Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гемагглютинирующие свойства хантавирусов и получение специфического диагностикума

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кушнарева, Татьяна Валерьевна

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Антигенная и молекулярно-генетическая характеристика хантавирусов.

Глава 2. Современные методы лабораторной диагностики хантавирусных инфекций.

Глава 3. Классические серологические реакции в изучении хантавирусов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 4. Материалы и методы.

4Л. Штаммы хантавирусов, используемые в работе.

4.2. Сыворотки крови, используемые в работе.

4.3. Источники и методы получения гемагглютинирующих антигенов.

4.4.Методы, используемые при исследовании антигенов и антител.

4.5. Статистическая обработка результатов исследования.

Глава 5. Изучение гемагглютинирующих свойств хантавирусов, циркулирующих на юге Дальнего Востока России.

5.1. Условия выявления гемагглютининов у штаммов хантавирусов.

5.2. Факторы, влияющие на гемагглютинирующие свойства хантавирусов.

5.3. Некоторые свойства гемагглютининов штаммов хантавирусов.

Глава 6. Способ получения высокоактивных гемагглютинирующих антигенов хантавирусов.

6.1. Процедура получения гемагглютинирующих антигенов вирусов Хантаан, Сеул и Пуумала.

6.2. Сравнительное изучение специфической активности антигенов вируса Хантаан, полученных из разных источников и разными методами.

6.3. Оценка функциональной активности штаммов вируса Хантаан возбудителя заболевания ГЛПС в Приморском крае.

Глава 7. Диагностические возможности РТГА при хантавирусной инфекции.

7.1. Использование функционально-активных штаммов хантавирусов для повышения диагностической эффективности РТГА при ГЛПС.

7.2. Изучение динамики формирования антигемагглютининов у больных ГЛПС с разной тяжестью заболевания.

7.3. Использование РТГА для дифференциальной диагностики ГЛПС, обусловленной вирусами Хантаан и Сеул.

7.4. Изучение антигенных взаимосвязей штаммов хантавирусов с помощью кинетической РТГА.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гемагглютинирующие свойства хантавирусов и получение специфического диагностикума"

Актуальность темы. Род Хантавирус семейства Буньявириде, согласно последним данным, включает более 20 серологически и/или генетически различаюпдихся хантавирусов. Среди них не только патогенные для человека, но также вирусы с не установленной эпидемиологической значимостью. Источником заражения людей и природным резервуаром хантавирусов являются мелкие млекопитающие, главным образом, дикие грызуны. На сегоднящний день известны две клинические формы хантавирусной инфекции. На Евроазиатском континенте - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛНС) различной степени тяжести, возбудителем которой являются вирусы Хантаан, Пуумала, Сеул и Добрава. В Северной и Южной Америке - хантавирусный пульмональный синдром с высокой летальностью, вызываемый вирусами Син Номбре, Блэк Крик Кэнал, Нью-Йорк, Бае, Андес и Лагуна Негра (Schmaljohn С , Hjelle В., 1997; Kanerva М. с соавт., 1998; Hjelle В., 1999; Peters J. с соавт., 1999).В последнее десятилетие отмечена (Онищенко Г. Г., 1997) значительная активизация природных очагов и увеличение заболеваемости ГЛПС на многих территориях Европейской части и Дальнего Востока России. В Дальневосточном регионе ГЛПС регистрируется в Амурской области, Хабаровском и Приморских краях и вызывается, в основном, вирусом Хантаан и реже вирусом Сеул (Слонова Р. А. с соавт., 1999; Tkachenko Е. с соавт., 1999).Высокую социальную и медицинскую значимость проблемы хантавирусных инфекций обусловливают их широкое распространение, высокие показатели заболеваемости людей, отсутствие специфических средств лечения и профилактики. Из-за клинического полиморфизма ГЛПС относится к числу трудно диагностируемых заболеваний, в связи с этим остается важной специфическая лабораторная диагностика этой инфекции (Ткаченко Е. А. с соавт., 2001). В настоящее время предложено несколько серологических тестов, которые, наряду с достоинствами, имеют и недостатки. Поэтому вопросы по созданию новых и совершенствованию известных методов сохраняют свою актуальность. В России для серодиагностики ГЛПС применяется коммерческий «Культуральный поливалентный диагностикум ГЛПС для непрямого МФА».Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) практически не применяется ввиду отсутствия коммерческих препаратов, что связано со сложностью получения высокоактивных стабильных гемагглютинирующих антигенов хантавирусов.К началу планирования работы в литературе по гемагглютинирующим свойствам хантавирусов и диагностической эффективности РТГА при ГЛПС имелись данные только зарубежных исследователей (Tsai Т. F. с соавт., 1984; Brummer-Korvenkontio М. с соавт., 1986; Okuno Y . с соавт., 1986; Dantas J. с соавт., 1987; Yang J., с соавт. 1988), которые показали наличие рН-зависимого гемагглютинина у эталонных штаммов хантавирусов, возможность использования его для серодиагностики ГЛПС и изучения антигенных связей хантавирусов. В связи со сложностью проведения способов получения антигенов для РТГА, предложенных Tsai и Okuno, вопросы по изучению гемагглютинирующих свойств хантавирусов и по разработке более простого и экономичного способа получения гемагглютинирующих антигенов сохраняли свою актуальность.Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение гемагглютинирующих свойств хантавирусов и получение специфичных антигенов для диагностики ГЛПС. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.1. Выявить условия формирования и накопления гемагглютининов при размножении штаммов хантавирусов in vitro.2. Изучить свойства гемагглютининов.3. Разработать экономичный способ получения высокоактивных и специфичных гемагглютинирующих антигенов.4. Оценить функциональную активность штаммов вируса Хантаан.5. Изучить возможности применения полученных антигенов в РТГА для специфической диагностики ГЛПС. Научная новизна и теоретическая значимость работы. Получены приоритетные данные по выявлению и свойствам гемагглютининов при сравнительном изучении гемагглютинирующих свойств штаммов хантавирусов, выделенных от больных ГЛПС и диких грызунов-природных резервуаров вируса. Впервые оценена функциональная активность штаммов вируса Хантаан, имеющего основное значение в этиологии заболевания ГЛПС на юге Дальнего Востока России, и отобраны функционально-активные штаммы для диагностикума хантавирусов. Впервые дана антигенная характеристика штаммов вирусов Хантаан, Сеул и Пуумала с помощью кинетической РТГА и предложенного показателя А. Полученные данные вносят вклад в изучение биологических свойств хантавирусов, а также в решение теоретических проблем медицинской вирусологии, и, прежде всего, в исследование механизмов действия оболочечных белков вирусов - возбудителей инфекционных заболеваний.Практическая значимость работы. Разработан экономичный способ получения гемагглютинирующих антигенов хантавирусов. Положительное решение НИИ Государственной патентной экспертизы о выдаче патента на изобретение «Способ получения диагностикума хантавирусов» (сентябрь 2001 года) дает основание рекомендовать производственное получение гемагглютинирующих антигенов хантавирусов для нужд практического здравоохранения.Результаты исследований вошли в методические указания «Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, обусловленная заражением от серой крысы-носителя вируса Сеул» (внедрены в октябре 2001 года). В разделе *В помощь вирусологу в журнале «Вопросы вирусологии» опубликованы статьи по использованию функционально активных штаммов хантавирусов для серодиагностики ГЛПС (№ 4/1999г.) и по применению кинетической РТГА для изучения антигенных взаимосвязей штаммов хантавирусов (№ 5/2000г.). Материалы диссертации использованы в учебном процессе на факультете повышения квалификации врачей-эпидемиологов ВГМУ. Апробация работы. Материалы диссертации представлены на научнопрактических конференциях: «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней» (Ставрополь, 1993), «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998), «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Ростов-на-Дону, 1999), «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 1999). Диссертация апробирована на заседании Ученого совета НИИЭМ СО РАМН 26 декабря 2001 года и рекомендована к защите.Исследования по гемагглютинирующим свойствам хантавирусов признаны Нью-йоркской Академией наук. После опубликования в журнале «Вопросы вирусологии» (№ 2/1995г.) статьи по выявлению и свойствам гемагглютининов хантавирусов автору пришло приглашение от ее президента (сентябрь 1995г.) стать Действительным членом этой Академии. Автором получен персональный Грант Губернатора Приморского края (декабрь 1999г.) за исследования по получению антигенно-активных гемагглютинирующих препаратов для создания эффективных диагностических тест-систем при хантавирусной инфекции.Материалы диссертации в виде 21 статьи и тезисов докладов опубликованы в журналах и трудах научных конференций, в том числе 11 - в центральной печати. За первым именем автора опубликовано 10 работ. Запатентован способ получения гемагглютинирующих антигенов хантавирусов.Основные положения, выносимые на защиту 1. Гемагглютинирующие свойства хантавирусов отличаются вариабельностью и зависят от источника изоляции штамма (больные ГЛПС и дикие грызуны), условий культивирования (культура клеток, сыворотка животного, температурный режим культивирования, сроки культивирования).2. На гемагглютинирующую активность штаммов хантавирусов влияют физико-химические факторы (обработка вирионов твин-80-эфиром и ацетонультразвуком, рН среды реакции гемагглютинации, температура хранения антигенов).3. Авторский способ получения стабильных гемагглютинирующих антигенов хантавирусов с высокой специфической активностью, позволяющей выявлять антигемагглютинины в сыворотках крови больных ГЛПС, обусловленной близкородственными вирусами Хантаан и Сеул, отличается от способа Окипо упрощением этапов концентрации, дезинтеграции и инактивации вируса, увеличением объема конечного продукта и сокращением времени получения антигенов.4. Эффективность применения РТГА при серологических исследованиях может быть повышена за счет использования в качестве диагностических препаратов гемагглютинирующих антигенов функционально-активных штаммов хантавирусов.5. Применение кинетической РТГА и предложенного показателя А позволяет проводить оценку степени антигенных различий не только разных хантавирусов, но также штаммов в пределах определенного хантавирусного типа.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРБ1

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кушнарева, Татьяна Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Получены приоритетные данные по выявлению гемагглютининов у штаммов хантавирусов, выделенных от больных ГЛПС и диких грызунов. Штаммы, выделенные от полевой и восточноазиатской мышей, продуцировали гемагглютинины в высоком титре (гемагглютинирующая активность антигенов 1:256-1:2048), в то время, как штаммы, изолированные от больных ГЛПС - в более низком титре (гемагглютинирующая активность антигенов 1:8-1:64). Как правило, штаммы, выделенные от основного вида грызуна-экологического хозяина, имели высокую гемагглютинирующую активность, в случае выделения «несвойственного» для данного вида грызуна хантавируса была отмечена низкая гемагглютинирующая активность изолятов. Это свидетельствует о том , что гемагглютинирующие свойства хантавирусов генетически детерминированы.

2. Получены данные по влиянию определенных условий культивирования зараженных хантавирусом клеток на накопление гемагглютининов в культуральной жидкости. Показано, что добавление в поддерживающую рост клеток среду фетальной телячьей сыворотки в количестве от 2 до 3.5% обеспечивало получение антигенов с более высокой гемагглютинирующей активностью. Максимальное накопление гемагглютининов (гемагглютинирующая активность антигенов 1:64-1:2048) отмечалось при культивировании в условиях 35°-37°С на 8-14 сутки. Установлены различные сроки максимального накопления гемагглютининов: для вируса Хантаан - 8-10 сутки, для вируса Сеул -10-12 сутки, для вируса Пуумала - 12-14 сутки.

3. Получены приоритетные данные по свойствам гемагглютининов. Обнаружены различия между хантавирусами по влиянию физико-химических факторов и изменений рН среды на их гемагглютинирующую активность. При этом установлено, что воздействие твин-80-эфира в 16-128 раз повышало гемагглютинирующую активность штаммов вируса Хантаан, а воздействие ацетон-ультразвука в 8-64 раза - штаммов вируса Пуумала. В более широком диапазоне рН (5.2-6.6) проявлялись гемагглютинирущие свойства штаммов, выделенных от полевой и восточноазиатской мышей, от рыжей и дальневосточной полевок. В более узкой зоне рН выявляли гемагглютинины штаммов, изолированных от больных.

4. Разработан и запатентован способ получения высокоспецифичных и стабильных гемагглютинирующих антигенов хантавирусов, отличающийся от прототипного тем, что концентрирование вируса в вируссодержащей культуральной жидкости проводят с помощью низкоскоростного центрифугирования в присутствии 7.5-8.5% полиэтиленгликоля, а гемагглютинирующую активность осажденных вирионов повышают с помощью обработки твин-80 и эфиром. Предлагаемый способ отличается упрощенной и экономичной технологией, что дает основание рекомендовать производственное получение диагно-стикума хантавирусов.

5. Впервые проведена оценка функциональной активности штаммов вируса Хантаан - основного возбудителя заболевания ГЛПС в Приморском крае. Выявлены штаммы с высокой (от полевой и восточноазиатской мышей) и низкой (от больных ГЛПС, красной и красно-серой полевок) функциональной активностью. Показано, что диагностическая эффективность РТГА при ГЛПС может быть повышена за счет использования антигенов функционально активных штаммов хантавирусов, что необходимо учитывать при конструировании диагностических препаратов.

6. Ранняя дифференциальная диагностика ГЛПС, обусловленной близкородственными вирусами Хантаан и Сеул, с помощью РТГА и гемагглютинирующих антигенов, полученных по предлагаемому способу, возможна при исследовании сывороток крови больных ГЛПС на 1-3 неделе от начала заболевания по 4-16 кратной разнице титров антигемагглютининов, полученных в реакциях с гемагглютинирующими антигенами этих вирусов.

7. Предварительную оценку антигенных взаимосвязей штаммов хантавирусов можно проводить в кинетической РТГА, которая, как показано, обла

120 дает более высокой специфичностью по сравнению с РТГА. Предложенный показатель А дает возможность оценить степень не только типовых, но и внут-ритиповых антигенных различий штаммов хантавирусов. Это позволит целенаправленно проводить дальнейшее изучение вновь выделенных штаммов с помощью более трудоемких и дорогостоящих молекулярно-генетических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Успех своевременной и достоверной диагностики хантавирусных заболеваний и изучения хантавирусов в значительной степени зависит от разработки новых и совершенствования рутинных методов исследования.

Трудности, связанные с выделением вируса от больных ГЛПС выдвигают на первое место серологические методы исследования. Это в свою очередь диктует необходимость решения вопроса о повышении функциональной активности антигенов, определяющих эффективность серологического теста.

Известно, что условия репродукции многих вирусов (вид клеточной культуры, состав питательной среды, доза заражения и т.д.) оказывают влияние на формирование гемагглютининов, а воздействие некоторых физических и химических факторов (ультразвук, твин, эфир, ацетон, температура и т.д.) влияют на функциональные свойства антигенного препарата и его стабильность. Упомянутые методы обработки являются ценным дополнением к поиску антигенно активных штаммов вирусов. Весьма актуальна в связи с этим разработка таких методов получения и использования антигенов, при которых максимально проявляются их функциональные характеристики.

Успешное выделение и культивирование хантавирусов (Lee Н. W. с соавт., 1978; French G. R. с соавт., 1981; McCormic J. В. с соавт., 1982), принадлежащих к семейству Буньявириде (White J. D. с соавт., 1982; Schmaljohn С. S. с соавт., 1983), позволило Т. F. Tsai с соавторами (1984), М. Brummer-Korvenkontio с соавторами (1986) и Y. Okuno с соавторами (1986) показать наличие рН-зависимого гемагглютинина у четырех прототипных штаммов хантавирусов и возможность использования его для серодиагностики ГЛПС и дифференциации хантавирусных типов в РТГА. В связи с тем, что на территории Приморского края установлена циркуляция нескольких хантавирусов (Слонова Р. А., 1993), мы поставили перед собой задачу выяснить возможность и условия накопления гемагглютининов в культуральной жидкости при их размножении in vitro и изучить некоторые свойства.

Как установлено нами, размножение штаммов хантавирусов, выделенных от больных ГЛПС и грызунов-носителей вируса, в культуре клеток Vero-Е6 сопровождается накоплением в среде культивирования гемагглютининов, способных связываться с рецепторами эритроцитов гуся. В нативной вируссо-держащей культуральной жидкости гемагглютинины в низком титре (1:2-1:16) выявляли у Хантаан-подобных штаммов, выделенных от диких грызунов. У остальных исследованных штаммов хантавирусов гемагглютинины выявляли только после дополнительной обработки культуральной жидкости. Полученные данные свидетельствуют о низком накоплении гемагглютининов в вирус-содержащей культуральной жидкости при размножении штаммов хантавирусов in vitro. Поэтому для получения гемагглютинирующих антигенов и изучения гемагглютинирующих свойств хантавирусов необходимо концентрирование вируссодержащего материала.

На основании полученных данных установлено, что гемагглютинирую-гцая активность варьирует как у штаммов, относящихся к разным хантавиру-сам, так и среди штаммов, принадлежащих к одному хантавирусному типу. Способностью к постоянной продукции гемагглютининов в высоком титре обладали Хантаан-подобные штаммы, выделенные от полевой мыши (гемагглю-тинирующая активность антигенов 1:512-1:2048) и от восточноазиатской мыши (гемагглютинирующая активность антигенов 1:256-1:1024). В то время, как штаммы, изолированные от больных ГЛПС, продуцировали гемагглютинины в невысоком титре (гемагглютинирующая активность антигенов 1:161:64). Как правило, высокая гемагглютинирующая активность отмечалась у штаммов, выделенных от основных видов грызунов-экологических хозяев хантавирусов, что свидетельствует о генетически детерминированном свойстве хантавирусов.

Клеточная культура Vero-Еб, как показали наши исследования, является чувствительной биологической системой, обеспечивающей высокий выход гемагглютининов при размножении штаммов хантавирусов, что согласуется с данными Y. Okuno с соавторами (1986).

В проведенных нами исследованиях показано влияние на формирование гемагглютининов сыворотки животного, добавляемой в поддерживающую рост клеток среду при размножении хантавирусов in vitro. Более высокий выход гемагглютининов в вируссодержащей культуральной жидкости отмечался при использовании фетальной телячьей сыворотки в количестве от 2 до 3.5%. Этот факт указывает на создание при этом одного из оптимальных условий для культивирования хантавирусов и накопления гемагглютининов.

Изучение оптимальных температурных зон формирования гемагглютининов хантавирусами in vitro представляет теоретический и практический интерес. Максимальное накопление гемагглютининов (гемагглютинирующая активность антигенов 1:64-1:2048) отмечалось при культивировании в условиях на 8-14 сутки. При температуре 32°С наблюдался замедленный синтез гемагглютининов (максимальное накопление в титре 1:16-1:256 отмечалось на 16-18 сутки). Полученные данные свидетельствуют об особенностях синтеза хантавирусов и необходимости соблюдения оптимального температурного режима культивирования для получения максимального выхода гемагглютининов.

Изучение динамики накопления гемагглютининов в культуральной жидкости при размножении хантавирусов в клеточной культуре Vero-Еб показало, что сроки максимального накопления гемагглютининов у хантавирусов различались: для вируса Хантаан установлены 8-10 сутки, для вируса Сеул - 10-12 сутки, для вируса Пуумала - 12-14 сутки. Выявленные между хантавирусами различия по срокам максимального накопления гемагглютининов необходимо учитывать при сборе вируссодержащего материала с целью получения высокоактивных гемагглютинирующих антигенов.

Методы получения вирусных гемагглютинирующих антигенов для РТГА обеспечивают экстракцию гемагглютининов из вируссодержащих тканей и, кроме того, заключаются в освобождении гемагглютинина от блокирующего его ингибитора. Y. Okuno с соавторами (1986) при получении гемагглютинирующих антигенов хантавирусов из культуральной жидкости с помощью ультрацентрифугирования использовал ацетон и ультразвук. При этом авторы отметили, что экстракция ацетоном полностью инактивировала инфекционный вирус, а последующая обработка ультразвуком повышала титр гемагглютининов хантавирусов в 2-8 раз, кроме того, гемагглютинирующие титры полученных антигенов повышались 2-4-х кратно при хранении в условиях - 80 С. Обработка клеточного лизата Vero-Еб с помощью твин-80 и эфира позволила М. Brummer-Korvenkontio с соавторами (1986) повысить гемагглютинирующую активность антигенов вируса Пуумала в 2-4 раза. Эти наблюдения показывают, что разрушение вирусных частиц хантавирусов важно для получения высокого титра гемагглютининов.

Как показали результаты наших исследований дезинтеграция вирионов (осажденных низкоскоростным центрифугированием в присутствии полиэти-ленгликоля) повышала их гемагглютинирующую активность в 2-128 раз. При этом для штаммов вируса Хантаан, за исключением штамма CRF-4450 от красно-серой полевки, более эффективной оказалась обработка твин-80-эфи-ром, для штаммов вируса Пуумала - ацетон-ультразвуком. В то же время для штаммов вируса Сеул оба метода дезинтеграции вирионов были эффективными.

К началу наших исследований в литературе имелись лишь единичные сведения о зависимости гемагглютинирующей активности хантавирусов от рН среды, и проведены они были с ограниченным набором штаммов. Т. F. Tsai с соавторами (1984) для штамма 76-118 вируса Хантаан установил оптимум рН в пределах 6.0-6.2. М. Brummer-Korvenkontio с соавторами (1986) у прототип-ного штамма вируса Пуумала и Y. Okuno с соавторами (1986) у четырех штаммов вирусов Хантаан, Сеул, Пуумала и Проспект Хилл выявляли самые высокие титры гемагглютининов при рН 5.8. Нами при исследовании штаммов хантавирусов, выделенных от больных ГЛПС и диких грызунов, были установлены различные зоны, в которых проявлялись их гемагглютинирующие свойства. В довольно широком диапазоне рН (5.4-6.6) выявлялись гемагглю-тинины у Пуумала-подобных штаммов. В группе Хантаан-подобных штаммов выявлены различия: у штаммов, выделенных от полевой мыши, гемагглюти-нины выявляли в широком диапазоне рН (рН 5.2-6.4), в то время как у штаммов, изолированных от красной полевки (штамм CRT-4959) и больного ГЛПС (штамм Р-4642), зона рН, при которой удавалось выявить гемагглютинины, была узкой (рН 5.6-5.8). Несмотря на различные зоны рН среды, в которых проявлялись гемагглютинирующие свойства хантавирусов, максимальный титр гемагглютининов у всех исследованных штаммов выявлялся при рН 5.75.

Судя по нашим данным, высокой стабильностью по сохранению гемагг-лютинирующей активности отличались гемагглютинирующие антигены штаммов вируса Хантаан. Так, антигены штаммов от полевой мыши сохраняли высокие титры гемагглютининов при хранении в условиях -18°С в течение 2-х лет и более, при хранении в условиях +4 С - 6 месяцев и более, при комнатной температуре - около месяца. Не отмечено существенных различий между стабильностью жидких и лиофилизированных антигенных препаратов. Для сравнения, гемагглютинирующие антигены вирусов Хантаан и Сеул, полученные Y. Okuno с соавторами (1986) из культуральной жидкости с помощью ультрацентрифугирования и обработки ацетон-ультразвуком, сохраняли свою активность при +4°С в течение трех недель. По всей вероятности, на стабильность гемагглютинирующих антигенов оказывает влияние способ их получения.

Известен способ получения гемагглютинирующих антигенов хантавирусов из вируссодержащей культуральной жидкости, предложенный Y. Okuno с соавторами (1986). Однако, из-за трудоемкости получения и невысокой стабильности антигенов данный способ применяется только в исследовательской практике. Для широкого использования РТГА при ГЛПС необходимо было упростить технологический процесс получения антигенов, увеличить объем выхода гемагглютининов и повысить стабильность антигенных препаратов.

Согласно предложенной нами схеме, антигены хантавирусов получали из вируссодержащей культуральной жидкости (с учетом сроков максимального накопления гемагглютининов) с помощью низкоскоростного центрифугирования в присутствии 7.5-8.5% ПЭГ и последующей обработки твин-80-эфиром. Использование полиэтиленгликоля для концентрации вируса в исходном материале позволяло осадить вирионы менее трудоемким способом (без применения ультрацентрифугирования), что значительно упростило технологию получения культуральных гемагглютинирующих антигенов. Однако осадки вирионов хантавирусов обладали низкой гемагглютинирующей активностью. Для дезинтеграции вирионов применили более щадящий способ, по сравнению с обработкой ацетоном и ультразвуком, обработку твин-80 и эфиром, которая в 4-128 раз повышала гемагглютинирующую активность вирионов, инактивировала инфекционный вирус и, кроме того, способствовала стабильности препаратов по сохранению гемагглютинирующей активности в течение длительного времени. Это дает возможность использовать полученные по предлагаемому нами способу гемагглютинирующие антигены в диагностических исследованиях.

Полученные гемагглютинирующие антигены вирусов Хантаан, Сеул и Пуумала имели титр 1:16-1:2048 (в отличие от исходных вируссодержащих культуральных жидкостей, имевших титр 1:2-1:16) и обладали высокой стабильностью, сохранясь без существенного изменения в титре более 12 месяцев при хранении в условиях - 18°. Специфичность и чувствительность гемагглютинирующих антигенных препаратов была оценена при параллельном титровании сывороток крови больных ГЛПС и реконвалесцентов и здорового населения из разных районов края, а также сывороток крови диких грызунов и иммунных животных в РТГА и МФА.

Известно, что активность гемагглютинирующих антигенов в серологических реакциях зависит от ряда условий, в том числе от исходного материала накопления гемагглютининов и способа получения антигена. Сравнительная оценка специфической активности культуральных антигенов, полученных по способу Okuno и нашему способу, была проведена в кинетической РТГА с использованием гомологичной иммунной сыворотки. При этом культуральный антиген, полученный по нашему способу (твин-эфирная дезинтеграция ви-рионов вместо ацетон-ультразвуковой) оказался более активным при выявлении антигемагглютининов. Не исключено, что обработка антигена ацетоном и ультразвуком, в большей степени изменяет его антигенные детерминанты, снижая способность более полно и быстро реагировать со специфическими рецепторами антител, поэтому гемагглютинирующий антиген, полученный по нашему способу, оказался более активным при выявлении антигемагглютининов. Эти наблюдения свидетельствуют о высокой чувствительности оболочеч-ных белков хантавирусов к физико-химическим воздействиям.

Среди биологических свойств вирусов особый интерес представляет антигенная структура и связанная с ней активность вирусных антигенов, определяющая характер взаимодействия со специфическими антителами. Предварительное изучение антигенной активности штаммов вируса Хантаан в РТГА с иммунной сывороткой, полученной к штамму АА-10508, обладающему выраженной иммуногенностью, показало, что активность гемагглютининов штаммов одного антигенного типа хантавирусов в идентичных условиях постановки реакции различна и в значительной степени зависит от штаммовых особенностей вируса. При этом установлено, что для максимального выявления антигемагглютининов в исследуемых сыворотках крови достаточно 4 часов контакта при +4°С между антигеном и антителом (вместо 18 часов), что значительно сокращает время проведения РТГА и получения результатов.

Функциональная активность исследуемых штаммов была оценена в кинетической РТГА с использованием набора иммунных сывороток по показателю F. Функционально-активные штаммы (7^-штаммы) с высоким значением показателя F (F = 50.72-60.37) изолированы от полевой и восточноазиатской мышей. К низкофункциональным штаммам (/^-штаммы) отнесены штаммы, изолированные от больных ГЛПС, имевшие значения показателя F от 24.26 до 36.24. Полученные данные свидетельствуют, что циркулирующие в очагах ГЛПС штаммы, антигенно сходные с вирусом Хантаан, отличаются по функциональной активности, что необходимо учитывать при конструировании диагностических препаратов.

Следует отметить, что диагностические возможности РТГА при ханта-вирусной инфекции еще полностью не раскрыты. Мы применили несколько способов, позволивших повысить эффективность РТГА при диагностике хантавирусных инфекций и изучении антигенных взаимосвязей штаммов хантавирусов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кушнарева, Татьяна Валерьевна, Владивосток

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции // Мол. генетика, микроб, и вирусол. 1993. - № 4. - С. 3-8.

2. Астахова Т.И., Слонова Р.А., Компанец Г.Г. Подходы к выбору штамма вируса Хантаан для разработки инактивированной мозговой вакцины // Вопр. вирусол,- 1997.-№3,-С. 105-108.

3. Башкирцев В.Н., Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Рыльцева Е.В. Выделение штаммов вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Вопр. вирусол. 1984. - № 4. - С. 497-502.

4. Букринская А.Г., Кицак В.Я., Федорова Ю.Б., Бебешко В.А. Методы экспресс-диагностики вирусных инфекций. Индикация вирусов // Метод, рекомендации М., 1984. - 58 с.

5. Верета Л.А., Мжельская Т.В., Воронкова Г.М. Иммунологическая и зооло-гопаразитологическая характеристика эпизоотий геморрагической лихорадки с почечным синдромом в природных очагах Приамурья // Вопр. вирусол. 1983.-№3.-С. 351-355.

6. Воронкова Г.М. Разработка и применение реакции непрямой гемагглютинации в исследованиях при геморрагической лихорадки с почечным синдромом: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Москва, 1980. - 18 с.

7. Ворошилова М.К., Жевандрова В.И., Балаян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М.: Наука, 1964. - С. 148-157.

8. Вотяков В.И., Протас И.И., Жданов В.М. Западный клещевой энцефалит. -Минск: Наука, 1978.

9. Гайдамович С.Я., Обухова В.Р., Мельникова Е.Э. Использование ультразвука для повышения активности арбовирусных антигенов в серологических реакциях in vitro // Вопр. вирусол. 1973. - № 3. - С. 356-360.

10. Гайдамович С.Я. Новые пути лабораторной диагностики вирусных инфекций // Вирусные инфекции: Сб. науч. тр. Свердловск, 1976. - С. 86-90.

11. Гайдамович С.Я., Клисенко Г.Я., Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Резапкин Г.В. Реакция непрямой гемагглютинации для индикации вируса ГЛПС и лабораторной диагностики заболевания // Вопр. вирусол. 1984. - № 1. - С. 82-86.

12. Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., Липская Г.В. Генетическая дифференциация хантавирусов с помощью полимеразной цепной реакции и секвениро-вания // Вопр. вирусол. 1996. - № 1. - С. 24-27.

13. Донец М.А., Резапкин Г.В., Королев М.Б., Ткаченко Е.А. Вирус-возбудитель геморрагической лихорадки с почечным синдромом новый представитель семейства Bunyaviridae // Вопр. вирусол. - 1989. - № 3. - С. 330-334.

14. Здродовский П.Ф., Соколов И.И. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. М.: Медицина, 1965. - 592 с.

15. Зубенко А.В., Субботина Л.С. Антигенная активность штаммов вируса клещевого энцефалита // Диагностика и профилактика вирусных инфекций: Сб. науч. тр. Свердловск, 1974 - С. 140-147.

16. Иванов А.П. Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций: Автореф. дис. д-ра мед. наук. - М., 1994. - 62 с.

17. Иванов А.П., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. Дот блот анализ в лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Вопр. вирусол. - 1996. - № 1. - С. 6-8.

18. Калчурина А.А., Каныгина Е.А., Слепушкина В.Г. Получение гемагглютинирующих антигенов парагриппозных вирусов // Вопр. вирусол. 1969. -№ 4. - С. 497-500.

19. Колотвинов С.В., Масленникова В.А. Метод оценки функциональной активности вирусных антигенов // ЖМЭИ. 1980. - № 8. - С. 58-61.

20. Кокорев С.В., Серебрякова Т.А. Методы повышения диагностической ценности реакции подавления гемагглютинации при клещевом энцефалите // ЖМЭИ. 1970.-№ 11.-С. 103-107.

21. Кокорев B.C., Федотова Т.Т. Показатель степени авидности антигенов, антител и ингибиторов // Вопросы этиологии, эпидемиологии, патогенеза и диагностики вирусных заболеваний: Сб. науч. тр. Свердловск, 1972. - С. 149-152.

22. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1980. - С. 283.

23. Леонова Г.Н., Кругляк С.П., Рыбачук В.Н., Гуляева С.Е., Баранов Н.И. Клинико-эпидемиологические особенности клещевого энцефалита в Приморском крае // ЖМЭИ. 1987. - № 12. - С. 40-44.

24. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае. Владивосток: Дальнаука, 1997,- 190 с.

25. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина, 1989.

26. Маргонин Р.Д., Голиков В.Ф. Реакция непрямой гемагглютинации в вирусологических исследованиях // Полиомиелит в условиях массовой вакцинации. Неполиомиелитные энтеровирусные инфекции: Сб. науч. тр. Свердловск, 1975.-С. 169-185.

27. Методы лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Метод, рекомендации. М., 1982. - 22с.

28. Методы стимуляции репродукции арбовирусов в клеточных культурах и повышения активности антигенных препаратов // Метод, рекомендации. -Омск, 1985,- 37 с.

29. Никоноров Ю.М, Филатова О.В, Беньковская Г.В. Кодирующая стратегия хантавирусов // Мат. науч. конф. «Актуальные проблемы медицинской вирусологии». М., 1999.-С. 75.

30. Носков Ф.С., Вершинский Б.В., Беляев А.Е. Результаты и перспективы применения иммунологических методов при изучении и диагностике геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Труды Ин-та им. Пас-тера. Л., 1983. - Т. 60. - С. 14-26.

31. Онищенко Г.Г. Заболеваемость вирусными инфекциями в Российской федерации // Вопр. вирусол. 1997. - № 4. - С. 148-152.

32. Осипова Е.Г., Тымчишин П.Н. Сравнительное изучение действия детергентов на вирус клещевого энцефалита // Вирусные и бактерийные препараты: Сб. науч. тр. Томск, 1983. - Т. 32. - С. 26-32.

33. Розен Л. Гемагглютинация, вызываемая вирусами животных // В кн.: Методы вирусологии и молекулярной биологии: Пер. с англ.- М.: Мир, 1972. -С. 219-229.

34. Салтов М.Х., Бейсембаева Р.У., Асанова С.Е. Эффективный стабилизатор для приготовления антительных эритроцитарных диагностикумов к вирусам гриппа А и В // Вопр. вирусол. 1986. - № 6. - С. 674-679.

35. Семенов Б.Ф., Степанов Г.М. Применение кинетической реакции подавления гемагглютинации для изучения штаммов вируса из группы клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 1966. - № 6. - С. 717-721.

36. Слонова Р.А., Астахова Т.Н., Косой М.Е. Изучение геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе новых методических подходов // Бюл. Сибирского отделения АМН СССР. 1982. - № 1. - С.9-13.

37. Слонова Р.А., Астахова Т.И., Косой М.Е. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Приморском крае // Вопр. вирусол. 1983. - № 1. - С. 82-86.

38. Слонова Р.А., Астахова Т.И., Ткаченко Е.А., Дзагурова Е.К. Серотипы хантавирусов, циркулирующие в очагах Дальнего Востока России // Вопр. вирусол. 1990.-№ 5.-с. 391-393.

39. Слонова Р.А. Итоги изучения геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Приморском крае // Юбил. сб. Владивостокского НИИЭМ, посвященный 50-летию института. Владивосток, 1991. - С. - 114-124.

40. Слонова Р.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом на юге Дальнего Востока России (Вирусологические и эколого-эпидемиологические аспекты): Дис. . д-ра мед. наук. М., 1993. - 253 с.

41. Смородинцев А.А., Алтшулер И.С., Дунаевский М.И., Киселев М.В., Чури-лов А.В., Даршкевич В. Этиология и клинические наблюдения за геморрагическим нефрозо-нефритом. -М: Медгиз, 1944. С. 26-47.

42. Ткаченко Е.А. Специфическая лабораторная диагностика, этиология и распространение геморрагической лихорадки с почечным синдромом.: Авто-реф. Дис. . д-ра мед. наук. М., 1988. - 266 с.

43. Ткаченко Е.А., Дроздов С.Г., Федоров Ю.М. Хантавирусы и хантавирусные инфекции // Мат. науч. конф. «Актуальные проблемы медицинской вирусологии».-М., 1999.-С. 88.

44. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Миме С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. Биология вирусов животных: Пер. с англ. М.: Мир, 1977. - Т. 1. - С. 78-80.

45. Филипсон JI. Применение в вирусологии фазовых систем, образуемых водными растворами полимеров // В кн.: Методы вирусологии и молекулярной биологии: Пер. с англ.-М.: Мир, 1972. С. 89-104.

46. Фогг П. Обнаружение вирусных антигенов при помощи иммунофлюорес-ценции // В кн.: Методы вирусологии и молекулярной биологии: Пер. с англ.- М.: Мир, 1972. С. 253-262.

47. Хейлб К. Реакция нейтрализации вирусов // В кн.: Методы вирусологии и молекулярной биологии: Пер. с англ.- М.: Мир, 1972. С. 230-237.

48. Шмидт Н. Анализ вирусных антигенов и антител при помощи реакции связывания комплемента // В кн.: Методы вирусологии и молекулярной биологии: Пер. с англ. М.: Мир, 1972. - С. 208-218.

49. Эльберт Л.Б., Бреслер С.У., Флоров Г.Н. Нехроматографические методы концентрирования вируса клещевого энцефалита // Вирусные и бактерийные препараты: Сб. науч. тр. Томск, 1983. - Т. 32. - С. 19-25.

50. Antic D., Lim B.Y., Kang C.Y. Nucleotide sequence and coding capacity of the large (L) genome RNA segment of Seoul 80-39 virus, a member of the Hantavirus genus // Virus. Res. 1991a. - Vol. 19. - P. 59-66.

51. Antic D., Kang C.Y., Spik K., Schmaljohn C.S., Vapalahti O., Vaheri A. Comparison of the deduced gene products of the L, M, and S genome segments of hantaviruses // Virus. Res. 1992. - Vol. 24. - P. 35-36.

52. Ardoin P., Clarke D.H. The use of sonication and of calcium phosphate chromatography for preparation of group С arbovirus hemagglutinins // Am. J. Trop. Med. and Hyg. 1967. - Vol. 16. - P. 357-363.

53. Aricawa J., Takashima I., Hashimoto N. Cell fusion by haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) viruses and its application for titration of virus infectivity and neutralizing antibody // Arch. Virol. 1985. - Vol. 86. - P. 303313.

54. Aricawa J., Schmaljohn A. L., Dalrymple J. M. and Schmaljohn C. S. Characterization of Hantaan virus envelope glycoprotein antigenic determinants defined by monoclonal antibodies // J. Gen. Virology. 1989. - Vol. 70. - P. 615-624.

55. Aricawa J., Yao J.S., Yoshimatsu K. Protective role of antigenic site on the envelope protein of Hantaan virus defined by monoclonal antibodies // Arch. Virology. 1992.-Vol. 126.-P. 271-281.

56. Avsic-Zupanc Т., Xiao S.Y., Stojanovic R., Gligic A., van der Groen G., LeDuc J.W. Characterization of Dobrova virus: a hantavirus from Slovenia // J. Med. Virology. 1992.-Vol. 38.-P. 132-137.

57. Avsic-Zupanc Т., Toney A., Anderson K., Chu Y.K., Schmaljohn C.S Genetic and antigenic properties of Dobrova virus: a unique member of the Hantavirus genes, family Bunyaviridae // J. Gen. Virology. 1995. - Vol. 76. - P. 28012808.

58. Avsic-Zupanc Т. Hantaviruses and hemorrhagic fever with renal syndrome in the Balkans // In book «Factors in the Emergence and Control of Rodent-Borne Viral Disease (Hantaviral and Arenal Diseases)». France: Elsevier, 1999. P. 93-98.

59. Avsic-Zupanc Т., Petrovec M., Furlan P., Kaps R., Elgh F., Lundkvist A. Hemorrhagic fever with renal syndrome in the Dolenjska region of Slovenia A ten - years survey // Clin. Infect. Dis. - 1999a. - Vol. 28. - P. 860-865.

60. Chappel W.A., Halonen P.E., Tode R.F., Calisher C.H., Chester L. Preparation of La Crosse virus hemagglutinating antigen in BHK-21 suspention cell cultures // Appl. Microbiol. 1969. - Vol. 18. - P. 433-437.

61. Chen Li-Li, Wang Hong-Xi, Gu Xian-Shi. Early diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome by IgM ELISA technique // J. Chin. Med. 1987. - Vol. 100. - P. 402-405.

62. Chen S.Y., Hang C.S., Li Y.Y., Lang M.F., Qou H.L., Song G. Detection of Hantaviruses with cDNA probe made from M genome segment recombinant of

63. R22 strain // Abstracts of proceeding of Int. Symp. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Hubei, China, 1988. - P. 91-92.

64. Chen S.Y., Hang C.S., Li Y.Y., Lang M.F., Song G. Expression of the small genome fragment of Hantaan virus in E. coli // Abstracts of proceeding of Int. Symp. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Hubei, China, 1988. - P. 93.

65. Chishikov Y.E., Spiropoulou C.F., Morzunov S.P., Monroe M.C., Peters C.J., Nichol S.T. Complete genetic characterization and analysis of isolation of Sin Nombre virus // J. Virology. 1995. - Vol. 69. - P. 8132-8136.

66. Chu Y.K., Rossi C., Le Due J., Lee H.W., Schhmaljohn C. S. and Dalrymple J. M. Serological relationships among viruses in the Hantavirus genus, family Bunyaviridae // Virology. 1994. - Vol. 198. - P. 196-204.

67. Chumakov M.P. Studies of virus haemorrhagic fevers // J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. 1963. - Vol. 7. - P. 125-135.

68. Chumakov M. P., Gavrilovskaya I. N. Are the two serotypes of the agent of hemorrhagic fever with renal syndrome // Lancet. 1980. - № 8196. - P. 690691.

69. Clarke D.H., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination inhibition with artropod borne viruses // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1958. - Vol. 7.-P. 561-573.

70. Clement G., Leirs H., McKenna P. Diagnosing West -European NE-cases with a simple high density particle agglutination (HDPA) test // Abstracts of 2nd Int. Conf. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Peking, China, 1992. - P. 5.

71. Dalrymple J., Hasty S., Harrison S., Schmaljohn C.S. Partial characterization of Hantaan virus // Abstracts of 5th Int. Conf. «Compar. Virology». Canada, 1982. -P.117-117.

72. Desmyter J., LeDuc J.W., Johnson K.M., Brasseur F., Decker C., van Ypersele de Strihou A. Laboratory rat associated outbreak of haemorrhagic fever with renal syndrome due to Hantaan-like virus in Belgium // Lancet. 1983. - Vol. 2. -P. 1445-1448.

73. Dzagurova Т., Tkachenko E., Slonova R., Ivanov L., Ivanidze E., Markeshin S., Dekonenko A., Niklasson В., Lundkvist A. Antigenic relationship of hantavirus strains analysed by monoclonal antibodies // Arch. Virology. 1995. - P. 17631773.

74. Elgh F., Linde K., Norrman B. Latex-based microparticle agglutination test for rapid serological diagnosis of acute Hantavirus disease // Abstracts of 4th Int. Conf. «HFRS and Hantaviruses». Atlanta, USA, 1998. - P. 50.

75. Elliot L.H., Kiley M.P., McCormic J.B. Hantaan virus: identification of virion proteins // J. of Gen. Virology. 1984. - Vol. 65. - P. 1285-1293.

76. Elliott L. H. Molecular biology of the Bunjaviridae // J. Gen. Virol. 1990. -Vol. 71.-P. 501-522.

77. Elliott L.H., Ksiazek T.G., Rollin P.E., Spiropoulou C.F., Morzunov S., Monroe M., Goldsmith C.S., Humphrey C.D., Zaki S.R., Krebs J.W., Maupin G., Gage

78. К., Childs J.Е., Nichol S.T., Peters C.J. Isolation of the causative agent of Hantavirus Pulmonary syndrome // Am. J. Trop. Med. 1994. - Vol. 51. - P. 102-108.

79. Franko M.C., Gibbs C.J.Jr., Lee P.W., Gajdusek D.K. Monoclonal antibodies specific for Hantaan virus // Proc. Nat. Acad. Science. 1983. - Vol. 80. - P. 4149-4153.

80. French C.R., Foukle R.S., Brand O.A., Eddy G.A., Lee H.W., Lee P.W. Korean hemorrhagic fever: propagation of the etiologic agent in a cell line of human origin // Science. 1981. - Vol. 211. - P. 1046-1048.

81. Giebbel L.B., Zoller L., Bautz E.K.F., Darai G. Rapid detection of genome variations in different strains of hantaviruses by polymerase chain reactiontechniques and nucleotide sequence analysis // Virus. Res. 1990. - Vol. 16. -P.127-136.

82. Goldgaber D., Lee P.W., Gibbs C.J., Gajdusek D.C. Quantitation of Hantaan virus infectivity, antigen and antibody by immunoenzyme methods // Abstracts of the 1st Int. Symp. «Public Health in Asia and Pacific Basin». Honolulu, Hawaii, 1983.-P. 94-94.

83. Goldgaber D., Gibbs C.J., Gajdusek D.C., Svedmyr A. Definition of three serotypes of hantaviruses by a double sandwich ELISA with biotin-avidin amplification system // J. Gen. Virology. 1985. -Vol. 66. - P. 1736-1740.

84. Groen J., van der Groen G., Hoofd G. Comparison of different enzyme-linked immunosorbent assay and immunofluorescence techniques for the serology of hantavirus infections // Abstracts of 29th Int. Coll. «Hantavirus». Antwerp, 1987.-P. 27.

85. Halonen P.E., Stewart J.A., Hall A.D. Rubella hemagglutinin prepared in serum free suspension culture of BNK-21 cells // Ann. Med. Exp. Biol. Fen. 1967. -Vol. 45.-P. - 182-185.

86. Hjelle В., Chazer-Giles F., Torrez-Martinez N., Asker M., Jenison S. Dominant glycoprotein epitope of Four Corners hantavirus is conserved across a wide geographical area // J. Gen. Virology. 1994. - Vol. 75. - P. 2881-2888.

87. Hjelle В., Jenison S., Torres-Martinez N., Herring В., Quan S., Polito A. Rapid and specific of Sin Nombre virus antibodies assay suitable for field diagnosis // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 600-608.

88. Hjelle Brian. Hantaviruses and Hantavirus cardiopulmonary syndrome in the Americas // In book: Factors in the Emergence and Control of Rodent-Borne Viral Disease (Hantaviral and Arenal Diseases). France: Elsevier, 1999. P. 5562.

89. Inouye S., Matsuno S., Kono R. Difference in antibody reactivity between complement fixation and immune adherence hemagglutination tests with virus antigens //J. Clin. Microbiol. 1981.-Vol. 14.-P. 241-246.

90. Kamrud K.I., Schmaljohn C.S. Expression strategy of the M genome segment of Hantaan virus 11 Virus. Res. 1994. - Vol. 31. - P. 109-121.

91. Kanerva M., Mustonen J., Vaheri A. Pathogenesis of Puumala and other hantavirus infections // Rev. Med. Virology. 1998. - Vol. 8. - P. 67-86.

92. Kang C.Y. Molecular genetics and replication strategy of hantaviruses // Abstracts of 3rd Int. Conf. «HFRS and Hantaviruses». Helsinki, Finland, 1995.-P. 22.

93. Kingsford L., Ishizava L.D., Hill D.W. Biological activities of monoclonal antibodies reactive with antigenic sited mapped on the G1 glycoprotein of La Cross virus // Virology. 1983. - Vol. 129. - P. 443-455.

94. Ksiazek T.G., Peters C.J., Rollin P.E. Identification of a new North American hantavirus that causes pulmonary insufficiency // J. Trop. Med. Hyg. 1995. -Vol. 52.-P. 117-123.

95. Kurata Т., Tsai Т., Bauer S.P., McCormick J.B. Immunofluorescence studies of disseminated Hantaan virus infection of suckling mice // Infect, and Immunol. 1983. - Vol. 41. - P. 391-398.

96. Lee H.W., Lee P.W., Johnson K.M. Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever // J. Infect. Dis. 1978. - Vol. 137. - P. 298-308.

97. Lee H.W., Lee P.W., Laehdevirta J., Brummer-Korvenkontio M. Etiological relation between Korean hemorrhagic fever and Nephropathia epidemica // Lancet. 1979. - Vol. 1. - P. 186-187.

98. Lee H.W., Baek L.J., Johnson K.M. Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever, from urban rats // J. Infect. Dis. 1982. -Vol. 146.-P. 638-644.

99. Lee H.W. Hantavirus infection in Asia // Nephrology. 1988. - Vol. 2. - P. 816-831.

100. Lee H.W. Hemorrhagic fever with renal syndrome in Korean // J. Infect. Dis. 1989.-Vol. 11.-P. 864-876.

101. Lee H.W., Dalrymple J.M. Manual of Hemorrhagic fever with renal syndrome. WHO Collaborating Centre forVirus Reference and Reseach (HFRS), Institute for Viral Diseases, Korea University. Korea, Seoul, 1989. 137 p.

102. Lee H. W., van der Groen G. Hemorrhagic fever with renal syndrome // Prog. Med. Virology. 1989. - Vol. 36. - P. 62-102.

103. Lee P. W., Amyx H. L., Gibbs G. J. Jr., Gajdusek D. C. and Lee H. W. Propagation of Korean hemorrhagic fever virus laboratory rats // Infection and Immuniti. 1981.-Vol. 31.-P. 334-338.

104. Lee P.W., Goldgaber D., Gibbs C.J., Gajdusek D.C., Yanagihara R.T., Svedmyr A., Hlaca D., Vesenjak-Hirlan J., Gligic A. Other serotypes of hemorrhagic fever with renal syndrome viruses in Europe // Lancet. 1982. -Vol. 2.-P. 1405-1406.

105. Lee P.W., Amyx H.L., Yanagihara R., Gajdusek D.C., Goldgaber D., Gibbs C-.J. Partial characterization of Prospect Hill virus isolated from meadow voles in the United States // J. Infect. Dis.- 1985. Vol. 152. - P. 826-829.

106. Lee P.W., Gibbs C.J., Gajdusek D.C., Yanagihara P. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization test // J. Clin. Microbiol. 1985. - Vol. 22. - P. 940-944.

107. Levis S., Morzunov S.P., Rowe J.E., Enria D., Pini N., Caideron G. Genetic diversity and epidemiology of hantaviruses in Argentina // J. Infect. Dis. -1998. Vol. 177.-P. 529-538.

108. Lundkvist A., Niklasson A. Bank vole monoclonal antibodies against Puumala virus envelope glycoproteins: identification of epitopes involved in neutralization // Arch. Virol. 1992. - Vol. 126. - P. 93-105.

109. Lundkvist A., Horling J., Bjorsten S., Niklasson A. Sensitive detection of hantaviruses by biotin-streptavidin enhanced immunoassays based on Bank vole monoclonal antibodies // J. Virol. Meth. - 1995. - Vol. 52. - P. 75-86.

110. Martin M.L., Regnery H.L., Sasso D.R., McCormic J.B., Palmer E.L. Distinction between Bunyaviridae genera by surface structure and comparison with Hantaan virus using negative stain electromicroscopy // Arch, virology. -1985.-Vol. 86.-P. 17-28.

111. McCormick J.B., Sasso D.R., Palmer E.L., Kiley M.P. Morphological identification of the agent of KHF (Hantaan virus) as a member of the Bunyaviridae // Lancet. 1982. - Vol. 1. - P. 765-768.

112. Meegan J., LeDuc J., Zheng Z.M., Xiao S., Lee H.W., Huggins J. Rapid diagnosis of HFRS using Enzyme-linked immunosorbent assays // Abstracts of proceeding of Int. Symp. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Hubei, China, 1988. - P. 51.

113. Musser G.G., Carleton M.D. Family Muridae // Mammal Species of the World. Washington, 1993. P. 501-755.

114. Nichol S.T. Genetic analysis of hantaviruses and their host relationships // In book «Factors in the Emergence and Control of Rodent-Borne Viral Disease (Hantaviral and Arenal Diseases)». France: Elsevier, 1999. P. 99-102.

115. Niklasson В., Kjellson T. Detection of Nephropathia epidemica (Puumala virus) specific immunoglobulin M by enzyme-linked immunosorbent assay //J.Clin. Microbiol. - 1988.-Vol. 26.-P. 1519-1523.

116. Niklasson B. The diagnostic problems of HFRS // Abstracts of 2nd Int. Conf. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Beijing, China, 1992. - P. 10.

117. Papa A., Johnson A.M., Stockton P.C., Bowen M.D., Spiropoulou C.F., Alexiou-Daniel S., Ksiazek T.G., Nichol S.T., Antoniadis A. Retrospective and genetic study of the distribution of hantaviruses // J. Med. Virology. -1998.-Vol. 55.-P. 321-327.

118. Parrington M.A., Kang C.Y. Nucleotide sequence analysis of the S genomic segment of Prospect Hill virus. Comparison with the prototype hantavirus // Virology. 1990.-Vol. 175.-P. 167-175.

119. Parrington M.A., Lee P.W., Kang C.Y. Molecular characterization of the Prospect Hill virus M RNA segment: A comparison with the M RNA segments of other hantaviruses // J. Gen. Virology. 1991. - Vol. 72. - P. 1845-1854.

120. Peters C.J., Simpson G.L., Levy H. Spectrum of hantavirus infection hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome // Annual Rev. Med. 1999. - Vol. 50. - P. 531-545.

121. Plyusnin A., Vapalahti O. and Lankinen H. Tula virus: a newly detected hantavirus carried by European common voles // J. Virology. 1994. - Vol. 68.-P. 7833-7839.

122. Plyusnin A., Vapalahti O., Lundkvist A., Henttonen H., Vaheri A. Hantaviruses in Europe: an overview // In book «Factors in the Emergence and Control of Rodent-Borne Viral Disease (Hantaviral and Arenal Diseases)». France: Elsevier, 1999. P. 85-91.

123. Puthavathana P., Lee H.W., Kang 'C. Typing of hantaviruses from five continents by polymerase chain reaction // Virus. Res. 1992. - Vol. 26. - P. 1-14.

124. Qiu J., Hang C., Dong Z., Song G. RNA detection for Hantavirus in clinical sera of hemorrhagic fever with renal syndrome with reverse transcription -Nested PCR // Abstracts from 4th Int. Conf. «HFRS and Hantaviruses». -Atlanta, USA, 1998.-P. 51.

125. Reed L.J., Muench H.A. A simple method for estimating fifty percent endpoints // Am. J. Hyg. 1938. - Vol. 27. - P. 493-497.

126. Ren Ke. Establishment and application of SP-RPHA and SP-RPHI for specific diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) // Abstracts of 2nd Int. Conf. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Beijing, China, 1992,- P. 127.

127. Rosen L. Hemagglutination with animal viruses // Fundamental techniques in Virology. N. Y.: K. Habel and N. P. Salzman, 1969. - P. 276.

128. Schhmaljohn C. S., Dalrymple J.M. Analysis of Hantaan virus RNA: evidence for a new genus of Bunyaviridae // Virology. 1983. - Vol. 131. - P. 482491.

129. Schmaljohn C.S., Hasty S.E., Harrison S.A., Dalrymple J.M. Characterization of Hantaan virions, the prototype virus of hemorrhagic fever with renal syndrome // J. Infect. Dis. 1983. - Vol. 148. - P. 1005-1012.

130. Schmaljohn C.S., Jennings G.B., Hay J., Dalrymple J.M. Coding strategy of the S genome segment of Hantaan virus // Virology. 1986. - Vol. 155. - P. 633-643.

131. Schmaljohn C.S., Schmaljohn A.L., Dalrymple J.M. Hantaan virus M RNA: coding strategy, nucleotide sequence and gene order // Virology. 1987. -Vol. 157.-P. 31-39.

132. Schmaljohn C.S., Chu Y.K, Schmaljohn A., Dalrymple J.M. Antigenic subunits of Hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virus recombinants // J. Virol. 1990. - Vol. 64. - P. 3262-3270.

133. Schmaljohn C.S. Nucleotide sequence of the L genome segment of Hantaan virus // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P. 6722-6728.

134. Schmaljohn C., Hjelle B. Hantaviruses: a global disease problem // Emerg. Infect. Dis. 1997. - Vol. 3. - P. 95-104.

135. Shang G., Yang W., Guan D., Hang C. Research of hantavirus gene from patients with hemorrhagic fever with renal syndrome // Abstracts of 2nd Int.Conf. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Beijing, China, 1992. -P. 21.

136. Sheshberadan H., Niklasson В., Tkachenko E. Antigenic relationship between Hantaviruses analyzing by immunoprecipitation // J. Gen. Virol. 1988. -Vol. 69.-P. 2645-2651.

137. Shope R.E., Sather G.E. Arboviruses // In book: Diagnostic procedures for viral, rickettsial and chlamydia infections. 5th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1979. P. 767-814.

138. Song G., Hang C.S., Liao H.X, Fu J.L, Gao G.Z, Qiu H.L, Zhang Q.F. Antigenic difference between strains causing classical and mild types of epidemic hemorrhagic fever with renal syndrome in China // J. Infect. Dis. -1984.-Vol. 150.-P. 889-894.

139. Stohwasser R., Giebel L.B., Zoller L., Bautz E.K.F., Dakai G. Molecular characterization of the RNA S segment of Nephropathia epidemica virus strain Hallnas Bi // Virology. 1990. - Vol. 174. - P. 79-86.

140. Stohwasser R., Raab K., Daral G., Bantz E.K. Primary structure of the large (L) RNA segment of Nephropathia epidemica virus strain Hallnas В coding for the viral RNA polymerase//Virology. 1991.-Vol. 183. - P. 386-391.

141. Sugiyama K., Matsuura Y., Morita C., Shiga S., Akao Y., Komatsu Т., Kitamura T. An immune adherence assay for discrimination between etiologic agents of hemorrhagic fever with renal syndrome // J. Infect. Dis. 1984. -Vol. 149.-P. 67-73.

142. Sugiyama K., Morita C., Matsura Y., Shiga S., Komatsu Т., Moricawa S., Kitamura T. Isolation of virus related to hemorrhagic fever with renal syndrome from urban rats in nonendemic area // J. Infect. Dis. 1984. - Vol. 149.-P. 473.

143. Takenaka A., Gibbs C.J., Gajdusek D.C. Antiviral neutralization antibody to Hantaan virus as determined in plaque reduction technique // Arch. Virology. 1985.-Vol. 84.-P. 197-206.

144. Tang Y.W., Ruo S.L., Sanchez A. Hantavirus strains isolated from rodents and insectivora in rural China differentiated by polymerase chain reaction assay // Arch. Virology. 1990. - Vol. 119. - P. 37-46.

145. Tkachenko E. A., Donets M. A., Ivanov A. P., Rezapkin G. V., Dzagurova T. K., Leshchinskaya E. V., Mustafm N. M., Savinova Т. I. Immunosorbent assays for diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome // Lancet. -1981.-№ 8240.-P. 257-258.

146. Tkachenko E.A., Dzagurova Т.К., Leshinskaya E.V. Serological diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome in European regions of USSR // Lancet. 1982. - Vol. 2. - P. 1407.

147. Tkachenko E.A., Drozdov S.G. The study of the natural foci of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in the USSR // Abstracts of 4th Int. Conf. «Comparative Virology». Montreal, Canada, 1982. - P. 116-116.

148. Tomiyama T. and Lee H.W. Rapid serodiagnosis of hantavirus infection using by high density particle agglutination (HDPA) // Abstracts of 2th Symp. «Arboviruses in the Mediterraneal Countries». Dubrovnik, Yugoslavia, 1989.-P. 31.

149. Tsai T.F., Tang Y.W., Hu S.L., Ye K.L., Chen G.L., Xu Z.Y. Hemagglutination inhibiting antibody in hemorrhagic fever with renal syndrome // J. Infect. Dis. - 1984. - Vol. 150. - P. 895-898.

150. Vaheri A., Brummer-Korvenkontio M., Hedman K. Molecular biology of Puumala virus and impact on diagnosis and pathogenesis of hantavirus infections // Abstracts of 2th Int. Conf. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Beijing, China, 1992. - P. 14.

151. White J.D., Shifly E.G., French G.R., Hyggins J.W., Brand D.M., Lee H.W. Hantaan virus, etiologic agent of Korean hemorrhagic fever, has Bunyaviridae like morphology // Lancet. - 1982. - Vol. 1. - P. 768-771.

152. World Health Organization. Haemorrhagic fever with renal syndrome : Memorandum from a WHO meeting // Bull. WHO. 1983. - Vol. 61. - P. 269 -275.

153. Xiao S.Y., Chu Y.K., Knauert F.K., lofts R.S., Dalrymple J.M., LeDuc J.W. Comparison of hantavirus isolated using a genus-reactive primer pair polymerase chain reaction // J. Gen. Virology. 1992. - Vol. 73. - P. 567573.

154. Xiao S.Y., LeDuc J.W., Chu Y.K., Schmaljohn C.S. Phylogenetic analysis of virus isolates in the genus Hantavirus family Bunyaviridae // Virology. 1994. -Vol. 198.-P. 205-217.

155. Xu Z.K., An X.I., Wang M.X. The antigenic analysis of hemorrhagic fever with renal syndrome viruses in China by monoclonal antibodies // J. Hyg. -1986.-Vol. 97.-P. 366-375.

156. Xu Z.K., Wang M. X., Jiang S.C. Detection of HFRS virus antigen and antibody by monoclonal antibody enzyme-linked immunosorbent assay inderect sandwich method // J. Med. Coll. PLA 1987. - Vol. 2. - P. 46-48.

157. Yan D., Lin X., Zhang L., Jin Z. A survey on cold blood reservoirs of hemorrhagic fever with renal syndrome // Abstracts of 2nd Int. Conf. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». Beijing, China, 1992. - P. 75.

158. Yanagihara R., Svedmyr A., Amyx H.L., Lee P.W., Goldgaber D., Gadjdusek D.C., Gibbs C.J., Nystrom K. Isolation and propagation of nephropathiaepidemica virus in bank voles 11 Scand. J. Infect. Dis. 1984. - Vol. 16. - P. 225-228.

159. Yang J., Zhao T. and Fu W. Study on the detection of Rattus confusions EHF antibody and serologic type by hemagglutination inhibition test // Abstracts of proceeding of Int. Symp. «Hemorrhagic fever with renal syndrome». -Hubei, China, 1988.-P. 117.