Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства рекомбинантных белков и вирусоподобных частиц ВИЧ-1, образованных при экспрессии рекомбинантных вирусов осповакцины

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Свойства рекомбинантных белков и вирусоподобных частиц ВИЧ-1, образованных при экспрессии рекомбинантных вирусов осповакцины"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР Институт вирусологии имени Д. И. Ивановского

На правах рукописи

УДК 578.828.6 + 578.821.51:577.21

ВЗОРОВ АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ И ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ ВИЧ-1, ОБРАЗОВАННЫХ ПРИ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСОВ ОСПОВАКЦИНЫ

(03.00.06 — вирусология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1991

•Работа выполнена на каФедре вирусологии ЦОЛИУВ.

Научный руководитель - член-корр.АМН СССР, профессор

. А.Г.БУКРИНСКАЯ

Официальные оппоненты:

Профессор•С.С.Маренникова Доктор мед.наук Е.Н.Прркудина

Велящее учреждение - 1ПШ иммунологии Ш СССР

Защита состоится " У« й/ • 1991 г. в

часов на заседании специализированного Ученого совета Д 001.20.01 при Институте вирусологии км.Д.И.Ивановского АМН СССР (Москва, '123098, ул.Гамалеи, 16)1

Автореферат разослан " ^" Л_1991 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института -вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

А.М.Яуковский

г

Актуальность проблемы.

Пандемия СЩЦ охватила страны Америки, Африки, Европы, угрожает сейчас пажей стране. Этиологическим агентом СПИД, как известно, является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В связи с этим изучение инфекции ВИЧ, разработка методов тестирования и профилактики является одной из самых актуальных проблем настоящего времени. Персдектизньм подходом для репеьля этой проблемы может быть использование рекомбинантных белкоб. В качестве- вектора для встраивания специфических генов используют крупные ДНК-содержащие вирусы, в частности, вирус осповакцины. Рекомбинантные белки, экспрессируемые вирусными генами, встроенными в эти векторные системы, по целому ряду данных сходны с природными аналогами, но в отличие от юцс они безопасны и более рентабельны. С пои'ощыэ рекомбинантных белков возможна разработка лечебные препаратов, специфических вакцин, необходимых д-ч контроля над ИИ-инфекцией. Кроме того, на модели рекомбинантных белков удобно исследовать молекулярные механизмы процессов, происходящих в зараженных i русом клетках. Изучение функций индивидуальных вирусных белков также осуществляется с помощью рекомбинантных вирусов, они позволят! провес.ти исследование не только путей Процес-скнга и созревания, но и роли отдельных белков в инфекционном процессе. • , •

Несмотря на интенсивное изучение ЗИЧ-инфекции многие стороны взаимодействия вируса с зараженной клеткой остаются нераскрытыми. Это относится в частности и к морфогенезу вирусных частщ и к роли отдельных белков в формировании вирионов. В связи с этим особую актуальность приобретает изучен»"» рекомбинантных белков gag и вот,

S '

основных структурных белков,, выполняющих важную функцию в морфогенезе ШЧ-1 и возможности формирования содержащих их вирусоподобных частиц. Кроме того, продукция антител к этим белкам является оснсг-нш клиническим показ' телем в диагностике ВИЧ-инфекции. Пор?ому большое значение имеет разработка тест-систем, где в качестве антигена применяются рекомбинвнгные gag и env белки. .

Цель работы . заключалась в изучении рекомбинактньж белков, экс дрессируемых при заражении клеток вирусами оспсвакцин« vCo и vi£34£ со встроенными генами gag и env вируса иммунодефицита человека первого типа, образуемых вирусоподобных частиц, содержащих эти белки, и разработка подтверждающих тестов для диагностики СПИД ка основе ,рекомбинантных белкоЕ.

. В связи с этим в задачи исследования ехззкло: • *.. I. Изучение локализации и кинетики накопления реком^кактнч; белков-,з клетках.

• 2. Изучение продессинга рекомбинантных белков.

3. Динамика образования и свойстве вирусоподобных частал.

4. Характеристика »^¡муногенньзс свойств рекомбинантных' белков и вирусоподобных частиц.

5. Изучение действия антивирусных хиыиопрепаратов не модели рекомбинантных белков.

6. Разработка крупномасштабных методов культивирования для увеличения продукции рекомбинантнкх белков.

7. Разработка подтвержаагадкх тестов для сиагностики wjL-Д на основе белков, продуцируешь рекокбинак'гнк'ми вирусами.

Научная новизна и практическая ценность.

Установлено, что рекомбинантный белок-предшественник гена gag ZpGO, в котором отсутствует 71 аминокислота о С-конца, т.е. отсутствует рб и часть р9, обладает радом свойств, присущих природному аналогу. Он обнаружен в составе гладких и шероховатых: клеточных мембран, что, вероятно, свидетельствует о его шфистил про ванта, а также небольшое его количество обнаружено в ядре и в цитоэоле. Белок гр50, как и нативный белок-прьдпественник роб, нарезается вирус-специфической протеазой с образованием промежуточного предшественника грЗЭ и зрелых .белков гр24 и 17.

Установлено, что белок rgpI60, продуцируемый рекомбинан-тнки штаммом вируса осповакцины "»E234I. как и его природный аналог нарезается до образования зрелых белков rgpI20 и 41. Нарезание rgpIbO- осуществляется клеточными протеазами и .происходит,по-видимому, в кислых вакуолях, .так как при использовании слабого основания 'хлористого слмон'/к) происходило ингкбирование процесс'инга. Рекойби-нантные env белки rgpI60 и 120 обнаружены в гладких мембрана", в шероховатых иембрг: х обнаружен только xgpI60. Показана секреция rgpI20 в куяьтуральну» жидкость. Рекомбинантные env .'белки экспонированы на клеточной поверхности к способны образовывать сизигий.

При заражении клеток C7-I рекомбинантнш вирусом осповакг*-нк vC5 .образовывались вирусоподобные частицы, почкующиеся с клеточной поверхности. По своим свойствам и ыорфологаческик особенностям они напоминали дефектные го нарезании gag предшественника вирио-чк ЭДЧ. Дря двойном заражении клеток С V-I рекомбинантнкш вирусами ■ осповакцикы, содержащими гены gag ,и eav , происходила экспрессия белков sag и вит , бели* env вюшчались в вирусоподобные

частицы. Частицы не содегакали вирусспецифической мРНК. Наблюдалась интерференция вирусоподобных частиц gag +■ ею с ВИЧ-I. Частиц обладали более высокой иымуногенностыэ, чем рек^мбинантные белки, выделенные из зараженнчх клеток.

На основе рекомбкнактньх белкощ gag и .en-» были разработаны подтверздавдие гесты для диагностики СПИД, шефНс 'лот и иммуно-флуоресценцил. Наши данные показали, ото реномбинантные белки БИЧ, получаемые в гетерологишых системах, иогут помочь в дискриминации между позитивными и лсжно-шзитивными результатами.

Основные положения, выносимые на защиту.

I. Определена локализация и кинетика накопления рекомбинант-нюс белков в клетках.

2, Изучен процессинг рекомбинактньх белков.

3. йзученн свойства вирусоподобных частиц, содержащих регоы-бинангньге белки.

'4. Исследованы иммуногеннке свойства рекоибкнантныг белтов в составе вирусоподобных частиц с получением гийериммунных кроличьих сывороток.

5. Изучено действие апротининов и препаратов амантацинового pipa на модели рекомбинантных белков.

6. Разработаны подходы для увеличения продукции рекомбинантных белков.

7. Разработан» подгвептдащие тёст-системы для диагностики СПВД,' иммуноблот и иммунофлуоресценция на основе белков продуцируемых рекомбинантньми вирусами.

Внедрение полученное результатов. Экспериментальное серии диагностических препаратов испьтанк в НИЛЭИ им.й.¿.Гамалеи, в Цент-

' 6 ,■ ральном военком госпитале КГБ СССР, в Третьем Главном Управлении пр Минздраве СССР, в специализированной лаборатории ГИСК им.Л.А.Тара-са™-:а. Методические рекомендации по', способу определения антител к SI4-I с помесью «гтяганов, продуцирующих рекомбинантными штаммами, ссясшпцины "«С5 и vE234b ' методами иммуноблота'и иммунофлуорес-ценцки, били «/твержены на Ученом совете НИК вирусологии им.Д.И.Йв4 нозского СССР. :

Ал^се'али.г работ-;,'. Оснознье результаты работы доложены на с«кц:«янсм заседании ХЖ съезда ШОМЭиП им. И.И.Мечникова в г.Алмаза, 1Эо9, на конкурсе'научных работ ЦОЛйУВ, 1989, на У15 мевжун&рар н,-«< конгрессе вирусологоз, Берлин, 1990г., на конкурсе научных "after г^Щ вирусологии им.Д.И.Ивановского АШ СССР, 1990г., кг совместном заседании кгфепр» вирусологии ЦОЖУВ и лаборатории бксеййтеза НИИ . ьируселогии им.Д.И.Квановсного АМН СССР, 1990г. ■

Ойъш и ст?У'~" УТ& работы,- Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литератур«, вклкзчау^его 3 главу, 5 глав собственных, исследований', обсуждения полученных результатов'"« выводов. .'Материалы диссертации иллюстрирован;.;- .'.is., -рисунками и ..?... таблицами. Список литературы . в.лгчает .+??.. источников (»??. отечественных и .i-47,- иностранных, "торов).

ССБСТЕШИЕ ИССЯВДОВШЯ

МАТЕРИАЛЫ И ЯВЩЩ .

Ре константные вирусы. • •

3 pat-'оте использованы рекомбинантные вирусы сспосащини, сконструированные в группе а.и.ьуйринсиого: I. Рекомбинантный виру.

осповакцины штамм -vC5 с г встроенным геном gag ВИЧ-I, кодирующий с I по 441 аминокислотный остаток предшественника р55. 2. Реком^инан-тннй вирус осповакцины штамм vE234l ' со встрогчннм полноразмерньм геном env ВИЧ—I. г>. ДикиП вирус осповакцины итамм ПН- , который применяли для конструирования рекомбкнантных вирусов vC5 и -vE234 L.

Перевиваемые клеточное линии.

I. Лк.ши клеток почки африканской зеленой мартвшш С V-I и получены из лаборатории культуры тканей' института вирусологии AllН СССР. 2." Лимфобластоидная клеточная линия Н9 была любезно предостав- ' лена сотрудником института вирусологии АМН СССР Н.К.Шаровой. 3. Лим-фобластоидная клеточная линия C-8I66 была любезно Предоставлена сотрудником института вирусологии АМН СССР С.А.Шулениным.

Микроносители для культивирования клеток CV-I.

.Микроносители "Цктолар", синтезированию из денатурированного коллагена, были любезно предоставлены сотрудником института вирусологии АМН СССР В.А.Исаченко. М.Н. "Цитолар" использовали для крупномасштабного культивировали клеток CV -I и повышения продукции вирусоподобна частиц,,

Фракционирование клеточнкх мембран методом флотации проводили при смегчванш клеточного лизата е 60$ сахарозой в отношении 1:1 к центрифугирования в ступенчатом градиенте сахароз» 25-30-40-45-60$.

35.

Получение и очистку меченнух ь метиоигаом внеклеточн---* вирусоподобна частиц осуществляли из культуральнои жидкости клеток, заоа^енн:^ рекомб'.шаитн1:?.:!'. ппрусами, с лсусщьи лкне?.ного сахарозного 20-6С5 градиента.

. 8

Нарезание " р50_рекомбинанчной ВИЧ-специфической.-,протеазой.

Рекомбинантная ВИЧ-специфическая про^еаза-, экспрессируемая в клетках Е. Coli , была любезно пред0с4йёАёна. соТруднийом Института вирусологии АМН СССР С.А.Шуяенинш. Нарезание тр§0 проводили при смешивании белка гр50 , полученного из клеточных мембран или из вирусоподобных частиц, с протеазой в отношении 1:1.

Электрофорез в полиакриламицном геле проводили по методике .Laearali (1970).

Иммуноферментный анализ (ИМ) проводили с использованием тест-система "Вектор", имму; блотгинг проббдМи при поы&цй элекгро-

иереноса белков из ПААГ на нитроцеллюлозу йе МёТодикё iovibin (1981). Идентификацию рекомбинантных белков осущебФвляли с использованием сыворотки крови зараженного ВИЧ пациента или моноклональ'ных антител к белкам р24 и р17, любезно предоставленньк д»ром Гельдербломом (Ж). ' •

Радкоишунопреципитзция (РИП), п.ульс-чейз .эксперимент проводили по методике изложенной-в руководстве Д.Глов.ер (1988) с нексгсорьзд мог-^икацияш. • . '

Иммунофлуоресценцив (Ш?) проводили, как списано в работе борова и соавт. (1290). " '

Элекгронномикроокопическне и ишуноэлектрошомикроскодияеские исследования проводили по методике, описанной в работе Григорьева и соавт. (IS83). Использовали монокдональние антитела к р24 (<£FT) и р17, любезно предоставленных зав.лабораторией института вирусоло=-гии АМН СССР А.А.Кущ. . ..."

Введение, электрофорез • блот-гибркцизацко-ЕНК проводили -по

методике, описанной в рг^оте Тенцова и соавт. (1989).

Иммуногенность рекомбинантных белков и вирусоподобных частиь, определяли птоем иммунизации кр'оликов.

Доказательства сьлзквакия СД4. рецептора с рекомбинантным_

белком получали путем применения ингибитора СД4 рецептора ауринтри-карбоновой кислоты, любезно предоставленной директором НИИ гриппа АМН СССР О.й.Киселевым.

Изучали влияние на продукцию вирусоподобных частиц препаратов амантадинового ряда, пролонгированного ремантадина и ВС ВАКа, любезно предоставленных директором 1ЖИ гриппа АМН СССР О,И.Киселевым.

Разработанная тест-система иммуноблот представляла собой нитро-целлюлознке полосы с иммобилизованными рекомбинантных белка»«! гер1б0 и ир50. Клетки С "5-1 на покровных стеклах , зараженные vC5 и лй234ь , использовали для определения антител в сыворотках путем /ммунофлуо-ресцентного анадиаа,

результату исследования

Свойства рекомбшантниго Ба5 - белка ( грэО).

Идентификацию продуктов экспрессии тЮ5 проводили путем анализа в иммуноблоте лизатов клеток С"7 -1, зараженных В качество контроля использовали клетки, зараженные диким штаммом вируса оспо-вакцины . Из рис.1 видно, что в клетках, заракекнъх 'Со, присутствует полипептид, специфически реагирущий с антителами к ЗйЧ-1. Молекулярная ¡¿асса его составила 50 кД.

С помоцьо блот^гибрвдизации было установлено, что в клетки С7-1, заракеннмх тС5, синтезируется специфическая' мрнк, име-

ющая гетерогенный характер с преобладанием мР!К размером около 2 кБ. .

i г- - _J ."SP160

; I ^sp'20

j 94- '

67-

es3

«2 3 ' 4. 5 б "

' Bio. I. Характеристика антигенов, продуцируемых рекомбинант-нши вирусами осповакцины методом кмиуноблот.

Дороже I - клетки С7 -I, зараженные ".Й . Дорожка 2 - .клетки, зараженнче 'Со. Дорожка 3'- смесь клеток зараженных ?С5 и ' • v £234 I . Дорожка 4,5 - клетки, заракеннке vE234L с множественностью 15 ВОЕ.на. клетку и лизированы через б ч и 2. БОЕ на клетку и лизироваяы через 24 ч, соответственно. Дорожка б -клетки Н9, зараженные ВШ-1.

Молекулярная касса стандартных белков показана слева.

Кинетику накопления гр50 в клетках изучали с помощью иммуно-флуоресценции и иммуноферментного анализа. Было показано, что в клетках Cv -I специфическое свечение выявляется при заражении 0,5 ЕОг, на клетку через 12-16 ч. Свечение ¡увеличивается в последующие сроки наблюдения и достигает максимума через 24-30 ч, В клетках .. Vsro специфическое свечение при той ¡¡се множественности заражения

появлялось несколько позже, через 24-28 ч, а максимальное - через 46-48 ч. Кинетическая кривая экспрессии гр50 была построена не. основании данных ИФА. Параллельно клеточным пробеч анализировали осадки проб культуральной среды, подученные при низкоскоростном центрифугировании (рис. 2). Из полученных результатов видно, что сроки максимального уровня экспрессии vC5 в клетках С7 -I i. , Vero разные. Для клеток С7 -I ото - 32 ч , а для клеток Vero - 64 ч. Скорее всего это связано с разной лервдссивностьв клеток для вируса осто-закцикы. Увеличение антигенной активности в среде, вероятно, связано с разруиением клеток и присутствием хр50 в клеточном дебрксе.

Для количественного определения белка гр50 лизат инфицированных . ^С5 клеток в количестве 5x10® фракционировали в I0Í ПААГ параллельно о маркерами молекулярных левов. Гель окрашивали .и сканировали 9 вдмсгцы) денситометра. Было установлено, что «р50 составляем прдаерно 8Л0$ от тотального клеточного белка "и на 5x10^ клеток синтезируется около 12,5 мкг тр50.

Внутриклеточную локализацию, так же как и кинетику накопления ip50 в клетках, изучали с помщьп имцунофлуоресценции (Ш). При ино-жествекноети 0,5 POS на глотку свечение в клетках С? -I появлялось через 12-16 ч после заражения и околоядерной области цитоплазмы и при дальнейшей инкубации о&йрудавалось во всей цитоплазме. Характер свечения был одинаковым при использовании ионоклональных антител к белкам pi? и р24 и сыззроток от больных ВИЧ» Поскольку белок-предшественник gas з зараженной ВИЧ клетке благодаря ииркстилиро-ванноцу 3-концу заякоризаэтся з гладких мембранах ( квгтпа, 1983), представляло интерес определить, связквется ли с клеточными мембранами рекомбпнантныЯ бедок gag . При фракционировании ме»«5ран

ивл

Рис. 2. Кинетика накопления белков gag в клетках ' cv-I и ' по. даннкм' Wik.

I - лизаты клеток С 7-1 зараженные VC5.

2- лизаты клеток Taro зараженные VC5.

3 - оса ,ки культуральной жидкости от клеток С? -I.

4 - осадки культуральной квдк.зсти от клеток Vero. . •- ч ..

Р/ и - отношение оптической плотности проб к, обработанной ; .сывороткой здорового донора, к оптической плотности проч.л,-обработанной сывороткой больного ВИЧ-1.

- гарекекн-г-к VC5 клеток методом флотации в зонах с плотностью 1,10— 1,12 г/см3 (гладкие мембраны) и 1,16-1,18 г/см3 (шероховатые мембрана) методом VE бнл обнаружен белок гр50 (рис.3). В цитоэоле количество гр50 бкло примерно в 6-8 раз; меньше, чем в мембранах тех не . клеток. Д." я определения внутриядерной локализации; белка, ядра от ми-

12 3

—94 -67

r?50—«—«.«як»

-43 ~30

Рис. 3. Анализ gag белков ВИЧ в. мембранах, вццел^нньх из .. клеток, зараженных 7С5, с, подацьп ИБ.

Мембраны -получали методом флотации в сахарозном градиенте из 'клеток через 24 ч посла заражения. Дорожки I и 2, мембраны с плотностью 1,10-1,12 г/смэ '(дорожка I) и; 1,16-1,18 г/см3 (дорожка 2). Дорогска 3 - мембраны,' выделенные из плеток, зараженных ка . Цифры справа обозначают положение маркеров.

вали буфером, содержащим тритон Х-100, а'затем разрушали ультразву- , ком. Методом радиоиммуноцреципктации было установлено наличие бел га ip50 в ядрах. Судя по. интенсивности специфической полосы, его бнлс значительно меньшеi чем в клеточных мембранах и примерно соответст- . вовало количеству белка в цитозоле. Таким образом, основное количество белка г р50 накапливается в клеточных мембранах. •

Определяли способность' гр50 нарезаться вирусспецифкчесгой протеазой. Для этого клеточной лизат, полеченный через <4 ч ьосле ,

заражения клеток штаммом т С5, смешивали с лигатом бактериальные -клеток, содержащим рекомбинантнул вирусспецифическуи протеазу, и продукты нарезания идентифицировали с вомоцьп iБ. Уге через В мин инкубации появлялся первый продукт протеолиза - промежуточный предшественник гр39, а через' 16 мин инкубации - конечный продукт про-теолиза гр24 (рис. 4). Таким образом, процессинг гр50 протекает так же, как и процессинг природного предшественника gag , за тем исключением, что образуется лииь один промежуточный предшественник с и -конца р39 и отсутствует р4Ха И, по-видк.юму, оИйуг&гзие этих промежуточных предпествянников связано с делецией на С-конце гр50. На модели, рекомбинантного белка удалось отделить стадию образования промежуточного предшественника р39 от стадии образования зрелых бел-" ков. .

.В клетках С' -I гак же, как'и в лимфобластоедных клетках C-8I66 при заражении <!5 в концентрированном материале иногда обнаруживались белки по размерам идентичные продуктам процессинга е&б белка (р39 и р24-2о). Методом ИБ при использовании моноклональных антител к р24 в них были выявлены .специфические антигенные детерминанты .sas. белков. Наличие этих белков можно объяснить процессингом с участием клеточньзе протеаз.

Свойства рекомбинантного eav белка ( трГбО}. ректификацию продуктов экспрессии -v S234lT проводили при анализе в лизатов клеток CV -I, заралсенных ■VE234L и vvr Из рис.1 .водно, что в клетках, зараженных vE234l , присутствует полипептид, реагирующий со специфическими антителами. Молекулярная масса его составила 160 кД. • . ■ •

С псысгаьЕ блот-гибридизации б«ло установлено, что в клетках

1 2 3 4 5

.<; ч- '■.<•■. ;; -. !'. , , • .....,; • L 04

..•■м--

цадиг» — 37

Рис. 4. Нарезание tp5Q рекомбинантной ВИЧ-специфшиской про-теазой. Лиза? C7-I клеток, содержащий гр50,.и лизат бактериальных клеток, содержащий рекомбиначтную ВИЧ-специфическую протеазу, смешивали в отношении 1:1 и через резные интервалы времени инкубации при 37°С анализировали вирусепецифические белки с помощью иммуно-блота, используя сыворотку от больного ВКЧ.

Cv -I, зараженных; vE234l • синтезируется специфическая env mFHIC, имеющая гетерогенный характер с преобладанием мШС размером около 3 кБ.

Была изучена кинетика накопления rg pI60 в клеточных культура:-: CV -I, Varo и Н9, зараженных: "»E234L С помощью непрямой юшуно-флуоресцекции бьотЬ показано, что в клетках CV -I и Н9 специфическое свечение выявляется через 12-16 ч и в последующие сроки наблюдения

- N

увеличивается и достигает максимума через 26-30 ч. В клетках Vero

свечение обнаруживали через 25-28 ч, а максимальное наблюдалось через 46-48 ч. Данные ЙФ подтвердили данные иымуноферментного анализа.

В клетках С7 -I, зараженных тЕ2а41 , гер160 составляет примерно

С

7-10% от тотального, белка, т.е. около 14 мкг белка на 1x10 клеток.

Внутриклеточную локализации гщ)160 изучали с помощью, непрямой иммунофлуоресценции и ИЗ. При множественности 0,5 БОЕ на клетку свечение в клетках С -I появлялось через 12-16 ч. Флуоресценция наблюдалась в перинуклеарной _ оне, по-видимому, в аппарате Гольдаи. Дальнейшие доказательства связи хёр1б0 с клето^рьми мембранами были получены путем'фракционирования клеток и анализа лизатов в ИБ. Как видно на рисунке 5, в мембранной фракции с плотностью 1,10 г/с и3 (гладкие мембраны) были обнаружены как гв р160, так и хв р120. Во фракции с плотностыз 1,19 г/см3 обнаружен только гйр160.

Представляло интерес определить, экспонирован.ли на поверхности клеток рекомбккантный «пу белок. Для этого ш использовали три способа: I) обработка клеток трилсйко«;-2) выявление синцития и 3) определение действия ауринтрикарбоновой кислоты (АТК), которая является специфическим ингибитором СД4 рецепторов. В первом варианте опыта, при обработке'¡слеток, зараженных vE234 Ь трипсином, методом ИБ выявлялось уменьшение количества хе р160. Во втором варианте опыта мы использовали диьфобяастокдше клетки Н9, которые заражали со многкествэнностью 5 БОЕ на клетку штаммом '»Е234Ь . В качестве контроля эти же клетки ш заражали либо "*С5, либо . Через ' 16 ч после заражения в клетках, зараженныхЕ234Ь , под интвертиро-. ванннм микроскопом мы обнаружили с нцитиальные поля, количество кото-рьзс в процессе поел едущих 8 ч увеличивалось." В последнем из трех ' вариантов ощл?а, при использовании АТК меченные ^Б метионином

1 « 3 4 5 6

120—*=»

г'-' ф

-54 —.87

^43 —20

Рис. о. Анализ ещг белков БКЧ в мембранах, выделенных из легок, зараженных ^32341 , с помощью ИВ.

Мембранк получали методом флотации в сахарозном градиенте из клеток через 24 ч после заражения. Дорожка I - клетки Н9, зараженные ВИЧ-1. Дорожка 2 -г мембраны с "лотностью 1,10 г/смэ.

. Дорожка 3 - мембран" с плотностью 1,14 г/см3. Дорожка 4 - мембраны с плотностью 1Д6 г/см3. Дорояка 5 - мембраны с плотностью 1,19 г/см3. Дорожка 6 - клетки СУ-1, зараженное КН . Цифрг справа обозначают положение маркеров.

•дабранн клеток Н9 с СД4 рецептором связнвались в 2 раза меньше с ¡. аражеинъ-ми V £234 Ь клетками С? -I, чем без АТК.

Из полученных результатов ввдно, что белок гдр1с0 локализован на гладких мембранах и способен взаимодействовать с рецептором СД4. И, следовательно, находится на клеточной поверхности. На гладки мембранах обнаруживали продукт его протес липгчесого нарезания -

■18

rg pI20, при этом белок rgpI20 бьш обнаружен также в цитоэоле и в культуральной среде. На шероховатых мембранах был обнаружен.только бело« rgpI60.

Кинетику синтеза и процеосинга рекомбинантных env белков ш изучали при одноцикловой инфекции в клетках CV -I с помощью пульс-чейз эксперимента. В течение периода пульса (30 мин) метка включалась только в rgpjIfeO. Продукт протеолитического нарезания rgpISO бил обнаружен через I ч чейз периода, а большая его часть обнаружена через 3 ч чейз-периода. В этом интервале времени на радиоавтографе был виден еще один продукт протеолитического нарезания - rgp4I (рис. 6).

: Изучена секреция rgpI60 v. 120 в культуральную годность с помощью радиоиммунопреципнтации. Небольшое количество rgpI20 было обнаружено на 3 и 5 ч после внесения метки, xgpI60 обнаружить не далось (рис. б).

Выл проведем пульс-чейа эксперимент о присутствии HB^Cl 1 который известен как ингибитор лиоосошльного протеолнза. Обработка клеток препаратом приводила к резкому уменьшении деградации onv белков в метках. Отмечался такке сильный кигибирующий эффект на протеолити-ческое нерезание белка: в обработанных CV -I клетках не обнаруживался , rgpI2Q.

На основании полученных результатов можно предположить, что процесс.инг и деградация rg pI60, так же как и нативного g pI60, . происходит внутриклеточно и зависит от активности чувствительных к хлористому аммонию кислотозависимых протеаэ.

Известно, что протеолиз белков env ВИЧ-I осуществляется клеточными .трипоиноподобньми протеазами ( LicCune et al.t 1988)t

1 2 3 4 5 0 7 П

—од

i

: t j (

i -аз

! !■ ( i

! I -SO

Рис. б. Процессинг env белков в клетках СУ -I при анализе методом РИЛ (пульс-чейз эксперимент) .

Дорожки 1-4 - к-ки С7 -I, зараяениые vE 234L со множественность*) 15 БОЕ на клетку; период пульса - 30 мин (дорожка I) ; чейз период - I ч, 3 ч, б ч (дорояки 2-4, соответственно). Дорогой! 5-7 - культуральная жидкость, чейз период Г ч, 3 ч, 5 ч, соответственно. Дороква 8 - клетки С? -I зарататоые Цыйры справа обозначают полояетш маркеров.

Згот процесс мохно сравнить с протеолизом оболочечпьк гликопротеидов вирусоп гриппа и парамнксопирусоп, где происходит нарезание гемаг-глютгашна и Г—белка соответствующими трипсиноподобньми ферментами клетки ( Lazarowitz et al., , 1973, Scheid et al., 1974). Этот процесс в двух последних случаях ингибируется апроткни-на!.1и. !'ы определяли действие гордокса, относящегося к этому классу соединений, на нарезания xgpI60. Действие гордокса мы изучали

при одноцикловой инфекции в клетках СГ? -I и Н9 с помощью пульс-чейз эксперимента. Продукт протеол гического нарезания Г8р120 был обнаружен через I ч чейз-периода и больна;! его часть через 3 ч чейз периода, эти говорило о том, "что ингибировйние процеесйнга не происходило.

Следовательно, трил мноподобнве прогеа^ы клеток, участвующие в процессинге белк^ епу ВЙЧ-1, не идентичны тргасиноподобнш протв-азам, осуществляющий цротеолиткческу-; -активацию белков вирусов гриппа и парагриппа.

Свойства вир зоподобных: частиц.

После ультрацентрифугирования через 20% сахарозную подушу, культур альной жидкости, по луче-гной через 24 ч после заражения в осадке обнаруживалось значительное количество грбО как методом *Б с использованием поликлочальных и лоноклональных антител, так и при окраске нитро! ¡ллюг^энигс фильтра. Эти результаты указывают на то, что гроО продуцируется зараженными клетка/и в нерастворимой форме.

Дня дальнейшей характеристики. частиц, зараженные 'С5

35

клетки метил?' Б -мегионином, и осадок культуральной жвдкости подвергали ультрацентрифугирог^ний в линейном 20-60% градиенте сахарозы. Каждую фракцию градиента .анализировали на радиоактивность и наличие хр50 методом ИБ. Радиоактивность обнаруживалась в области градиента с плотностью• 1,16-1,18 г/см3 (рис. 7а) и в этих же фракциях был выявлен гр50 76).

■ Элекгронноиикроскопический анализ подтвердил присутствие в культуральн-й жвдкости частиц, содержащих гр50. При исследовании ульч.-дтонких срезов клеток через 24 ч после заражения штаммом у Со

г

3 з £

£

НОМЕРА ФРИКЦИИ

Рис. 7. Анализ ВИЧ-1 балков в реномбинанткых вирусоподобных частицах.

С?-!!*и1втил бшш инфилдрованн вирусами осповацины, мечены -метионином, через 24'ч. вирусоподобные частицы были вьще-лены из культуральной йидкости, ресуспег"тиро£аян и ентрийугиро-ванн е 20-60;" сахарозном традаенте 16 ч.ирг 2л.043 об/ыин.

А. Распределение радиоактивного материала меаду францдяид гг*а-диента^ I. - иатер;..л из клеток з^агеяных ''Сб.. 2. - материал из клеток ноинбицироЕаннхк ТС?ЧГ-гЁ2341Г.

3

160—

1 2 3

¥ \ '

— 84 —67

— 43

— 30

- I !

50—

:~94 .-67;

I !

—30

о

1

Рис. 7. Б. Распределение ВЩ-1 белков между фракциями градиента Белки е вирусоподобных частицах продуцируемые клетками, за-ракенныш! были детектированы с помощью ¡щыуаоблота с

использованием сыворотки о? ВИЧ (Зольного. I. Фракция с плотностью 1,16 г/см3. 2. фракция с плотностью 1,18 г/см3. 3. Франция с плотность» 1,21 г/си3.

В. Анализ белков вирусолодобных частиц продуцируемых клетками (коиюушщроЕанкыш! (дорожка I); инфицированные ■

■«СЬ (дорожка 2). Белки получены ш фракции градиента с плотностью 1,16 г/см3 и были детектированы (РИП).

были выявлены частицы размером 100-120 нм, почкующиеся с клеточной поверхности. Они имели электронно-прозрачный l,jhtp, окруаенный оптически плотным кольцом, покрытым бислойной липидной оболочкой, по-видимому, производной плазматической мембраны метки и по своей ст -руктуре и размерам не отличались от незрелых частиц ВИЧ. Специфичность результатов подтверждалась иммуноэлектронной микроскопией с использованием моноклональнкх антител, к р17 и р24.

Свойства и морфология ВИЧ-подобных частиц наводила на мысль, что их сборка происходит подобно тому процессу, который происходит з заражениях ВКЧ клетках. Мы проверили способность этих частиц также ка¡с и В!'!Ч упаковывать молекулы нуклеиновой кислоты. Однако блот-гиб-ридизация и гибридизация in situ . в составе частиц ЗЙЧ-специфичес-кой sag .д-ЙК не выявлена.

Вирусоподобные частицу нарезались рекокбинантной ВНЧ-протеазой до образования зрелых sac белков pi? и р24.

Было важно также -Установить, как коэкспрессия env белков будет влиять на образование гр50 частиц, будут ли б-iv белки про-цессироваться и зключатьсг в состав частиц ч как это повлияет на свойства вирусоподобных частиц.. Вначале мы идентифицировали в клетках Су -I оба рекомбинантных белка, при совместном зар^ении vC5 и v£234l . Через 3, б, т8 ч после внёсения метки клеточные лизаты анализировали на ВИЧ-1 белки с помощью РИП. Как видно на рис. 8, гр50 и rgpISO обнаруживали на всех изучаемых'сроках инфекции. Продукт протеолитического нарезания env белка' , р12П был виден через б ч и 18 ч (рис. 8). Во фракци? куянгуральной жидкости с плотность*) 1,16 г/см3 методом fffil, при заражении vC5 и vE234L , выявляли как . гр50, так и rgpI60, в то время как при заражении vC5 обнаруживали только гр50 (рас. 7в). Количество частиц при двойной инфекции s

1 2 С. 4 5 3 .

I

160120—

; —§7

— —.¿з

I

Рис. 8. Кинетика накопления белков ВИЧ-1 б- мембрана?; клеток СУ -I, при ан^я^зе методом ИШ. . '

Догожки 1-3 - клеп коинфицированкка ?С5 и vE234L 3, б, 18ч после заражения, еоответстве"но. Дорожки 4-6 клетки, инфицированные "VСО, 3, 6, 16 ч после заражений, соответственно, Мембраны бкли получены при центр^угировании клеточных лизатов через 41% сахарозу при 21.000 об/мин 2ч.

культуральной среде С ,-ло ыеньге, чем при заражении только уС5, возможно, в связи с интерференцией двух вирусов (рис*. 7а), ,

Кинетика продукции частиц измерялась по включенному ■•мети-онина в белки. Ь!аксимальное количество частиц при мнокественност'' заражения 0,5 БОЕ на клетку было через 1С ч после инфицирования и снижалось через 24 ч после начала инфекции. Обнаруживалось меньшее колич ;тво частиц во всех временных интервалах при двойной инфекции клеток (рис. 9).

ч*с-а после гдрАЖЕния

Рис. 9. Кинетика продукции вирусоподобных частиц .

Клетки, были к0Шф5ЩйровРныу С5 и vE234l (I) или к рицированы vC5 (2)/мечены ^метионином в течение различных интерва-

лов времени и вирусоподобные частицъ, были фракционированы в 20'. ' 60$' сахарозно^,, градиенте.' Фрс -ция с плотностью 1,16 . г/см3 былг анализировано, на рад'")актявност -.

Электронномикроскопическлй анализ подтверждал присутствие вирусоподобных частиц при двойной инфекции. Наличие специфической FHK в очищенных gag + зп\ частицах с поиов5>п блот-гибридизации и гибридизации in situ не определялось.

Была изучена способность вирусоподобных частиц к образованию синцития и интерференции с нативным вирусо- ,-К лгмфоблассоидньм клеткам C-8I66 добавляли ВИЧ и cepi . «¡те разведения частиц gas к, gae+ -env. Из таблицы I видно, что'частицы, 'содержали- белки S2S и gag + env, лишена способности образовывать синцитиали.ые поля. •

Однако, частицы, содержащие оба рекомбшантньк белка, были способны интерферировать, с нативным вкусом в разведении 1:10 и 1:20. Этой способностьи не обладали частицы, содержание только gag белок. Полненные данные указывает на функциональную активность белка ешг в составе вирусоподобных частиц и его способность узнавать клеточные рецепторы и взаимодействовать с ниш. Зги же данные указывают на поверхностную локализацию белка eov в составе вирусоподобных час.иц.

Таблица I.

Интерференция gag и gag + an-v частиц с вирусом ВИЧ-1

штамм ШВ в клетках C-8I66 .

Инокуляты

1:10

Разведения

1:20 1:40

1:80 1:160

1.

2. Н9/ШВ +. gas .. частицы

3. Hi/© -t gag + eav, час?ици

4. gag частицы

5. Sag + eav частицы

+ +

Использована ксцентрацяя вируса, вызывающая стабильное образование синцития.

(+) г наличие синцигиальннх-полей. (-) - отсутствие синцитиальных шлей.

Как извес -го, одним из механизмов действия химиопрепаратов илан-тадинового рада является ве ¡бранотропнБ'й эффект. В связи с этим бкло интересно, изучить действие этих препаратов на процесс почкования вирусоподобных частиц. С этой целью клетки СУ -I заратали V Со со мкожемвенаоеты) 0,5 БОЕ, ыегшш -иетиошшоы и одновременно

+

+

+

+

I 27

! вносили химиогпепараты в соответствующих кон^нтрациях. Через 3, б, 9, 12, 15 и 18 ч после внесения метки клеточные лизаты ан лизировали с помощью ИБ. Ремантадин, амантадин и ВС ВАЯК не влияли на продукцию вирусоподобна частиц на динамику их образования, в то время как пролонгированный ремантадин, представляющий из себя ремантадин со встроенной боковой цепочкой, .увеличивал более чем. в 2 раза их'количество и скорость образования.

Для увеличения продукции вирусоподобнкх частиц были использова-' ны отечественные микроносители Цитол- э-2. Три их использован!-, продукция частиц увеличивалась в 4 раз' по сравнению с продукцией частиц, полученной без микроносителей.

Вирусоподобньте частицы оказались высокошмуногенными. При иммунизации кроликов четьрьмя различными материала!® • I) очищенными sag и 2) sag + env частицами; 3) фракцией клеточных мембран и 4) нитроцеллюлозой. мембраной, содержащими гр50, лучший иммунный ответ индуцировали вирусоподобные частицы. Антитела появлялись уже после второй .иммунизации, и после четвертой кммунк ации титр антитэл к rgpI60 возрастал до 1:50П,' а антитела к gag бедкам достигали титра 1:500С 1В других случаях, специфический антктельный ответ на этих сроках не наблюдался (рис. 10).

Неожиданным оказалось то, что при постановке кроличьих снворйтс в коммерческом ИВ, на стрилах с нанесенными белка;«! ВИЧ-I, антитела выявлялись только к р24 и не выявлялись к белку предшественнику р55.' Однако, сыворотки реагирогтли с рекомбинантннм белком г р^О. Вероятно, антигенные детерминанты р24 белка в состав рекоыбкнантаого х р50 лучше представлены и индуцируют сильный жсчу.-дкй ответ, чемло. , всему предшественнику в целом. Мы изучали, им^нный'с ест при иммунизации частицами, содержащей нарезанный gag'. , предварительно обра-

1 2 3 4 S6 Г 8

180 j ■! | - 120 —D ■ ; ! ,

M : ; . j i

6P— ? i ; | 55— Ь - " 41-4 3-е

32 — с ; j ; . 24 -*~ß »¿(.¡,

Рис. 10. Имщгиогениосгь рекрыбшантньсс белков. .

Дорожки 2-4 _ снворс-ки кроликов проиммунизирор^нных gag + eav част цаш, ;ag частицами обработанными рекомбинантной ШЧ-1 протеазой, gag . чагтицаш, соответственно. Дорожка 5 - сыворотка преишунного кролика. Дорожки 6-8 - сыворотки кроликов проиммунизированных фракций клеточных мембран с гр50, нитроцеллюлозой, содержащий гр50, и фракцией клеточных мембран, содержащих белки чируса осповакцины. ' Сыворотки были проан. лизкровруу в коммерческом иммуноблоте Bio Rad . Дорожка I - сыворотка больного ВИЧ.

ботаннкми бактериальным экстрактом, содержащим специфическую ВИЧ-1 протеазу. При "том антитела возникали к белкам транс криптазного эм-плекса и ко.всем eag белн-м, кроме рГ7. Титр антител к р24 был таким же высоким 1:50.000, к остальным белкам - I.100. Отсутствие реакции с р17, вероятно, связано с низкой шмуногенностьв этого белка (рисЛ©. Полученное гшершмуннне кроличьи сыворотки обладала

нейтралкзущс" активностью, нейтрализуя способность ВИч к образованию синцития.

ВЯЧ-1 вирусоподобные частицы, про.дуцируемые в нашей системе, являются удачным канд1.матом для создания ВЙЧ вакцины по следующим характеристикам: . ..

1. В«лусоподобные частицы содержат gag и env белки ВИЧ.

2. Белки, вклю" энные в вирусоподоо'ные частицы, более иммуногенны, чем белки, ^строенные в клеточные мембраны.

3. Вирусоподобные частицы не содерэк вир,¿специфической РНК л поэтому нет опасности в интеграг ш ДНК в клегочный геном.

4. Вирусоподобные частицы стабильны, могут бьтаь легко очищены иг яультуральной среды с помощью центрифугирования з сахарозном градиенте.

5. При использовании роллеров и микроносителей их можно накапливать з больших количествах.

6. Их продуцируют клерки почек зеленых мартышек, которые не требуют богатой питательной среды, как это несводимо ^ля лиг"оцитарных-клеточных линг"-,'. продуцирующих ВРЯ, иг продукция более рентабельна, чем продукция живого вируса.

7. Они абсолютно безопасны для медицинского персонала.

Иг ользозаниз векомбинантннх gag и еэт белков для разработки подтверждающих тестов.

Для подтверждения лабораторного диагноза ВИЧ "чфекции широко применяют иммуноблот, а т-кже шлмунофлуоресцекгота.ИБ пр 7 и тьзоза-нии белков нативного вируса не исключает получения лоянополгахитедьннх результатов в связи с наличием НЬА белков з аирусном лязате или с перекрестим 'взаимодействием частично денатурированных' ЗИЧ антигенов

1 2 3 4 5

Ml

'i

-ss¡t20 160— ч »

рб5 p55

8Í\

—P31 В—-p24

i 23 4 se 7 с « « к ou13wi7k iïî031 22 23 a»35 2e27 2s2í»3!s A-

to—pi7

50— Во

Рцо. II- Анализ ложкопоэигквн'« сывороток с помощью кок-v-рческого "33 ( Eu Pont ) и рекомб-инантного Ш.

А. Лс'--;млозймшнь,е реакции детектируемые коммерческим I®.

1-30 - образцы-снворогок от здоровье доноров, демисти-

■ - • лирующие ложные реакции ; 31 - негативней контроль из тест-системы • Pont. ; 32 - позитивный контроль из тест-системы Pont

Б. Рекомбинак^ннй ИВ.

I- 2 - сыворотки от ВИЧ-больн'-х, 3 - скворотка от здорового донора, не дающая лоннопоз ктивш-< реакций в коммерческом КБ. 4, 5 - лозшопозитивнре сыворотки.

"• с неспецифлч"ес::и1.£и антителами Í ïlenderson et al., IS67) ;

Hesniejc . 1988). Эти проолемк можно решить при использовании рекой бинант.1»« белков.

• Кммунобло? на основе рекоубинактнг-х и env белков.

Клетки, инфицированное Cj j; vE234L , б»ли лизиров&ны и ис-

з:

.пользованы дл,*'приготовления стрипов ЙБ. Чувствительность КБ мы .сравнидала с ¿15 фирмы " Bu " с'помощью «-«ровилл поги-'чзнон

сквороткн больного ВИЧ. В р^комбинантном гЪ знверотдо 'ззажизейсг-во-вала с антигеном до разведения 1С однако, тест-гсистека_фисагг " Du pent " была в 5 раз более чувствительна1 '

'&: -тестировали панель смешанные сывороток, используя рекомби-нантный ;И коммерческий Ж; ста ,-злель включала подтвержденные серспо-зитивнне. и яег;. .'квные образцы, а также 30 локюпг.лежительгп-х сывороток (т?.бл.- 2). '

Результаты тестирования поз»*изнас *л негативны-: образцов г.е-комбинантада я коммерческим Ж были идентичны, за исключением ог..~:ой положительной скзорстки с низкий титром анжиел, яиг яяемой только коммерческим ИБ. Таким образом,'чувствительность рекоыбпнантного ÎS составила 99,5$, а коммерческого:I00Ç».

Значительнее расхождения б«ли обнаружены при те тировакии ло&-нопозктивнкх. образцов." При использовании ИВ 4 Du Pont " большинство ложных реакций было с анти-р17 'и акти-р24, некото, за сыворотки реагировали с рбб, с gp4I, ~\31, многие образта давали реакцию с белка' ми, относящимися, н группе р55/.р51^рИе. di ^.

Однако, все сыворотки не взаимодействовали с рекомбинакткымк белками. Р-и бьши такле негативными в рзкомбинантной ИМ фирмы " Abbott. " при подтверждении лоанис реакцу" в ИБ с приходным вирусом. Некоторые из этих сывороток мы.тестировали ыетог-^м иммунсфг э-реецэнции, используя шу клетки Н9, инфицированные статям HTIV -23, или клетки С -г -I, инфицированные. vC5 и >£¿34'L. Эти анализы давали одинаковые результаты, которые, также1 демонстрировали ееронегативкоатьГ образцов.- . . , : '

Наши данные показывают, что i лшмбгаангныв белнк ВИЧ,

ченные в гетерологичшх системах, могут помочь в дискриминации ыеж-ду позитивны». . и ложнопозитивними результатами.

. Таблица 2.

Сравнительное изучение иммуз/облотов^ основанных на использовании природных и ргкоибянантных белков ВИЧ .

Тест-си<. .-еыа

Реакция сыворотяк Позитивные Негативные _ «с сыворотки сыворотки

522 »Р"- ло**о-- нега-

цоз

тивные 100 образцов разцов

полож. 30 об-

ИБ

с природным вкусом фирма "Vи Вэп* "

реагируют не реагируют

200 0

•30

0

0 100

ив

с рвкоь-бикантньми белками

реагируют не реагирует-

199 I

■0

30

0 100

Имиукофлуоресценция на основе -рекомбкнантных 5аь и белков. .

Клетки С7 -I на покровных стеклах, инфицированные 435 и уЕ224 ь , фиксированное охладглннш этанолом и использовали для тестирования сывороток. Чувствительность № сравнивали в коммерческой си темой Ш,' где для заражения клеток использовали нативный вирус. При титровании контрольной позитивной сыворотки рекомбинантная К'й оказалась в 2 раза менее чувствительна. Мы тестировали панель смешанных сывороток, используя рекомбинангнув и коммегяг скую М. Эта панель включала подтвервденкне серопозитнвше и негативные образцы, а также 5 лояноположтаельньк сывороток, использованных для постановки

в Ш. Результаты тестирования позитивных и негативных образцов ре-комбинантной и коммерческой ИФ были идентичны Различий не было обнаружено и при тестировании ложноположительных образцов (табл.3).

Наши данные показывают, что тест-система Ш на основе реког-бинантных gag и env белков может быть применима как -подтверждающий тест, при этом являясь более безопасной для работающего с ней персо-

нала.

Таблица 3

Сравнительное изучение методов иммунофлуоресценции, основанное на использовании ;ру,родных и рекомбинанткых белков ВИЧ

Тест-система

Реакция сывороток в ИФ

т

с природными бел- реагируют ками БИЧ-1 , не реагируют

"ИВ

с рекомбинантньми белками ВИЧ-1

реагируют не реагируют

Позитивные сыворотки

Негативные сыв-ки

ооразцов полом>

5 образцов

•so

О

50 О

О 5

О

F>

негативные 30 'образцов

О .30

0 30

.gag

выводы ■

I. Рекомбкнангный "'згокг р50ь~" , отличающийся 'т "а—твного gag предшественника р55, отсутствием с С-конца 71 аминокислоты (нет рб и части р9) имеет свойства, сходные с природным аналогом: локализуется на клеточных мембранах, способен проникать в д^ра^е помощью рскоыбккантноК ВИЧ-протеазы подве^ зется протеолизу- до образования

3 4 ' ■

промежуточного предшественникахрЭ? к зрелых gag белковip24 изрГ7, реагирует с пноклональньми антителами.

env

2. Рекомбинанткай белок rgp!60 имеет свойства,, сходные с ппиродннк аналогом: локализуется, на гладких и шероховатых мембра-hex, экслонирован на клеточной поверхности, узнает СД4' рецептор, способен образовывать синцитий, процессируется до образования эре-

«nv беяксЕ' rgpI20 и 41, rgpISO се1фетируется в культу^аль-ную жидкость, кммукогенен.

3.С поверхности зараженных клеток .почкуются вирусоподобные частик*, содержащие gas предшественник. гр50. Их размеры к физико- ■ химические свойства не отличаются от зрелых вирионов ВИЧ; го свим морфологическим особенностям они напоминают дефектные по нарезанию

Sat предшественника в^рионы ВИЧ. Таким образом, сборка вирусоподобных частиц, es почкование обусловлены gag - белком и'происходит в отсутствии други* зирусспецифических белков.

... 3^ /сопонобнае частицы обладают более высокой иммукогек-ностью, чем рекокбкнантнкэ белки., выделенные из зйраженнъх клеток. Образующиеся при иммунизации кролика антитела реагируют с нативнш бедког.' E^S р24. .

5, При двойно:: заражении клеток О' -I рекомбинадандаи вирусами осповакцнкы, содержащими гены ess и env , происходит экспрессия белков eng и es- , бели: ев* включаются в вирусоподобное частицы, частицы не содержат вирусспецифкческой РНК.

Вирусоподобные частицы, содержалие белк;- ад к eav , лишенные витзусспеци^нческой РНК, обладающие высокой »-кмуногенностыо, являете огааыаяышм кандидатом для конструирования вакцины против

U'.W'^A.

6. Изучjho действие некоторых химиопрепаратов на продесскнг и синтез рекомбмнантн^х белков. Хлористый аммоний ингибировал про-цесеинг env белков, пролонгированный ремантадин стимулировал продукцию вирусопод 5ньх чаСТИЦ.

7. На основе реко^бинантнътх бзлков ба5 и snv разработаны под-твер::. агащие тесть' (и.муноблот и кммунофлуоресценцчя) для серодиагностики инфицированных ВИЧ.

1. А. Е Взоров, М. Букринский и А. Г. Еукринская. Докали*-ция рекомбинантных бежов ВИЧ в зараженной клетке и их использование в подтверждающих тестах. В сб. "Молекуляр-

н я биология и генетическая инженерия вирусов", Москва, 1989, стр. П -13

2. A.Bukrinskaya, М. Saiaev,A. Vzorov, S. Shu 1 en in. and N. Sha-rova Processing of H1V-1 Gag precursor includes N-ter-minal p 39 which зп penetrate into the-cell nuklei. Abstract of via intern. Congress of Virology, Berlin

£ 1990 ] p 210

M. Bukrinsky, A. Vzorov, A. Bukrinsky a Intracellular local >zation of recomb'nant vaccinia-produced HIV antigens and thier use for lionfirmation-of HIV seropositivity. Acta Virol. 1990, V. 34,5, p. 416-419.

4. A. H. Bs jpob,Г. ИХ Тенцов, В. Б.Григорьев, С. А. Щуленин, М. II Гараев,О. Е Богдан,А. Г. Еукринская.Образование вируссо-подоОных частиц белком gag ВИЧ-1, экспрессируемим реком-Оинатным оирусом осповакцины. Молекулярная биология 1990, Т.'24,6, стр. 2666-1674.

5. A. Vzorov, М. Bukrinsky, V.Grygoryev, Yu. Tentsov and A. Buk-rinsk£»'& Highly immunogenic human imaunodeficiency viruslike ¿articl s are produced by recombinant vaccinia virus lnfeoted cells. AIDS Pes. Hum. Retroviruses 1991,.vi>- - -'■