Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и анализ свойств рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих гетерологичные гены

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и анализ свойств рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих гетерологичные гены"

РГ6 од

/ 3 !мд-'1казаксж ордена ленина и ордена трудового

красного знамени государственный университет ИМЕНИ В. И. ульянова-ленина -

На правах рукописи

ТИМИРЯСОВА ТАТЬЯНА МИХАИЛОВНА

КОНСТРУИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТЖ вирусов ословакцины, экспрессирущих гетерологичные гш

03. 00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 1993

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии Наук

Научный руководитель - доктор биологических наук И. И. фодор

Официальные оппоненты:' доктор ветеринарных наук, профессор Хаэипов Н.Э. кандидат биологических наук доцент Малков C.B.

Ведущая организация: Институт общей генетики Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится "J7" 1993г.

0 г -

в '7 ~~ ч. на заседании Специализированного совета К. 053.29.19 при Казанском Государственном Университете имени В. И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул. Ленина, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского Государственного Университета.

Автореферат разослан '¿f(?' 1993г.

Ученый секретарь -специализированного совета

Аскарова А Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение первичной структуры ДНК и разработка систем экспрессии генов in vitro существенно расширили знания в области структурно-функциональной организации эукариотических генов. Эти исследования способствовали решение множества вопросов, связанных с регуляцией экспрессии генов, о . посттранскирпционной и поеттраналяциониой модификацией генных продуктов, а также связанных с созданием и получением различных генно-инженерных препаратов, необходимых для диагностики и профилактики инфекционных болезней человека и хивотнж, Существенную роль в этих исследованиях играют рекомбинантные конструкции на основе эукариотических вирусов, которгп экспрессируют гены, кодирующие различные антагены возбудителей инфекций, и являются живыми вакцинам.

В этом отношении вирус осповакцины (ВОВ) представляет большой научно-практический интерес. Он имеет такие отличительные свойства, как способность включать значительное количество экзогенной ДНК, правильная транскрипция экзогенных генов и правильная трансляция ыРНК с образованием белка сходного с нативным по структуре, функции и расположению, щггоплазматнческая локализация репликации вируса и наличие безопасных вакцинных штаммов (Moss, 1991). Все это позволяет рассматривать вирус осповакцины в качестве перспективного вектора для клонирования чужеродных генов различных антигенов, в качестве ивой рекоыбинантной вакцины против возбудителей инфекций человека и животных (Brody et al.t 1992; R'.vlere et al., 1992).

На данный момент получен целый ряд рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирувдих различные чужеродные гены, в большинстве случаев на основе вирулентных штаммов (Williamson, 1938).

В настоящей работе mi показали использование вируса осповакцины штамма ЛИВГ1, широко апробированного как вакцина для ликвидации и профилактики натуральной оспы в СНГ, в качестве вектора экспрессии. Провели изучение рекомбинантных штаммов ВОВ, экспрессирутащх как репортерные гены, ¿ак и тьм антигенов вируса гепатита В (ВГВ) и бешенства. Созданные наш рекомйинанткые вирусы могут рассматриваться как кандидаты на живые генно-инженерные вакцшш против гепатита В и бешенства. Все это и определяет актуальность данной темы.

Цель и задачи исследования. Целью работа было . создание и • изучение свойств рекомбинантных штаммов • вируса осповакцины, экспресскрушдас гетерологичные гены. В соответствии с этим были определены следующие задачи:

- сконструировать бактериальные векторы инсерции, содержание гены /з-галактозидазы E.coll, лициферазы светлячка Photlnua pyralls, HBoAg вируса гепатита В;

- изучить транзиентную экспрессию репортерных генов;

- получить стабильные рекомбинантные вирусы осповакцины штампа ЛИВП, экспрессирувдие гетерологичные гены;

- изучить экспрессии репортерных генов в процессе • репродукции рекомбинантных вирусов; • .

- провести иммунологический анализ экспрессии HBeAg и НВ Ag вируса гепатита В и гликопротеина вируса бешенства рекомбинанташ вирусами осповакцины.

Научная новизна. Результаты по клонирование гетерологичных генов в ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП косят приоритетный характер. Впервые получены рекомбинантные ВОВ шташа ЛИВП, содержащие в HlndIII-N- и НА-областях чужеродные гены. Впервые создан тривалентный рекомбинантный вирус осповакцины штамма ЛИВП. экспрессирущий три чужеродных гена: р-галактозидазу E.coll, HBoAg и KBoAg вируса гепатита В. Впервые получен рекомбинантный вирус осповакцины шташа ЛИВП, который экспрессирует гликопротеин . вируса бешенства штамма "Внуково-32". Впервые сконструирован интегративный вектор инсерции чужеродных генов в ^ШПН-Н-область генома вируса осповакцины.

Научно-практическая значимость результатов. Основным итогом работы явилось создание серии рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирувших гетерологичные гены в различных несущественных областях генома.

Сконстрррованные рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирувдие антигены вируса гепатита В и бешенства являются кандидатами на живые генно-инженерные вакцины против этих инфекций. Рекомбинантный вирус, экспрессируэдий гликопротеин вируса бешенства,- проверен на лабораторных животных и получены положительные-результаты. В настоящее время оформляется патент на этот рекомбинантный штамм, как на живу» вакцину против бешенства.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение и выводы. Работа изложена на 146 страницах, содержит 8 таблиц и

26 рисунков. Список литературы включает 204 наименования.

Апробация работа. Материалы диссертации были доложены и одобрены на:

- V научной конференции социалистических стран по биотехнологии, Balatonaaeplak, Венгрия, 1939г;

- Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии", Пущино, 1990г

- VIII Международной конференции по псксвнрусам и иридовирусам, fflRtergreen, Virginia, США, 1950г;

- годовых сессиях по итогам научных исследований в институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, 1989-iS9ir. г;.

- Республиканской научно-производственной конференции "Актуальные вопросы ветеринарии и зоотехник", Казань, 1532г;

- Международной конференции "Ködern approaches to new vaccines. Including Prevention of AIDS", Cold Spring harbor. New Уогк, США, 1992г.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в И опубликованных работах.

Материалы и методы. Для получения рекомбинантных вирусов был использован широко апробированный в качестве вакцины для ликвидации и профилактики натуральной оспы в СНГ вакцинный штамм вируса осповакцины ЛИВП, полученный из института вирусных препаратов РАМН г.Москва от д.м.н. В. И. Черноса.

Рекомбинантй вирус ЖОГЕН-НВ 32/ПГ, содержав ген поверхностного антигена вируса гепатита В (Альтитейн и др., 1986), лвбезно предоставил д.м.н. В.И.Черное. Данный вирус в работе обозначен как recW7.

Рекомбинантный вирус осповакцины ЛИВП-Luc-lacZ, содержаний ген лвциферази светлячка Phot!ñus pyralls и р-галактозидазы E.coll ск :струирован в лаборатории генной инженерии ШФМ РАН, где выполнялась данная диссоргацконная работа СКраузова и др., 1991). Этот вирус в работе обозначен как revW^.

Титрование, клонирование, размножение вирусов и трансакцию проводили в культуре клеток почек зеленой мартышки CV-1, полученной из института обией генетики РАН г.Москва от д.н.н. А. Д. Альтштейна.

В работе был использован штамм Escherichia coll К12 HB 101.

При конструировании различных- плазг^идных векторов - были использованы основные методы молекулярной биологии и генной

инженерии, описанные в рроводстве Маниатиса и др. С198ДЗ.

Для получения, селекции, анализа свойств сконструированных рекомбинантных вирусов осповакцшш были применены различные методы в некоторых модификациях, которые подробно описаны в диссертационной работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование- векторных плазмид для клонирования чужеродных генов в геном вируса осповакцшш

Одним из наиболее привлекательных свойств вируса осповакцшш как вектора. экспрессии является его емкость для чужеродной генетической информации и, в связи с зтим, возможность создания поливалентных вакцин против многих инфекционных болезней CGoebel et al., 1990).

Теоретически возможно конструирование рекомбинантного штамма вируса осповакцины, экспрессирувдего более 20 гетерологичных антигенов-СSmith and Moss. 1983). В связи с этим возникает необходимость создания значительного количества плазмидных векторов переноса для вклшения гетерологичных генов в геном вируса, а также сравнительное калекулярно-биологическое изучение рекомбинантных штаммов, экспресоирувдих чужеродные гены в различных участках генома, а особенно, в плане эффективности экспрессии гена к жизнеспособности вируса.

Нашей основной задачей было создание серии рекомбинантных ВОВ содержащих в различных участках генома гетерологичные гены в разных комбинациях, и анализ их экспрессии.

Для исследования в нашем распоряжении были два вектора интеграции CpSGt1 и pVY6). Vu сконструировали третий вектор -pSN6 Сркс.1): Этот вектор содержит репортерный ген /?-галактоэидаэы для быстрой селекции рекомбинантных клонов под вирусным промотором Р11 и свободный ранне-поздний промотор Р7,5 с тремя уникальными сайтами Kpnl, styl, sali для клонирования чужеродных генов. . Весь этот комплекс с 3'- « 5'- концов фланкирован вирусспецифическими последовательностями из несущественной для репродукции вируса в культуре клеток HlndlII-N-области осповакцины ыташь kr. Следует отметить, что данный вектор переноса сконструирован нами впервые в мире и проверен путем получения рекомбинантных вирусов. Данный этап

характеризуется тем, что для клонирования какого-либо из

перечисленных чужеродных генов в разные несущественные области генома вируса осповакшгаы, необходимо сконструировать для каждого случая отдельно определенную плазмиду, содержащую чужеродный ген под контролем промоторз осповакцины и соответствующие фланкирующие внрусспецифические последовательности из определенного участка ДНК вируса. Поэтому мы сконструировали целый ряд рекомбшштных плазмид, которые представлены на рис. 1 Рис.1. Конструирование рекомбинантных векторных плазмид.

Новый вектор интеграции в шмШ-Нчэбласть вируса осповакцины

Транзиентная экспрессия re эв р-галактоэидази E.coli и лщиферазы светлячка Photlnus pyralls в системе клеток млекопитающих CV-t

В ходе выполнения исследований ш широко использовали метод анализа транзиентной экспрессии репортерных генов. Транзиентная экспрессия позволила нам анализировать генный продукт в течение нескольких часов после проникновения ДНК- в клетку и быстро определить целый ряд интересующих параметров. Этот подход дал возможность количественно оценить активность исследуемых промоторов, предварительно изучить функциональную активность сконструированных векторных плазмид до начала трудоемкой работы по селекции рекомбинантных штаммов вируса осповакцины.

В результате наших опытов было показано, • что репортерные гены экспрессируются с высокой эффективностью. Активность ферментов р-галактозидаэы и люциферазы находится в прямой зависимости от дозы вируса на клетку и убывает с уменьшением множественности инфекции.

плэзмиды p19PL27, pSCL47, pVIMT, pSCI1 И pVY6 были исследованы ь опытах по транзиентной экспрессии репортерных генов в клетках CV-1, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛШП с множественностью инфекции 1Б0Е/клетка. Результаты одного из трех типичных опытов представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, оба фермента экспрессируются "'фектизно, независимо от вирусспецнфических последовательностей. Более высокая экспрессия люциферазы при трансфекции плазмидой P19PI27 свяэяна с тем, что ген находится под контролем сильного промотора позднего белка 11кД СЛопарев и Черное, 19873. Следует отметить, что предел обнаружения активности люциферазы был на порядок выше, чем р-галахтозидазы. Не имели эндогенной активности люциферазы: клетки, не инфицированные вирусом и без плазмид; зараженные вирусом, но без плазмид; с плаэмидамп, но без вируса. Однако, эндогенная р-галактозидазная активность в контролях клеток обнаруживалась.

Ка: :i изучена динамика транзиентной экспрессии генов lue и lacZ. При заражении клеток CV-1 вирусом осповакцины с множественностью инфекции 1 ЮЕ/клетка и при трансфекции различными плаэмидами в концентрации 30 мг/мл экспрессия люциферазы была отмечена спустя 4 часа после начала трансфекции. Экспрессия р-галактозидаэы обнаруживалась позднее 6 часов, что

Таблица 1

Сравнение транзионтной экспрессии генов люцифераэы и ß-галактозндаэы в клетках CV-1 при трансакции различии}® плазмидаьш и вирусом осповакцины штамма ЛКВП

Плазмида Фланкирующая последовательность Активность

люцшЬеразы, мВ/мг белка р-галактоэидазн. Е/мг белка в шш

р19PL27 pSCL47 pVN47 ТК N 2,43-Ю17 8,90-104 8,73-10* 2,86- 1СГ' 2,29-5 О4

pSCll ТК - 3,09-10''

pVY6 Контроль вируса без плазмид НА м 2,80-10 ? ,Oi -н''-

Контроль плазмид без вируса Контроль клеток без вируса и плазмид 0 0 1,02.10' 0,97-10i

Доза вируса - 1 БОЕ/клетка.

Время ннфешши вирусам - 24

связано с позшш характероч фушсшш «роиоюра Pi'i, под контроле-которого находится ген lacz. Оптимальна? щюлонхятешюсть опнтп по траяэиентиой экспрессии репортер»?? генов ■• 20ч Эти результаты полностью согласуется с литературными даннннч СКрауэова и др., 1591; Rodriguez ei si.. !9ЯЗ\

После оценки сконструированных гоизми* и изучения интересующих нас параметров мы приступили г: следушису этапу наших исследований - к трудоемкой работе по конструированию оекомбинантных вирусов.

Получение и анализ стабильны:; рекоггбннзнтшш вирусов осповакцины, экспрессирущих репортерные гены в различных несущественных участках генома

Используя плаэмиды pHV47, pSCII, pLZ4a: pLZ42CL pVV6t ш сконструировали стабильные рекомбннаитние вирусы осповакцини recW , recVYa, recWgJ recWü5 recTV^, соответственно, которио содержат ген /i-гаяактозидаэы E.coli и люцифераэы сьетлячкг Photinus pyralla в трех несущественных ТК-.НА-, ¡»-областях генома

Срис.2). Нами проведен сравнительный анализ экспрессии р-галактозидазы и люциферазы при репродукции данных рекомбинантных вирусов. Динамика экспрессии репортерных генов представлена на рис.3. Va которого видно, что. оба гена, интегрированные в разные несущественные области генома ВОВ, экспрессировались с высокой эффективностью, независимо от места их локализации в геноме и от количества интегрированных генов.

Из литературы известно, что N- и ТК-районы являются ранними Kotwal and Мозэ, 1988; Weir and Мозэ, 1983). Pennington С1974) показал, что активность гемагглютинина обнаруживается позднее 4ч. Вгош и его коллеги С1991) в своей работе указали, что продукт гена гемагглютшшна появляется в ранней фазе инфекции и экспрессируется с двух разных промоторов, один из которых является ранним, а второй поздним. Исходя из этих данных маню объяснить одинаковую кинетику экспрессии репортерных геноь в трех различных несущественных областях генома ВОВ.

Полученные нами результаты о возрастании экспрессии репортерных генов полностью совпадают с динамикой репродукции вируса осповакцины дикого штамма СМозэ, 1990). Активность люциферазы обнаруживается с первых часов после заражения клеток реиомбинантными вирусами и далее возрастает, достигая максимума к 10-20 ч инфекции. Более поздняя экспрессия /?-галактоэвдаэы обусловлена функционированием' позднего промотора- PU, под контролем которого находится этот ген (Chaltrabartl et al., 1985). Максиму:- активности р-галактоэидазн наблюдается к 20 ч инфекции. Дальнейшее небольшое снижение активностей ферментов связано, видимо, с выраженным цитопатогепным действием вируса и лизисом клеток. Наши рес.льтаты подтверждают данные, полученные С Rodriguez et al., 1988;- Краузова и др., 1991).

Хотя использование репортерных генов не требует радиоактивных изотопов, ' но в данной работе наряду с фенот^тческой иллюстрацией и энзиматическим определением активностей р-галактозидазы и люциферазы ш провели габридизационный анализ ДНК из рекомбинантных вирусов, который подтвердил кнсерцию чужеродных генов в ту или иную область генома вируса осповакцины.

Рис. 2. Схема рекоыбинантных вкусов осповакцины штамма ЛИВП. В0В-/ШВП ь ^р Е С А РВ О

1--Ц"---м '—----г-ч--■—>

ИшаШ

N

ТК

/

/ НА

гес 1/1/, йм^УДш, тег _

гес V^ Л1" Р!5Й1

гес 1/14

гесУУ^

гес V ^

гес 1/Ц

гес

гес1%

гес М, гос

/-ее УК,

гес V V,, |

гес 1/|/и |

гес VI',,

ггс уу с рдрпшг

И5Й1 Ю«*

I_1—1-

1ис Р15 «I юсг

1_1—I—1-1

1ис Р(5йиосг

1 1 — '

1ц{ РГБРПаЬс^

Нйсд^ Р/.51>11 Ьасг 1

ВД Р?5 г, рг5р111о' '

м5ри

—I-1

рури юсг

ггсЧе

Рис.3. Динамика экс;1; ессии лщиферазной (А) и 0-галактозидаэиой СБ] активностей при репродукции рекомбинантных вирусов в культуре клеток СУ-1.

По оси абсцисс - продолжительность инфекции клеток рекомбинантнши .вирусами Сч); по оси ординат - активность люциферазы СмВ/мг белка)и р-галактозидазн СнМ ОНФГ/мг белка в мин ). Обозначения: 1 - эндогенная активность р-галактозидаэы (фон), 2 - гесУУа; 3 - гесУУ2; 4 - гесУУа, 3 - гесУУ4, б -гесУУ .

Фермент р -галактоэидаза экспрессировался полученными рекомбинантными вирусами в большом количестве и легко выявлялся при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

_ Экспрессия люциферазы по белку была существенно ниже р-галактоэидаэы, поэтому электрофорезом в АААГ-ДСН мн не выявили данный белок. Тем не менее чувствительность ан?лиза люцифераэной активности, благодаря люминесценции всегда была на порядок выше ¡з-галактозидазы, что согласуется с данными литературы (Rodriguez et al., 1988; Краузова и др., 1991). Метод определения люцифераэной активности является относительно простым, даюада быстрый ответ Св течение секунд, минут], не требует радиоактивных изотопов, в клетках отсутствует эндогенная биолюминесценция. Определение люцифераэной активности можно осуществлять энзиматическн или путем фотодетекции на чувствительных пленках.

Таким образом, используя репортерные гони - р-галактозидазы Е.coll и лщнферазы светлячка PtioUnuy pyralls, мы отработала метод получения рекомбинантных вирусов осповакцины. С помощью этих генов нами продемонстрирсвана возможность включения чуаеродш'Х генов в три несущественные области генома оиповакиины штамма ЛИВП.

Наряду с репортерннми генами lue и lauZ з своих исследованиях мы использовали также гены вирусов гепатита В и бешенства. Нас интересовало, каки" ои'разом интеграция нескольких гетерологичных функционально-активных генов отдается на экспрессии вирусных антигенов.

. Получение и анализ свойств рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих гены антигенов вируса гепатита В и бешенства

Сотрудниками трех институтов был получен рекомбинантныЯ ВОВ, содержащий в ТК-области ген HBeAg вируса гепатита В САльтштейн я др., 1983; Альтштейн и др., 1986; F<>dor. 1991). Было показано, что этот рекпмбинантный вирус зкспрессирует IIB Ля. обладающий

-i.iT'ir"t-H!- Ii* ЧХ'.чуНСч''i-iüOi'i h Л n«4'V-O Vb-J, .'0 f-pN»! r.Cnil!par-TO.!

ДИсЖТрО» ?? H!t Ь U.töv'lt? '-K,4<' ■ТКЮРЯЯН. .аннич nilj.v'ü и^'начепннй -ак rv./YV,/ ..„.¡я конструирован!!-; ¡йда :ско'^ки-игга^к

вирусов - -vow , ¡4M..VV #, ivftw,,, Гнбрпдпаааконшто .'нализоп ДНК /-оказали наличие гена KB а>>, ь геисме snoyca •.сповакцичн.

S- •

¡Ь/мунофермеитннм асследоьанком нродс-монс iрироьали ¿кспрессгю этого гена Результат предо швлены в габлиие с

lb данных таблицы Z следуот, что ¡-и кц, сиишфичеслй выявляется в супернатанте разрушенных клеток в титре 1:1000 при экспрессии рекокйгааятшш znpycaw r*-oV7,, гс-.-п,. , rmvv. :r r> неинвен титре (1:200) при зарз.ч-мг,- хлего:< eipyoo- .

Рекомоинантный вирус recWM содержит в своем геноме ген ttb^Ag ВГВ в ТК-области и ген lacZ Е.coll в НА-области (рис.2.); оба гена экспрессируются с высокой эффективностью. Ре-комбтшт ВОВ i«i<iWia зкспрессчрует три чугеродшм 'сна: lacS.

IffieAg. Конструкция вируса recW отличается or rocW ^ ж тем, что в recWjo HBpAg содержит эпнтоп "А" BBA« ВГВ (рпп.Й.). Мч показали экспрессию \mjß вирусом recTV и нефушщионз явность этого гена в вирусе recWjo (таблица 3). Следовательно, далю предположить, что снижение уровня экспрессии reiw пв Ag в

Сравнение экспрессии клетках СУ-1 методом ИФА

Таблица 2

iaAg рекомбинантными вирусами в

' Исследуемый Разведения

материал н/р 1:50 1:100 1:200 1:300 1:1000

гео\П77 >4 >4 1,890 0,913 0,397 0,260

гееТПГ 1 0 >4 >4 2,022 1,046 0,426 0,239

геоУУ1( >4 >4 2,514 1,266 0,469 0,200

гесУУ1Э 1,339 0,295 0.149 0,073

гесУУ1 геоТУ

«в

контроль клеток

контроль

вируса

осповакцины

0,122 0,104

0,002 0,024

геСТУ, а. по сравнению с гес7У10, зависит от экспрессии гена НВ Ар,, и может быть НВ А& каким-то образом ингибирует

О __о

транскрипцию гена НВ Ае, но для точного доказательства этих предположений необходимы дальнейшие дополнительные исследования.

• Нами сконструированы три стабильных рекомбинантных вируса гесУУ9, гес\п/5а, геоУУ13, содержащие ген НВоАе вируса гепатита В. Радиоиммунологическим анализом эти вирусы "были исследованы на способность экспрессировать НВоА& Результаты представлены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 видно, что три рекомбинанта геочч^, геоУУ1а, гесУУ13 синтезируют НВсАе. Анализ препаратов других вирусов; клеток не зараженных вирусами; и клеток, зараженных диким штаммом ВОВ и зараженных рекомбинантными вирусами гесТ^, геа¥?10. гесУУ1б не выявил НВоА& Методом имыуноблоттннга белков клеток ст-1, зарашшых рекомбинантными вирусами гес^, recWlal гесУУ13, мы показали, что с ыоношшлыаш антителами СЦЕН к •С-дошну НВ Аз вируса гепатита В взаимодействует полипептид,

имеювдй электрофоретическуа подвикность, соответствуем белкам о

молекулярной массой 22 кД. Получешшо наш; результата коррелируют с данными, описанными в литературе СЛопарев н др., 1990; 2е)10(1е1 ега!.. 1992).

Табдши 3

Сравнение экспрессии НВоЛ£ рекоибинантныин вирусами в клетках СУ-1 методом РИА

Образцы

пробы

Счет, шп/икн

Среднее значение, имп/мии

% связывания

Результат

анализа наличия

нч ,\гт

гесУУ

гесУУ

гесУУ

16

Положи г. контроль из набора

Отри цат.

КОНТРОЛЬ

пз набора Вирус

оспсяакишш ШШ

Контроль клеток

1 171

2 187

1 166

2 177

1 167

2 165

2897

2

1 ^ Р з1

2755

!

у ¿076

1 1г»0

а

1 308-г

г (Ш

3 3030

4 2019

1 2729

2 то

1 2940

2 2663

179 17.1,3 166 2943

231П

1[54

2925

с/Ы.й 2801,3

93,9 94,1 94,3 4.1

о

5,8 4,2

о

К настоящему времени мы не проводили изучения физического состояния НВ=Ай, экспрессируемого рекомбинантными вирусами осповакцшш. Но рядом исследователей СЛопарев и др., 1990; НсТяеМчп е1 ч1., 1987; БсЬосМ ег а1., 1992) электронно-микроскопическим анализом фракций сахарозного градиента было показано содержание частиц размером около 27 кД, соответствующих по размеру частицам НВ А& выделенным из крови больных гепатитом В. Основываясь на этих данных, мокно предположить, что синтезируемый рекомбинантными вирусами гесУУ9, гес\?У12> гесУУ1з НВсАе БГВ, также может собираться в подобные частицы. Для подтверждения этого предположения будут проведены дальнейшие исследования.

Целью нашей работы явилось также получение рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего гликопротеин вируса бешенства. По имеющимся данный (АпШоп1з е! а1., 1982; Ьесося ег а1., 1985) основным белком, способным индуцировать вируснейтрализующие антитела и реагировать с ними, является белок оболочки вируса - гликопротеин с.

Используя ген гликопротеина С вируса бешенства нами сконструированы два рекомбчнантных вируса осповакцины штамма ЛИВП - гееТУ14 и геиУУ1Б, содержаще и экспрессирующие этот ген в ТКи К- областях генома, соответственно. В отличие от АпШогЛу е1 а1. (1992) для этого была использована не мРНК гена гликопротеина, синтезированная в инфицированных клетках, а непосредственно вирусная РНК, используя которую с помощью праймера, комплементарного началу гена --гликопротеина, была синтезирована к ДНК, а затем был амплифицирован ген гликопротеина методом полимеразной цепной реакции.

Один из полученных рекомбинантных клонов гео\^14 исследовали, на лабораторных животных. Результаты одного из экспериментов представлены в таблице 4.

Таблица 1

Иммуногенные и протективные свойства рекомбннантного вируса осповакцины гес

Исследуемый материал Количество мышей Титр вирус-нейтрализу-садх антител Инъекция УЛИЧНОГО бешенства Вшило Пало

гее^ 1 4 12 1:125 + 12 -

вирус осповакцины ЛИВП 12 0 . - 12

¿«экологический 12 раствор 0 4. - 12

Из результатов таблицы 4 видно, что иыш. который вводили дикий вирус осповакцины и физиологический раствор, пали. Выгили лишь мыши, иммунизированные рекомбинантный вирусом. Следовательно, рекомбинантный вирус гее7?м при введении в

организм >«®сй иплуцирует образование раоическчх иеЗтралкзуеыая антител и заглот «ивоша от зара«еяня /яг.--::ши вирусом беиекства Крон? того, эксперименты, проведенные в институте полиомиелита и вирусных энце-[-алцтов Г4ЧИ г.Мсоява, свидетельству»-! о то», что рексыбинантнцн вирус .а процессе культивирования сохраняет антигенные сг-сСства :Г является стайняьнга Сотрудника«; этого института такте показало, что после иммунизации аивотшя гесТ^ развитие ггочстеитиости ¡1 носледущему заражению их удичиш ьарусс^; бешенства оопровоялается развитием гуморальное и клеточного иммунитета. По своей активности г*с77 арреоокодт ■>?"ом'ж рирокячнуя лиатварошауа ващшу * п т устутше? »чяглн»»р(л»п!шпй концентрированной кошерческой вакцине против бешенства.

Следовательно, рекомбинантный вирус осповакцины гесУ¥15, экспресс??«?»»« гпикопротеин вируса бешенства штамма "Ь'нукср.о-32", обладает протектнвни^! и чечунс [шш'.щ г.*.-'.-.;! яа»т ! «охет рассматриваться в качестве кандидата н* -чвуч рекомбкнантнуо вакцину против бешенства.

В заключение следует ещэ раз отпсгл;., ••

рекомбинантные вирусы осповакцины, описанные в данной работе, полуиены на основе вакцинного штампа ЛИВП. Используя репортерные гены и гены антигенов вируса гепатита В и бешенства, мы продемонстрировали возможность использования трех имущественных областей генома вируса осповакцины штамма ЛИВП для инсерции чужеродных генов i способность рекомбинантных вирусов экспрессировать эти гены, показали возможность создания поливалентных вакцин на основе вируса осповакцины против различных заболеваний человека и животных.

. ВЫВОДЫ

1. Сконструирован и структурно охарактеризован ряд рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессирувщих

-репортерные гены лодиферазы светлячка PhoUnua pyralle и р-галактозидазы E.coll, а также антигены вируса гепатита В и бешенства. Функционально-активные ■ гетерологичные гены интегрированы в три различные области генома вируса.

2. Экспрессия репортерных генов весьмч эффективна и не зависит от места локализации в геноме вируса осповакцины. Кинетика их активности соответствует характеру промоторов вируса осповакцины.

3. -Сконструирован новый вектор интеграции pSN6 для Hindlll-. N-участка генома вируса осповакцины." Эффективность вектора была продемонстрирована с использованием репортерного гена р-галактозидазы.

4. Разработан метод получения рекомбинантных вирусов осповакцины. Ряд рекомбинантных вирусов получен путем инактивации и интеграции гетерологичного гена в ген lacZ при условии наличия lacZ в геноме вируса. Для этих целей сконструирована специальная плазмида-вектор.

5. Сконструированы рекомбинантные закцинные штаммы вируса осповакцины ЛИВП recWe, recW12, recWi3, содержащие и экспрессирущие поверхностный и сердцевинный антигены вируса гепатита В. Штаммы представляет интерес как кандидаты на живую рекомбинантнув вакцину против гепатита В.

6. Получены рекомбинантные штаммы вируса осповакцины recWt4, recWjB, экспрессирущие гликопротеин вируса бешенства штамма "Внуково-32", Рекоибинантный вирус recWI4 вызывает образование вируснейтрализущих антител и может рассматриваться в

качестве кандидата на живу» генно-янхенеркув вакцину против

бешенства.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Krausova V.I., Kopylova-Svlrldova T.N., Tlmlrjasova Т.Н., Fcxlor I. Expression of the reporter genes coding for firefly luolferase and bacterial p-galactosldaae in mammalian cells utilizing vaccinia virus promoters// Abstracts oi the V scientific symposium of Socialist countries on Biotechnology.-Balantonszeplak, Hungary, 1989.-V.II.-P.330.

2. Fodor I., Krausova V.I., Kopylova-Svlrldova T.N., Tlmlrjasova T.M. Tramlent and stable expression of firefly luolferase In tramrcjllan cello using a poxvirus - derived vector//Abstract в of the 8th international Conference on Poxvlrusea and Trldovlruses.-Wlntergreen Conference Center, Virginia, USA, 1990.-P.145.

3. Когшяова-Свиридова Т. H., Горелова Т. В., Крарова В. И., Тиыирясова Т.М.-, Фодор И.И., Шуппе Н.Г. Бакуловнрусная система экспрессии люциферазы сьетлячка в клетках тутового

. шелкопряда// ДАН СССР. -1090. -Т. 312. -С. 1507-1510.

4. Potior I., Krausova V.T., Ko;ty 1 ova-Svir I«!ova Т.Н., floraluva T.V., HoJwtkov O.Ai, Snukovatltsln V v., Ttotrjaeove Т.Н., ^«•Ьирре H.C. I.rti'p- DUA vlnises as gene Pxpr^nslon vectors '/ Abatracts of the 20th muting of Die FFRSr Budapest, Hungary, 1990.-P.I?7.

5. Krausova V.T., Kopylova-Svlrldova i.N., TJmfrJaaova Т.Ч., Fodor I. Synthesis of recombinant firefly lueiieraae In laurnmal Ian ceils//Abutracts of the 20th roue 4 rig of the FEBSr

. Budapest, Hungary, 19SO.-P.1&6.

6. Краузова В. И., Копылова-Свиритова Т. Н., Тимчрясова Т. М., йодбр И. П. Инактивация репортерного гс-ка рэхомбинаптного вируса основанцнни путей гоиолегшшой рекомбинации in ?l7o-v "Новые направления биотехнологии".- Тезисы докл.-Пущйно, 1990.-С. 74.

7 Копшппа-Пвириплпз TJ1 Гпррпппя T R Крауэопа В. И.'.

Тнмнря.севч Т.М. . 0упп<= !!. Г. , Фодоп И П Получи;:!? и изучена рс-конй1шааиц1х штатов бакудовнруссз, импрэссирусаих ген лецифераэы// "Новые направления бпоте^юнопт".- Теппсч докл. -Пуцино, 19S0.-С.70.

8. Краузова В.И., Копнлова-Свиридоиа Т.Н., Тньшряссвэ Т.П.,

Фодор И. И. Экспрессия гена лщифераэы светлячка в клетках млекопитащих о использованием векторов на основе вируса осповакщшы// Мол. генетика, микробиология и вирусол. -1091. -N2. -С. 23-28.

9. Kopylova-Svlrldova T.N., Kreusova V.I., Timlrjaaova Т.Н., Gorelova T.V., Schuppe N.G., Fodor I.Transient expreeslor аввау in a baculovlrua eyetem ualng llrelly luclierase gem ae a reporter// Virus genes.-1992.-V. 6.-P. 379-386.

10. Tlmlrjaaova Т.Н., Kopylova-Svlrldova T.N., Fodor 1. Construction and comparative characterization of recomblnani vaccinia vlmses canning heterologous genes In differed nonessential regions of the genome//Abstraete of the meetly on "Modern approaches to new vaccines. Including preventioi of AIDS",-Cold Spring Harbor, He« York, USA, 1992.-P.6l.

11. Тимирясова Т. И., Копылова-Свиридова Т. Н., Фодор И. И. Анали: экспрессии репортерных генов в различных участках геном; вируса осповакцины//Молекулярная биология.-1993.-Т.27.-вып,2