Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурный и функциональный анализ транспортных генов гордеивирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структурный и функциональный анализ транспортных генов гордеивирусов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Р Г 5 ОД

ЯП О ЦТ г"" На правах рукописи

САВЕНКОВ Евгений Иванович

СТРУКТУРНЫЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСПОРТНЫХ ГЕНОВ ГОРДЕИВИРУСОВ

03.00.06 — Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1995

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик РАН, профессор И. Г. Атабеков доктор биологических наук С. Ю. Морозов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Ю. Л. Дорохов доктор биологических наук С. К. Завриев

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

нии Специализированного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Л змоносова.

Автореферат разослан « » 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат химических наук В. Н. Каграмапов

Защита состоится « 1Ъ » а 1995 г. в

> *

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование структуры вирусных геномов и экспрессии вирусных генов, а также сравнительное и функциональное изучение кодируемых ими белковых продуктов является сегодня одним из основных направлений молекулярной вирусологии. Данные о структуре вирусного генома позволяют построить модель его функциональной организации, выдвинуть предположения о роли кодируемых им полипептидов и, используя широкий спектр . генно-инженерных подходов, проводить экспериментальные исследования отдельных белков. Кроме того, сравнительный анализ структуры генома и белков дают возможность выявить эволюционное родство вирусов и судить о путях .их эволюции. Изучение геномов вирусов растений имеет также большое практическое значение, позволяя , приблизиться к разработке эффективных методов борьбы с вирусными' заболеваниями важных сельскохозяйственных культур.

Не вызывает сомнений, что (+)РНК-содержащие вирусы растений, составляющие более 80% от известных фитавирусов, в силу простоты организации генома представляют собой чрезвычайно удобную модельную систему для изучения принципов организации вирусных геномов. Наиболее эффективным подходом к их изучению оказалось манипулирование' клонированными кДНК-копиями их геномов, частей геномов и отдельных генов. Первым этапом такого рода работ обычно является определение первичной структуры вирусного генома, когда предварительно решается задача его клонирования в виде кДНК.

Объектом настоящей работы являются полулатентный вирус мятлика (pslv) и вирус кольцевой пятнистости зорьки обыкновенной (lrsv), принадлежащие к группе гордеивирусов. pslv и lrsv имеют характерные для их типового представителя, вируса штриховатой мозаики ячменя (bsmv), палочковидные частицы длиной II0-I60 нм, их геномные (+)РНК в составе вирионов одеты капсидным белком с молекулярной массой 21-23 кДа (Jackson & Lane, 1981; Atabekov & Dolja, 1986; Jackson et al., 1989).

Цель и задачи исследования. Целью : данной работы являлось изучение первичной структуры;и организации геномов pslv и lrsv. В ходе исследования решались следующие задачи: клонирование и физическое картирование, pslv- и lrsv- специфических кДНК, анализ первичной структуры клонированных кДНК-копий фрагментов генома pslv и lrsv и выяснение полной нуклеотидной последовательности

PHKs pslv и lrsv, анализ кодирующего потенциала геномов в сравнительное изучение кодируемых им белков, использование полученных данных для филогенетической характеристики pslv и lrsv, экспериментальное изучение функционального сходства тройного блока генов гордеивирусов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые определена полная нуклеотидная последовательность Э-компонентов генома pslv и lrsv, а также частично секвенированы РНК а и * pslv и lrsv. Установлено, что геномы pslv и lrsv содержат все элементы характерные для гордеивирусов. Белки, кодируемые РНКя и 5'-проксимальной ОРТ РНК» гомологичны соответствующим белкам bsmv, образующим вирусную РНК-зависимую-РНК полимеразу. За 5'-проксимальным геном белка оболочки РНКр следует три частично перекрывающиеся ОРТ, составляющие тройной блок транспортных генов. Используя полные кДНК-копии геномных РНК bsmv различные районы тройного блока генов bsmv замещались на гомологичные им участки тройного блока генов pslv и lrsv. Полученные таким образом химерные транскрипты совместно с транскриптами РНК« и РНК* bsmv использовались для заражения различных растений хозяев. Показано, что некоторые из таких замен приводили к изменению круга хозяев и симптомов bsmv. Апробация работы. Материалы исследований были представлены на двух международных конференциях: . "Fundamental and applied problems in phytovirology", Ukraine, Crimea, Yalta, 1994 и "Conference on virus disease of Poaceae in Europe", France, Versailles, 1995; и на iv Конгрессе по молекулярной биологии растений, Амстердам, 1994. Результаты работы изложены в I публикации в 3 сообщениях. Диссертация была апробирована на заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ 24 апреля 1995 г.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на .. страницах, содержит 20 рисунков. Список литературы включает . публикации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Клонирование и секвенирование геномных РНК lrsv и pslv.

Геномные РНК pslv выделяли из препарата вируса, полученного из зараженных растений ячменя, методом фенольной депротеинизации

(Proii et ai, i98i). Препарат РНК lrsv любезно предоставил профессор a.o.jackson. ДНК комплементарную РНК pslv и ДНК, комплементарную РНК lrsv, а также кДНК к их искусственно полиаденилированньш препаратам, синтезировали по методу Gubier, (1988). Для затравления синтеза кДНК на геномной РНК lrsv использовали как статистическую затравку, так и олигонуклеотиды

d(T)1518 И dtTCTCGAGT^GG) . ПрЭЙМвр d(TCTCGAGT^GG) бЫЛ

использован исходя из предположения, что РНК lrsv, также как и РНК bsmv и pslv, на 3'-конца имеют последовательность -ссаон

(Kozlov et al.,1984; Agranovsky et al.,1992). КДНК,

синтезированную описанным вше способом, затем клонировали в плазмидных векторах pBS-SK(-); pBS-KS(-) И pGEM3z (Promega). В качестве метода трансформации е.соИ была применена как обычная са2"-трансформация так и электропорация, позволяющая достичь высокой эффективности,трансформации.

Интересно, что во всех восемнадцати клонах, содержащих вирус-специфические вставки кДНК, полученные с использованием 3•-полиаденилированной РНК lrsv в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК, отсутствовала З'-нетранслируемая область. По-видимому, это обусловлено затравленней синтеза кДНК- с помощью олигонуклеотидов d (Т) i5 ia и й(tctcgagt1sgg> преимущественно на внутреннем poly(А)-тракте РНК lrsv и/или нестабильностью плазмид со вставками, окруженными двумя poiyiа)-трактами, в E.coii. Поэтому для клонирования полной 3'-нетранслируемой области мы провели на препарате 3'-полиаденилированной РНК lrsv реакцию обратной транскрипции и pcr с использованием специфических праймеров d(TCTCGAGT15GG) и d(GAGACTOCagCGCCTATAAACGGGTTCG). Последний из упомянутых олигонуклеотидов соответствует внутреннему участку 3;-нетранслируемой области,

последовательность которой была установлена по клонам lrsv, полученным с использованием статистической затравки:

Для клонирования. геномных РНК pslv использовалось два ^специфических праймера: d( eg teggt ас ctggtcttccttggaggaccgaagc), 'комплементарный 3'-концевой, последовательности РНК pslv, и d(cTTTTATcTCgAgTCATAGAGACTGTCCTTT), комплементарный внутреннему району РНК0 pslv (Agranovsky et ai., 1992). Первоначальный отбор клонов, содержащих фрагменты кДНК, соответствующие 3'-концу РНК/з pslv, проводили методом гибридизации колоний на фильтре с эгР-меченной первой цепью кДНК затравленой с олигонуклеотида

• d(cgtcggtaccTGGTCTTCCTTCGAGGACCGAAGC).

Клоны, содержащие кДНК 5'-концевых участков геномных РНК а и i lrsv и pslv, также отбирались методом гибридизации колоний на фильтре. Последовательно в качестве зондов использовались радиоактивно меченные фрагменты кДНК, соответствующие областям геномных PJIK наиболее удаленным от 3'-конца.

Последовательности РНКэ pslv и lrsv были установлены по обеим цепям кДНК, 98% каждой из них секвенированы по двум и более перекрывающимся кДНК-клонам.

Последовательности, прилежащие непосредственно к 5'-концам РНК/з lrsv и pslv были определены путем секвенирования РНК с использованием дидезоксинуклеотидов и обратной транскриптазы по методу Fichot ь Girard (1990). Однако этот метод не позволил точно определить первые два 5'-концевых остатка в обеих РНК.

Протяженные кДНК вставки клонов укорачивали с помощью экзон.уклеазы III ПО протоколу Erase-a-Base system. Promeg а. Нуклеотидные последовательности полученных серий клонов с однонаправленным« делециями кДНК определяли методом дидеоксинуклеотидного секвенирования по Сенгеру (Sanger et ai., 1977)' с использованием модифицированной ДНК полимеразы фага Т7

(Sequenase, VS Biochemicals).

2. Молекулярная организация РНКр lrsv и pslv. '2.1 Выявление кодирующих районов.

В последовательностях РНКр pslv и lrsv обнаружено по четыре открытые рамки трансляции (ОРТ), которые, согласно критерию Трифонова (Triconov, 1987), могут быть экспрессируемыми in viro генами; их расположение, размеры и последовательности кодируемых белков сходны с таковыми четырех известных ОРТ в РНКр bsmv (Hunter et al., 1989). В PHKfl. pslv эти четыре ОРТ занимают позиции с III по 710 нуклеотидный остаток, с 840 по 2567, с 2573 по 2980 и с 2787 по 3272, и' способны кодировать белки с молекулярными массами 22431 (22 кДа), 63II3 (63 кДа), 14593 (15 кДа) и I8I97 (18 кДа) соотеетвенно. В РНКэ lrsv эти четыре ОРТ занимают позиции с 176 по 760 нуклеотидный остаток, с 869 по , 2227, с 2199 по 2567 и С 2425 по 2895, и способны кодировать белки с молекулярными массами 2I7I2 (22 кДа), 50226 (50 кДа), 13647 (14 кДа) и 17605 (18 кДа) соответственно.

Три 5'-дистальные ОРТ pslv и lrsv, частично перекрывающиеся друг с другом (рис.1), составляют так называемый тройной блок генов (Morozov et ai., 1989), кодирующий три белковых продукта.

м

и

BSMV

PSLV

LRSV

> 3 1

Рисунок I. Схема организации ^-компонентов геномов bsmv, pslv и lrsv. CP - белок оболочки, еь, 0с и fid - соответствуют

обозначениям tgbpi, тсврз и тсврг (см. текст)._

необходимых для транспорта вирусной' инфекции . Продукты 5'-проксимального, среднего и 3--проксимального генов тройного блока у разных вирусных групп в данной работе обозначены как tgbpit тсвр2 и тсврз, что соответствует 0b, fid и fic белкам bsmv. 3. Сравнение белков оболочки pslv, lrsv и bsmv.

5'-проксимальные ОРТ РНК/з pslv и lrsv кодируют эа-продукт 200 и 195 аминокислотных остатков-и мол. массой 22431Да и 21712Да соответственно, что согласуется с данными о предполагаемой мол.массе капсидных белков pslv. и lrsv на основании их электрофоретической подвижности (Hunter et al., 1989). Кроме того, эти белки были идентифицированы как белки оболочки pslv и lrsv на основании протяженной гомологии с белком оболочки типового гордеивируса bsmv, Выравнивание последовательностей белков оболочки гордеивирусов показало, что белок оболочки bsmv имеет большее сходство с белком оболочки pslv, чем с белком

•оболочки lrsv (55,2% и 41,5% ид6нтичных OCT3TKOB COOTB6TCTB61fflO),

что согласуется с данными о серологическом родстве этих трех гордеивирусов (Hunter et al., 1989).

Белки оболочки всех палочковидных Синдбис-подобных вирусов растений имеют несколько консервативных мотивов и представляют собой монофилетическое семейство, хотя последовательности этих белков значительно дивергировали ( Morozov et al., 1989,- Dolja et

BSMV

PSLV

LRSV

PCV

7MV

RMV

ccmrv-w

rt

shmv

NVMV BNTVY pmty SBWMV

trvcam

pebv trvfso

TSVTCM

Рисунок 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе выравнивания аминокислотных последовательностей белков оболочки палочковидных вирусов растений.

al., • 1991;, Koonin and ßolja, 1993). Филогенетическая реконструкция показывает, что белки оболочки pslv, bsmv и lrsv наиболее • близкородственны фуровирусу pcv, но имеют ограниченное сходство с белками оболочки . других фуровирусов (рис. 2). Приведенный результат филогенетической реконструкции подтверждает данные о значительных отличиях между некоторыми палочковидными вирусами, переносимыми хитридиевыми грибами (fungus-borne viruses ) и в настоящее время объединенными в группу фуровирусов

(Koonin and Dolja, 1993; Shirako and Wilson, 1993).

4. Предполагаемые хеликазы, кодируемые тройным блоком генов гордеивирусов и другими вирусами растений.

Brakke et ai. (1988) показали, что бОК-белок bsmv является мажорным белком, ассоциированным с РНК на ранних стадиях вирусной инфекции. Установлено, что тсвр1 bsmv и потексвирусов обладают NTP- И PHK-Связывающими активностями In vitro (Donald et al., 1994; Rouleau et al., 1994; A.O.Jackson, personal communication; Калиина и др., неопубликованные данные). Аминокислотные замены в любом из шести консервативных мотивов этр-азного/хеликазного домена рь белка bsmv (Gorbaienya et al., 1988) приводят к полной потере вирусной транспортной функции (Donald et al., 1994). На основании приведенных выше данных, можно предположить, . что

б

транспортная функция,' в обеспечении которой участвуют TGBpi bsmv и потексвирусов, АТФ-зависиыая.

TGBpl pslv и lrsv им8ют молвкулярную мэссу 63 КДа и 50 КДа, соответственно, и содержат полный набор мотивов ntp-эзы (рис. 3). Выравнивание последовательностей тсвр1 белков показывает, что в пределах консервативного ытр-азного/хеликазного домена белки pslv и LRSV демонстрируют высокую степень сходства с соответствующими белками bsmv и фуровирусов pcv, nvmv, pmtv и bnyw, и меньшее, но все же достаточно значительное сходство с TGBpi потеке- и карлавирусов (рис. 3).

В отличие от TGBpi потеке- и карлавирусов, вся последовательность которых представлена только

NTP-азным/хвликазным доменом, TGBpi фуро- и гордвивирусов имеют удлиненный N-конец, значительно варьирующий как по длине, так и по аминокислотной последовательности (рис. 3). ы-концевые' домены TOBpi PSbv и bsmv имеют определенное сходство друг с другом , но не имеют статистически достоверного сходства с соответствующим доменом. TGBpi lrsv, что отражает эволюционную удаленность lrsv от двух других гордвивирусов. ...'■'

5. Сравнение малых гидрофобных белков, кодируемых тройным блоком генов.

Белки fiü и ре bsmv, а также tgbpî и твврз фуро-, потеке- и карлэвирусов содержат протяженные блоки незаряженных аминокислот, образуйте гидрофобные сегменты, способные ассоциировать с мембранами эукариотических клеток (Morozov et ai., 1987,- 1989). Установлено, что tgbp2 и tgbp3 потеке- и карлавирусов связываются с мембранами in vitro (Morozov et al., 1990, 1991). Кроме того, показано, что TGBp2 bsmv (Donald et al., 1993), bnyw (Richards and Tañada, 1992) и pvx (Калинина и др., неопубликованные данные) ассоциированы с. клеточной стенкой и мембранами в листьях инфацированных растений.

Выравнивание tgbpî lrsv, pslv и bsmv с tgbp2 фуро-, потекс-°и карлавирусов показывает, что молекулы тэврг организованы сходным образом и имеют консервативную гидрофильную область, которая расположена между двумя гидрофобными сегментами (рис. 4). Подобная . организация типична для мембранных белков, взаимодействующих с гидрофобными субстратами. Следует отметить, что с-концевой сегмент этих белков обогащен остатками цисгеина и гистидана (рис. 4). В некоторых случаях для увеличения

ВвМУ 58К МПМТКТУЕЕККТ

РЭЬУ 63К МЗОаЬНтаНОЫЕТРСУОЗЕКМЕЬНОГСЗШТОВДАБЗСАКЗЮтГБКТОЕТ

ВЭМУ 58К ЫаТОЗУКСУРЕЫЗТ1РК.............................УРТСОЕМаЗСКЗЗЗТ

РЭЬУ 63К АКТТОУКЕЗРБвЕЗЬЗаУЗАУЗС^ТОКСЕКЗАтаКЕАСЕЗКЕЗРКЗУРЗШСЕУКНТОТЕ

ВЭМУ 58К ЗКЬКЕТЬКУА1Х}ТРЬЗУтСАКЗКШЗЗПК0УРОУАС0ТРЬЗУШаАКЗК1Д)ЗЗО11(2УРа

РЭЬУ 63К TKAKSKRKKKNKKTPKEGTSKTTSBSSSAKNVESKESKK.QTKPKAVSP----ББОТЗУЛА

1Д8У БОК МШР1ЛГОГГМА10К1УК301гаЗ

РОТ 51К МЕт1гАРЗККК1,ЕЕКУКШ1ЭАК0АТОУЬЬЕКУОЕ0И«,БГЖ1,

РМТУ БОК МЕЗУРНаЗКРНКУККПЬРПКУЫРУОТОСЗЗОТГСЫАРХКШШКТОШКРОЗСР

ВвМУ 58К РЕЬКРКУККЗКККК10КРАОРЗОРШЬ---К©ЗТКСЗЗОУОЕЫУЗЕЭТТС18КЕААК---РЗЬУ 63К £ЕУ53АККАТККЕЗККОТКБКСЗАЕПЬ---ЫАОТКЬКАКА5ЕОКСРТ1РСТЗАЕАЗК1БЬ

ЬИЗУ БОК 0К0038ККККШКНОгаУУЕЫЗТКУаУРРЫЕвУТЬ11КУНЗУЕ31ПЕ1РТЗЫ011ТРРААЕ1Э

РОТ 51К ОКНЬ01ШгКЮ1Ю1КЕКТКТКАЕКУРРУ.................БУУЗРЕРУЕЫРМКШН

РМТУ БОК GNRЫEGDQTKNNKSDLQQPSEVHPEN............ОУЯРЕЗЗТСЕЗУКСЮЗЕРНЯУХ,

ВЭМУ 58К --ОКОКТРКЭУ...........КМОЗЫиШКРКАМЭТННБЕЬХЫКРООРУНЕТСЬКЗОРЕ

РвЬУ 63К Ь------------------------033ТАЕКРТКШтаКТА1ЛТтеРУА01НКРС1Е0СРЕ

1ЛЗУ БОК ЬРОКОКОЭКРР...............8УАККНААШК11НУЕКА1ЭАРМИК1УЕАЗКАЗСР(3

РОТ Б1К ЯЕЕРЕКЗЕЕЯЯ......СНКОУНШЗОЫРУС...........ООРЬКУ-ЬЗЕЕАЬКАаРО

РМТУ БОК Е0ККОЗСКТАС88та1РЕЕ(3<3«ЗЬО8АНУ1/ЗКНО1ЛЭРУАКЬСТЕЗСРК-УАКЬСУЕЗСРК

ВЫУУУ42К ^0У0ЯЕТССО---КСАКСдаАЗЗАРтаЗШ^0ПОЫЗКТНРПО1РЗУ-1ЕКТЬУЕ1ХЗУК

ЦУМУ ЗЭК ' МЗЕНАЕОУРМОРРЗУ-ЬЕЗКСЯЗЦЗРУ

ВЭМУ 58К ГгеЕ0УРНАКЗНРРЕМ1К1ЛЗЬУПКНЬКЕСМАКАС-ТЬЕКЕЯЬКККЫ,ЬУКАЬКРАУРР1, РвЬУ 63К РТСК0УМНАКАЫХ.РЕЬУСЬНЫЬУМЕНГ,ККТААКАС-НРТКПК1ЕККЬРЬТ2ЫНКРЗУОР1. 1ЖЗУ БОК РТСОЫРККСРАЫЬРЕКСКЬ1Ш,УОКНЬКУШКОАС-ОЗЕКЕК1ААКЗРЬНЯЗЬКРтгаРК РОТ Б1К НтеКУМКНРРАВУРЕКЗКР1ОМГОКНЬТТЬКЕКАССККЕ|Ш0108КЬ10ЬК0ЬКРЗаЭРЬ РМТУ БОК ЗТСКРЬККУРАЕРРКЗЗСЬЬЕКРОКУЬЗЗЯШКССЫ130И-ЕЗЕ\т,К>1ЬКЗК{1АЕОЗРЬ В№УУУ42К ШаУКРаНСВИСКЬКЕЗСА1ШРКСТЬЕ0Е1ЛКИС-0ЬТО1АААУК1Х)ТЬС)КУКТЗБОУГГ №/МУ ЗЭК УНиКСРИИСНггЛЬУВВаЬЬОБЬтГЬЬБЬРБИБС-БВНБЕААМУАВАУУСБРРПРОО^ РУХ 2БК мтьизькзьоуБктнкзи)

РУМ 2БК МОУХУОЬЬУКУКРЕКЬЗЖЬУ

i ' . 1а

ВЗМУ Б8К --ТС113СУРвЗСК8Т1УКТ1Л--К0ЕРРАУСА-ЦШРАЬ-ММ)У301ЕСУУ0ЦтЬ1.3 РЭЬУ 63К --УС1У8СУРСССК8Т1ЛПШ,Ь--П8Р18С™А-1ЛШРАТ-ЕЯВтеСТЗ№тТХХЮ1ЛЬА 1ЛЗУ БОК - -VGIVSGVAGSGKSTLIRKL~ --СББАОАМСУ-и^РНЬКЁТПУКаОЗКТР^ООУЫЗ РОТ 51К --АОТУ86УРОЗОК8таЬЮ1У--0ККЬКЫЗУСЬ-иШКЕЬК-СПРАСУР8УРЗУЕЕМЬЬЗ РМТУ БОК --АСАУТСУРазаКТТЬЬНКУ-0СЕ(ИРН31У1-ЬСЫРКЗК-ТЕРЗЫЬРЗСУТАКЕ1ЬЬЬ ВКУУУ4 2 К АКУвХУКдАРСУСКЭТЭ 1КЫЬХЛЭКР(УиШКМ\а,СЬРР80ЬЬЕОУРАОК1ЛЛТЬ\ГООХ,РСЙ ЫУМУ ЗЭК СКУСЬ\т5САа8СК8аУЬКЕУ---У0-00311Ь-УРНКЬМЬ-0РУЯСК-КУРТУЦЕМЬТК

РУХ 25К ЗСРЬУУНАУАСАСКЗТАЬЕКЬ1ЬИНРТРТУНТЬ0УР0КУЗХЕТКСЮК-РСР1РЕС----

РУМ 2БК С-Р1УУНСТРОАСК88ЫНЕЬЬЕизЗЕРСАУТАвУЕБ0РНЬЗСШ1НККЗС00РЕО----

Рисунок 3. (начало)

IX

III

ВБМУ 58К АУР1---ТЗПЬЬ1тЕУТ1ЛЕЗАЕ1Ь1Ь0НЯЬаАЗМУЬЬУСОУА0СКАТТА331ЕУ1ЛХР РЭЬУ 63К КУРМ---88ОЬЫАШЕУТ1АЕЗАЕ1Ы,Ь0ЕЕта38^Ы,УСП7А0СЕБША5М1ЕУЬтаР Г^БУ БОК 1УРМ---ТЗО1У1УЕЕУТЬАЕЗЛЕЕЕЬЬ0РКЬ0АТР1Ла,РСОУА0СНАКТАЗЗЕЕУЬ0РР РОТ 51К АУРЗ - - - ЗРИ-даЬ'ЛЗЕУТЬТОЗАЕХЬЬЬОНКШАК!^ЬРСВНЕОат1КЬТ5РЕИЫГОР РМТУ БОК О1А1---КСЕУЬЬ1ОЕУТЬЬТЗСЕ1ЬЬ1£К1таЗН1У1ЬРСПКА0СЗЗЩ'ЬСЗРЕ1'адУР ВМУ\ГУ42К ЗУВУв--КУШт\ГОЕУТКУКМСЕ1ЬУ1АаН1ЙУКЫУ1СРСОРАОСЬНУКАСЗА\ттаРР ИУМУ ЗЭК GLEFSтаPMRTLLVDEFTRYHLGEIFFLAAKYGIRNWLFGDHFQRSQRRNGSILLASIP

РУХ 25К.........ОТА1ШЕУТ.........иЭМТПЗДЗУОАЬРАОРУОАРЕРвЬЕ-РН.....

РУМ 25К.........КРУУЦЭЕУТ.........1.1"ТЕУРРУР-АЬРСОР103Ш'ЗАУ0ЯАО.....

ВЭМУ 58К У1УРЗЕТТУНЬа0ЕТЛЗЬСЗК0---СКИ1-УЗКОСЕСТУ11ТО-УШЕТЛЕТЕКШАРТУ РЭЬУ 63К VIYRKITSHRIGEETAKACSKQ---GNRI-RSAGRKDKLILV0-YEGETEETEK!1LAFTE

глбу бок уур15ктзне1хзкнтаеьсккн---с0арерсзрееое11уа1)-у1хдааоттек1т1артк

рсу 51к 1ур35033нервретакрсево---везь-есессеок1уксв-уесесептеульсрте риту бок vifqsltsrrfgkatanlcrrq---gfdf-eggehedkvvesp-yegsspatdi^iivfse внууу42к iiaecyasrrfgkatadlinssngggkpwgnnevkdswtfeelcgkildms-tуlvatr

муму зэк уьанзот51ж1ркш0р1,ьуер---сршусе0киксуте1,сньунее1руе>уру1лра1)

РУХ 25К - - РУЬЕТЗРРУРККУА01ДА- - -СеСРПРЕтаЗОЕЕСтЕ1Т01РКС- -РЬЬСКУХАМЕ РУМ 25К --FVCSVSRRFGSATCGLLR.....ЕШдаптЗЕКАШ,У<2УЗВ1УТК--ОРЬСКУУРБЕЕ

)_V_> <_VI • |

ВБМУ 58К ОТУР.П7КВСаУВСАЬА1СУ0СКЕРВЗТТЬРЬЯИЕ-ПаКА1АВКНЬЯЬУАЬЗЯНКЗКЕ11К РЭЬУ 63К ЕТР.ООУКССаУПСЗЬУЗЕУОСЬЕУЕЗУТЬРЬЯНТ-ОЯАААЗОННКН'П/ЗМТРНКЗЬЬИК Ц13У БОК ЕГУЕОЫШАаУЕАЗЬУЬЕТ<2СКЕУЕЗ УГЬР ШЕЭ-ОЕААКАВЗНЬРАУАЬТЕНЯККЬИК РСУ 51К ETKADLVEVQVEAFLVSSVQGRTFSSVSLFVREN-DKPVFSDPHLRLVAITRHRKLLSIR РМТУ БОК ЗТКЕПЬЕЕСС1ЕЗТЬУЗПУ0СКЕУКТУТЬР1РОЕ-ОКЕУ1,таАНЕаЗУАР8РНКРУЬЕ1Р. ВНУУУ42К ETQKFLLEDNIESILYSDAHGQTУDVVTIILEDEFDDAAICDPNVRAVLLTRARKGGMIK №ГМУ ЗЭК KTASMLVEADISCQL.VAGCQGRBFDNVCLWCGT-DLVGI-DQEELFVGLTRHKKSLRIM РУХ 2 5К ЕЗЕТТЬЗКНСУЕРУКРС0УТСЬЕРХУУТ^8АА--Р1ЕЕ1О05ТАРУНАтаЗКС1,ТУУК РУМ 25К ЕУССЫЛ8НСУЕАЬЗЬ0Е1ТС0ТРЕУУТГУТЗЕ - -Ы8РУ1№1АААУ0СМТН1ШТАШИ,С

ВБМУ Б8К АОАЕ1&0АРЬТСБ10ЬЗЗК-АЗ№ЗНЯУЗАКРОЕОНЗНРКАК

РЭЬУ 63К АЕОЕМОРРЬМОЕЬЗУБЗгаРЗКАНУУЗЗЕ

Ы^У БОК АЕРСУОЗЗРЬНСЕ--ЬКЗКТЗАБЗНКУЕЗЗКУЗУАОЗЗЗАААО

РСУ Б1К АОРЕТОУ5ГМГАТ---НЕвЕЕУОТНСУСЕЕНЯРОЕАЕ

РИТУ БОК СМРЕЬРКСЬПЮЕЬТЗКООРО'ПЖУаРЕ

ВКУУУ4 2К МСРШААНРКЖЗПРМЗРОУЗКЗСГСОТРСЕШ!.

МУМУ 39К АОЕВАЬАТЬЗБСЕЬУКЫХаЬУЗВСКвТСРР

РУХ 25К АСТ

РУМ 25К РПАТУТАА

Рисунок 3. Сравнение аминокислотных последовательностей тсврг белков трех гордеивирусов, четырех фуровирусов, потексвируса рух и карлавируса рум. Консервативные мотивы отмечены стрелками.

гидрофобности клеточных и' вирусных интегральных белков и их транспорта к мембранам наблюдается специфическая модкфикаг-я: аминокислотные остатки, содержащие гидроксильные группы, например

pslv 1sk

bsmv 1 4 к

lrsv 14k

p cv 14 к

pmtv 13k

bnyw 13k

nvmv 14k

piamv 12k

pvx 12k

wciMv 13k

smyeav 12 к

cymv 12k

nmv 14k

pmv 12k

lvx 12k

fmv пк

ShVX пк

• pvm 12к

cvb пк

PVS 12к

LSV 12к

PSLV 15к

BSMV 14к

LRSV 14к

pcv 14к

PMTV 13к

BNYW 13к

NVMV 14К

P1AMV 12К

pvx 12К

WCIMV 13К

SMYEAV 12К

CYMV 12К

NMV 14 к

PMV 12К

LVX 12К

FMV 11К

ShVX ПК

PVM 12К

CVB 11К

PVS 12К

LSV 12к

mpakttsvgsrpnkywp- -1vagigwglfaylifanqkh-stes-gd-nihkfanggsyrpgskcisyhrn-np mkttvgsrpnkywp-- ivagigwglfaylifsnqkh-stes-gd-nihkfanggsyrdgsksisynrn-hp mptqvaqrpnkywp-- iwgvgliglfayliftnqkh-atqs-gd-nihkfanggsyqdgnkrinynkn-nn mvkstvptrpnkywp- -gwaiglvslfiflsvsnqkh-stts-gd-nihkfsnggtyrdgskcitynrh-sp mvrnneigarpnkywp- -waawaiclfgfltvtnqkh-atqs-cp-nihkfangglyrdgsksikyncn-np ! msreitarpnknvp - - iwgvcwaffvllafmqqkh - kthsgcdygvptfsnggiyrdgtrsadfnsnnhr ¡

matqqgrfltqjcqdktwlylagvsvlglyvlvgylttspkw-rtasggpymvptfanggtyrdgtrmvsfnsntgr < msgahhltpptdyg---kpvlaasigislallvytatrs-tlphvgd-hlhalphggryvdgtksisyfspsas msaqghrltapvnse---kwivlglsfalvsitfllsrn-slphvgd-nihslphggayrdgtkailynspnlg '

mpltpppnpq---ktyqiailalglvllafvli-sdhspkvgd-hlhnlpfggeykdgtksikyfqrpnqj

mpltpppdhs- - -ityrilavglcsccaiyaatrs-tlphtgd-nlhslpyggkysdctksicysgpgpt i

mskapihltpppdhs---ktlfaawgvslavlvftltrs-tlphtgd-nihslphxghyrdgtkvigynspngt

hpgltppwyeqvykvl---aigfllcasxycl-rsnhlphvgd-nihslphggnyadgtkrvqyfrphss 1

msshqnf1tpppdhs---kailavavg7glaivlhfsl-syklpspg0-nihslpfggtyrdgtksiiynsphrg j

mpltpppdyt- --kpfiawvggtlaafvllltrn-tlphtgd-nlhslphggtvcdgtkriryggphrs (

mslsqgtgapaistpltlrpppdnt-- -kailtvaigiaaslvffmltrn-nlphvgd-nihslphggsyxdctksxnyrppasr j

msfapppdys- - -kiylalgcglglgfwyas-rvnhlphvgd-nthnlphggqycdgnkrvlysgpksg

mpltp p pd ft---kvylsaalgvslalwwllirs -tlpwgd-rdhnlphggwyrdgtks vf ynspgrl i

mpltpppdht- - - kvllvaaiglsi vas iltysrn-tlpqvgd - hshllphggvykdgtktyvyggprkl ¡

mpltpppnyt---glyiaaalgvslaawalftrs-tlpivgd-sqhnlphggryrdgtkaidyfkptkl j

mpltpppdyt---rvytalaigasiafftglitrn-tlpsvgd-liqhnlphggryrdgtksveycgprkl с

t i

fayg.....nass-----pgmllptlftiigivsyl- - -watrgbimggnspllghncgeecagbcvrgldrqblppnsv .'

fayg.....nass.....PGMLLPAMLTIIGIISYL- --HRTRDSVLGD--SGGNNSCGBDCQGECLNGHSRRSLLCD1G , j

laygykglsnass......vdlwmlglciaaiaagiygeylrkrk......hdecttcppdckicggwr

layn.....gsssn- - -ntlfwlcllglsmvwiaycg- - yksl........sgqwhs cqhd - knernflfecfe ¡

rayn.....gsssn- - -ntfsqlplpvlligaalyäyl-wftrpd........csvtcrgdccrsygg i

-aygcggsggsvssrvgqqlivlaivsvlivsllqrlrsppe.........hicngacg !

fpwainsrss.........lvdwviiliisvillhkfsgev............kdncgcngvshtc , • ;

ktrd............pfpfaflliltlsglilllsrrrsnp..........hscpscgtpha j

srvslhngk-......naafaavllltlliygskyisqrn..........- -htc-acgnnhssh 1

hslsktlaxsh......nttifllilglivtlhglhyfnnnrrvs.....s slhcvlcqnkh '

pdipth...........lpallvlvlwaiyassrldfsvn-----------yrcscrvhnrsgq ,

rsgpqkt..........iplvlaxilpaiiyalshrrsp.............hpcsnplcpalhnqg i

tstnhky..........talca vltlsllifaqtrlaagnrit.......svsichhcssqgslsggnhgrvsghselptt

PGQSG......

hvpeEpaks--

co

P. —

о ш

2 to

<15 0\

2 --I

О ?

с

p.

03

Й a

о >>

© ш

CO

a.

to >i

К

sspt........

nsiearkapll-nsleggfnlpv-nsvepgnywyt-nsvesgsrhtf-

-alpiitvfaizectlhvlrkrdnpvrp-

----wal i twa ilialh f s clrthr---

--ypssnllvslhqïspqysfsshshi -hnlwpfitvialtlailltscprrr----gqpwaiwllvlliwashklgr-- •----

--qpwflvillsaaifllscrsg-.....

--QPKLLVZLLVALICLSGRHAQ......

--q pw llvivlval11algrqg-......

-qhsdcpncs --vhrcvlchttsg

--vcircsqhh -pncracagsht --hrrvcgqch --CCPRCNRVHSA -hncracgrsh

H

о и

a

i

¡a

остатки цистеина, ацилируются жирными кислотами. Другим местом модификации может быть я-концевая аминокислота полипептидной цепи. Описан пример подобных модификаций для маленького мембранного белка альфавирусов (Gaedigk-Nitschko et al., 1990)', Можно предположить, что с-сегмент tgbp2 играет сходную роль в "заякоривашш" данного Сежа в специфическом сайте плазматической ' мембраны инфицированных клеток.

Аминокислотные последовательности TGBp3 lrsv, pslv и bsmv в значительной степени сходны как друг с другом, так и с таковыми товрз pcv и pmtv (рис. 5). Все эти белки (обозначенные здесь как группа i TGBp3; рис.''6) имеют два высококонсервативных гидрофобных сегмента и ' характерный , консенсус His-x-x-x-cys-x-cys-x-x-cys на м-конце (рис.. 5.). Однако, tgbp3 белки группы i не имеют статистически значимого сходства с tgbp3 ПОТеКС- И КарлаВИруСОВ (группа II ТСВрЗ/ Morozov et al., 1991). TGBp3 белки, группы х обладают двумя грансмембранными доменами, тогда как TGBp3 группы и имеют только один трансмембранный домен (рис. 6).

' TGBp3 белки BNYW и NVMV также содержат два гидрофобных сегмента, но аминокислотные последовательности этих сегментов не имеют сходства как друг, с другом, так и с белками группы i. Таким образом, в отличие . от TGBp2 .белков,- которые . образуют монофилетическое ;■ семейство, теврз белки, по-видимому, . имеют разное происхождение... ■.,••"•

Ориентация молекул интегральных белков в мембране зависит от суммарного заряда N-концевой части., бежа, . предшествующей гидрофобному сегменту. Согласно современной точке зрения, положительно и отрицательно заряженные ы-концевые части бежов имеют различную ориентацию в мембране: положительно заряженные сегменты экспонированы в цитоплазму, а отрицательно заряженные -в экстрацеллюлярное -пространство (von Heijne, гэва,- sipos and von Heijne, 1993). Основываясь на этой, точке зрения, мы предполагаем, что молекулы теврг могут быть интегрированы в .мембране в конфигурации, напоминающей букву v, причем л- и с-концевые ..' сегменты при этом погружены . в цитоплазму; а центральный гидрофильный район экспонирован в экстрацеллюлярное пространство (рис. 7). Сходная конфигурация, но с противоположной ориентацией в мембране, может быть предложена для теврз белков гордеивирусов, pmtv и pcv (рис. 7). Возможно, что трансиортная функция белков TGBp2 и TGBp3 зависит от специфики их ассоциации с

BSMV 17K MAMPHPLECCCPQCLPSSESFPIYGEQEIPC-SETQAETTPV-EKTVRANVLTDILD PSLV 18K MAMPHLLGCSCPLCSQSSESFPIYGPPEERLWEETPPSSATIVERNAPENVFVAWID

LRSV 1BK MPHPLTCGCSDCVLP----PLGREFTESIYANENMMSAPPAPQTAKSV-VGG--D

PCV 17K MEAPAITHSSGCVCSDCQWS.......GSPTVDTKVYLGSGTHANTTKTRETSFLSVLND

PMTV 21K MDPPVIIHSPNCSCQFCSSE.....--LPSTHTCGSQDQTVPLHVEATAAGHMEVKNFSL

BSMV 17K DHYYAILASLFIIALWLLYIYLSSI-- - PT-ETGPYFYQDLHSVKI - YGIG-ATNTEVIA PSLV X8K RNYLLILCSLALLSVSLAYIYFTSGNNNPY-VKGGYFYQDLHSVEVRFGEH- PVDPKVIA LRSV 18K DLFLMMYSFLAGVLLTLLVIWSVGGTTCSNPQKASYYYQDLHKIEMEVAPGSPIDPEVIK

PCV 17K NAWLFVIAALILCLYFIISKPHVDA---VYTE----FHQDLNGFSMKLAPGVPIDPKVIA

PMTV 21K QYVLLVA - - FVSVLLGFS FCVYLKSMSNDEASDTTYYYQDLHS VE IKLGKN - PLDPEVIК

BSMV 17K AIHHWQKYPFOESPMWG---GLISVLSI................................

PSLV 18K SIHHWQKNPFGVSPLWE---GLNNLVSS............-...................

LRSV 18K AIHHFQNFPYGRTPGLGWIDDVTTLVfV....................i...........

PCV 17K AVKNWQK YPFCTOPRBN- - -MVTSIVSG................................

PMTV 2 IK AVHSFQEFPYGNIASSIRREAEFDVQNDESSAWLSGSNNNRRQVASTPCENNVLLKLWK

BSMV 17K LLKPLTLVFALSFFLLLSSKR PSLV 18K LVSALKFYVGLLFLLLLIIIFK LRSV 18K WFTRLIY-LGIIFFFIWVFKNI PCV 17 К LRHS FCX LLLVWLLVYVCHKP PMTV 2IK DDLSFTIIAVTVLVGVMLARCPMTV

Рисунок 5. Сравнение аминокислотных последовательностей TGBp3 бежов i группы гордеи- и фуровирусов. Подчеркнуты трансмембранные погруженные спирали, предсказанные по методу Rao

Ь Argos (1986).

плазматической мембраной и клеточной стенкой вблизи плазмодесм, как В случае ЗОК бежа-TMV (Moore et al.; 1992,- Lucas and Giibertson, 1994). Известно, что белки могут составлять от 1/6 до 2/3 вещества мембраны. В первом случае они легко перемещаются в плоскости липидного бислоя. Скорость латерального движения бежов сильно снижается, если белки становятся главной составной частью мембраны. Мы предполагаем, что TGBp2 и TGBp3, встраиваясь в мембрану вблизи плазмодесм, понижают ее "текучесть" и стабилизируют и/или упорядочивают белки плазмодесм, тем самым облегчая транспорт нуклеиновых кислот.

6. Анализ нуклеотидных последовательностей 3'-концевых областей

РНКа pslv, РНКа lrsv и PHKr lrsv.

Для выяснения особенностей первичной структуры и филогенетических связей pslv и lrsv с гордеивирусом bsmv нами были определены нуклеотидные последовательности 3'-концевых областей РНКа pslv, РНКа lrsv и PHKr lrsv. Интерес к анализу первичной структуры РНКа pslv, РНКа lrsv и РНК? lrsv объясняется следующими особенностями гордеивирусов: во-первых, для bsmv

Группе I

ВЭМУ 17К РЭЬУ 17К ЬЙБУ 17К

РСУ 17К

Группа и рта вк

Р1АМУ 13К СУОТ 7К РУМ 7 К СУВ 7К

Ж

I—I

1Ш_

1 щи

JUL

тсврз-белки, не принадлежащие ни к одной из двух групп

BNYW 13К NVMV ?К

Рисунок 6. Схема организации молекул тсврз белков. Пояснения в тексте.

TGBp2 ТСВрЗ

0

N ©

и

cytoplasm

Рисунок 7.'

Предполагаемое расположение молекул тсврг белков и молекул тсврз белков группы I в ' плазматической мембране- .

показано, что белки, "ассоциированные с репликацией, прямо вовлечены В транспорт вирусов (Petty et al, 1990b; Petty et al, 1994; Weiland & Edwards, 1994); ВОНВТОрых, Petty et al,(1994), Donald s. Jackson, (1995) показали, что rb - авторегуляторный белок, который также осуществляет транс-активаторную регуляцию генов РНК/?,

Общая длина секвенированного • района РНКа pslv (без учета 3'-нетранслируемой области) составила 1390 нуклеотидов: длина секвенированного района РНКа lrsv (без учета внутреннего Поли(А)-тракта) составила 1573 нуклеотида; длина секвенированного района PHKr lrsv (без учета внутреннего поли(А)-тракта) составила 1538 нуклеотидов,

'6.1 Выявление кодирующих районов. .•._.-'».■'

В последовательности 3'-концевых районов РНК« pslv и РНК« lrsv обнаружено по одной неполной ОРТ, которые, согласно критерию Трифонова (Trífonov, 1987), могут быть экспрессируемыми in Viro генами. В последовательности секвенированного района PHKr lrsv обнаружено две ОРТ, отделенных друг, от друга уридин-богатым межцистронным районом, Аминокислотная последовательность белка, кодируемого 5'-проксимальной ОРТ РНК? lrsv, имеет значительное сходство с С-концевым сегментом га белка bsmv, з < -проксимальная ОРТ способна кодировать белок с мол, массой 15761Да, имеющий сходство с I7K белком bsmv и 20К белком pslv. ;

7.Анализ первичной структуры белков, кодируемых РНКа pslv, РНКа lrsv И PHKr lrsv. 7tl Белок аа pslv и lrsv.

Сравнение аминокислотных последовательностей С-концевыХ районов аа белков pslv и lrsv. выявило протяженную область сходства с С-концевым районом аа белка bsmv. с-концевая область сходства высокомолекулярных аа белков, гордеивирусов включает консервативный кгр-связыващий/хеликазный домен. Известно, что наибольшим сходством ытр-связывающий/хеликазный домен обладает с указаными доменами тобамо-, тобра-, клостеро- и трикорнавирусов

(Gustafson et. al,, 1989; Petty et al., 1990a; Koanin & Dolja,

1993)..',' которые были;. отнесены к тобамо-подобной ветви Синдбис-подобк х вирусов. К аа белку bsmv в пределах ntp-связывавдего/хеликазного домена ближе всего С-концевая часть «а белка pslv (64.W идентичных аминокислотных остатков) и

С-концевая часть ста белка lrsv (58.8% идентичных аминокислотных остатков), что позволяет отнести pslv и lrsv к группе гордеивирусов и тобамо-подобной ветви Синдбис-подобных вирусов.

Большой интерес для нас представляла организация области аа белков pslv и lrsv, соответствующей району с 2218 по 2454 нуклеотидный остаток РНК« bsmv, так как показано, что .способность штамма cv42 bsmv системно инфицировать овес картируется именно в этой области РНКа, и наиболее важным для вирулентности штамма cv42 bsmv является остаток треонина в положении 724 белка аа

(Weiland 6 Edwards, 1994).

Сравнение аминокислотных последовательностей внутренних районов, аа белков pslv и lrsv с районом bsmv, определяющем способность штамма cv42 системно инфецировать овес, показывает, что аминокислотные последовательности pslv и lrsv в соответствующем районе значительно сильнее отличаются от тйКовых трех итаммов bsmv чем другие районы белков (Рис. 8). Это возможно' следствие функций этого сегмента аа белков в адаптации к определенному типу хозяев.

cv42 t--......kt-k................-..........i..........-........

ND18 PLNARFYSFOSLQPGWVFKTPSHSEVOHSYAVHFDFXTVGTDPBESLAFCRMVPISIfDKS

type ............r.........................x---l.................

PSLV ---GKIF-YKDGNAK-I-RE-TAADT--A.....--YGDEQ-I-KC-SY-T--S-H--R-

LRSV P-SS.YI.YSCEKMS-MLR--KPT----DFT---K-RQ-SEEI--C-EY-TITEVR--R-

Рисунок 8. Сравнение аминокислотных последовательностей внутреннего района bsmv-ndib с 714 по 775 аминокислотный остаток с соответствующими районами аа белков pslv, lrsv и штаммов туре и cv42 bsmv. Аминокислотные остатки ' идентичные таковым в Последовательности штамма, ndis-обозначены (-). Точки введены для оптимизации выравнивания.

7.2 та белок lrsv.

Сравнение последовательности С-концевой части га белка lrsv с выявило протяженную область сходства с С-концевыми райономи га белков bsmv и pslv. С-концевая область: аминокислотной последовательности га белка lrsv протяженностью около 250 аминокислотных остатков, содержит ряд консервативных мотивов, характерных для РНК-зависимых РНК полимераз всех (+)РНК содержащих вирусов. Наибольшее сходство наблюдается с РНК-полимеразными доменами РНК-репликаз гордеивирусов bsmv и pslv -(75% идентичных аминокислотных остатков и 72.3% идентичных аминокислотных остатков, соответственно).,.

7.3 Цистен-богатый белок lrsv.

3'-проксимальная ОРТ PHKr lrsv кодирует гъ белок с мол. массой I6K. 3'-проксимальные ОРТ bsmv и pslv также кодируют гъ белки (Gustafson et al., 1987; Agranovsky at al., 1992) гомологичные I6K белку lrsv (Рис. 9).

Аминокислотные последовательности гъ белков гордеивирусов содержат области сходства с двумя цистеинбогатыми . белками фуровирусов: белком I5K, который кодируется PHKI pcv, и белком I9K, который кодируется ÎHK2 sbwmv. Области сходства включают CI домен, содержащий два консервативных остатка цистеина; район основных аминокислот, обогащенный лиэиновыми и аргининовыми аминокислотными остатками; и С2 домен, содержащий два консервативных остатка цистеина и один консервативный остаток 'гистидина (Рис. 9). Предполагается, что район основных аминокислот и цистеинбогатые домены CI и С2 формируют так называемые цинк-связывающие "пальцы". Однако, у 15К-белка pcv полностью отсутствует CI-домен, а район основных аминокислот локализован непосредственно на n-конце (Рис. 10),

Долгое время значение этих белков для развития вирусной инфекции оставалось неясным. Лишь в последние годы было показано, что замена цистеиновых остатков (которые консервируются у четырех вирусов) на остатки серина в CI-домене bsmv, приводит к повелению листьев и повышению синтеза rb белка в растениях, инфицированных мутантным вирусом. Замена гистидинового остатка и двух цистеиновых остатков (которые консервируются у пяти вирусов) в С2-домене приводит к появлению аттенуированных симптомов и снижению синтеза белка .оболочки и fib белка в растениях, ийокулированных мутантными вирус ЛИ (Donald & Jackson, 1995). Кроме того показано, что гь белок связывается с одноцепочечной РНК, а главную роль в этом процессе играют остатки лизина и аргинина района основных аминокислот. Таким образом, не исключена возможность того, что „по аналогии с ть белком bsmv, цистеин-богатые ' белки гордеивирусов ' и фуровирусов pcv и sbwmv являются РНК-связывающими регуляторными белками.

Сравнение аминокислитных последовательностей ть белков гордеивирусов и сходных с ними белков фуровирусов показало идентичную организацию их С-концевых районов. Молекулы упомянутых цистеинбогатыл белков на С-конце имеют трипептид: ser-Arg-Leu с единственной заменой аргининового остатка на остаток серина у sbwmv. Возможно, С-концевая консервативная структура ser-Arg-Leu

bsmv

pslv

lrsv

sbwmv

pcv

bsmv

pslv

lrsv

sbwmv

pcv

bsmv

pslv

lrsv

sbwmv

pcv

bsmv

pslv

lrsv

sbwmv

pcv

CI

|-j-j-;-j-л xjooocoooocooooocxkxx

mmatfscvccg..........tsttstycgkrcerk - hvy sgtrnkrl -elykk

mstdlcsvcgnvkdvstfvesqedgkfcsakclrk-atfrrvr-kqlaeeylk

mas s pnvkvctmcc........ivfdselefcs pkcetr-agfkser - krraelfak

mstvgfhtcasc............vdgpk - - sikcvsk- - - yrisvyktlg.....

mpkseffreerkrrva-- - - -

C2

XXXXX I-1

I * * I

yll- epqkcalngivghscgmp----csia-- --eeacdqlpivsr---fcgqkhad

hdl-ipvscqlnsfpgyhcgm.....isal----emdpsgkpw---mnfcgqkhea

hnl -taktcglnkfpaescgmyani........aehqlpdgtttltiddycgskhyy

- -l-dwkcrlpadcgvncgmpaaf-......vleqghpklt----mdgycgekhrg '

-llgedavcklkgvcgyscgmppavekvsvpadteedvymltfpy- -eqfcgekhfk '

lydsllkrseqell.....leflqkkmqelk...............lshivkma-kl

lalalkakdgaklr.....leylerrfyqmkdv.........yarrldriaenl - kb

qggllavmsdtelk.....iraaalklehqr.......:----atavakgik- -lake

yvls-gawrhaqlrslnaeldtleareeslraqikalsagdhcpavlayvpkkltkl lyeslkdvsddelkr----lrrlerqretllas.........fqqklkrydeki - al

e......sev----nairksvassfedsvgcddsss................vskl

ernrlttsgt----itvkrrlttsgtitvkrdgeeskqlevsvpmttadffklskl

laalrns.........-....................................skl

kaevhdvtgkkqvcitglvkkqvcitglvdvmdsalvrlapdsppk----<-kissl

......lsek----fknlr..................................skl

Рисунок 9. Сравнение аминокислотных последовательностей цистеинбогатых белков трех гордеивирусов (вбму, pslv и lrsv) и двух фуровирусов (эвуму и рот) . Консервативные остатки цистеина отмечены - *. С1, С2 домены и район основных аминокислот отмечены над аминокислотными последовательностями. Выделены идентичные аминокислотные остатки. Пробелы введены для оптимизации выравнивания.

является сигналом, узнаваемым определенными клеточными белками.

8.1 Конструирование рекомбинантов на основе геномов bshv и pslv.

Рекомбинантные геномы были получены на основе полноразмерных кДНК копий РНКа, РНК/з и РНКг штамма шхв bsmv. кДНК копии геномных РНК bsmv находятся в транскрипционных' векторах pzfi9u под контролем промотора РНК-полимеразы фага Т7, что позволяет получать инфекционные транскрипты in vitro (Petty et al., 1988; Petty et ai., 1989). Инфекционные кДНК копии были лхйезно предоставлены проф. А.О. Джексоном.

Используя полноразмерную кДНК копию мы заменяли фрагменты РНК/з bsmv на соответствующие им районы PHK/î pslv. Для замены фрагментов использовались сайты: Ncol, ».saiGl, PstI и Muni -,

»

BSMV N—| CI MM—I tfS 1-—-*c

psbv- m-| tl 1дд1 | i i i-2m-*c

lrsv

SBWMV '

pcrv kHMI—j " d }-~-*c

Рисунбк 1Й. Схема организации пяти цистеннбогатых белков трех .горда ивиру сов и двух фуровирусов. Затемненные прямоугольники соответствуют району основных аминокислот. CI и С2 - цистека богатый домены. Шифрами обозначено количество аминокислотных остатков в неконсервативной области соответствуют* белков. * -С-концавой трипептид Ser-Arg-Leu.

удрбно расположенные в последовательности РНК£ bsmv. для того чтобы облегчить клонирование генов pslv в кДНК копию РНКэ bsmv, с помощь» ПЦР в кДНК клон pslv были введены сайты: Ncol, saiol, и pstl по позициям аналогичных сайтам в PHK/J bsmv (Рис, II). Крою того, при конструировании рекомбинантов также использовался сайт Muni, расположенные в идентичных позициях последовательностей генов тавр2 bsmv и pslv (Рис. II). Таким образом, мы сконструировали пять рекомбинантных РН№ (соответствунцие клоны названы Р684, Р690, ММ4, PS3 и Р87).

8.2 ИвфакцйОННОСТЬ рекомбинантных вирусов ДЛЯ С. emarantlcolar.

Рекомбинантные РНКЭ или РНКя bsmv, полученные при

ТраВСКрИПЦИИ СООТВеТСТВУПЦИХ ПОЛНЫХ КДНК КОПИЙ (Р684, Р690, ММ4, ps3 и ps7) совместно с транскрштами кДНК копий РНКа и PHKr bsmv использовались для инокуляции листьев с. amaranticoior. В дальнейшем под обозначениями Р684, рбэо, мм4, ps3 и ps7 подразумеваются рекоибина—гные трехкошюнентные вирусы, геном которых представлен РЕК» и PHKr bsmv, а р-компонент представляет собой транскрипт соответствущего рекоыбинантного кДНК клона.

Некрозы, которые вызывал рекомбинант PS7 по размеру и форме были похожи на некрозы, вызываемые штаммом шхв bsmv через 5 дней после инокуляции. Рекомбинант Р684 вызывал локальные некрозы

n-1 с1

n-1 с1

ТГ

"СГ

61

109

-*С

-*с

#

вод

ИНАЯ

хЖ:

"яСГ

"мЬ вЬп

(•«¡ШМ о»

С*атагап1ко!аг

ВШУ сое* ргеЫя

в

мм

■¿^Ч* ---р;-!,

*1о1 д«

гет х ____^ ^-„„1-

иг

Рисунок ii. а - схема организации е-компонентов геномов взму и рбы/. б - схема организации рекомбинантных РНКо, сконструированных на основе /з-компанентов геномов взму и рзьу и их инфекционность для С. атагапасо1ог.

через 7 дней после инокуляции, но в сравнений с некрозами, вызываемыми штаммом ктэ взму и рекомбинантом рб7, эта некрозы были меньшего размера. Рекомбинанты Рбэо, мм4 и рэз не давали никаких симптомов на листьях с. атагапИсо1ог.

Листья инокулированных растений анализировали через 7 дней после инокуляции методом иммуноблотинга. в качестве специфических антител использовались антитела к белку оболочки вэму. Белок оболочки вбму был выявлен в листьях с. аиагаписо1ог, инокулированных вирусом дикого типа и рекомбинантными вирусами Р87 И-Р684, тогда как в листьях с. атагапНсо1ог, инокулированных рекомбинантными вирусами Рбэо, мм4 и рэз, белок вгму .не обнаружен.

Рекомбинант с заменой тройного блока генов вэму на тройной блок генов рбьу - р684, инфекционен для С. атагапИсо1ог. Этот

результат показывает, что тройной блок генов рвыг, необходимый для передачи вируса между соседними клетками отдельного листа, функционален в данном хозяине и совместим с геномом вбму в обеспечении вирусной транспортной функции. Задержка в появлении симптомов и уменьшение размера некротических пятен в сравнении с диким типом вбж/ может происходить в результате не полного функционального соответствия белков, кодируемых тройным блоком генов Рвьу, новому хозяину и/или вирусному геному.

Рекомбинант ъбт, экспрессирувдий химерный тсврг белок, на с. атагапй1со1ог вызывает симптомы сходные с симптомами, которые дает вирус дикого типа. Этот результат показывает, что н-концевые районы- тсвр1 белков взму и рэьу, последовательности, которых не консервативны, тем не менее функционально идентичны в с. 'alnaranticolor. Химерный тсврг белок с более длинным и-концевым районом рзьу (такой белок экспрессирует рекомбинант рзз), возможно, не функционален, что приводит к неспособности рекомбинантного вируса рэз распространяться между соседними клетками отдельного листа с. атагаписоаог. Интересно, что рекомбинантный вирус Рбэо с заменой района, кодирующего тавр1 вбму, на гомологичный район товр1 рбьу, а также рекомбинантный вирус мм4 с заменой двух перекрывающихся генов теврг и тсврз на соответствующие гены рзглг, не инфекционны для с. атагапИсо1ог, хотя тсврг, тсврг и тсврз белки Р8ЬУ, экспрессируемые этими рекомбинантами, функциональны в растениях, зараженных р684. Подобный феномен может объясняться тем, что для успешной координации тсвр1, тавр2 и тсврз белков в обеспечении функции транспорта вируса мевду соседними клетками отдельного листа, необходима совместимость гордеивиуусных тсвр1 белков с белками товр2 и тсврз.

выводы

1. Геномы рб1л/ и ьиэу клонированы в виде кДНК. Определена полная нуклеотидная последовательность э-компонентов геномов рэм/ и шзу, а также протяженных З'-концевых районов РНКа рэм/ и ьябу, и 3'-концевого района РНК* ыгэу. .

2. Выявлены консервативные структурные элементы в 5'- и З'-некодирувдих областях геномных РНК рбьу и глэу.

3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей . белков, кодируемых .рбьу и шву, позволил установить:

1) белки аа и та являются компонентами репликазы рэьу и ьибу;

2) 0а белки являются капсидными белками рбьу и LRSv;

3) 0Ь~, эс- -и /за-белки обладают характерными свойствами продуктов тройного блока транспортных генов вирусов растений;

4) ть белки рбьу и шву - цистеин-богатые регуляторные белкй

4. На основе геномов рэьу и взму сконструированы гибридные вирусы, экспрессируюпще химерные транспортные белки. Обнаружена инфекционность ряда гибридных вирусов для с. атагапИсо1ог, что подтверждает структурно-функциональную гомологию тройных блоков генов у гордеивирусов. В результате выявлено высокое сходство в организации геномов всех членов группы гордеивирусов. ,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.G.Solovyev, В.I.Savenkov, A.A.Agranovsky and S.Yu.Morozov "Nucleotide sequences and comparative analysis of rna beta in Poa Semilatent Virus and Lychnis Ringspot Virusi a putative role of the triple gene block as a determinant of hordeivirus host specifity", Abstracts of International Conference "Fundamental and applied problems in phytovirology", Ukraine Crimea, Yalta, 22-26 May, 1994, page 15.

2. A.G.Solovyev, В.X.Savenkov, S.Yu.Morozov, A.A.Agranovsky "Conserved and diverged elements in RNA/3 of three hordeiviruses", 4th International Congress of plant molecular biology, Amsterdam, June 19-24, 1994, Abstracts, number 1505.

'3. A.G.Solovyev, B.I.Savenkov & V.2. Grdzelishvili "Role of the triple gene block proteins of barley stripe mosaic virus and poa semilatent virus in determination of hordeiviruses symptom expression", Conference on'virus disease of Poaceae in Europe, Versailles, France, May, 15-18, 1995, Abstracts, number 43. 4. M.Kruere, R.Koenig, A.Hoffmann, U.Commandeur,

A.G.Solovyev, E.X.Savenkov and W.Burgermeieter "Restriction fragment length polymorphism analysis of reverse transcription-PCR products reaveals the existence of two major strain groups of beet necrotic yellow vein virus." Journal of General Virology (1994), 75, 1835-1842.