Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение возможности использования электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Кандыба, Дмитрий Николаевич, Москва

Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и пнтомниководства

На правах рукописи

Кандыба Дмитрий Николаевич

изучение возможности использования электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных

культур.

Специальность - 06. 01. 11- защита растений.

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научные руководители:

доктор с.-х. наук, академик РАСХН кандидат с.-х. наук

Кашин В. И. Приходько Ю.Н.

МОСКВА -1999

Содержание

Введение.....................................................................................4

Цели и задач исследований..............................................................6

Научная новизна и практическая ценность работы.................................7

Глава 1. Обзор литературы..................................................................................8

1.1. Вирусные, фитоплазменные и вирусоподобные болезни

ягодных культур.....................................................................8

1.2. Основные принципы и методы очистки вирусов и

вирусных белков....................................................................14

1.3. Особенности очистки непереносимых соком вирусов.....................23

1.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот......25

1.5. Использование электрофореза белков для изучения и диагностики вирусов..................................................................................33

1.6. Диагностика и анализ вирусов методом электрофореза нуклеиновых кислот................................................................36

Глава 2. Материалы и методы...............................................................................38

2.1. База исследований.................................................................38

2.2. Материалы и объекты исследований..........................................38

2.3. Методика выделения и очистки вирусспецифических белков............40

2.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот.....45

2.5. Методика проведения электрофореза.......................................48

Глава 3. Результаты исследований......................................................................51

3.1. Очистка и выявление методом электрофореза специфического

белка вируса хлороза жилок малины (ЯУСУ)................................51

3.2. Очистка и выявление методом электрофореза специфических белков вирусов крапчатости (БМУ) и морщинистости (8СУ) земляники......55

3.3. Очистка и выявление методом электрофореза специфических белков возбудителей вирусных и вирусоподобных болезней смородины

и крыжовника.....................................................................60

3.4. Изучение возможности использования разработанной методики для

выявления вирусов косточковых культур.....................................63

3.5. Очистка и выявления методом электрофореза специфических РНК вирусов ягодных культур........................................................65

3.6. Ожидаемый экономический эффект по использованию метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур...................68

3.7. Обсуждение результатов...........................................................................69

4. Выводы........................................................................................85

5. Рекомендации по практическому использованию....................................86

6. Список литературы.........................................................................87

7. Приложение...............................................................................104

Введение

Ягодные культуры в сильной степени поражаются вирусными и фито-плазменными заболеваниями. К настоящему времени число выявленных вирусов и фитоплазм составляет на землянике -27, малине -25, смородине -14, на крыжовнике 9 (R.H. Converse, 1987). Вредоносность этих заболеваний может быть значительной. Так, израстание на малине и реверсия на смородине могут вызывать полное бесплодие насаждений (Ю.Н. Помазков, 1975). Потери урожая малины в результате заражения мозаикой могут достигать 53% (Г.Т. Борзых, 1975; A.A. Кузнецова, 1970), на землянике от вирусов крапчатости и морщинистости урожаи уменьшаются в 1,7 раза (О.О. Белошапкина, 1986; В.Ю. Минаев, 1985). Из-за внутриклеточного характера паразитирования и теснейшей взаимосвязи цикла развития вирусов с жизнедеятельностью растений-хозяев борьба с этими патогенами в существующих насаждениях невозможна. Единственный эффективный способ снижения их вредоносности в условиях многофакторной динамичной системы адаптивного садоводства является использование высококачественного оздоровленного посадочного материала (В. И. Кашин, 1995).

Производство оздоровленного посадочного материала и фитовирусологи-ческие исследования, в целом, в настоящее время невозможны без современных методов экспресс-диагностики вирусов. К одним из таких методов относится иммуноферментный анализ, основанный на производстве антисывороток к вирусам. Однако область применения этого метода довольно ограничена ввиду наличия целого ряда так называемых соконепереносимых вирусов, частицы ко-

торых необратимо разрушаются либо в экстрактах сока, либо в процессе очистки. Получение антисывороток к таким вирусам в настоящее время не представляется возможным. Диагностика этих вирусов в настоящее время возможна только путём прививок на соответствующие растения - индикаторы, что весьма трудоёмко, требует наличия зимних теплиц и большого количества растений-индикаторов, в то время, как продолжительность теста составляет 1-2 года. Аналогичным образом осуществляется сейчас и диагностика фитоплазм, поражающих ягодные культуры: израстания малины, желтухи и позеленения лепестков земляники и т. д.

Исследования последних десятилетий показали возможность решения данной проблемы на основе использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот данных патогенов.

Широкое применение электрофорез получил в области фитопатологии первоначально как метод изучения, выделения и очистки нативных вирусных частиц. Позднее было признано использование данного метода для анализа кап-сидного вирусного бежа и нуклеиновых кислот. Данный метод позволяет установить природу болезнетворного агента (вироид, вирус или фитоплазменный организм), определить молекулярную массу, макроструктуру и концентрацию белков и нуклеиновых кислот, контролировать качество очистки вирусных препаратов и иммуноглобулинов, анализировать конечный продукт полимеразной цепной реакции и т.д. В последнее десятилетие электрофорез выделился в качестве самостоятельного метода диагностики некоторых флоэмограниченных ви-

русов, вироидов и считается единственным методом выявления так называемых критических вирусов.

В России и СНГ метод электрофореза использовали для диагностики вироидов веретеновидности клубней картофеля и карликовости хризантем (Т.Я. Васильева, 1985; Т.Б. Кастальева, К.А. Можаева, 1988; Ю.А. Леонтьева и др., 1988) и для изучения прижилковой мозаики и бороздчатости древесины винограда (H.A. Мулюкина, 1993); на ягодных культурах данный метод не испытывал ся.

В связи с выше изложенным, целью наших исследований являлось изучение возможности использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур.

В конкретные задачи исследований входило следующее:

1. Выделить и изучить методом электрофореза специфические белки возбудителей вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур.

2. Отработать методику выделения и анализа РНК для диагностики ряда непереносимых соком вирусов ягодных культур.

3. Оценить возможность использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для выделения безвирусных клонов ягодных культур.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Впервые разработана методика очистки и выявления методом электрофореза специфических белков и нуклеиновых кислот труднодиагностируемых вирусов хлороза жилок малины (КУСУ), морщинистости земляники (8СУ) и крапчато-сти земляники (8МУ) непосредственно из тканей растений хозяев.

Впервые выявлено наличие у КУСУ и 8СУ двух белков с молекулярными массами 52кД и 37кД, типичных для представителей группы рабдовирусов.

Впервые очищены и фракционированы методом электрофореза специфические белки возбудителей реверсии чёрной и красной смородины, а также нуклеиновые кислоты КУСУ, БМУ и 8СУ.

Практическое значение работы состоит в разработке методики тестирования наличия специфических белков и нуклеиновых кислот соконепереносимых вирусов ягодных культур, что позволяет сократить сроки их диагностики с 1-2 лет до 2 дней по сравнению с методом растений - индикаторов и в 43 раза снизить затраты на проведение диагностических тестов.

1. Обзор литературы

1.1. Вирусные, фитоплазменные и вирусоподобные болезни

ягодных культур

В 1994 году Европейской организацией защиты растений (ЕОЗР) были приняты сертификационные схемы получения свободного от патогенов посадочного материала ягодных культур (Certification schemes №№ 09,10,11 ЕРРО,1994). В этих схемах перечислены вирусы, фитоплазмы и вирусоподобные агенты, которые должны отсутствовать в сертифицируемых клонах, и описаны методы их тестирования (Таб. 1-3).

Схема получения сертифицированного посадочного материала земляники регламентирует подавляющее большинство известных вирусных и вирусоподобных патогенов этой культуры (Таб.1), за исключением неповируса кольцевой пятнистости томата (Том RSV), выявленного на этой культуре лишь в Северной Америке (N.N. Frasier et. al., 1961; R.H. Converse 1981).

Анализ таблицы 1 показывает, что из 22 регламентируемых патогенов земляники только четыре неповируса (AMV, SLRV, RRV, TBRV) и один илар-вирус (TSV) можно диагностировать механической инокуляцией сока растений травянистого индикатора Chenopodium quinoa, или методом иммуноферментно-го анализа (ИФА). Для выявления 12 сокопереносимых вирусов и вирусоподобных агентов земляники требуется наличие целого набора индикаторных клонов Fragaria vesca (UC-4; UC-5; UC-1; UC-6; UC-10; EMK; Alpina) и осуществление их прививки листочками тестируемых растений земляники методом Фрезера (N.W.Frazier, 1974а,б) в различных модификациях. Методы гибридизации нуклеиновых кислот и полимеразной цепной реакции, успешно испытанные для выявления вирусов слабого пожелтения краёв листьев и окаймления жилок земляники, пока ещё не используются в сертификационных программах из-за их высокой стоимости (R.H. Converse et. al., 1988; D.C. Stenger et.al., 1988; W.Jelkmann et.al., 1990). Диагностика 5 известных фитоплазмозов земляники

осуществляется по наличию характерных симптомов и методом электронной микроскопии.

Сертификационная схема ЕОЗР по малине (Табл. 2) включает фактически все важнейшие вирусы этой культуры, широко распространённые в России и Европе (Ю.Н. Приходько,1997; А.Т. Jones, 1986 и др.). В схему из-за ограниченной распространённости не включены сокоиереносимые вирусы погремковости табака (TRV) и некроза табака (TNV), обнаруженные на малине в Шотландии (С.Н. Cadman, 1961). Очевидно, редко встречается на малине и У-вирус картофеля (PVJ), серологически выявленный на этой культуре в Подмосковье (Ю.Н. Приходько, 1997). Однако, ввиду массового завоза различными коммерческими фирмами посадочного материала ежевики и малины из США, существует реальная опасность интродукции в нашу страну сокопереносимых вирусов кольцевой пятнистости томата (TomRSV), кольцевой пятнистости табака (TobRSV), штриховатости табака (TSV), рашпилевидности листьев черешни (CRLV) и афидофильного вируса скручивания листьев малины (RLCV), широко распространённых на культурах рода Rubus на американском континенте (R.H. Converse, 1987).

Из регламентируемых схемой ЕОЗР вирусов малины наиболее сложна диагностика вирусов мозаичного комплекса (BRNV, RLMV, RLSV и RINV), а также вирусов хлороза жилок малины (RVCV) и желтой пятнистости малины (RISV). Их выявление требует набора растений-индикаторов (здоровые растения R.occidentalis и RJdaeus сортов Horfolk Quant, Mailing Landmark и Mailing Promise), для инокуляции которых используют так называемый «бутылочный тест» или прививку сближением побегов (C.H.Cadman, 1961) в условиях зимних теплиц; продолжительность теста - не менее 1 года.

Видовой состав вирусов чёрной и красной смородины значительно беднее, чем у малины и земляники. Сертификационной схемой ЕОЗР регламентируется на смородине лишь 5 переносимых соком вирусов (неповирусы -AMV, SLRV, RRV, TBRV и кукумовирус огуречной мозаики) и 2 соконепереносимых патогена -вирус окаймления жилок крыжовника (GVBV) и реверсия смородины

(Таб. 3). Последние, однако, имеют наиболее важное экономическое значение (R.H. Converse, 1987). Для условий России необходимо также включение в схему рябухи смородины, повсеместно распространённой в Сибири (В.И. Гладких, 1978) и регулярно интродуцируемой с посадочным материалом в Европейскую часть нашей страны (О.Ю. Суркова, 1994). Кроме того, на наш взгляд, в схему сортификации необоснованно не включены такие вирусоподобные болезни смородины, как желтуха и инфекционная пестролистность, отмеченные в ряде стран Европы (C.Putz, 1972; J.Thresh, 1970;R.H. Converse, 1987) и в нечернозёмной зоне России (О.Ю. Суркова, 1994).

В качестве индикаторов для выявления GVBV рекомендуется использовать здоровые растения красной смородины сорта Йонхер ван Тете, для диагностики реверсии, желтухи и пестролистности -растения чёрной смородины сортов Амос Блэк, Болдуин и Оджибьён (R.H. Converse, 1987) или сорта Катюша (О.Ю. Суркова, 1994); к рябухе наиболее чувствителен сорт Голубка (В.И. Гладких, 1978). Индикаторы инокулируют прививкой щитками коры или верхушками побегов; продолжительность тестов -2года для реверсии и не менее 1 года-для остальных патогенов.

Все перечисленные в таблице 3 сокопереносимые вирусы, а также вирус окаймления жилок крыжовника, широко распространены также в Европейской части России на крыжовнике (Ю.Н. Приходько, О.Ю. Суркова, 1994).

Таким образом, все известные вирусы ягодных культур можно подразделить на две группы по способности к передаче с соком на травянистые растения. Как уже отмечалось выше, сокопереносимые вирусы диагностируются на травянистых индикаторах и методом ЙФА. Методика ИФА для выявления этих вирусов применительно к условиям средней полосы России детально отработана (OJO. Суркова, 1994; Ю.Н. Приходько, 1996; Ю.Н. Приходько и др., 1994, 1995; М.Т. Упадышев, 1996; Е.А. Лукьянова, 1998), и при условии наличия антисывороток и необходимого оборудования не представляет трудностей. Диагностика же непереносимых соком вирусов и вирусоподобных агентов по-прежнему осуществляется трудоёмким и дорогостоящим методом растений - индикато-

ров. Разработка экспресс -методов выявления этих патогенов является актуальнейшей задачей безвирусного питомниководства.

Таблица 1

Вирусы, фитоплазмы и вирусоподобные агенты земляники, регламентируемые сертификационной схемой Европейской организации защиты растений (Certification scheme №11 Pathogen -tested strawberry //OEPP/EPPO.-1994).

№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения -индикаторы

Переносимые соком вирусы

1 Неповирус мозаика резухи (Arabis mosaic nepovirus =AMV 1,3 Chenopodium quinoa

2 Неповирус кольцевой пятнистости малины (Raspberry ringspot nepovirus = RRV) 1,3 Chenopodium quinoa

3 Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники (strawberry latent ringspot nepovirus = SLRV) 1,3 Chenopodium quinoa

4 Неповирус чёрной кольчатости томата (Tomato black ring nepovirus = TBRV) 1,3 Chenopodium quinoa

5 Иларвирус штриховатости табака (Tobacco streak ilarvirus = TSV)*) 1.3 , Chenopodium quinoa

Непереносимые соком вирусы

1 Рабдовирус морщинистости земляники (strawberry crincle rhbdovirus -SCV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5

2 Вирус крапчатости земляники (strawberry mottle virus = SMV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5

3 Вирус слабого пожелтения краёв листьев земляники (strawberry mild yellow etge virus = SMYEV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5

4 Каулимовирус окаймления жилок земляники (strawberry vein banding caulimovirus =SVBV) 2 Fragaria vesca UC-6, UC-12

5 Латентный вирус С земляники (strawberry latent С virus - SLCV)*) 2 Fragaria vesca UC-5, EMC

6 Карлавирус ложного слабого пожелтения краёв листьев земляники (strawberry pseudo mild yellow edge virus = SPMYEV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-12, Alpine

Продолжение таблицы 1

№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения - индикаторы

Вирусоподобные агенты

1 Хлоротическая крапчатость (Chlorotic fleck)*) 2 Fragaria vesca EMB,EMK

2 Скручивание листьев (Leafroll)*) 2 Fragaria vesca UC-5

3 Ведьмина метла (Witches'broom)*) 2 Fragaria vesca UC-4,UC-5

4 Многоверхушечность(МиШрНег plant)*) 2 Fragaria vesca UC-4,UC-5

5 Перистость листьев (Feather-leaf) 2 F. vesca UC-1;4, Alpina

6 Паллидозиз (Pallidoses)*) 2 F. vesca UC-10/UC-11

Фито плазмы

1 Фитоплазма позеленения лепестков земляники (strawberry green petal phytoplasma) 1,4 Vinca rosea

2 Фитоплазма желтухи астр (Aster yellow phytoplasma)*) 4

3 Фитоплазма желтухи (Yellows phytoplasma)*) 4

4 Фитоплазма летального увядания (Lethal decline phytoplasma)*) 4

5 Риккетсия желтухи (Yellows ricket-sia)*) 4

Примечание: *) Патогены, отсутствующие в регионе ЕОЗР и подлежащие тестированию только в материале из других регионов; **) Тест—методы: 1 - Травянистые растения -индикаторы;

2 - Индикаторные клоны Fragaria vesca;

3 - Иммуноферментный анализ;

4 - Электронная микроскопия

Таблица 2

Вирусы и фитоплазмы малины, регламентируемые сертификационной схемой Европейской организации защиты растений (Certification scheme №10 Pathogen -tested materialofRubus//OEPP/EPPO.- 1994).

№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения -индикаторы

Переносимые соком вирусы

1 Неповирус мозаики резухи (AMV) Chenopodium quinoa

2 Неповирус кольцевой пятнистости малины (RRV) ^ LI _ Chenopodium quinoa

3 Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники (SLRV) _______1,3 Chenopodium quinoa

4 Неповирус чёрной кольчатости томатов (TBRV) 1,3 Chenopodium quinoa

5 Неповирус скручивания листьев черешни (