Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и анализ свойств рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессирующих гетерологичные гены

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и анализ свойств рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессирующих гетерологичные гены"

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В. И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

На правах рукописи

ТИМИРЯССВА ТАТЬЯНА МИХАИЛОВНА

ЖСТРУИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ СВОЙСТВ РЕКСМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ОСПОВАКЩНЫ, ЭКСПРЕСС ИРУЩО, ГЕТЕРОЛОГИЧНЫВ 1ЕНЫ

03.00.04 - блохтт •

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 1993

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Инстт биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии Нг

Научный руководитель - доктор биологических наук И. И. Фодор

Официальные оппонентн: дгнтор ветеринарных наук,

профессор Хазиг.ов Н.Э. кандидат биологических наук доцент Малкоь С. В.

Ведущая организация: Институт общей генетики Российской Академии Наук

Запита диссертации состоится " _ 1993г.

в /У^ч. на заседании Специализированного совета К. 053.25.5 при Казанском Государственном Университете нмеии В. И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул. Ленина, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского Государственного Университета.

1993г.

Аскарова 4. К.

Автореферат разослан £ис/1би<Л/

Ученый секретарь специализированного совета ¿К^/у

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение первичной структуры ДНК и заработка систем экспрессии генов in vitro существенно расширили шия в области структурно-функциональной организации ^наркотических генов. Эти исследования способствовали решение южества вопросов, связанных с регуляцией экспрессии генов, с зсттранскирпциошгай и теттранзляционной шдифакацией генных эодуктоа, а также связанных с созданием и получением различных энно-инхенерных препаратов, необходимых для диагностики и рофилактики инфекционных болезней человека и животных, ущественнув роль в этих исследованиях играет рекомбинантные энструкции на основе эукариотических вирусов, которые кспрессирувт гены, кодируовде различные автогены возбудителей нфакций, и является живыми вакцинам.

В этом отношении вирус осповакцины СВОВ) представляет олыюй научно-практический интерес. Он имеет такие отличительные войства, как способность включать значительное количество кзогенноЯ ДНК, правильная транскрипция экзогенных генов и равияьная трансляция мРНК с образованием белка сходного с ативньш по структуре, функции и расположении, цитоплазматическая окализация репликации вируса и наличие безопасных вакцинных ташов Ciioss, !99t). Все это позволяет рассматривать вирус сповакцшш в качестве перспективного вектора для клонирования ухеродных геноа разяитгх антигенов, в качестве живой екомблнаятной вакцины против возбудителей инфекций человека и лвотных (Brody et al., 1992; Hlviere et al., 1992).

На данный моыент получен целый ряд рекомбинаншк вирусов сповакцины, экспрессируювдх различные чужеродные гены, в ¡ольшинстве случаев на основе вирулентных штаммов СWilliamson, 938).

В настоящей работе «ы показали использование вируса юповащшы штамма ЯИВП, широко апробированного как вакцина для гиквидащш и профилактики натуральной оспа в СНГ, в качестве ¡ектора экспрессии. Провели изучение рехомбшштных штаммов ВОВ, 1кспрессиррдах как репортерше гены, ;ак и го^ы антигенов вируса ■епатита В СВГВ) и бешенства. Созданные наш рекомбинантные ¡ирусн могут рассматриваться как кандидаты на гавые 'енно-инженерюе вакцины против гепатита В и бешенства. Все это н зпределяег актуальность данной темы.

Цель и задачи исследования. Цельв работы было . создание и изучение свойств рекомбтштшя штампов вируса осповахцшш, экспрессирувада гетерологичные гены. В .соответствии с этим были определены следующие задачи:

- сконструировать бактериальные вектора иксерции, содержащие гены р-галактозидазы E.coll, лщиферазы светлячка Photlnus pyralls, ЕВ Ag вируса гепатита В;

- изучить транзиентную экспрессию репортерних генов;

- получить стабильные рекомбинантные вирусы осповакцины штакма ЛИВП, экспрессируяиде гетерологичные гены;

- изучить экспрессию репортерных генов • в процессе репродукции рекомбинантных вирусов;

- провести иммунологический анализ экспрессии HBeAg и вируса гепатита В и гяжопротеина вируса бешенства рекомбинантньш вирусам осповакцшш.

Научная новизна. Результаты по клонирований гетерологичньа генов в ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП носят приоритетный характер. Впервые получены рекомбинантвде ВОВ штамма ЛИВП, содержащие в Hindlll-N- и НА-областях чужеродные гены. Впервые создай триваяентяый рекомбинантный вирус осповакцины штамма ЛИВП, экспрессируоздй три чужеродных гена: 0-галачтозидазу E.coll, HBoAg и HBcAg вируса гепатита В. Впервые получен рехомбинантный вирус осшзвакциш штамма ЛИЗП, который зкспрессирует гликопротеин вируса бешенства штамма "Внуково-32". Впервые сконструирован интегративный вектор инаерции чужеродных генов в i.inciiil-N4idnacTb генома вируса осповакцины.

Научно-практическая значимость результатов. Основный итогом работы явилось создание серии рекомбинактных вирусов осповакцнны, экспрессирувдих гетерологичные гены в различных несущественных областях генома.

Сконструированные рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирувдие антигены вируса гепатита В к бешенства являптся кандидатами на живые геняо-шишерше вакцины против этих инфекций. Рекоибшштшй вирус, зкспрессируодий гликопротеин вируса беиеяства, проверен на лабораторных хивотных и получены положительные-результаты. В настоящее время оформляется патент на этот рекомбинантиый штате, как на живую вакцину против бешенства.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение и выводы. Работа изложена на 14В страницах, содержит 8 таблиц и

26 рисунков. Список литературы включает 204 наименования.

Апробация работа. Материала диссертации были доложены и одобрены на:

- V научной конференции социалистических стран по биотехнологии, Balatonsaeplak, Венгрия, 1939г;

- Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии", Пущино, 1990г- 71II Мевдународкой конференции по псксвнрусам и

иридовирусам, Wintergreen, Virginia, США, 1990г;

- годовых сессиях по итога].! научных исследований в института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущина, 1989-1991г. г;.

- Республиканской научно-производственной конференции "Актуальные вопроси ветеринарии и зоотехнии", Казань, 1992г;

- Международной конференции "Modern арргоасЬез to nevv vacclnes. Includlng Preventlon oi AIDS", Cold Spring nartor, New Уогк.США, 1992г.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 11 опубликованных работах.

Материалы и метода. Для получения рекоыбянантных вирусов был использован широко апробированный в качестве вакцины для ликвидации и профилактики натуральной оспы в СНГ вакцинный штамм вируса осповакцияы ЛИВП, полученный из института вирусных препаратов РАМН г. Москва от д. м. н. В. И. Черноса.

Рекомбияаятнкй вирус ЛИОГЕН-НВ 32/ПГ, содержаний ген поверхностного антигена вируса гепатита В САльтштейн и др., 19S8), любезно предоставил д.ы.н. В. И. Черное. Данный вирус в работе обозначен как recTV7.

Рекомбинантный вирус осповакцшш ЛИБП-Luc-lacZ, содерхавдй ген люциферазы светлячка Photlnua pyralls и /з-галактозидазы Е.сои сконструирован в лаборатории генной инженерии ИБФМ РАН, где выполнялась данная диссертационная работа СКраузова и др., 1991). Этот вирус в работе обозначен как revW..

Титрование, клонирование, размножение вирусов и трансфекцию проводили , в культуре клеток почек зеленой мартышки CV-1, полученной из института обдей генетики РАН г. Москва от д. м. н. А. Д. Альтштейна.

В работе был использован ытамм Escherichia coli К12 HB 101.

При конструировании различних- плазмидных векторов били использованы основные ыэтодц молекулярной биологии и генной

инженерии, описанные в руководстве Маннатиса и др. С198АЗ. '

Для получения, селекции, анализа свойств сконструированных рекомбинантных вирусов осповавдины были применены различные методы в некоторых кодификациях, которые подробно описаны в диссертационной работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование- векторных плазыид для клонирования чужеродных генов в геном вируса осповакцины

Одним из наиболее привлекательных свойств вируса осповакцины как вектора экспрессии является его емкость для чукеродной генетической информации и, в связи с этим, возможность создания поливалентных вакцин против многих инфекционных болезней CGoebel et al., 1990).

Теоретически возможно конструирование рекомбинантного штамма вируса осповакцины, экспрессмрущего более 20 гетерологичных антигенов СSmith and Moss, 1983). В связи с этим возникает необходимость создания значительного количества плазмидных векторов переноса для включения гетерологичных генов в геном вируса, а такте сравнительное колекулярно-биологическое изучение рекшбинантных шташов, экспрессирувгщх чужеродные гены в различных участках генома, а особенно, в плане эффективности экспрессии гена и жизнеспособности вируса.

Нашей основной задачей было создание серии рекомбинантных ВОВ содерхадах в различных участках генома гетерологичные гены в разных комбинациях, и анализ их экспрессии.

Для исследования в кашек распоряжении были два вектора интеграции СpSCH и рУУб). Ш; сконструировали третий вектор -pSN6 С рис.1): Этот вектор содержит репортерный ген р-галактозидазы для быстрой селекции рекомбшштшх клонов под вирусным промотором Р11 и свободный ранне-поздний промотор P7.S с трем уникальными сайтами Kpni, styl, Sail для клонирования чужеродных генов. Весь этот комплекс с 3'- и 5'- концов фланкирован вирусапецифическими последовательностями из несущественной для репродукции вируса в культуре клеток Hlndlll-1 [-области осповакцины ¡таима Ж Следует отметить, что данный вектор переноса сконструирован нами впервые в мире и проверен путем получения рекомбинантных вирусов. Данный этал

характеризуется тем, что для клонирования какого-либо из перечисленных чужеродных генов в разные несущественные области генома вируса осповакнины, необходимо сконструировать для каждого случая отдельно определенную шгазмиду, содержащую чужеродный ген под контролем промотора осповакцины и соответствующие фланкирующие вирусспецифические последовательности из определенного участка ДНК вируса. Поэтому мы сконструировали целый ряд рекомбияантных плазмяд, которые представлены на рис.1 Рис Д. Конструирование рекомбинантик векторных ллазмид.

Новый вектор интеграции в ншаш-и-область вируса осповавднны

Транзнентяая экспрессия генов р-гаяактозидазы E.coll к гадиферазы светлячка Photinus pyralls в системе клеток млекопитающих CV-1

В ходе выполнения исследований tot широко использовали метод анализа транэиентной экспрессии репортерных генов. Транэиеитиая экспрессия позволила нам анализировать генный продукт в течение нескольких часов после проникновения ДНК в клетку и быстро определить целый ряд интересующих параметров. Этот подход дал возюхяость количественно оценить активность исследуемых промоторов, предварительно изучить функционально активность сконструированных векторных плазмид до начала трудоемкой работы по селекции реномбинантных штаммов вируса осповакцины.

В результате наших опытов было показано, что репортерные гены экспресслруотся с ьысоной эффективностью. Активность ферментов р-галактозвдазы и лщкферазы находится в прямой зависимости от дозы вируса на клетку . и убывает с уменьшением множественности инфекции.

Плазмндн P19PL27, pSCLtT, pVIMT, pSCIl И pVY6 были исследованы ь опытах по транэиентной экспрессии репортерных генов в клетках CV-1, зарашшых вирусом осповакцины штамма ЛЙВП с множественность» инфекции 1 БОЕ/клетка. Результаты одного из трех типичных опытов представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, оба фермента экспрессируются с/¡активно, независимо от вирусспецифических последовательностей. Более высокая экспрессия лоцкфаразы при трансфекцин плазмндой P19PL2T связана с те«, что ген находится под контролем сильного промотора позднего белка 11кД СЛопарев и Черное, 1937). Следует отметить, что предел обнаружения активности люциферази был на порядок выше, чем р-гаахюзвдазы. Ils имели эндогенной активности лоднферазн: клетки, не инфицированные вирусом и без гошшщ; заракэнные вирусом, но без плазыид; с плазмцак:, но оез вируса. Однако, эндогенная р-галактозидазная активность в контролях клеток обнаруживалась.

Нади изучена динамика чранзпентной экспрессии генов lue и lacz. При заражении клеток CV-1 вирусом осповакцины с шшествшгссгьи инфекции 1 БОЕ/клэтка и при трансфекщш различишь плазшщаш з концентрации 30 мг/мл экспрессия люциферази была отмечена спустя 4 часа после начала трансфекщш. Экспрессия р-гадактозидазы обнаруживалась позднее G часов,, что

Таблица l

равнение траиэионтной экспрессии генов люциферазн к -галактозидаэы в клетках cv-i при трансакции различными плаэмидаии и вирусом осповакцины штамма Jffîl

Плазмида Франкирующая последовательность Активность

люци^еразы, иЗ/нг белка р-галактозидазы, EAT белка в шш

р19Р127

рБСШ

рШ7

рБСН

рПб

Контроль вируса без плазмид

Контроль плазмид без вируса

Контроль клеток без вируса и плазмид

ТК H ТК НА

2,43.10s 8,96-10* 8,73.1o-4

О О О

2,86.10* 2,29-10« 3,09.10* 2,80.10*

1.01.101 1,02.10* 0.97401

Доза вируса - 1 БОЕ/клетка. Время инфекции вирусом - 24 ч.

связано с поздним характерен функции промотора PU, под контролем которого находится ген laoZ. Оптимальная продолжительность опыта но гранзиенпюй экспрессии репоргерних генов - 20ч. Эти результаты полностью согласуотся с -литературными данными СКраузова и др., 1691 ; Rodrlguea et al., 1988).

После оценки сконструированных гошшц и изучения интересующих нас параметров ш приступили к спедуошгу зтапу наших исследований - к трудоемкой работе по конструирований секомбшшшш вирусов.

Получение' и анализ стабилыш ретсой&шаншл: вирусов осповакцины, зкспрессирувздх репортерши гены в различных несущественный участках генома

Используя ГОШМИДЫ р!ЛМ7, PSC11. pLZ48, pLZ420, рТ/б, 151 сконструировали стабильно рекомбшантные вирусы осповахщш recW , recW3, recWs, recW6, recWo, соответственно, которые содержат ген р-гаяактозидазы E.coll к лецифэрази светлячка Phot Шиз pyralls в трех несущественных ТК-.НА-, М-облаотях генома

С рис. 23. Нами прсьедек сравнительный анализ ■ экспресса ß-галактозидаэц и лвциферазы при репродукции дакни рекокбинантных вирусов. Динамика экспрессии репортерных: гено: представлена на рис.3. Из которого видно, что оба гена интегрированные в разные несущественные области генома ВОВ экспрессироаались с высокой эффективностью, независимо от «ест, их локализации в renoue и от количества интегрированных генов.

йз литературы известно, что N- и ТК-райокы являются ранним Koivval and Моза, 1938; Vtelr and Моээ, 1983). Pennington С1974 показал, что активность генагглютинина обнаруживается позднее 4ч Brown и его коллеги С1981) в своей работе указали, что продук гена геыагглйткинн'а появляется в ранней фазе инфекции экспрессируется с двух разни промоторов, один из которы является ранним,'а второй поздним. Исходя из этих данных ыохн объяснить одинаковуо кинетику экспрессии репортерши генов в тре различных несущественны]: областях генома ВОВ.

Полученные наш результаты о возрастании экспрессии репортерных генов полностью совпадает с динамикой репродукци вируса осповакцшш дикого штамма (Mosa, 1990). Актавност лоцпферазы обнаруживается с первых часов после заражения клето рекоыбинантньш вируса?,а! и далее возрастает, достигая максимума 10-20 ч инфекции. Более поздняя экспрессия ß-галактоэидаэ обусловлена функционированием позднего промотора- Р11, под контролем которого находится этот ген CChakrabartl et al., 1935) Максиму: активности ¡¡-галактозидазы наблюдается к 20 ч инфекции Дальнейшее небольшое снижение активностей ферментов связано видимо, с выраженным цитопатогешш действием вируса и лизисо клеток. Наши рее. льтаты подтверждают данные, получении С Rodriguez et al., 1988;' Краузова и др., 1991).

Хотя использование репортерных генов не требуа радиоактивный изотопов, ' но в датой работе наряду (¡енотыгической иллюстрацией и зпзииатичеекки определенна активностей р-галактозидаэи и лвциферази ш провел гибридизационный анализ Щ из рекокбинантных вирусов, которы подтвердил инсерцио чужеродных генов в ту или иную область геном вируса осповакцшш.

Рис. 2, Схема рекомйинантнюс вирусов осповакцины штамма ЛИВП. B06-/IUM1 » «lF -Е WHÄIII С А У Q

■----—-V! ---1-

Hindin

/V

гес Щ нъуАКЩ iqcz , гес V .ы wsw.Locg _

recVl/3 rec VW, recVVs гес Щ recVV, recVVj'

rec VV, recVVf, reeVV,,

reo VV12 н&сАэ^.ри иасг i rec Wu |

recVVf

rGC Щ5 _ G PtSPHLOcZ j

recl/Ks

TK \

PÖfll LoeZ t_i—i-1

Luc (>¡5Hl IObZ ■ ■_i_i-1

Luc PiSWUatZ <—i—»-.

Uc W.5MULacZ i_tJ_i—i-1

«ücAjPtSPII LacZ , И i^j/ji VV3 Д5

G P(SNU« :

\ _ I J

HSAVP^j^ix,

-r-^r-

/

/ HA

P(SPH LdtZ

PISf» LocZ

/ \

Рио.З. Динамика экс1>: ессии лодиферазиой САЗ и р-галактозндаэной СБ) активностей при репродукции рекомбинантных вирусов в культуре клеток С7-1.

По оси абсцисс - продолжительность инфекции клеток рекокбинантными , вирусами Сч); по оси ординат - активность лвцнферазы СмВ/мг бэлкаЗи /з-галактозидазы СнМ ОШГ/мг белка в мин ). Обозначения: 1 - эндогенная активность р-галактозидазы С фон), г - гecWв; 3 - гесУУ2; 4 - гесУУэ, 5 - гесУУ^, б -гесУУв.

Фермент р-галактозидаза экспрессировался полученными рекомбинаптннми вирусах« в большом количестве и легко выявлялся при электрофорезе в полиакрилашдном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Экспрессия лвциферазы по белку была существенно нике р-гаяактозидазы, поэтому электрофорезом в ПААГ-ДСН ны не выявили данный белок. Теп не менее чувствительность ан?лиза лщиферазной активности, благодаря люминесценции всегда била на порядок выше р-галактозидазн, что согласуется с данными литературы Скойг1£иег еЬ а1., 1988; Краузова н др., 10913. Метод определения лоциферазной активности является относительно простым, давдиа быстрый ответ С в течение секунд, шшут), не требует радиоактивных изотопов, в клетках отсутствует эндогенная биолшинесценция. Определение лщиферазной активности можно осуществлять энзиматически или путем фотодетекции на чувствительных пленках.

Таким образои, используя репортерные гены р-галактозидази В.coll и тгоциферази светлячка РУюШш pyralls, ш отработали летод получения рекомбинангных вирусов осповакцшш. С поиода& этих генов наш! продемонстрирована возможность вклоченкл чужеродных генов в три несущественные области генома оспозакцины лтамма ЛИВП.

Наряду с репортерншш генами lue и ] aeZ в своих исследованиях мы использовали так»е гены вирусов гепатита В и бешенства. Нас интересовало, каки» ои'разом интеграция нескольких гетерологичных функционально-активных генов отраиется на экспрессии вирусных антигенов.

Получение и анализ свойств рекомбинантных вирусов осповакцшш, экспресснруюдих гены антигенов вируса гепатита В и бешенства

Сотрудниками трен институтов был получен рекомбинантный ВОВ, содержащий в ТК-обяасти ген HB^Ag вируса гепатита В САльтштейн и др., 1985; Альтштейн и др. , 19S0; F"doi-, 1991). Было показано, что этот рекоибинаитный вирус экслрессирует НВ Ag, обладаний антигенной и иммуногенной активность», который собирается в частицы диаметром 22 нн. Мы в работе использовали данный вирус (обозначенный как reeW ) для конструирования ряда рекомбинантных вирусов - reevv , ivcW , reuW Гибридизационным анализом ДНК доказали наличие гена НВ Ag в геноме вируса осповакцшш. Инмукоферментшгн исследованием продемонстрировали экспрессию этого гена. Результаты представлена в таблице 2.

Из данных таблицы 2 следует, что НВ Ag специфически выявляется в супернатакте разрушенных клеток в титре 1:1000 при экспрессии рекомбинантннш вирусами recW , reuW)( , recW){ и в меньшем титре Cl:200) при заражении клеток, вирусом recW . Рекомбинантный вирус recW содержит в своем геноме геи Hí^ág ВГЯ з ТН-сбластгс и ген lacz Е.соп в НЛ-области Сркс. 2. ); оба гена зкспрессируотся с высокой зффзктивносты). Рекомбшшт BOB recWj3 эксарессчрует три чукеродньк гена: KB lacZ, HBoAg. Конструкция вируса recW( отличается от recW!0 шпь тем, что в recWt0 HBe/g содержит эпитсп "A" IIBJg ВГВ (рйо.2. ). Ш показали экспрессия НВ Ag вирусом recW13 и нефункционашюсть этого гена в вирусе recV?to Стаблица 33. Следовательно, мояно предположить, что снижение уровня экспрессии геил дд в

Таблица

Сравнение экспрессии BBaAg рекомбинантнынн вирусами клетках CV-t методом ИФА

Исследуемый Разведения

материал н/р 1:50 1:100 1:200 1:500 1:1000

recW„ 7 >4 >4

iecW.„ 1 0 >4 >4

recW|( >4 >4

recW(3 1,339 0,295

recWt 0,122

reoTV,, 0,104

контроль клеток 0,002

контроль вируса осповахцшш 0,024

1,890 0,973 0,397 0,260

2,022 1,046 0,426 0,239

2,514 1,266 0,469 0,200

0,149 0,073

гес771э, по сравнение с recW10> зависит от экспрессии ген НВ Ag, и монет бить HBoAg каким-то образом ингибируе трансхришию гена HB^g, но для точного доказательства эта предположений необходимы дальнейшие дополнительные исследования.

Нами сконструированы три стабильных рекомбюштных вирус recW9, recwia, recWj3, содерхавде ген HBoAg вируса гепатита В Радиоиммунологическим анализом эти вирусы были исследованы н способность экспрессировать HBeAg. Результата представлены таблице 3.

lb данных таблицы 3 видно, что три реноибшшта recWs reoWls, recV7i3 синтезируют HBeAg. Анализ препаратов другн вирусов; клеток не зарашаш вирусами; и клеток, заражена; дикий штаммом B0D к зараженных рекоыбшштныш вирусами reoVrV] recW10, recWf4 не выявил НВсА& Методом кммуиоблоттинга беякс клеток CV-1, зарагешшх рекомбинангнши вирусами reeW9, recWls xecW , ш показали, что с шшшгашьныкк антителами С14Е11 С-доишу TiB kg ' вируса гепатста В взаимодействует полкпептнл

мещий электро^оретическуа подвихность, соответствующую белкац о юлекулярной массой 22 кД. Полученные наш! результаты коррелируют ! данными, описанными в литературе СЯопарев и др., 1950; Schodel >t Ol., 1992).

Таблица 3

Сравнение экспрессии HBoAg рекоыбинантиьши вирусам з клетках CV-1 методом РИА

Образцы Номер Счет, Среднее У, связы- Резуль-

пробы . 1ПЯ1/1ШН значение, вания тат

имплш ['»»13- анализа

наличия

анти-НВ о пв а а а

recW 9 1 2 1Т1 18? 179 93,9 +

recW 1 2 166 177 171,5 94.1 +

recW 1 2 167 165 I66 94,3

recW f 1 2 2897 2989 2943 4,4 -

recW 10 1 2 3024 2796 2910 4,3 -

recW t 6 1 2 3102 3076 3089 4,6 -

Полоит. 1 2 150 153

контроль из Haiopa 154 91,7 t

Отрицат. 1 3084

контроль из набоса 2 3 4 2967 -J030 2019 2923 0 -

Вирус -1 оспояакцшш 4 JjJfflil d 2729 2780 2734,5 б,а ' -

Контроль клеток 1 2 2940 2603 2801,5 4,2 -

К настоящему времени мы не проводили изучения физической состояния НБ экспрессируемого рекомбинантными вирусам! осповакцины. Но рядом исследователей СЯоларев и др., 1990; МоЬаеМяп е1 я]., 1987; 5еЬсх1е1 ег а1., 1992) электронно-иикроскопическ!ш анализом фракций сахарозного градиента былс показано содержание частиц размером около 27 кД, соответствущю по размеру частицам НВсА£, выделенным из крови больных гепатиток В. Основываясь на этих данных, можно предположить, чтс синтезируемый рекомбннантными вирусами гес'/У^, гесТУ)г, гееУТ^, НВ^Аз ВГВ, также может собираться в подобные частицы. Дл^ поатверждения этого предположения будут проведены дальнейшие исследования.

Цельс нашей работы явилось также получение рекокбинантногс вируса осповакцины, экспрессирувщего гликопротеин вирусе бешенства. По имеющимся данным САп1Иоп1а е1 а1., 1982; Ьесося е1 а!.. 1985) ссновным белком, способным индуцировать вируснейтрализувдие антитела и реагировать с ними, является белоя оболочки вируса - гликопротеин С.

Используя ген гликолротеина й вирус* бешенства нами сконструированы два рекомбчнантных вируса осповакцины штамма ЛИВГ - и гееУУ15, содерхадае и зкспрессируошие этот ген в ТК-

и Н- областях генока, соответственно. В отличие от АпШогЛе» е1 а1. С1992) для этого была использована не мРШ генг гликопротеина, синтезированная в инфицированных клетках, г непосредственно вирусная РЖ, используя которую с ломоты прайкера, комплементарного, началу гена гликопротеина, была синтезирована кДНК. а затем был амплифицирован ген гликопротеина методом полимеразной цепной реакции.

Один из полученных рекомбинантных клонов гесУУ]4 исследовали на лабораторных поотных.. Результаты одного из экспериментов представлены в таблице 4.

Таблица 4

Иммуиогеннш и протективные свойства pt-коибинаитсюго вируса осповакцины гес W

кдуеиый триал Количество мышей Титр вирус-нейтрализу-вдих антител Инъекция удачного бешенства Вызнло Пало

Bc\-V14 12 1:120 + ■ 12 -

вирус эвакцшш ЛИВП 12 0 f - 12

иологический 12 раствор 0 + - 12

Jb результатов таблицы 4 видно, что ши, который вводили ий вирус осповакцины и физиологический раствор, пали. Выти ь мыши, иммунизированные рекоибинантныи вирусом, дователыго, рекоыбинантный вирус reoVY npj введении в аннзм мшей индуцирует образование рабических нейтрализация ител и защиадет ювотных от заражения 'уличньш вирусом енства. Кроме того, эксперименты, проседешше в институте иоииелита и вирусных энцефалитов РАМН г.Москва, детельству»? о tow, что рекоибянантный вирус reeW в процессе ьтивнрования сохраняет антигенные свойства и является б.чльш-ш. Сотрудника«! этого института тг-кг.е показано, что ле иммунизации яиеотньпс recVV(i развитие резистентности к ледущему заражешш их уличчнм в:<рус он беиенства рсвочдзется развитием гуморального и клеточного кшунитета. По ■ей активности гесW превосходят некоицентрнрованяую ктивировашув _ вакцину • я не уступает шштнвнрованной центрированной коммерческой вакцтше гротлв бешенства.

Следовательно, рекоубинантный вирус осповащтш recW , прессирущий гликопротеин ' вируса бешенства штампа уково-32", обладает протектшзниш я тшуногашгол! своЗстраин и ет рассматриваться в качестве кандидата на глвуп окбннантнуэ вакцину против бешенства.

В заключение следует ецо раз отметить, что есо

.рекомбинантные вирусы осповакцины, олисанныч в данной рабо получены на основа вакцинного штамма ЛИВП. Используя репортер гены и гены антигенов вируса гепатита В и бешенства, продемонстрировали воэмогаость использования трех имуществен областей генома вируса осповакцины штамма ЛИЗП для инсер чужеродных генов ■ способность рекомбинантных виру экспрессировать эти гены, показали возможность соэда поливалентных вакцин на основе вируса осповакцины про различных заболеваний человека и животных.

вывода

1. Сконструирован и структурно охарактеризован рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессируш, репортерике гены лмшферазы светлячка Phollnus pyralie р-галактозидазы к.coll, а также антигены вируса гепатита В бешенства. Функционально-активные гегерологичные г интегрированы в три различные области тенома вируса.

2. Экспрессия репортерных генов весьмч эффективна и зависит от места локализации в геноме вируса осповакци Кинетика их активности соответствует характеру промоторов вир осповакцины.

3. 'Сконструирован новый вектор интеграции pSN6 для Hindi Н-участка генома вируса осповакцины. Эффективность вектора б продемонстрирована с . использованием репортерного г р-галактозидазы.

4. Разработан метод получения рекомбинантных виру осповакцины. Ряд рекомбинантных вирусов получен путем инахтива и интеграции гетерологичного гена в ген lacZ при условии нали lacZ в геноме вируса. Для этих целей сконструирована специаль плаэмвда-вектор.

5. Сконструированы рекомбинантные вакцинные штаммы вир осповакцины ЛИВЕ recW9, recW12, recWi3, содержаще экспрессируюиле поверхностный н сердцевиный антигены вир гепатита В. Штаммы представляют интерес ка;; кандидаты, на жи рекомбинантную вакцину против гепатита В.

6. Получена рекомбинантные штаммы вируса осповакц recW , recWls, экспрессирущие гликопротеин вируса бешенс штамма* "Внуково-Зг". Рекомбинантный вирус reeWi4 вызыв образование вируснейтрализующих антител и может рассматриватьс

естве кандидата на живус генно-юненернуо вакцину против

енства.'

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Krausova V.I., Kopylova-Svlrldova Т.Н., Tlmlrjasova Т.Н., Fodor I. Expre9Blon of the reporter genes coding tor firefly luclferase and bacterial fl-galaetosldase In mammalian cells utilising vaccinia vlrua promoters// Abstracts ol the V scientific aympoelUM of Socialist countries on Biotechnology.-Baluntonsaeplak, Hungary, I989.-V.ri.-P.330.

. Fodor I., Krausova V.I.. Kopylova-Svlrldova Т.Н., Tlmlrjasova Т.К. Transient and stable expression of firefly luclferase In mammalian cells using a poxvirus - derived vector/ZAbstracts of the 8Ш International Conference on Poxviruses and Irldovirusea.-Wlntergreen Conference Center, Virginia, USA, 1990.-P.145.

. Копылова-Свиридова Т.Н., Горелова Т.В., Краузова В.И., Тимирясова Т. М., Фодор И. И., Шуппе Н. Г. Бакуловирусная система экспрессии лвцифераэы светлячка в клетках тутового шелкопряда// ДАН СССР. -1990. ~T.312.45.15307-1510.

. Fodor I., Krausova V.I., Kopylova-Svlrldova Т.Н., Gorelova T.V.. Holodkov O.Aj, Soukovatlteln V.V., Tlmlrjasova Т.Н., Schuppe N.G. large DMA vlruaet) as gene expression vectors/'/ Abstracts of the 20th meeting of the FF8Sг Budapest, Hungary, 1990.-P.127.

>. Krausova V.I., Kopylova-Svlrldova T.W., Timirjaaova T.ff., Fodor I. Synthesis of recombinant firefly luclferase In mammalian cella/ZAbstraeta of the 20th meeting of the FEBS.-

. Budapest, Hungary, 1990.-P.186.

>. Краузова В.И., Когалова-Свирипова Т.Н., Тимирясова Т.Н., Фодор И. И. Инактивация репортерного гена рехомбияантяого вируса осповакцины путем гомологичной рекомбинации in vivo// "Новые направления биотехнологии".- Тезисы докл.-Пущшо, 1990. -С. 74.

I. Копылова-Свиридова Т.Н., Горелова Т.В., Краузова В.И.-, Тимирясова Т.М., Иуппе Н.Г., Фодор И. И. Получение и изучение рекомбинантных штаммов бакуловирусов, зкспрессируюиих ген люцшйеразы// "Новые направления биотехнологии".- Тознсы докл.-Пущино, 1090.-С.73.

3, Краузова В.И., Кошлова-Свнридова Т.Н., Тямирт-г-ч 1.1!..

Фодор И. И. Экспрессия гена лщифераэы светлячка в клет нлекопитаоадя о использованием векторов на основе вир осповакцины// Иол. генетика, микробиология вирусол. -1991. -!2. -С. 23-28.

9. Kopylova-Svlrldova Т.Н., Krausova V.I., Timlrjasova Т. Gorelova T.V.:, Schuppe N.G., Fodor I.Transient express aeeay in a baculovirue system ualng ПгеПу luclferase £ as a reporter// Virus genes.-I992.-V.6.-P.379-386.

10. Timlrjasova Т.Н., Kopylova-Svirldova T.N., Fodor Construction and comparative characterization oi recomblr] vaccinia vlnmee carrying heterologous genes In dllier nonessential regions of the genorce//Abatracts оГ the meet on "Kolem approaches to new vaccines. Including prevent or AIDS".-Cold Spring Harbor, New York. USA, 1992.-P.61.

11. Тимирясова T.M., Копылова-Свиридова Т.Н., Фодор И.И. Ana экспресснн репортерных генов в различных участках ген вируса осдовахцины//Молекулярная биология.-1993.-Т. 27.-вил