Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно - функциональный анализ генетических полиморфизмов вируса ECHO11, связанных с изменчивостью рецепторной специфичности

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структурно - функциональный анализ генетических полиморфизмов вируса ECHO11, связанных с изменчивостью рецепторной специфичности"

На правах рукописи

Резайкин Алексей Васильевич

Структурно - функциональный анализ генетических полиморфизмов вируса ЕСНОН, связанных с изменчивостью рецепторной специфичности

03.02.02 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2014

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Уральский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Сергеев Александр Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Бичурина Майна Александровна

ФБУН «Санкт-Петербургский научно-

исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им.

Пастера», заведующая лабораторией

кандидат биологических наук, Короткова Екатерина Александровна

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, научный сотрудник

Ведущая организация

Федеральное бюджетное учреждение науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора

Защита состоится "10" октября 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова" Российской академии медицинских наук, по адресу: 142782, город Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км. Киевского шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте ФГБУ "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова" РАМН http://poliomyelit.ru

Автореферат разослан -20 " _2014 г.

И.о. Ученого секретаря диссертационного совета,

доктор биологических наук

! 'О ' ■ * " ' '''

roc j ; .■■ -¡ля Общая характеристика работы ' - ' ' Актуальность проблемы

Специфичность взаимодействия вирусов с рецепторами чувствительных клеток является ключевой детерминантой тканевого тропизма, выполняющей триггерную функцию в отношении всех последующих этапов вирусного инфекционного цикла. [Baranowski Е. et al., 2001; Evans D.J. et al., 1998; Lentz T.L. et al., 1988; Rossmann M.G. et al., 2002]. Следовательно, идентификация таких рецепторов и изучение особенностей их взаимодействия с вирусами является одной из важнейших задач фундаментальной вирусологии, от решения которой, в частности, зависят перспективы целенаправленного создания высокоэффективных противовирусных средств.

Клинические проявления инфекции, вызванной неполиомиелитными энтеровирусами, характеризуются широким спектром, включающим лихорадочное заболевание, конъюнктивит, инфекции верхних и нижних дыхательных путей, гастроэнтерит, менингит, энцефалит, энцефаломиелит и др. [Pallansch M.A. et al., 2001; Rotbart H.A. et al„ 2000; Ворошилова M.K. 1979;].. Это подразумевает способность энтеровирусов к репродукции в различных тканях и органах за счёт использования различных клеточных рецепторов для инфицирования клеток.

Изучению топологии молекулярных взаимодействий неполиомиелитных энтеровирусов с клеточными рецепторами методом структурно-функционального анализа однонуклеотидных генетических полиморфизмов посвящено относительно небольшое количество работ, однако, это направление интенсивно развивается [Carson S.D. et al., 2011 ; Gullberg M. et al., 2010; Pan J. et al., 2011].

В результате ранее проведённых исследований с использованием первичной культуры фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) было показано, что способность вируса ЕСНОП (EVI 1) к связыванию с рецептором DAF (CD55) является вариабельным генетическим признаком, а в популяциях гемагглютинирующих штаммов и клонов, имеющих Daf+ фенотип, частота негемагглютинирующих (da/-) мутантов составляет Зх10"5 [Sergeev A.G. et al.,

1994]. Математическая модель накопления daf- мутантов в популяции daf+ клона EV11 при репродукции в культуре клеток ФЭЧ [Novoselov A.V. et al„ 2004], с помощью численных экспериментов позволила обосновать предположение о том, что утрата вирусом сродства к рецептору DAF может быть обусловлена единичной миссенс-мутацией. Данное предположение было экспериментально подтверждено методом секвенирования структурной части генома близкородственных daf+ и daf- клонов EV11, полученных в первичной культуре ФЭЧ [Резайкин A.B. и др., 2009; Rezaikin A.V. et al., 2009]. У четырех клонированных daf- вариантов, выделенных из популяции гемагглютинирующих штаммов EV11 (прототипного штамма Gregory и клинического изолята 7611), было выявлено по одной миссенс-мутации, приводившей к аминокислотной замене в белке VP2 (S135G, S145N, G162E или Т165М).

В настоящей работе продолжен анализ генетических полиморфизмов близкородственных клонов EV11 с целью выяснения топологии вирусного антирецептора, обеспечивающего взаимодействие EV11 с альтернативными по отношению к DAF неидентифицированными клеточными рецепторами, присутствующими в различных культурах клеток, а также использованы моноклональные антитела, позволяющие исследовать функциональную роль отдельных молекул на поверхности клеток при взаимодействии со структурно измененными белками капсида EV11 на ранних этапах инфекционного цикла.

Цель исследования

Установление взаимосвязей генетических полиморфизмов в структурной части генома с изменением рецепторной специфичности EVI I.

Задачи работы:

1. Картировать миссенс-мутации в структурной части генома EVI 1, выявляемые при адаптации к различным перевиваемым клеточным культурам, и провести анализ взаимосвязи структурных и функциональных изменений.

2. Разработать экспериментальную модель для изучения рецепторной специфичности EV11 в культуре клеток рабдомиосаркомы человека (RD) с использованием близкородственных dof+ и daf- клонов вируса, капсидные белки которых отличаются единственной аминокислотной заменой, и моноклональных антител (мАТ), блокирующих клеточные рецепторы.

3. Изучить протективный эффект мАТ, взаимодействующих с клеточными рецепторами DAF, HLA класса I (HLA-I) и р2-микроглобулином (ß2m) при инфицировании клеток RD модельными клонами EVI 1.

4. Исследовать влияние эффекта фенотипического смешивания на формирование структуры популяции клонированного EVI 1 в отношении аффинности к рецептору DAF.

Научная новизна работы

Впервые показано наличие двух пространственно разграниченных кластеров аминокислотных замен в капсидных белках клонированных вариантов EVI1, ассоциированных с адаптацией к различным клеточным культурам. Первый кластер локализован вблизи оси симметрии 2-го порядка и ассоциирован с вариабельностью аффинности вируса к клеточному рецептору DAF. Второй кластер расположен в области северной стены каньона вблизи оси симметрии 5-го порядка и связан с адаптацией вируса к неидентифицированному клеточному рецептору, используемому независимо от DAF.

Доказано, что в культуре клеток RD экспрессия DAF-зависимого фенотипа EV11 контролируется одиночным нуклеотидным полиморфизмом: миссенс-мутацией в позиции 493 участка генома, кодирующего белок VP2.

Показано, что различие первичных рецепторов, используемых близкородственными daf+ и daf- клонами EV11, не влияет на выраженность протективного эффекта мАТ к ß2m в культуре клеток RD.

Впервые доказано, что при репродукции DAF-зависимого клона EV11 на культуре клеток RD, в популяции вирусного потомства присутствует минорная фракция инфекционных вирионов (приблизительно 0,1%), несущих daf+ геном, но

имеющих Эа^ фенотип. Таким образом, было показано присутствие химерных вирионов, являющихся результатом фенотипического смешивания.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенные исследования имеют фундаментальный характер. Полученные результаты дополняют представления о молекулярной топологии вирусных антирецепторов (сайтов связывания с клеточными рецепторами) на поверхности DAF-зависимых вариантов EVI 1 и вариантов, не взаимодействующих с рецептором DAF. Обнаружение биологически значимого кластера аминокислотных замен в области оси симметрии 5-го порядка указывает на важную для интернализации и (или) депротеинизации функциональную роль неидентифицированного клеточного рецептора, взаимодействующего с вирионом EVI 1 в области каньона.

В структуре популяций клонированных daf+ вариантов EV11 выявляется минорная субпопуляция химерных вирионов, имеющих Daf- фенотип и несущих daf+ геном, которая приводит к своеобразной маскировке рецепторной специфичности. Ненаследуемое изменение рецепторной специфичности в отношении рецептора DAF может вносить определенный вклад в преодоление тканевых барьеров в патогенезе энтеровирусной инфекции.

В связи с интенсивным развитием методов полногеномного секвенирования, практическое значение может иметь использованная в диссертации концепция установления взаимосвязи между одиночными нуклеотидными полиморфизмами (миссенс-мутациями) и изменением контролируемого в эксперименте биологического признака. В сочетании с картированием аминокислотных замен в трехмерной структурной модели вириона, данная концепция позволяет однозначно интерпретировать биологическую роль однонуклеотидных полиморфизмов, формирующих пространственно разграниченные кластеры аминокислотных замен в наборах спонтанных мутантов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Аминокислотные замены в капсидных белках клонированных вариантов EVI 1, ассоциированные с адаптацией к различным клеточным культурам, группируются в два пространственно разграниченных кластера. Первый кластер локализован вблизи оси симметрии 2-го порядка и ассоциирован с вариабельностью аффинности вируса к клеточному рецептору DAF. Второй кластер расположен в области северной стены каньона вблизи оси симметрии 5-го порядка и связан с адаптацией вируса к неидентифицированному клеточному рецептору, используемому независимо от DAF.

2. Экспрессия DAF-зависимого фенотипа EVI 1, использующего DAF в качестве первичного клеточного рецептора, при репродукции в культуре клеток RD контролируется одиночным нуклеотидным полиморфизмом в позиции 493 гена VP2, приводящим к аминокислотной замене в позиции 165 капсидного белка VP2.

3. Различие первичных рецепторов, используемых близкородственными daf+ и daf- клонами EVI 1, не влияет на выраженность протективного эффекта мАТ к ß2m в культуре клеток RD.

4. В популяции вирусного потомства DAF-зависимого клона EVI1 на культуре клеток RD, выявляется минорная фракция инфекционных вирионов (приблизительно 0,1%), несущих daf+ геном, но имеющих Daf- фенотип, то есть наблюдается феномен фенотипического смешивания.

Внедрение результатов исследования и апробация работы

Полученные в результате выполнения работы нуклеотидные последовательности структурной части генома 10-ти клонов EVI 1 депонированы в международном банке генетической информации GenBank NCBI под номерами EU518467, EU518468, EU518469, EU518470, JF925112, JF925113, JF925114, JF925115, JF925116, JF925117.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения РФ.

Основные результаты работы представлены и обсуждены на 60-й, 61-й, 62-й и 63-й межвузовских научно-практических конференциях молодых ученых и студентов с международным участием "Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения" (г. Екатеринбург, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.); второй и третьей окружных научно-практических конференциях "Актуальные аспекты вирусных инфекций в современный период (эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика и лечение)" (Екатеринбург, 2008, 2009 гг.); четвертой окружной научно-практической конференции "Актуальные вопросы вирусных инфекций" (Екатеринбург, 2010 г.); научной конференции с международным участием "Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней" (Иркутск, 2010 г.); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации" (Москва, 2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России и 2 публикации в ведущих рецензируемых зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, главы литературного обзора, описания использованных материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 21 отечественный и 141 зарубежный источник, и приложения. Диссертация имеет объем 120 страниц, иллюстрирована 9 таблицами и 10 рисунками.

Собственные исследования Материалы и методы

Перевиваемые клеточные культуры. В работе использовали перевиваемые линии клеток RD, НЕр-2, BGM, полученные из вирусологической лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области" и перевиваемую клеточную культуру JI-41 КД/84, полученную из коллекции ФГУН Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций Роспотребнадзора.

Вирусы

Клон 111/RD был получен в результате адаптации клинического изолята EV11, выделенного от больного серозным менингитом в культуре клеток ФЭЧ (штамм 7611), к культуре клеток RD методом неразведенных пассажей с последующей 3-х кратной очисткой "из бляшки в бляшку" [Фадеев Ф.А., 2008]. Клоны 111/L41, 111/НЕр и 111/BGM были получены в результате адаптации клона 111/RD к различным перевиваемым клеточным культурам методом неразведенных пассажей [Фадеев Ф.А., 2008].

Моноклональные антитела. Для ингибирования репродукции вирусов в работе использовали следующие очищенные мышиные мАТ:

1.BRIC216 (Meridian Life Science Inc., США, каталожный номер Р5451 1М), взаимодействующие с SCR3 доменом DAF;

2. В9.12.1 (Meridian Life Science Inc., CILIA, каталожный номер P42107M), взаимодействующие с молекулой HLA-I человека (HLA-A,-B,-C) в области домена al;

3. ВВМ.1 (Abeam PLC, Великобритания, каталожный номер аЫ8605), связывающиеся с р2т человека и приматов (как свободным, так и ассоциированным с тяжелой цепью HLA-I).

Вирусологические методы исследования. Инфекционную активность вируссодержащих жидкостей оценивали методом конечных разведений, определяя величину 50% тканевой цитопатогенной дозы (ТЦД5о) в 1 мл вируссодержащей жидкости. Для определения инфекционного титра вирусов использовали формулу Spearman-Karber с расчетом суммарной аналитической погрешности [Husson-van

Vliet J. and Roussel P., 1988]. Для оценки достоверности различия инфекционных титров использовали F-test для распределения Пуассона [Krishnamoorthy К. and Thomson J., 2004; Гланц С., 2000].

Для постановки реакции бляшкообразования (РБО) использовали плотный клеточный монослой в пластиковом культуральном флаконе. Подсчет количества бляшек проводили через 72 часа. Концентрацию вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл вируссодержащей жидкости (БОЕ/мл).

Гемагглютинирующую активность вируса определяли микрометодом и выражали в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ) [Sergeev A.G. et al., 1994].

Оценку ингибирующего эффекта мАТ проводили на монослойных культурах клеток RD, выращенных в 96-луночных планшетах (Coming Life Sciences Inc., CILLA). Клеточный монослой предварительно инкубировали с определенной концентрацией мАТ, после чего заражали 10-кратными разведениями вирусных клонов. При исследовании зависимости ингибирующего эффекта от дозы мАТ, клетки предварительно инкубировали с различными концентрациями мАТ, затем заражали инокулятом, содержавшим 100 ТЦД50 клонов EV11.

Окончательный учет результатов проводили по состоянию монослоя на 5-е сутки после его фиксации 96% раствором этилового спирта и последующей окраски 0,5% раствором основного карболового кристалвиолета.

Молекулярно-генетические методы исследования. Структурную часть генома, кодирующую белки вирусного капсида VP1 - VP4 (2682 основания с фланкирующими последовательностями), амплифицировали методом полимеразной цепной реакции в виде трех перекрывающихся фрагментов длиной 952, 921 и 915 нуклеотидов с использованием трех пар праймеров (EF1-ER1, EF2-ER2, EF3-ER3). Секвенирование ДНК проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

и

Для подбора праймеров, сопоставления сегментов, выравнивания и сравнения последовательностей нуклеотидов и аминокислот использовали компьютерную программу MEGA, версия 5.1 [Tamura К. et а!., 2011].

Результаты исследования и обсуждение Миссенс-мутации в структурной части генома, выявленные у вариантов EV11, адаптированных к различным перевиваемым клеточным культурам

Адаптация исходного клона EV11 (111/RD), полученного в культуре клеток RD, к культурам Л-41 КД/84, НЕр-2 и BGM методом последовательных пассажей с высокой множественностью заражения была выполнена ранее [Фадеев Ф.А., 2008]. Было показано, что репродукция EV11 в культуре клеток RD сопровождалась накоплением Daf+ вариантов, культуры клеток Л-41 КД/84 и НЕр-2 обеспечивали позитивную селекцию Daf- вариантов, в то время как адаптация вируса к культуре клеток BGM не сопровождалась утратой ГА активности. Оставался открытым вопрос о молекулярно-генетических изменениях в структурной части генома, обеспечивающих селективные преимущества Daf+ и Daf- вариантов EVI 1 при адаптации к различным клеточным культурам, а также связь этих изменений с аффинностью к DAF.

В настоящей работе было проведено секвенирование и сравнительный анализ структурной части генома исходного клона 111/RD и его дериватов 111/L41, 111/BGM и 111/НЕр. Замены аминокислот, обнаруженные у адаптированных штаммов в результате сравнения первичной структуры капсидных белков с исходным клоном 111/RD, представлены в таблице 1.

Пространственное расположение аминокислотных замен на поверхности капсида EV11 показано на рисунке 1. Для создания рисунка использована программа визуализации трехмерных структур NCBI Cn3D v.4.1 и кристаллографические координаты моделей белков EV11 1UPN [Bhella D. et al., 2004] и 1Н8Т [Stuart A.D. et al., 2002], полученные из международного банка данных белковых структур NCBI Protein Data Base (PDB).

Таблица 1

Аминокислотные замены в структурных белках клонов ЕУ11, адаптированных к различным клеточным культурам

Клоны ЕУ11 Клеточная культура Daf фенотип Позиции в белке VP2 Позиции в белке VP1

156 165 88 129 265

111/RD RD + А Т К Q N

111/L41 Л-41 КД/84 - А А* К Q N

111/BGM BGM + А Т Е R N

111/НЕр НЕр-2 - Т Т Е 0 S

* Серым фоном и полужирным шрифтом выделены аминокислотные замены в сравнении с исходным клоном 11 !/1Ш

Анализ взаимосвязи обнаруженных мутаций и топологии аминокислотных замен с изменением биологических свойств вариантов EV11, позволил сгруппировать аминокислотные замены в два структурно-функциональных кластера. Первый кластер включает замены, которые обусловили утрату аффинности EVI 1 к рецептору DAF (Т165А и А156Т в белке VP2, а также N265S в белке VP1) у вариантов 111/L41 и 111/НЕр.

Второй кластер аминокислотных замен был локализован в области северной стены каньона вблизи оси симметрии 5-го порядка (К88Е и Q129R в белке VP1), то есть за пределами сайта, определенного ранее в качестве антирецептора для DAF у эховирусов 7, 11 и 12 серотипов [Фадеев Ф.А., 2008; Резайкин A.B. и др., 2009; Bhella D. et al., 2003; Pettigrew D.M. et al„ 2006; Plevka P. et al„ 2010].

По данным Stuart A.D. et al. [2002], аналогичные аминокислотные замены K88E и Q132K в белке УР1были выявлены при адаптации штамма EVI 1-207 с культуры клеток человеческою происхождения НТ29 к культуре клеток обезьяньего происхождения Vero. Учитывая, что клетки Vero и использованная в наших экспериментах культура клеток BGM имеют общее происхождение (почки африканской зеленой мартышки), сходство выявленных аминокислотных замен может свидетельствовать о необходимости изменения топологии белка VP1 в петле ВС для адаптации EVI 1 к культурам клеток обезьяньего происхождения.

ОАР

Рисунок 1. Локализация аминокислотных замен в белках УР1 и УР2 ЕУ11, выявленных у вариантов клона 111/1Ш, адаптированных к перевиваемым клеточным культурам Л-41 КД/84, ВвМ и НЕр-2.

Скелет из альфа-углеродных атомов аминокислот белка УР1 обозначен малиновым цветом, белка УР2 - синим, 8СЯЗ и БСЯ4 доменов ОАР - зеленым. Оси симметрии 2-го, 3-го и 5-го порядков обозначены овалом, треугольником и пятиугольником, соответственно. А. Расположение ОАР на поверхности протомера вириона (вид сверху). В. Расположение аминокислотных замен (выделены желтым цветом) на поверхности протомера. С. Расположение ОАР на сагиттальном срезе протомера, проходящем через оси симметрии 2-го и 5-го порядков. Р. Расположение аминокислотных замен на сагиттальном срезе протомера.

С учетом того, что замена всей петли ВС в белке VP1 у апатогенного для мышей полиовируса 1 типа (штамм Mahoney) на петлю ВС VP1 от патогенного для мышей полиовируса 2 типа (штамм Lansing) обеспечивала штамму Mahoney возможность распознавать гомолог рецептора для полиовируса в ЦНС мышей [Martin A. et al., 1988; Murray M.G. et al., 1988], можно вполне обоснованно предположить, что на северной стене каньона вблизи оси симметрии 5-го порядка локализованы важные детерминанты, определяющие видовой тропизм энтеровирусов, а именно - антирецептор для связывающегося с каньоном рецептора.

Получение близкородственных daf+ и daf- клонов EV11 в культуре клеток RD

Известно, что связывание энтеровирусов с рецептором DAF не приводит к образованию А-частиц и интернапизации вириона на генетически модифицированных непермиссивных клетках, экспрессирующих DAF. Поэтому Daf-зависимым штаммам для проникновения в клетку необходимо последующее взаимодействие с корецептором (вторичным рецептором), который до настоящего времени не идентифицирован. Результаты, полученные рядом авторов, свидетельствуют о том, что депротеинизация энтеровирусов происходит после взаимодействия с рецептором, сайт связывания которого расположен в области каньона [Dermody T.S. et al., 2009]. Несмотря на то, что рецептор с такими свойствами для вирусов ECHO до настоящего времени не идентифицирован, описаны протективные свойства мАТ, взаимодействующих с мембранными белками, относящимися к суперсемейству иммуноглобулинов [Halaby D.M. et al., 1999], а именно: к (32m [Ward T. et al., 1998] и к домену al молекул HLA-1 (HLA-A, -В,-С) [Chevaliez S. et al., 2008].

В работе Chevaliez S. et al., [2008], было показано что репродукция Daf + штамма EV11 эффективно подавлялась предварительной инкубацией клеток с мАТ к HLA-I и к р2т. Однако, вопреки ожиданиям, моноклональные антитела к рецептору DAF не блокировали адсорбцию и репродукцию вируса на клетках RD.

Исследуемый штамм демонстрировал DAF - независимый Daf+ фенотип и мог в качестве первичного рецептора на клетках RD, наряду с DAF, использовать другой рецептор.

По-нашему мнению, полученные результаты могли явиться следствием гетерогенности использованного авторами штамма по признаку рецепторной специфичности, а именно, присутствием в популяции, наряду с Daf+ вариантами, значительной доли вирионов, имеющих Daf- фенотип, либо наличием Daf+ вариантов с двойной рецепторной специфичностью.

Учитывая вышеизложенное, вопрос об участии молекул HLA-I в качестве первичного (альтернативного по отношению к DAF) рецептора или в качестве корецептора в репродукции Daf+ и Daf- вариантов EV11 нуждался в дополнительном изучении с использованием клонированных гено- и фенотипически однородных вирусных популяций.

Одной из задач настоящего исследования была разработка адекватной экспериментальной модели для изучения рецепторной специфичности EV11, а именно получение в одной культуре клеток близкородственных daf+ и daf- клонов с однонуклеотидным полиморфизмом в структурной части генома.

Сложность решения данной задачи состояла в том, что культура клеток RD обладает выраженной позитивной селекцией в отношении Daf+ вариантов, поэтому попытки выделения daf- клонов из популяции исходного клона 111/RD с использованием методики, применявшейся на культуре клеток ФЭЧ [Sergeev A.G. et al., 1994], были безуспешными. С другой стороны, репродукция daf+ клона 111/RD в культуре клеток Л-41 КД/84 сопровождалась выраженной позитивной селекцией Daf- вариантов, что не позволяло получить достаточно однородные популяции DAF-зависимых клонов [Новоселов A.B., 1994].

В то же время было отмечено, что обратная адаптация клонов, полученных на клетках Л-41 КД/84 и имевших Daf - фенотип, к культуре RD не требовала множественных или "слепых" пассажей [Новоселов A.B., 1994], что могло свидетельствовать в пользу минимальных изменений структуры капсидных белков EV11 в процессе реадаптации к культуре RD. Это давало основание для поиска

подходящей пары близкородственных клонов в вирусной популяции, полученной после заражения клеток к О [)аГ- клоном, предварительно адаптированным к культуре клеток Л-41 КД/84.

Схема получения с!аклонов и их последующей реадаптации к культуре 1Ш представлена на рисунке 2.

Ш/ЯР Н Ь-41 КР/84

111/1.41

Оа( -

121—Гкр~Ь-12ШР 211—Г~й5~1— 211ЯР 311—Г~яр~]— 311РР 431 —Г~йр~]— 431ГЗР •

431-1

Оя1*

431-6

Оа(-

Рисунок 2. Схема получения близкородственных «/«/+ и </«/- клонов ЕУ11 на культуре клеток 1Ш.

Секвенирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих капсидные белки у четырех Лаклонов, выделенных в культуре клеток Л-41 КД/84 (121, 211, 311, 431), показало, что все они сохранили аминокислотную замену Т165А в белке УР2, ассоциированную с Оа(- фенотипом (таблица 2). Остальные три аминокислотные замены (82331. в УР2; 086Я в УРЗ; К286Я в УР1), обнаруженные у с!а£- клонов при сравнении с консенсусной последовательностью исходного клона 111/Ь41, возможно, явились следствием процедуры селекции (эффекта "горлышка бутылки"). Вместе с тем, общая аминокислотная замена К28611 в С-терминале УР1 наблюдалась у трёх из четырех исследованных ф/-клонов, что указывало на её возможное адаптивное преимущество при репродукции данных клонов в культуре клеток Л-41 КД/84.

После 10 пассажей каждого из четырёх указанных выше с!а/- клонов (121, 211, 311, 431) в культуре клеток И О, было проведено секвенирование полученных вирусных пулов (121ЯО, 2111Ш, 3111Ш и 431ЯО). При визуальном анализе электрофореграмм, в позиции 493 последовательности, кодирующей белок УР2, было выявлено два пика: кроме большого, соответствующего гуанину, определялся меньший пик, указывающий на наличие аденина, которое

определялось в данной позиции у всех исследованных с1а/+ клонов (рисунок 3).

Таблица 2

Аминокислотные замены в структурных белках клонов ЕУ11,

адаптированных к культурам клеток Л-41 КД/84 _и реадаптированных к клеткам ЯР_

Клон Номер в Культура ЭаГ Аминокислотные замены

СспВапк клеток фенотип (белок / позиция)

1МСВ1 УР2 УРЗ УР1

165 233 86 286

111/ЯО ЕШ18467 ЯО + Т 5 9 К

11 мы\ Еи518468 Л-41 КД/84 - А* Б К

121 ■1Р925112 Л-41 КД/84 - А 0 я

211 .^925113 Л-41 КД/84 — А 8 о я

311 .^925114 Л-41 КД/84 - А 8 0 я

431 .^925115 Л-41 КД/84 - А 8 я к

431-1 .^925116 яо + Т 8 я к

431-6 ■1Р925117 яо - А 8 я к

* Серым фоном выделены аминокислотные замены по сравнению с исходным клоном 111/ЯО

Капсидные белки клона 431ЯО имели минимальные отличия от белков исходного клона 111/ЯО, поэтому данный клон был выбран для дальнейшего выделения близкородственных с!а/+ и с!а/~ клонов.

Рисунок 3. Фрагмент элекгрофореграммы, полученной при секвенировании клонов 431 (А) и 431ИЭ (В). Стрелками указаны пики, соответствующие 493-му нуклеотиду области, кодирующей белок УР2. А. Одиночный пик соответствует гуанину. В. Двойной пик соответствует смеси гуанина и аденина.

Из клона 431RD в культуре RD было выделено 18 субклонов. На втором пассаже каждого субклона полная деструкция клеток RD наблюдалась через 24-48 часов после заражения. Материал второго пассажа субклонов исследовали в РГА. У 14 из них ГА активность составляла 512-1024 ГАЕ, в то время как 4 субклона не проявили ГА активность.

Секвенирование было выполнено для всех четырех dcf - субклонов и для такого же количества случайно выбранных daf+ субклонов. По результатам секвенирования была выбрана пара клонов (daß- 431-1 и daf- 431-6), отличавшихся единственной аминокислотой заменой (TI65A) в белке VP2 (таблица 2).

Протективный эффект моноклональных антител к клеточным рецепторам при инфицировании клеток RD близкородственными daf+ и daf- клонами EVI 1

Оценку ингибирующего эффекта мАТ к DAF (BRIC216), к HLA-I (В9.12.1) и к ß2m (ВВМ.1) в разных концентрациях проводили с последовательными 10-кратными разведениями близкородственных клонов 431-1 (daf+) и 431-6 {daf-) на культуре клеток RD. Окончательный учет результатов проводили на 5-е сутки. Рассчитанный с учетом суммарной аналитической погрешности, инфекционный титр представлен в таблице 3.

Таблица 3

Оценка протективного эффекта моноклональных антител при репродукции

близкородственных daf+ и daf- клонов EV11 в культуре клеток RD

мАТ Концентрация мАТ (м кг/мл) Инфекционный титр (-loß10 ТЦДзд / 0,1 мл)

daf+ клон 431-1 daf- клон 431-6

Контроль без мАТ 0 7.75+0.20 5.75+0.22

В9.12.1 (Анти-НЬА-1) 10 7.50±0.20 5.75+0.31

40 7.50±0.20 5.75+0.31

BRIC216 (Ahth-DAF) 40 5.75+0.27* 5.75+0.27

В9.12.1 + BRIC216 10 + 40 6.00+0.31* 5.50+0.22

ВВМ.1 (Апти- ß2m) 10 6.75±0.27* 4.25+0.27*

20 5.50+0.27* 3.50+0.27*

* Отличие инфекционного титра по сравнению с контролем без мАТ является

статистически достоверным (р < 0,05).

Результаты экспериментов по блокированию репродукции близкородственных daf+ и daf- клонов EVI 1 моноклональными антителами позволили сделать следующие выводы:

1. Моноклональные антитела BRIC216, взаимодействующие с SCR3 доменом DAF, подавляют репродукцию daf+ клона 431-1 и не влияют на инфекционную активность daf- клона 431-6 EV11, что подтверждает DAF-зависимый фенотип клона 431-1 и использование клоном 431-6 альтернативного по отношению к DAF первичного рецептора.

2. Моноклональные антитела ВВМ. 1 к человеческому fem с одинаковой эффективностью ингибируют репродукцию как daf+ клона 431-1, так и daf- клона 431-6.

3. Предварительная обработка клеток RD мАТ В9.12.1, взаимодействующими с мономорфной детерминантой молекул HLA-I (HLA-A, -В, -С), не влияет на инфекционную активность как daf+, так и daf-клонов EVI 1.

С помощью мAT ВВМ. 1 к ß2m была исследована зависимость протективного эффекта от концентрации мАТ при постоянной инфицирующей дозе вирусов 100 ТЦЦ50. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4

Зависимость протективного эффекта от концентрации мАТ к ß2m при

постоянной инфицирующей дозе вируса (100 ТЦД50)

Концентрация мАТ BBM.I (мкг/мл) Средний процент ЦПД в культуре клеток RD

daf+ клон 431-1 , daf- клон 431-6

2-й день 5-й день 2-й день 5-й день

80 0 0 0 0

40 0 0 0 О

20 0 12,5 0 12,5

10 25 75 0 25

5 100 100 25 75 ........

2,5 100 100 100 100

1,25 100 100 100 100

Моноклональные антитела ВВМ.1 в концентрации 40 мкг/мл и выше защищали культуру клеток 1Ш в течение 5 суток при использовании инфицирующей дозы 100 ТЦД5о как daf+ клона 431-1, так и daf- клона 431-6.

Таким образом, при одинаковой инфицирующей дозе daf+ и da/- клонов EVI 1 не наблюдалось существенного количественного различия протективного действия мАТ к ß2m. Следовательно, механизм защитного действия мАТ к f^m не зависит от Daf фенотипа EVI 1, то есть является общим для двух клонов.

Учитывая полученные результаты и данные опубликованные другими авторами [Mbida et al., 1992; Chevaliez S. et a!„ 2008; Heikkilä O. et al., 2010; Triantafilou K. et al., 2002; Ward T. et al., 1998;], можно предположить, что к энтеровирусам группы В применима гипотеза разнообразия первичных рецепторов и универсального механизма депротеинизации с участием молекул HLA I класса (в частности - ß2m) и предполагаемого общего каньон-связывающего рецептора (например, действующего внутриклеточного).

Роль эффекта фенотипического смешивания в формировании структуры популяции клонированного EVI 1 в отношении аффинитета к рецептору DAF

Высокая степень изменчивости таких фенотипических признаков энтеровирусов как тканевой/клеточный тропизм и вирулентность, обычно объясняется с позиции высокого потенциала генетической изменчивости РНК-содержащих вирусов [Domingo Е., 2010]. Вместе с тем, в доступной литературе не обнаружено данных о возможной роли "химерных" вирионов энтеровирусов, представленных сочетанием РНК, имеющей консенсусную нуклеотидную последовательность мажорной субпопуляции, и капсида, являющегося продуктом трансляции мутантного генома, содержащего значимую для проявления конкретного фенотипа мутацию. Было показано, что при обычных для вирусологических методов исследования размерах популяций, клонированные daf+ варианты EVI 1 как в культуре клеток ФЭЧ [Sergeev A.G. et al., 1994], так и в культуре клеток RD [Фадеев Ф.А., 2008], содержат минорную субпопуляцию, не взаимодействующую с эритроцитами, но проявляющую инфекционную активность.

Для изучения гетерогенности популяции Daf+ клонов EV11 в отношении аффинитета к рецептору DAF проводили ее фракционирование с помощью трехкратной адсорбции на эритроцитах человека. После каждого из трех раундов адсорбции методом РБО на культуре клеток RD определяли остаточную инфекционную активность вируса, не связавшегося с эритроцитами.

Исходная инфекционная активность клона 111/RD составляла (2,9±0,2)х109 БОЕ/мл. После проведения первой обработки эритроцитами инфекционная активность уменьшилась в 1000 раз, до значения (2,5±0,2)х106 БОЕ/мл. После второй и третьей обработки вируса эритроцитами статистически достоверного снижения инфекционной активности не наблюдалось ((2,3±0,3)х106 БОЕ/мл и (1,7±0,3)х106 БОЕ/мл соответственно).

Гемагглютинирующая активность, составлявшая 1024 ГАЕ у исходного клона 111/RD, после первой обработки эритроцитами снизилась до нуля и отсутствовала после второй и третьей обработки эритроцитами.

Отсутствие статистически достоверного снижения доли не связавшегося с эритроцитами вируса при увеличении кратности обработки эритроцитами, можно рассматривать как доказательство эффективного разделения вирусной популяции на две фракции в отношении аффинности к рецептору DAF.

Для изучения свойств минорной фракции (субпопуляции) вирусных частиц, имеющих Daf- фенотип, из неё было выделено 25 клонов методом бляшек под агаровым покрытием. После первого пассажа па клетках RD все исследованные клоны обладали выраженной гемагглютинирующей активностью (от 256 до 1024 ГАЕ) и имели высокий инфекционный титр (10'8 - 10'9 ТЦД50 в мл). Полученные результаты указывали на то, что потомство вирусных частиц, не способных к адсорбции на эритроцитах, имеет Daf+ фенотип.

С помощью прямого секвенирования были определены последовательности нуклеотидов структурной части вирусного генома для исходной популяции клона 111/RD, для фракции, полученной после трёхкратной обработки эритроцитами, а также для пяти клонов, полученных из этой фракции. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей показало их полную идентичность daf+

генотипу. Таким образом, результаты генетического анализа показали, что минорная субпопуляция вируса, имеющая фенотип, и потомство выделенных из неё клонов имели консенсусную последовательность (¡а/+ генотипа.

Для подтверждения этого вывода были проведены эксперименты с использованием фракции фенотипических Оа1- вариантов по ингибированию их репродукции с помощью мАТ к рецептору ЭАР (ВШС216), к молекуле НЬА-1 (В9.12.1) и к р2т (ВВМ.1). Результаты оценки протективного эффекта мАТ представлены в таблице 5.

Таблица 5

Оценка протективного эффекта моноклональных антител в отношении

репродукции фенотипических Daf- вариантов EV11 в клетках RD

Моноклональные антитела (мАТ) Концентрация мАТ (м кг/мл) Инфекционный титр (—logic ТЦД$о / 0,1 мл)

Контроль без мАТ 0 6,00 ± 0,20

В9.12.1 (мАТкНЬА-1) 40 5,75 ±0,31

ВЯ1С216(мАТкОАР) 40 4,25 ± 0,27*

ВВМ.1 (мАТкР2т) 20 3,25 ± 0,27*

* Отличие инфекционного титра в сравнении с контролем без мАТ является статистически достоверным (р < 0,05).

Полученные результаты были аналогичны протективным эффектам мАТ, наблюдавшимся в отношении с1а/+ клона 431-1 (табл. 3). Следовательно, минорная субпопуляция фенотипических Оа1- вариантов была представлена вирусными частицами, имевшими ОаС-фенотип и ¿а/+ генотип.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что в составе популяции ЕУ11, полученной на клетках 1Ш, кроме вирионов, имеющих фенотип и с/а/+ генотип (мажорный компонент), и мутантов, у которых ОаГ-фенотип сохраняется в потомстве (генотипические ОаГ-/^а/-варианты), присутствует фракция вирионов (приблизительно 0,1%) с низким аффинитетом к рецептору ЭАР, у которых БаГ- признак не наследуется (фенотипические ОаГ-Ша/+ варианты).

Одним из возможных объяснений наблюдавшегося явления может быть модификационная (ненаследуемая) изменчивость за счёт внутритиповой транскапсидации. Проведенные ранее расчеты скорости накопления мутантов в клонированной популяции EVI 1 [Novoselov A.V. et al, 2004] и имеющиеся данные литературы о скорости накопления внутриклеточного пула РНК у энтеровирусов [Лурия С. и др., 1981] позволяют с достаточным основанием полагать, что образование «химерных» вирионов в инфицированной клетке является результатом одновременной трансляции консенсусного и мутантного генома с последующей инкапсидацией daf+ РНК в Daf- капсид в результате дизъюнктивной репродукции. Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать в пользу участия в патогенезе энтеровирусной инфекции особой субпопуляции энтеровирусов, образующейся в результате эффекта транскапсидации или "фенотипического смешивания" за счет своеобразной маскировки рецепторной специфичности, позволяющей вирусной популяции преодолевать тканевые барьеры.

24

Выводы

1. Показано наличие двух кластеров аминокислотных замен в капсидных белках VP1 и VP2 клонированных вариантов EV11, ассоциированных с адаптацией к различным клеточным культурам. Кластер аминокислотных замен в белке VP2 вблизи оси симметрии 2-го порядка ассоциирован с вариабельностью использования клеточного рецептора DAF. Кластер в белке VP1 вблизи оси симметрии 5-го порядка в области северной стены каньона ассоциирован с вариабельностью, обусловленной адаптацией к неидентифицированному клеточному рецептору, используемому вирусом независимо от DAF.

2. Экспрессия DAF-зависимого фенотипа EV11, использующего DAF в качестве первичного клеточного рецептора, при репродукции в культуре клеток RD контролируется одиночным нуклеотидным полиморфизмом: миссенс-мутацией в позиции 493 участка генома, кодирующего белок VP2.

3. На модели двух близкородственных daf+ и daf клонов EVI 1, капсидные белки которых отличались единственной аминокислотной заменой в области сайта связывания с рецептором DAF, показано, что различие первичных рецепторов не влияет на выраженность протективного эффекта моноклональных антител к ß2m в культуре клеток RD.

4. В популяции клонированного DAF-зависимого EV11, помимо преобладающей (мажорной) фракции вирионов с Daf+ фенотипом, выявляется минорная субпопуляция химерных вирионов (около 0,1% инфекционных для культуры RD вирионов), имеющих Daf- фенотип, но несущих daf+ генотип, то есть наблюдается эффект фенотипического смешивания, что приводит к своеобразной маскировке рецепторной специфичности. Ненаследуемое изменение рецепторной специфичности в отношении рецептора DAF может быть одним из механизмов преодоления вирусом тканевых барьеров в патогенезе энгеровирусной инфекции.

Публикации, содержащие основные научные результаты диссертации

1. Новоселов, А.В. Изменение рецепторной специфичности вируса ECHO 11 при адаптации к кулыуре клеток BGM не связано с межвидовыми различиями рецептора DAF у человека и африканской зеленой мартышки / А.В. Новоселов, А.В. Резайкин, Ф.А. Фадеев, А.Г. Сергеев // Уральский медицинский журнал. -№8(48). - 2008. - С. 168- 173.

2. Резайкин, А.В. Картирование точечных мутаций, приводящих к утрате сродства вируса ECHO 11 к рецептору DAF (CD55) / А.В. Резайкин, А.В. Новоселов, Ф.А. Фадеев, А.Г. Сергеев, С.В. Лебедев // Вопросы вирусологии. -2009. -Т54. -№1.-С. 41 -44.

3. Rezaikin, A.V. Two clusters of mutations map distinct receptor-binding sites of echovirus 11 for the decay-accelerating factor (CD55) and for canyon-binding receptors / A.V. Rezaikin, A.V. Novoselov, A.G. Sergeev, F.A. Fadeyev, S.V. Lebedev // Virus Research. - 2009. - Vol.145. - P. 74 - 79.

4. Резайкин, А.В. Роль фенотипического смешивания в формировании структуры популяции клонированного вируса ECHOl 1 в отношении аффинитета к рецептору DAF (CD55) / А.В. Резайкин, А.В. Новоселов, А.Г. Сергеев, Ф.А. Фадеев // Уральский медицинский журнал. - №13(91). - 2011. - С. 25 - 29.

5. Novoselov, A.V. A single amino acid substitution controls DAF-dependent phenotype of echovirus 11 in rhabdomyosarcoma cells / A.V. Novoselov, A.V. Rezaykin, A.G. Sergeev, F.A. Fadeyev, J.V. Grigoryeva, Z.I. Sokolova // Virus Research. - 2012. - Vol.166. - P. 87 - 96.

Резайкин Алексей Васильевич

Структурно - функциональный анализ генетических полиморфизмов вируса ЕСН011, связанных с изменчивостью рецепторной специфичности

03.02.02 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

I I I I

I

Подписано в печать 09.06.2014 г. Заказ № 223. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 э! Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.

- 86 97

2014155105