек у ГА клона 9.11 и мутантного 1ч-клопа 9.13 после одиночных циклов репродукции на культурах клеток /1-41 и ФЭЧ.

Вирус Инфекционная активность (БОЕ/мл, 1+ш) для культуры клеток Относительная бляшек эффективность образования на культуре клеток

ФЭЧ Л—41 ФЭЧ Л—41

9.11 Ф 9.11 Ф.Л 9.11 Ф.Л.Ф 9.11 Ф.Л7 (2,0+0,23x10 8 (1,2+0,2 3x108 (2,1+0,1)х105 (2,6+0,2)хЮ 8 (2,5+0,2)х104 С1.5+0.15x10 5 (3,0+0.3)х104 (2,6±0,2)х10 8 1 1 • 1 1 1,3x10"4 1,2x10"! 1.4x10"1 1

9.13 Ф 9.13 Ф.Л 9.13 Ф.Л.Ф (3,4+0.2)х10 8 (3,9±0,3)х10 5 (6,4+0,4)х10 6 (4,1+0,2)х103 (1,5+0,4 )х10 3 -(4,0+0,3)х103 1 1 1 1,2ХЮ"5 1,2x10"? 6,2x10"4

Примечания: Ф - исходный материал .(2-й пасса» на культуре ФЭЧ)

Ф.Л - урожай ОЦР на культуре /1—41. полученный заражением клеток вирусом Ф Ф.Л.Ф - урожай ОЦР на культуре ФЭЧ, полученный заражением клеток вирусом Ф.Л Ф.Л7 - материал 7-го пассажа вируса 9.11 Ф на^культуре клеток Л—41

- 16 -

Вместе с тем, анализ ряда полученных нами данных указывал на тс, что негемагглютинирувщие варианты, получавшие селективное преимущество в культуре клеток Л-41, по крайней мере частично, происходили из Гй вариантов, размножавшихся в культуре v34. 1) Установлен высокий уровень рестрикции при адаптации к культуре клеток Л-41 h- клона 9.13 (табл. 3), а также v ri- фракций нескольких Гй клонов. 2)Вирусных частиц в популяции Гй клока 9.11, способных к репродукции в культуре 11-41, было ка порядок величины больше, чем частиц, имев-вих Н- фенотип и тем более -• h- генотип. 3) Мутанты, выделенные нами на культуре ФЗЧ, не обладали расширенным диапазо ном клеток хозяев, то есть имели-генотип h-hr-, в отличие от h- мутантов, полученных на культуре Л-41, имевших генотип h-hr+. Следовательно, адаптация клонов, полученных на культу ре ФЭЧ, к культуре Л-41 происходила первоначально за счет се лекции пс пг признаку, а пр.и пассажах на данной культуре исходные h-r.r+ варианты вытеснялись более конкурентоспособным;1 h-hr+ вариантами. В условиях высокой множественности заражения h-hrr варианты могли появиться в результате рекомбинацм между h+r.r+ и h-hr- вариантами. Сформулированная гипотеза ш ЗЕОлает :;ъяснн:ь. почему в популяции ГР. клона, полученно1 на культуре ФЗЧ, было обнаружено больше инфекционных для культуры .".-41 частиц, чем имевших Н- фенотип и h- геноти; Кроме того, получает объяснение наблюдавшаяся нами и другим исследователями. [Подоплекин В.Д., 1964; Толстокорова Л.Е. 1975; Dosok Г.. Sinon M.. 1966; Johnson K.M., Lang DJ.,196 Hoscovici C., La Plaça M., 1961] ограниченная репродукция Г вариантов энтеровкрусов при адаптации с первичной на переви ваемую культуру клеток.

ВаЕКЫм следствием установленной нами независимости

признака от hr признака является то, что антирецептор на поверхности вириона, ответственный за взаимодействие с зритро-цитарным рецептором, не идентичен антирецептору, ответственному за взаимодействие с чувствительными клетками. Этот вывод согласуется с обнаруженной нами нейтральностью h- мутантов, выделенных на культуре клеток ФЗЧ.

При адаптации ГА клонов вируса ECHO 11 с культуры клеток RD на культуру Л—41 такте были получены негемагглитини-рующие мутанты с расширенным диапазоном клеток-хозяев.

Кроме того, при исследовании пассажных уровней восстановления ГА активности у.негемагглютинирующих клонов на культуре RD, нами впервые были установлены селективные свойства культуры RD в отношении ГА вариантов вируса ЕСНЗ 11.

Исследование возможности N-гликозилирования капсидных белков и связи Н признака с включением гяякозааина в состав вирио-нов.

Гипотеза о свази ГА свойств вирусов ECHO с включением в состав вирионов глюкозамина или его производного была высказана S.Halperen et а!.(1973) на основании того, что репродукция ГА вирусов ECHO 12 и ECHO 7 в присутствии радиоактивно-меченного глюкозамина приводила к ассоциации метки с вирио-нами. чего не наблюдалось при тех не условиях репродукции у негемагглютинируащего полиовируса типа 2. Нами была установлена возможность эффективного размножения внутритиповых вариантов вируса ECHO 11. различавшихся по Н признаку, в одной и той же перевиваемой культуре клеток RD, что позволило проверить гипотезу о связи ГА свойств с инкорпорацией глюкозамина в состав вирионов. В экспериментах были использованы Гй клоны: G112 (из шт.Gregory) и клон 111 (из шт.7611); а

такие негемагглатинирующий клон 111R/17R, адаптированный к культуре клеток RD после 7 пассажей в культуре /1-4i.При ультрацентрифугировании препаратов меченых вирусов в градиенте сахарозы были выявлены небольшие пики радиоактивности, совпадавшие с пиками инфекционной и ГА активности во фракциях полных вирионов. Однако, различия между уровнем радиоактивности фона и пиковых фракций оказались незначительными. Полученные нами результаты были сопоставимы с данными S.Halperen et al.(1973), но при расчете количества меченых молекул глю-козамина на 1 БОЕ (допуская, что вся ассоциированная с вирусом радиоактивность была представлена глюкозамином) не выявлено различий между Н+ кленом 111 и Н- клоном lllRfl7R,Анализ степени очистки ГА клойов показал, что уровень радиоактивности в пиковых фракциях соответствовал уровню очистки у поли-овируса относительно исходной активности в поддерживающей среде iDrzeniek R., Bilello P., 19741 при репродукции в присутствии меченых галактозы и N-ацетилгликозамина. Неспецифическое включение метки из глюкозамина в состав рибозы РНК и аминокислот также наблюдалось в экспериментах с кардиови-русом EMC [Burness А.Т.Н. et а!..1973].

В дальнейеих исследованиях химической природы гемагглю-тинина вируса ECHO 11 нами был использован антибиотик туникамицин - специфический ингибитор N-гликозилирования. Установлено, что туникамицин в субтоксических концентрациях ( К мкг/мл и менее) не снижал ГА активность урожая вируса на культуре клеток RD. Более высокие концентрации антибиотик, приводили к морфологическим признакам цитотоксического дей ствия в течение периода, необходимого для репродукции вирус Кроме того, туникамицин был использован для выяснения возмо еного влияния нековалентного включения глюкозамин-содержащи

соединений на ГА активность вируса ECHO 11. Добавление высоких концентраций глутамина в поддерживающую среду при одновременном блокировании синтеза N-гликанов (после предынкуба-ции клеток в условиях отсутствия глутамина и глутаминовой кислоты) должно было привести к накоплению внутриклеточного пула глюкозамин-содеряащих соединений. Если бы ГА свойства вируса определялись включением в состав вириона таких соединений, то при данных экспериментальных условиях не должно было происходить снижения ГА активности урожая вируса. Однако, в эксперименте наблюдалось снияение ГА активности, причем это снижение было связано с внесением в среду тукиками-цина. Более того, в присутствии антибиотика наблюдалась прямая зависимость мевду концентрацией глутамина и степенью снизения ГА активности урозая вируса. -Такае наблюдалось про-тективное действие туникамицина в отношении скорости развития цитопатического действия вируса. Полученные нами данные согласуются с данными S.Halperen (1976) о том, что синтетическое производное глюкозамина (Н-карбобензокси-Б-глюкозамин) полностью подавляло размножение вируса ECHO 12 и ингибирова-ло включение глюкозамина в инфицированные и не инфицированные клетки. Следовательно, блокирование синтеза N-гликанов приводило к подавлению репродукции вирусов ECHO. Представляется весьма вероятным, что блокирование синтеза N-гликанов и(или) накопление метаболитов-предшественников препятствует вирус-индуцированной пролиферации клеточных мембран, либо нарушает их функции. В пользу такой гипотезы свидетельствуют следующие данные: 1) ферменты долихолового пути N-гликози-лирования, который-блокируется туникамицином. локализуются в гладком эндоплазматическом ретикулуме [Datema R. et al., 1987]; 2) синтетическое производное глюкозамина ЕHalperen S.,

1376]• п:давляло рост инкорпорации холина в зараженные клетки; 3) индуцированное энтеровирусами увеличение инкорпорации холина других предшественников липидов является следствием пролифе:ации гладких цитоплазматических мембран, образующих везикулк в зараженных клетках ECaliguiri I.A., Tamm I.,1970; Guinea ?.., Carrasco L., 1990; Skinner M.S. et al., 1968].

Сравнительный анализ изоэлектрических точек гемагглютинирую-щего и негемагглптинирующего вариантов.

_•"• -Прх-изоэлектрофокусировании ГА и негемагглютинирующего клонов вируса ECHO 11, полученных на культуре клеток ФЭЧ, было выявлено практически одинаковое распределение ГА и не-гемагглвтинирующих частиц в широком градиенте pH (3,5 - 10). Б обоих случаях преобладали вирусные частицы, имевшие pi 3,5 что свидетельствовало об отсутствии существенных изменений поверхн:стного заряда вирионов. в результате мутации, приво-;?/:s¡': ;•: утрате ГА своЛств.

ВЫВОДЫ

1. 5 популяциях гемагглитинирующих клонов, выделенных ка культуре клеток ФЭЧ из прототипного штамма Gregory и из клинического изолята (штамм 7611) вируса ECHO 11. содержатся три типа вирусных частиц, различающихся по Н признаку ( способности адсорбироваться на эритроцитах человека и вызывать гемагглгтинацию); 1) H+h+ частицы, адсорбирующиеся на эритроцитах и дающие гемагглютинирующее потомство; 2) H-h+ частицы. не адсорбирующиеся на эритроцитах, но дающие генагглю-тинкруЕцее потомство; 3) H-h- мутанты, не адсорбирующиеся на эритроцитах и дающие .негемагглютинирующее потомство.

- 21 -

2. Частота спонтанных мутантов у РНК-содержацих вирусов является информативной в отношении молекулярного характера • изменений генома при условиях равновесного состояния вирусной популяции и нейтральности мутации.

3. Установлено, что в популяциях- гемагглвтинирущих штаммов и клонов вируса ECHO 11 негемагглютинирующие мутанты обнаруживаются со средней частотой З.ОхЮ-^ . Частота гемаг-глютинируэцих ревертантов в популяциях негемагглютинируяцих клонов составляет 10"^ - 10"*^ . Найденные значения частот свидетельствуют о точковом характере мутации, приводящей к утрате и восстановлению Н признака.

4. Адаптация гемагглютинирующих клонов вируса ECHO 11.

в

полученных на культурах клеток ФЗЧ и RD. к культуре клеток Л-41 приводит к селекции негемагглютинирующих мутантов с расширенным диапазоном клеток-хозяев. Модификационная изменчивость Н признака, контролируемая клеткой-хозяином, в изученных культурах клеток не выявлена.

5. Антирецептор на поверхности вириона, ответственный за связывание с эритроцитарным рецептором, не идентичен антирецептору, ответственному за взаимодействие с чувствительными клетками.

6. Гемагглютинируэзщие свойства вирусов ECHO не связаны ни с наличием гликопротеинов в качестве структурных компонентов капсида, ни с нековалентным включением глюкозамин-содер-жащих соединений в состав вириона.

1. При особых экспериментальных условиях блокирование синтеза '(-гликанов ингибирует репродукцию вируса ECHO 11. вероятно, вследствие нарушения процессов индуцированного вирусом биосинтеза, ассоциированного с мембранами.

8. Перевиваемая культура клеток RD обладает выраженными

селективными свойствами в отношении гемагглютинирующих вариантов вирусов ECHO, а перевиваемая культура клеток Л-41 - в отношении негемагглютинирующих. Б первичной культуре клеток 034 гемагглютинирунщие варианты имеют незначительное селективное преимущество перед негемагглютинирующими.

9. Мутация, приводящая к утрате гемагглютинирующих 'свойств/существенно не изменяет поверхностней заряд вири-онов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ'

1. Новоселов А.В., Байбаков Д.М. Частота и скорость мутаций у РНК-содержащих вирусов - прикладные аспекты в популяци-онной генетике // Актуальные вопросы патогенеза, диагностики и лечения заболеваний: Тезисы докладов 46 научной конференции студентов, посвященной 60-летию СГМИ. - Свердловск: Изд. мед. пн-та. 1991. - с.72-73.

2. Новоселов А,В.. Сергеев А.Г, Изменение равновесного состояния популяции ге«агглютинирующего вируса ECHO 11 при адаптации к перевиваемой культуре клеток // Материалы Всесоюзной конференции "Энтеровирусы. Общетеоретические и-медицинские аспекты". - Киев, 1991. -с.76.

3. Новоселов А.В., Сергеев А.Г. Частота мутантов как операциональный критерий оценки молекулярных изменений в геноме РНК-содеряащих вирусов. - Свердловский гос. мед. ин-т: Екатеринбург, 1991. - 23 с. - ДЕП в ВИНИТИ 19.03.92 N929-В92.

4. Сергеев А,Г., Новоселов А.В. Сравнительный анализ гено- v, фенотипической гетерогенности популяции гемагглютинируи-щх штаммов и клонов вируса ECHO 11 // Материалы Всесовз-

- 23 -

ной конференции "Знтерозирусы. Общетеоретические и медицинские аспекты". - Киев. 1991. - с.85-86, 5. (Сергеев ft.Г., Новоселов А.В., Бубенщиков А.В., Кондрашо-ва З.Н.) Sergeyev A.G., Novoselov A.U., Bubenschikov A.U., Kondrashova Z.N. Genetic analysis of'echovirus 11 variability in adsorption to huaan erythrocytes // Arch.Uirol. -1994. - U.134, N1-2. - p.129 - 139.