Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные и биотехнологические аспекты изучения геномов ДНК-содержащих вирусов человека и животных

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные и биотехнологические аспекты изучения геномов ДНК-содержащих вирусов человека и животных"

российская академия медицинских наук

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

рго од

_ На правах рукописи

ГИ БАД УЛ ИН Рашит Абдрахманович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНОМОВ ДНК СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.06 — вирусология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук в форме научного доклада

Москва — 1993 г.

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д. Н. Ивановского Российской Академии Медицинских Наук.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ — профессор, действительный член АМН СССР В. М. Жданов.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: действительный член РАЕН,

член-корреспондент РАМН, профессор Ф. И. Ершов доктор .медицинских наук Е. Н. Прокудина профессор, доктор биологических наук В. В. Макаров.

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Московский НИИ вирусных препаратов рамн.

^ I Iй0

Защита состоится Т~' ^^О-иу9 дддз г в / часов

на заседании специализированного совета Д 001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской АМН по адресу. 123098, Москва, ул. Н. Ф. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской АМН.

Автореферат разослан

1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

А. М. Жуковский

- I -

введение

Актуальность проблемы. Открытие в начале 70-х гг. специфических эндодезоксирибонуклеаз(рестриктаз) дало молекулярным биологам чрезвычайно эффективный инструмент для исследования структуры и функции геномных ДНК. Уже в первые годы после открытия рестриктаз удалось провести рестрикционный анализ и построить физические карты генома для многих вирусов человека и животных.

Построение физических карт способствовало более детальному изучению процессов транскрипции вирусного генома и выяснению функций отдельных вирусных генов. Одной из наиболее важных сторон в исследовании генома ДНК-содержащих вирусов с помощью рестриктаз явилась возможность изучения биологической функции отдельных специфических фрагментов вирусного генома. Так, при трансфекции клеток млекопитающих отдельными фрагментами ДНК, вируса sv40, а также некоторых аденовирусов человека была Ъбнаружена их трансформирующая активность, а затем была картирована и область генома, ответственная за трансформацию клеток (p. J-. Abrahams et al. ,1973; F.I. Graham et al. , 1974; A. van der Eb et al.,1977).

Построение физических карт особенно полезно при изучении крупных ДНК-содержащих вирусов, особенно в тех случаях, когда имеется вариа-бильность в структуре ДНК Сравнительный анализ физических карт или карт расщепления ДНК позволяет установить сходство или отличия для каждого штамма вируса, как например, для вирусов простого герпеса. Особенно важно построение физических карт для аденовирусов, таксономическая группа которых включает в себя обширное число представителей, многие из которых относятся к онкогенным, способных индуцировать опухоли (у грызунов) или вызывать трансформацию клеток в культуре. Например, к началу 80-х гг. подгруппа аденовирусов обезьян насчитывала 18 серотипов, некоторые из которых относятся к числу сильноонко-генных и обнаруживают значительную степень гомологии ДНК с определенными серотипами аденовирусов человека (м, Р1 па et al., 1968).

К началу наших исследований с аденовирусами обезьян была опубликована только I работа (j. P.earnett et а?., 1975), в которой было показано, что фрагмент ДНК генома обезьянего аденовируса SA-7 способен индуцировать опухоли у новорожденных сирийских хомячков. Однако, он-когенная область генома SA7 в данной работе не была локализована, и вопрос о картировании этого участка генома оставался открытым. Это явилось одной из задач нашей работа Решение этого вопроса было необходимо для детального изучения гена или группы генов аденовирусов обезьян, ответственных за трансформацию клеток, что позволило бы сравнить особенности структуры и функции гомологичных генов у представителей различных подгрупп аденовирусов млекопитающих.

Вирус простого герпеса (ВПГ) исключительно вариабилен и к настоящему времени обнаружено большое количество генетически различных штаммов ВПГ, отличающихся друг от друга по патогенности, иммунологическим свойствам, способности к гемагглютинации, способности вызывать трансформацию клеток в культуре(в.Яо1гтап et al., 1970; А. К. Шубладзе и др., I97I; A. J. Nahmias et al.,I97I).

Наиболее чувствительным и в то же время достаточно простим и точным способом исследования вариабильности генома ВПГ является анализ ДНК с помощью рестриктаз (рестрикционный анализ). Суть этого метода состоит в сравнении числа и электрофоретической подвижности специфических фрагментов, образующихся при растеплении вирионной ДНК разных штаммов специфическими эндонуклеазами (рестриктазами). Картина расщепления ДНК каждого данного штамма ВПГ любой из рестриктаз является его постоянной генетической характеристикой - она не меняется при многочисленных пассажах вируса в культуре ткани или при его длительном (12 лет) пребывании в организме хозяина (В. Rol zman, 1979).

Таким образом, рестрикционный (структурный) анализ ДНК дает возможность четко и быстро дифференцировать различные штаммы ВПГ, поэтому он является весьма надежным подходом к изучению различных аспектов

эпидемиологии герпетических инфекций, что н было убедительно продемонстрировано В ряде работ( С. С. 1.1 ппетапп е1 а1.,1978; Т.С.ВисЬтап еиа!, 1978,1979).

В последние годы большое развитие получили работы по использованию генома вируса осповакцины (ВОВ) как вектора для экспрессии чужеродных генов в культуре клеток и в организме животных (н. Маскеи

а1., 1982). Рекомбинанты ВОВ, введенные в организм животных, индуцировали образование протективных антител помимо к белкам ВОВ, но и к экспрессируемому белку экзогенного встроенного гена. В ряде исследований была показана возможность получения полирекомбинантов ВОВ, экс-прессирующих до 3-х различных экзогенных белков, например, таких как. гемагглютинин вируса гриппа, гликопротелд Д вируса простого герпеса, Б-антиген вируса гепатита В (о. Рап1са11<, £.Рао1 еШ., 1982).

Рекомбинантны ВОВ имеют ряд преимуществ перед другими вирусными вектора»® - простота и экономичность наработки вируса в широком спектре культур клеток, стабильность вируса при хранении в высушенном состоянии, легкость введения в организм человека и животных. При этом в рекомбинантном ВОВ сочетаются эффективность живой и специфичность субъединичной вакцина

Большой геном ВОВ (180000 пар оснований) и неинфекционность вирусной ДНК вначале сдерживали развитие исследований по конструированию рекомбинантных штаммов ВОЕ Только после разработки метода рекомбинации плазмиды, содержащей чужеродный ген с фланкирующими гомологическими последовательностям!, с геномом ВОВ, находящегося в инфицированной клетке, открылись возможности в конструировании рекомбинантных штаммов ВОВ (в. I. Бш! И1 еь. а1., 1983).

Для конструирования • рекомбинантных штаммов ВОВ важным является выбор места для встраивания чужеродного гена, а также выбор промотора для экспрессии встроенных последовательностей. Для сохранения инфек-ционности рекомбинантного штамма ВОВ обычно используют последователь-

- 4 - .

ности несущественных областей генома ВОЕ Таких областей в геноме ВОВ имеется несколько, но наиболее широко используется ген тимидинкиназы, т. к. это позволяет одновременно создавать селективные условия для отбора рекомбинантов в присутствии высоких концентраций бровдезоксиури-днна. В качестве примера такой конструкции следует назвать плазмиду pGS20, разработанную в лаборатории RMocca (США). Эта плазмида содержит фланкирующие последовательности гена тимидинкиназы ВОВ, промотор белка 7, 5К и уникальные сайты рестрикции для встраивания чужеродных генов. Позднее были разработаны конструкции так называемых инсерцион-ных плазмид с искусственно созданным маркером, чаще всего в этих случаях используют ген бета-галактозидазы под промотором белка ПК BOR Примером такой конструкции может служить инсерционная плазмида pSCil, которая также была разработана в лаборатории Б. Мосса и где в качестве фланкирующих последовательностей был также использован ген тимидинкиназы.

В нашей лаборатории была разработана инсерционная плазмида pUJ25,

v

которая по своей конструкции близка к плазмиде pGS-2Q и которая широко использовалась нами при конструировании рекомбинантов ВОВ на основе генома лабораторного штамма WR.

Цель и задачи исследования. Пель настоящего исследования -структурно-функциональное изучение геномов ДНК-содержащих вирусов, связанное с решением .задач по идентификации типовой принадлежности обезьянего аденовируса, типированием вакцинных штаммов и созданием мутантов вирусов простого герпеса, резистентных к химическим ингибиторам и конструирование рекомбинантных штаммов для использования их в биотехнологии. Программа исследований предусматривала: I) для обезьянего аденовируса:

-построение физических карт по 8 рестриктазам для ДНК вирусного геном -картирование области вирусного генома, ответственной за трансформацию клеток;

- 5 -

-определение серологических свойств вируса;

-определение негомологичных областей с ДНК генома аденовируса sa-7; -определение последовательности онкогенной области и концевых повторов ДНК вирусного генома; -классификация изученного вируса в соответствии с новой номенклатурой;

2) для вируса простого герпеса:

-проведение анализа карт расщепления ДНК для 3-х вакцинных (J12, Ус и ВН), а также 3-х лабораторных штаммов ВЛГ (кирка, sc-16, ни) с целью установления их межтиповых и межштаммовьи различий; -получение мутантов, резистентных к химическим ингибиторам; -изучение активности 6 антивирусных препаратов с использованием мутантов вируса;

3) для вируса осповакциньс

-конструирование рекомбинантных штаммов, экспрессирукщих антигены вируса гриппа А, вируса гепатита В, а также антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1);

-внедрение в производство штаммов - продуцентов антигенов вируса гепатита Е

Научная новизна. Установлено серологическое родство исследуемого аденовируса с обезьяним аденовирусом sa-7; впервые построены физические карты ДНК генома обезьянего аденовируса по рестриктазам: BamHl, Е с о RI, Xbal, Hindin, Sali, Xhol, Hpal, Bglll, которые отличают его от других известных серогипов аденовирусов обезьян; проведено картирование области генома аденовируса, обладающей онкогенной функцией и показана ее локализация в области фрагмента Sali-в левой концевой области вирусного генома; расшифрована последовательность ДНК левой концевой области, составляющей 6% вирусного генома, а также последовательность концевых повторов, которая оказалась наиболее протяженной из всех известных аденовирусов; в результате чего авторами было предложено классифицировать данный аденовирус как новый независимый серо-

тип и обозначать его аденовирусом обезьян s-25 в соответствии с новой номенклатурой.

Впервые был проведен анализ карт расщепления ДНК 3-х вакцинных штаммов вирусов простого герпеса по нескольким рестриктазам, что позволило отнести штамм Л2 и Ус к 1-му серотипу, а штамм ВН ко 2-му серотипу.

Впервые в отечественной литературе были получены и описаны мутанты ВПГ-I, несущие I или 2 генетических маркера резистентности к химическим ингибиторам. v ^ Полученные, мутанты могут быть использованы для скрининга химических; ингибиторов репликации вирусов, а также для оценки меха низ мз их действия.

Сконструирован ряд оригинальных рекомбинантных штаммов вируса ос-повакцины, экспрессирукхцих антигены вируса гепатита В и вируса иммунодефицита человека типа I.

Впервые сконструирован рекомбинантный штамм ВОВ, продуцирующий

вирусоподобные частицы ВИЧ-I, формирующие внутри частиц нуклеоид, что »

представляет значительный интерес для изучения процесса морфогенеза БИЧ. Получено 2 авторских свидетельства на рекомбинантные штаммы ВОВ.

Практическое значение и реализация результатов исследований.

Результаты работ по изучению структуры и функции аденовируса обезьян, выделенного из культуры клеток почки зеленых мартышек, представляют собой законченный цикл исследований, позволившие авторам предложить для классификации данный штамм как новый серотип S 25.

Мутанты ВПГ-I, несущие I или 2 генетических маркера могут быть использованы для скрининга и.изучения механизмов действия химических ингибиторов. Кроме того, выявленная идентичность 2-х штаммов ВПГ-I, а именно, Л2 и Ус позволила авторам вакцины исключить I из штаммов при производстве вакцины, что в свою очередь позволило сделать ее более экономичной.

Штамм - продуцент нв$Ад вируса гепатита В с августа 1990г. внедрен в производство первоначально на НПО "Вектор", где на его основе производится диагностическая иммунофермеитная тест-снстемэ для выявления Н8$Ад ("Рекоматгеп К'). Готовится к выпуску тест-система "Векто -нв$Ад-антитела" для выявления антител к нв$Ад, что является весыла актуальным в связи с началом вакцинации против гепатита а В настоящее время штамм используется для производства диагностических тест-систем на А/к "Диавект" и на А/0 "Векторбест" НПО "Вектор".

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены обсуждены: на 1-ой Всесоюзной конференции "Генетическая инженерия" (Пущино-на-0ке,1980); на 5-ом международном симпозиуме соцстран "Антивирусные химиопрелараты" (Рига, 1982); на "Всесоюзной конференции по устойчивости вирусов к химиотерапии" (Рига, 1984); на "Международном симпозиуме по проблеме' гепатитов и СПИД" (Суздаль, 1988); на XVIII съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов"( Алма-Ата, 1989); на симпозиуме "Современные направления создания медицинских диэгнос-тикумов" (Москва, 1990); на международной конференции "Медицина, биотехнология, иммунизация и СПИД' (Ленинград, 1991).

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с Т. С. Денисовой, у которой автор являлся руководителем диссертационной работ На разных этапах ее выполнения в ней принимали участие Т. Г. Сенкевич, В Е Носиков, С. Г. Завгородний, Г. А. Галегов, К А. Ананьев, Е П. Юферов, Э. Е Карамов, Е Б. Григорьев, сотрудники лаборатории генно-инженерных препаратов Г. Ф. Денисова, Л Ф. Лидеман, А. Ю. Сазы-кин, Г. Н. Трушинская, 0. К Дзюбенко( НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН), а также сотрудники Лаборатории вирусного канцерогенеза Лейденского государственного университета X. ван Ормондт- и Ь Деккер (Голландия).

В завершенном виде работа была доложена на заседании Ученого Совета по апробациям в 26 февраля 1993 года.

- 8 - .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 научных работ, включая 2 авторских свидетельства.

Результаты.

Аденовирус. Этот раздел настоящей работы был проведен на изоляте обезьянего аденовируса, который был выделен и типирован Г. А. Алпатовой в 1965г. в Лаборатории биологического контроля Института полиомиелита и вирусных ^энцефалитов РАМН как обезьяний аденовирус н7 (SV-20). К началу данных исследований (1977г.) вирус прошел в указанной лаборатории 26 пассажей в культуре клеток ПЗМ. Вирус был дважды клонирован наш методом бляшек в данной культуре клеток.

Первоначально физические карты для ДНК генома SV-20P нами были построены по 5 ферментам: BamHI, EcoRI, Xbal, Sali HHindlll. Выбор ферментов определялся в основном ходом исследований по идентификации фрагмента ДНК, обладающего трансформирующей активностью. Анализ продуктов полного гидролиза ДНК для всех пяти ферментов показал, что рестриктазы BamHI, EcoRI, Xbal, Sali HHindlll расщепляют вирусную ДНК соответственно на 5,5, 4,3 и 8 специфических фрагментов.

Идентификацию концевых фрагментов осуществляли путем гидролиза ДНК-белкового комплекса с последующим электрофорезом продуктов в ага-розном геле. Белковые субъединицы, коваленгно связанные с 5" - концами молекулы ДНК' препятствуют вхождению в гель связанных с ними фрагментов, указывая на их концевое расположение (р. м. к. Rekosh et а1.,1977); s.Bashelhamer et а 1., 1977). Расположение остальных фрагментов, образующихся- при действии рестриктаз устанавливали на основании анализа размеров фрагментов, повторной фрагментации выделенных продуктов частичного гидролиза ДНК или при гидролизе ДНК-фрагмента- с помощью другой рестриктазы при наличии в нем соответствующего сайта узнавания.

Б дальнейшем эти физические карты были достроены еще по трем ферментам: ХЬо1, НраI и ВдШ. Итоговые результаты построения физических карт по всем 8 ферментам представлены в табл. I, рис. I.

А , $011

; е В А ХЬа I , 1

Е А 1 1 С Ю В ■ 1 ■ ЕсоЯ1 ...... 1

в с . 1 • с А • 1 Л 8атй1 1

В Е • А С (&Н)£ 1 1н г Непал 1 , \

Р Е Н6 В • ■ • ■ ■ 1 С ' й А Х/Ю1

С я. « 1 Е В ПШ А ■ 1 ■ 1 Нра1 . 1

/ян с II II • А В £ В ■ ■ ■ Г ВйП 1 .г

0 20 1_1-1_ *О 60 80 I I 1 1 100%

Рис.1. Физические карты ДНК генома обезьянего аденовируса $А-7р. Справа указаны наименования рестриктаз, по которым были построены карты. Молекулярный вес фрагментов показан в табл. I.

Для изучения структуры и функции вирусного генома наряду с построением физических карт важное значение имеет их ориентация, т.к. это сопряжено с локализацией определенных генов вдоль цепей молекулы вирусной ДНК, а также с направлением процесса транскрипции вирусных генов.

В 1977г. большая группа исследователей (Ва$Ие1Ьатег а!.,1977) предложена номенклатуру для цепей ДНК аденовирусов человека. Согласно этой номенклатуре, левая половина молекулы ДНК более богата 6С-парами

Таблица I.

Состав фрагментов ЩК аденовируса обезьян SA-7p(h7/sv-20p)

Иол. вес фрагментов ДНК (млн. Д)

Фра г-----------------------------------------—----

мент Sail Xbal BamHI EcoRI Hindlll Xhol Hpal Bgll]

a 15,87 iq 62 8,70 9,52 5,86 5,30 4,90 9,40.

в 4,10 4,981л 5,80 5,69 5,63 4,60 4,75 3,70

с 1,59 4,76', л 79 3,40 3,34 4,00 4,35 1,95.

d 1,35 2,65 2,70 2,66 3,45 3.35 1.60

e 0,49 a 35 2,18 1.95 2,30 1,60

f 1,65 1,20 1,43 1.25

g ft 25 0,83 a 42 0,97

h a is 0,42 a 35 a 60

i a 49 к

оснований и содержит участок, ответственный за трансформацию клеток. Правая половина молекулы более богата АТ-парами оснований и содержит так называемые несущественные области вирусного генома. Однако, к моменту начала наших исследований не было ясно, применимы ли указанные выше критерии для ДНК генома аденовирусов обезьян, т.к. они к тому моменту были мало изучены. В наших исследованиях мы изучили содержание вс-пар специфических фрагментов ДНК аденовируса 5А-7Р, полученных после расщепления рестриктазами вашН1 и ЕсоШ путем определения дифференциальной кривой температуры плавления ДНК отдельных фрагментов (табл.2).

Полученные данные показали, что фрагмент ДНК Есо1?1-а содержал С Опары до 60,3 %, тогда как противоположный концевой фрагмент ЕсоШ-В

Таблица n 2

Температура плавления и процентное содержание ее-пар в составе фрагментов ДНК вируса $У 20.

Фрагмент Тпл Содержание

йС-пар, %

Есо(И-А •78,6 ваз

ЕсоШ -С 73,5 47' 8

ЕсоШ-О 76,1 ' 54,2

ЕсоШ-В 75,3 52,2

ВашН! -В 77,3 57,1

ВатШ -С 78,7 6Ц5

ВатН! -0' » 75,2 54,4

содержал 54,4% сс-пар. Сходная картина наблюдалась и при определении содержания сс-пар во фрагментах ДНК, полученных с помощью рестриктазы ВатН1.

На основании полученных данных мы предложили ориентировать физическую карту ДНК генома $а-7р по аналогии с картой ДНК аденовирусов человека, расположив слева более богатую ее-парами часть молекулы ДНК. Правильность такой ориентации была подтверждена нашими данными по изучению трансформирующей активности отдельных фрагментов ДНК генома $а-7р, которые, как оказалось, также располагаются в более богатой йс-парами левой половине молекулы, что .будет представлено данными, изложенными ниже. ■ ' Трансформация культуры клеток специфическими фрагментами ДНК.

Как было установлено для ДНК человеческих аденовирусов, специфический фрагмент ДНК, составляющий от 4,5 до 8% величины вирус-

ного генома, способен вызывать трансформацию клеток в культуре (F.L.Graham et al., 1974; A. van der Eb et al.,I977). При этом изучение трансформирующей активности фрагментов различной молекулярной массы, принадлежащей к ранней области и полученных с помощью рестриктаз, было показано, что хотя все они обладают трансформирующей активностью (размеры наименьшего фрагмента составляют приблизительно 1,2мЩ морфология трансформированной клетки, характер и место синтеза ранних вирусных антигенов носят различный характер( A. van der Eb et al., 1979),

Эти данные свидетельствовали о существовании в пределах ранней области функций, необходимых и достаточных для возникновения и поддержания трансформированного состояния клетхи. Аденовирусы обезьян в этом отношении были шло изучены.

Для локализации онксгенной области генома SA-7P мы обрабатывали ДНК вирусного генома рестриктазами: BamHI, Xbal, Sali и EcoRl. кроме того, были использованы отдельные фрагменты ДНК, такие как BamHl-A, BamHl -В, BamHI-C, BamHI-D, S а 11 -А И Sali -В.

V

Трансфекцию ДНК проводили ДНК-кальциевым преципитатом в перзичной культуре клеток почки новорожденных крысят линии WAG в соответствии с методикой, описаной выше. Данные представлены в табл. 3.

Из данных таблицы видно, что трансформирующий активностью обладали, наряду с нативной ДНК SA-7P, гидролизагы ДНК, полученные после обработки ферментами: Sali, Xbal и BamHi, а также отдельные фрагменты ДНК Sali-в и BaraHi -в. Другие фрагменты ДНК, также как и гидролиз ат ДНК, полученный после обработки рестриктазой EcoRl, трансформирующей активностью не обладали. Как и оказалось, фрагменты ДНК, обладающие трансформирующей активностью, ,располагались на левом конце вирусного генома, ориентированного нами ранее по содержанию GC-nap оснований, т. е. у обезьяних аденовирусов область, ответственная за трансформацию клеток, находится в GC-богатой области и располагается на левом конце молекулы ДНК, как у аденовирусов человека.

Таблица 3.

Трансформирующая активность гидролизатов и отдельных фрагментов ДНК аденовируса обезьян SA-7p

Материал Количество Число фокусов трансформации Среднее число

ДНК мкг/экв. на I чашку Петри фокусов, гжг/

на геном ----------------------------------------------------/экв. на геном

12 3 4

ДНК лосося 5 0 0 0 0 0

Нативн. ДНК 3 2 I 2 I 0,4

ДНК+BamHI 3 3 2 4 I 0, 83

ДНК+XbaI 3 3 10 1 - I, 5

ДНК+S а ТI 3 • 0 6 I - 0,78

ДНК+EcoRI 3 0 0 0 - 0

BamHI-A 3 0 0 0 0 0

BamHI-В 3 I- I 0 0 0,17'

BamHI-С 3 0 0 0 0 0

BamHI -0 3 0 0 0 0 0

Sali -А 3 0 0 0 0 0

Sali -В 3 3 I 2 I 0, 58

Свойства трансформированных клеток.

При изучении трансформирующей активности отдельных фрагментов ДНК SA-7P в первичной культуре клеток почки крысят линии WAG были получены 2 перевиваемые линии трансформированных клеток. Одна из них была трансформирована концевым фрагментом ДНК BamHI-в и получала соответствующее обозначение sv-BamHi -в. Другая линия трансформированных клеток была получена после трансфекции гидролизата ДНК SA-7P, обработанной рестриктазой Sali- Эта линия трансформированных клеток была

- 14 -.

обозначена sv-$all-dt. Как было указано выше (табл.1), фрагмент BamHI -В имеет молекулярный вес 5, 8 мД и составляет 21% вирусного генома. Концевой фрагмент ДНК Sail-В, входящий в набор расщепленных фрагментов и ответственный за трансформирующую активность, имеет молекулярный вес 4,1 мД и составляет 19% вирусного генома. Была изучена способность культур трансформированных клеток к образованию колоний в полужидкой среде с 0,33% агарозой, а также наличие в клетках вирусс-пецифического опухолевого Т-антигена и интегрированных в геном клетки вирусспецнфических последовательностей.

Сравнительный анализ 2-х культур клеток показал, что обе они способны расти в виде колоний в полужидкой среде, однако они при этом проявляли и определенные отличия друг от друга. Так, например, клетки sv-sali-di проявляли более высокую эффективность образования колоний, они проявляли также способность формировать крупные колонии в отличие от другой культуры Клетки sv-saii-di проявляли слабую адгезию к

стеклу, а также ярко выраженную способность к многослойному росту, i

Обе культуры синтезировали опухолевый вирусспецифический т-антиген.

• специфичность трансформации клеток фрагментами генома SА—7р как и интеграция вирусных последовательностей в геном клетки была подтверждена методом б.шт-гибридпзации ДНК трансформированных клеток с фрагментом ДНК хьаI -с вируса SA-7P, обработанного рестриктазой ВдШ. Результаты блот-гибридизации показали, что из ДНК трансформированных клеток вьпцеплялись только 2 внутренних фрагмента Bglll-D и Bglll-H соответственно (рис.2), тогда как концевые фрагменты Bglllil, с) оставались в составе высокомолекулярной клеточной ДНК. Несмотря на то, что обе линии содержат интегрированные вирусспецифические последовательности SA-7P, однако число интегрированных вирусных копий у них было различным. Клетки линии sv-BamHl-B содержали не более одной копии ДНК SA-?P на клетку, причем они, по-видимому,, утратили фрагмент ДНК ВдШ -С, тогда как. линия SV-Sall-di содержала около 7-8 копий

вирусного генома на клетку.

Принято считать, что содержание различного числа копий трансформирующего фрагмента ДНК в геноме клеток не влияет на тукорогенность у аденовирусов человека (р. н. Gal И more et al.,1977), то подобные различия возможно объясняются отсутствием экспрессии Некоторых ранних вирусных генов, продукты которых необходимы для проявления клеткой он-когенных свойств.

Отличия между 2-мя культурами трансформированных клеток проявлялись также в способности к опухолевому росту при трансплантации клеток новорожденным сирийским хомячкам (НСХ). Так, трансплантация I млн. клеток линии SV-Sall-di НСХ приводила в 70% случаев к образованию опухолей с метастазами в печень и легкое животного к 26-35 дню после инокуляции клеток. Другая линия клеток при тех же условиях трансплантации не образовывала опухолей вплоть до 5 месяцев наблюдения.

Для аденовирусов человека было показано( A. van der Eb et al., 1977,1979), что вирусный онкоген занимает 8-11% вирусного генома и все фрагменты ДНК, превышающие эту длину, дают сходный тип трансформированных клеток. Мы испытывали более крупные фрагменты ДНК ( соот-ветс'тенно 27 и 19%), которые, однако, вызывали трансформацию клеток, отличающихся по ряду биологических свойств, что может представлять определенный интерес для изучения механизма трансформации клеток или поддержания у клеток этого состояния.

Серологические исследования.

Обнаруженные нами различия по физическим картам для вируса SV-20P с эталонным штммом SV-20 из коллекции С. С. Кальтера, побудило нас к более детальным серологическим исследованиям с целью повторного типи-рования с помощью антисывороток, взятых к 6 различным серотипам коллекционных штаммов аденовирусов обезьян: svil, sv-20, sv-30, SV-34,

Рис. 2. Реакция б лот-гибридизации ДНК трансформированных клеток, обработанной рестриктазой ВдШ.

а)ДНК клеток, трансформированных фрагментом BamHI-B.

б)ДНК SA-7P, обработанная ВдШ.

в)ДНК трансформированных клеток sv-salI -di.

г)ыаркер молекулярного веса ДНК.

SV-38 и SA?. Исследуемый нами штамм был взят в дозе 100 и 1000 ТЦД/50, а нейтрализующие сыворотки в дозе 4 и 16 нейтрализующих ед соответственно. Данные представлены в табл. 4.

Результаты исследования, показали, что вирус SV-20P нейтрализовался только собственной антисьшороткой и антисывороткой, полученной против вируса SA-7.

Таблица 4.

Типирование аденовируса обезьян sv-20P иммунными сыворотками

Вирус Иммунные сыворотки к аденовирусам

IOO-IOOO -----------------------------------------

тцд/50 svii sv20 sv30 sv34 sv38 sa7 sv20p

16 нейтрализующих ед.

sv-20p 4 нейтрализующих ед. - + +

sv-20p _ _ - + +

Далее была проведена перекрестная реакция нейтрализации с вирусом

sa-7, коллекционным sv-20, sv-20p и соответствующими антисыворотками.

*

Данные представлены в табл.5.

Результаты исследований показали, что sa-7 и sv-20p наблюдалась перекрестная реакция нейтрализации, т. е. антисыворотка к вирусу sa-7 в равной степени нейтрализовала вирус sa-7 и sv-2cp, в то время как антисыворотка к вирусу sv-20p нейтрализовала вирус sa-7 слабее. Эти результаты нашли подтверждение в исследованиях по определению индекса нейтрализации с этими двумя вирусами с помощью иммунных антисывороток (табл.6).

Антисыворотка к sa-7 имела одинаковые показатели индекса нейтрализации против собственного вируса и против sv-20p, тогда как антисыворотка к вирусу sv2üp имела индекс нейтрализации в 100 раз ниже к sa-7, чем против собственного вируса.

Анализ результатов серологичёских исследований указывают, что вирус sv-20p вероятнее всего является антигенным вариантом вируса sa-7. Поэтому мы стали обозначать его вирусом sa-7p. Однако, типирование данного штамма нельзя было считать законченным, т.к. налицо имелись

- 18 т

Таблица 5.

Перекрестная количественная нейтрализация вирусов sa-7, sv-20 и sv-20P с иммунными сыворотками.

Вирус Доза вируса ТЦД/50/0, 2мл. 50% титр иммунной сыворотки

SA-7 SV-20 SV-2CP

sa-7 100 I: 512 0 1:64

1000 1:256 0 1:32

sv-20 100 0 1:256 0

1000 0 1:128 0

sv-20p 100 1:512 0 1:512

1000 1:255 0 1:256

значительные структурные отличия от вируса sa-7, что побудило нас i дальнейшим исследованиям. *;,

Является ли вирус SA-7P только антигенным вариантом вируса SA-7 или он представляет собой новый независимый серотип?

Представленные выше результаты серологических исследований свидетельствуют о близком антигенном родстве 2-х вирусов, но не об их ан тигенной идентичности. В пользу этого могут свидетельствовать прежд всего их четкие различия по физическим каргам геномов (рис. 3).

Так, из 19 сайтов узнавания рестриктаз: EcoRI, BamHI, Sali, ХЬа и Hindiп, имеющихся в молекуле ДНК генома sa-7P, только 10 сайто могут с некоторой натяжкой считаться совпадающими по их расположени с геномом sa-7.

Кроме того, изучение гомологии ДНК 2-х геномов, проведенное мето дом гетеродуплексного анализа показало, что гомология "этих 2- х, гено

Таблица 6.

Определение индекса нейтрализации аденовирусов би 5а-7 иммунными сыворотками

Иммунные сыворотки Вирусы Нейтрализация вируса, Индекс

(4 нейтрализ. ед,) взятого в дозе ТЦД/50/0,2мл нейтрали-

10'*" 10^ 105 10 ^ 10 ^ I зации

$у-20р %\1-2СР + + + + + + 100000

б а-7 %Ч-20Р - -+ + + + 10000

бу- 20 $у-20р - - - + + 10

5 а-7 ба-? н. п. + + . + + + 10000

эу-го ба-7 - - - + i

ЪЧ-2 0? ба-7 -+ + + + 1000

мов достигает 85% и что существуют 3 области полного отсутствия гомологии между ними. Эти области приходятся на следующие координаты: 0,740 -0, 810 ед. Ц 820 -0, 885 ед. и 0,890 - О; 920 ед. вирусного генома (рис. 4). .

Различия между двумя вирусами были обнаружены также при анализе структурных полипептидов вирионов 5а-7 и 5А-7р. Они отличались по молекулярному весу самого крупного белка гексона (компонент И) и при-гексонового компонентна III», тогда как полипептидные компонентны v, vi и vii имели одинаковый молекулярный вес.

Установленные наш различия в физических картах, также как и в гомологии между геномами за-7 и $а-7р, нашли свое подтверждение при анализе нуклеотидных последовательностей, установленных для концевых повторов молекулы ДНК генома и левого концевого фрагмента хьо!-

Р, что составляет 2238 науклеотидов или Б% вирусного генома( рис. 5).

Как оказалось, молекула ДНК генома 5А-7Р обладает самыми протя-

J——г—l-1-1—f-1-1-1-1-1

О СО IM

tcoRl

Seil

BanHI

Hindi!1

Xb*I

J_L

U

t

SA7P SA7

SA7P SA7

I SA7P

m— Vsav

J_ SA7P

f

Г i sa7

|___ SA7P

1-"T-SA7

Рис.3. Сравнение физических карт вирусов 5А-7р и 5А-7, где показано совпадение координат общих сайтов рестрикции.

V

женными инвертированными повторами длиной 183пар нуклеотидов. Кроме того, она обладает также достаточно высокой степенью гомологии с нук-леотидными последовательностями генома 5А-7. Тем не менее они отличаются по составу аминокислот в секвенированной области Е1а на 5%. Однако, наиболее интересным выводом, который можно бьио•• сделать это вывод о том, что ранняя область Е1а генома 5А-7Р обладает обширной гомологией с геномами таких человеческих аденовирусов как н 5, Н 7 и н 12 (рис.6).

В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что вирус 5А-7Р является не столько антигенным вариантом вируса сколько

новым независимым серотипом, который мы предложили обозначить в соответствии с новой номенклатурой аденовирусов обезьян Б-25.

о о-и-—а—оо-—сз—о-о —о—о-о -о «о -о—о—о

од 1,0

Рис. 4. Гистограмма распределения областей негомологии в гетеро-дуплексе между ДНК 5А-7 и 5А-7р (результат обсчета 12 г,е-теродуплексных молекул). '

Глава 2.

Вирусы простого герпеса.

Известно в литературе 2 типа га то до в получения ДНК ВПГ. К 1-му типу относятся методы получения ДНК ВПГ из очищенных вирионов, которые в свою очередь выделяют из цитоплазмы зараженных клеток (И)Ше, 1973). Ко 2-му типу относятся методы выделения ДНК из суммарного клеточного экстракта (цитоплазматического и ядерного) без предварительной очистки вирионов. Преимуществом последних является более высокий выход ДНК, т.к. большая часть (до 80%) ДНК ВПГ накапливается в ядре клетки. Большинство исследователей в настоящее время выделяют ДНК ВПГ путем фракционирования тотальной клеточной ДНК на вирусную и

*м1м *•••« ят» мм* «мм »i»»

>й|!| |'йш|?1И1(>лш»УА|||Ц|И|||||||||?| ¿мишши * * - — * ' 1_* I*

г"

ч!.'" и

щищимн

г И1И»»» 1И1

"**-"""— i 1и~|лщм «ппиичгнищ— пин пиши пни ниш ипщии!

Рис.5. Первичная'структура ДНК вируса $А-7р между левым концом молекулы и хно!-сайтом в положении 2338 нуклеотида. Показана только часть этой последовательности. Инвертированный концевой повтор (I Т(?) имеет протяженность в 183 пары нук-леотидов.

клеточную по плавучей плотности, что требует неоднократных длительных центрифугирований в градиентэ плотности солей. Значительного упрощения метода можно достичь путем предварительной селективной экстракции вирусной ДНК из клетки, несмотря на высокую молекулярную массу ДНК ВЛГ.

Суть разработаного метода состоит в следующем: через 24 ч. после заражения, когда достигается полный цитопатогенный эффект вируса, заражению клетки снимали со стекла механическим способом, собирали низкоскоРбетным центрифугированием, промывали физиологическим раство-

• пук

WIIU : ОСУ ftl ' и f

' № « riHI |U praMlaeJ

U1P >

Рис. 6 Сравнительный анализ последовательностей ДНК 5А-7р в участке с 409 по 490 нуклаотид с 5*-концевьда участком ранней рб-ласти Е1а аденовирусов человека серотипов 5, 7 и 12. Рамками очерчены области их гомологии. Звездочками обозначены ну-клеотиды ДНК ЗА-7Р гомологичные ДНК аденовирусов человека.

ром и суспендировали в .буфере, содержащем 20мМ трис-HCl рН 8,5, 10шИ ЭДТА, 1% тритона Х-100. На 10 млн. клеток брали I ил. буфера. После инкубации в течение 20 мин. при комнатной температуре при помешивании к суспензии добавляли NaCl до концентрации 0, 25 М. Суспензию выдерживали 30 мин. при +4 С и центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Супернатант дважды депротеинизировали фенолом в присутствии 0,5% долечило улъфата На. ДНК осаждали этанолом, растворяли в буфере, содержащем 20 мМ трис - НС1 рН 7,5, 10 шн NaCl (материал из 200 млн. клеток растворяли в I мл. буфера) и обрабатывали I ч. при +37 С смесью панкреатической РНК-азы и РНК-азы TI, предварительно прогретых 10 мин. при +90 С. По окончании инкубации препарат'ДНК дважды депротеинизировали фенолом в присутствии 0,2% додецилсульфата Na. ДНК из водной фазы осаждали 2 объмами этанола и дважды переосавдали, промывая каждый раз осадки 70% этанолом. '

.Полученный таким образом препарат ДНК ВПГ давал острый пик по оптической плотности при'центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы и одну узкую полосу при электрофорезе в агарозном геле. На

электрофореграммах, получаемых при окраске гелей бромидом этидия, фон и клеточные ДНК практически отсутствовали. Выход вирусной ДНК составлял около 100 мкг из 100 или. оэгох.

ДНК 3-х лабораторных штаммов ВПГ (Kupka, SC-I6 и Hll) сравнивали с ДНК "стандартного" цггамма F по 3-м картам расщепления, образуемых рестриктаэами Xbal, Hindlll и Sm 18/4. Продукты расщепления ДНК исследуемых штаммов и штамма f каждой из 3-х рестриктаз подвергали электрофорезу в агарозиои геле с целью выявления возможных различий. Как известно, рестрнктаза Xbal является самой крупнощепящей эндонуклеаэой для ДНК ВПГ, имеющей всего 4 сайта расщепления. (Рис.7).

Вследствие существования 4-х изомеров ДНК ВПГ, отличающихся друг от друга взаимным расположением 2-х частей молекулы ДНК (l и $), расщепление ДНК ВПГ ферментом Xbal в 4-х точках приводит к образованию 7 фрагментов. Наборы фрагментов, образующихся при действии xbal на ДНК 3-х исследуемых штаммов и ДНК штамма F, оказались идентичными.

Отличия в первичной структуре ДНК штаммов Кирка и SC-I6 от ДНК F удалось установить с' помощью рестриктазы HtndlII, являющейся вторым (после xbal) из известных крупнощепящих ферментов для ДНК ВПГ (9 сайтов расщепления, образующих 15 фрагментов). Среди продуктов расщепления ДНК штамма Kupka этим ферментом по сравнению с ДНК Fl отсутствуют соседние фрагменты о и I, вместе с тем появляется новый фрагмент, обозначенный нами о-i, с молекулярной массой 9,8 шД что соответствует сумме молекулярных масс о (7,8 мД) и I (2,0 мД). Следовательно, в ДНК штамма Kupka по сравнению с ДНК F отсутствует сайт расщепления между соседними фрагментами о и I. В ДНК штамма SC-I6 отсутствует этот же сайт расцепления. Кроме того, в ДНК SC-I6 , по-видимому, отсутствует сайт расщепления между фрагментами И и N. Действительно, i гидролизате этой ДНК полностью отсутствуют фрагменты И и N, и также изомеры фрагмента М (DM и мм). Как следствие отсутствия данного сайта, мы наблюдаем появление новых более высокомолекулярных фрагментов,

-L-

м ТМ a,s , O.S D.3 п,а

в С F г D m

1 6 С f £ D tsj

V ' £ ' F ' С 0 tsj

1> Е r С в tsj

ел 1 f? 1М It ta.s t.0 «1 «to Vfi.u

н V » 1 J A К L D M N Г.

н 0 I . ' J ' A К L 0 1 в N U

» L К . Л J ! 0 < и M N G

D " L 4 A ' J 0 н 0 N M

i> ц i аг аз ал ¿г as ат at aj to

Рис.7. Физические Kspzzt-ЕГ^ГТпггамм f) для рестриктаз Xbal (A) и HlndllI (Б). Стрелками указаны направления инверсии субъединиц.

которые по сумме молекулярных масс соответствуют молекулярным массам своих предшественников.

Фрагменты, образующиеся при действии рестриктазы Hindi ii на ДНК штамма нп были неотличимы от соответствующих продуктов гидролиза ДНК штамма FI. Различия между ДНК штамма HI 1 'и Fl тем не менее нам удалось продемонстрировать при использовании рестриктазы Sau 18/4, действие которой на ДНК ВПГ бьшо изучено нами впервые (рис.8).

Данные электрофореза свидетельствует о том, что в гйдролизате ДНК штамма ни отсутствуют по сравнению с"ДНК штамма FI 4 фрагмента: в, С, о и Е и появляются 5 новых, условно обозначенных наш цифрами 1,2.3,4,5. Всего в гидролизате ДНК штамма fi, обработанной рестрикта-

зой $»и 18 /4, наш было обнаружено 16 специфических фрагментов ДНК.

Таким образом, при анализе карт расщепления ДНК 4-х штаммов ВПГ с помощью 3-х рестриктаз нам удалось обнаружить, что все они относятся к I типу (ВЛГ-1), т. к. их карты расщепления ДНК по рестристазе хь»1 неотличимы друг от друга. Карта расщепления ДНК ВПГ-2 имеет совершенно другой вид. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о межш-

а 6 о %

Рис. 8. Электрофореграммы продуктов расщепления ДНК штамма f(i, в) и штамма Hi 1 (б) рестриктазой Sau 18/4, г - маркер молекулярных масс, получаемого при гидролизе рестриктазой EcoRl ДНК аденовируса SA-7P.

таммовых отличиях в картах расщепления, показанных нами с помощью рестриктаз Hlndlll и Sau 18/4. Как уже указывалось выше, во второй части нашей работы, связанной с изучением структуры ДНК вирусов простого герпеса, мы анализировали карты расщепления ДНК 3- х штаммов ВПГ, которые использовались как вакцинные при производстве инактиви-рованной противогерпетической вакцины. К какому серотипу относились данные штаммы оставалось неясным, так как они они были классифицированы по антигенному составу, который ранее подразделял их на 6 антигенных групп( А. К, Шубладзе и др., 1971) для вирусов простого герпеса. К концу 70-х гг. в зарубежной литературе уже прочно установилось мнение о циркуляции в человеческой популяции всего 2-х серотипов вирусов простого герпеса, обозначаемых обычно ВПГ -I и ВПГ-2. Обоснованность такой классификации подтверждается анализом вирусспецифических полипептидов, исследованием гомологии нуоеотидной последовательности вирусной ДНК методом молекулярной гибридизации, изучением их плавучей плотности, а также анализом расщепления ДНК рестрикционными эндонук-леазамк, о чем уже упоминалось выше. В связи со значительным антигенным перекрестом между ВПГ-1 и ВПГ-2, а также заметными антигенными различиями штаммов внутри каждого из серотипов однозначное типирова-ние ВПГ иммунологичесскими методами представляет собой сложную задачу. С другой стороны, гомология нуклеотидной последовательности ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2 составляет не более 50%, в то время как различия между штаммами в пределах одного серотипа не превышает 10% (w.M. Sugino et al., 1976). Поэтому методы типирования, основанные на сравнении первичной структуры ДНК разных штаммов, для ВПГ являются наиболее адекватными (рис. 9).

Результаты проведенного анализа карт расщепленния ДНК вакцинных штаммов показал, что картина расщепления ДНК штаммов Л2 и Ус по рест-риктазам Hindin-, ßgin и EcoRi оказалась типична для ДНК ВПГ-1, т.к. они совпадали с картами растепления ДНК стандартного штамма F. Межш-

таммовые отличия в картах расщепления наблюдались по рестриктазе EcoRI, которые выражались в том, что у штаммов JI2 и Ус имелись 2 дополнительных сайта EcoRI, один из которых находится между фрагментами AHL, а другой - внутри фрагмента А. С другой стороны, штаммы Л2 и Ус оказались генетически родственны друг другу и оставались неотличимы по использованным рестриктазам.

Рис. 9. Электрофореграммы продуктов расщепления ДНК ВПГ-I штат F (I), штамма вн (2), ВЛГ-2 штамма с (3) рестрихтазами ВдШ (a), Hlndlll (б), Xbal (в). ДНК 3-го вакцинного штамма ВН анализировалась по рестриктазам ВдШ, Hindin и Xbal в сравнении с соответствующими картами расщепления ДНК штаммов F и 5. Результаты анализа показали, что набор ВдШ -фрагментов ДНК штамма ВН сходен с таковыми для ДНК штамма G ВПГ-2 и

принципиально отличается от набора фрагментов ДНК штамш F. Наборы фрагментов ДНК штамма БН по рестриктазам Hindi II и Xbal также совпадали с таковыми штамма G и принципиально отличались от карты расщепления ДНК штамма F, тем самым полностью и однозначно свидетельствуют о принадлежности штамма ВН к серотипу ВПГ-2.

Таким образом, проведенная работа позволила однозначно типировать штаммы ВПГ, используемые для приготовления противогерпетической вакцины. Простота и точность анализа расщепления вирусных ДНК рестрикта-зами позволяет, по нашему мнению, рассматривать" этот метод как наиболее удобный для типирования штаммов ВПГ для практических целей.

Функционально-генетические исследования.

Как уже указывалось выше, набор специфических фрагментов ДНК ВПГ, образуемых в результате воздействия рестриктазы, является стабильным генетическим признаком данного штамма. Это позволяет локализовать отдельные гены, контролирующие определенные функции вируса, привязывая их к структуре определенных фрагментов и соответственно к физической и генетической карте вирусного геномз.

В наших исследованиях карты расщепления ДНК с помощью рестриктаз были использованы для анализа рекомбинационных взаимодействий между различными штаммами ВПГ, контролирующих генетические маркеры, связанные с функцией вирусспецифической тимидиккиназы и ДНК-полимеразы.

Получение мутантов ВПГ-1, несущих маркеры резистентности2 Ок химическим ингибиторам.

Известно, что вирусы простого герпеса дикого типа чувствительны к ингибиругацему действию фосфоноуксусной кислоты (ФУК), т.- е. обладают фенотипом PAAs (phosphonoacetiс sensiti ve). (L.R.Overby et al.,I9?4). Однако, ряду исследователей удалось получить мутанты ВПГ, резистентные к ингибитору, которые обладают соответственно фенотипом РААг

(J.Hay et al., 1975). Установлено, что резистентность к ФУК связана с генетически стабильным изменением вирусной ДНК-полимеразы, локализация которой была установлена в опытах по рекомбинации между штаммами ВПГ.

В задачу нашей работы входило выделение мутантов ВПГ-1, несущего маркер рааг и изучение возможности передачи этого маркера другому штамму методом (ДНК х ДНК) рекомбинации.

Мутант ВПГ-1 с маркером РААг выделяли путем последовательных пассажей и клонирования,вируса (штамм f) в культуре клеток Vero в присутствии возрастающих;;- концентраций СУК в дозе от 50 до 250 нкг / мл. "V4"

среды. После 4-го пассажа и 3-го клонирования были получены клоны, которые обладали резистентностью к присутствие в среде ФУК в концентрации 100 мкг/ил (штамм F РААг), (Табл7).

Таблица 7.

Характеристика исходных штаммов, PAAr-мутанта и рекомбинанта по чувствительности к ФУК

Штаммы ВПГ-1

Фенотип_ вируса в культуре клеток VERO

Титры инфекционности в БОЕ/мл

PAAs

РААг

Отношение титров инфекционности

PAAr/PAAs В Í

F+ (дикий тип) Syn+ F+ РААг, КЛОН 6 Syn+ Л2 (дикий тип) Sjn-к551рекоыбинант Syn-

8,7x1o51 2,5x10 3 4,2x10 ^ 3,1x10 ?

4,6хЮв~ 3,3x106

2,8x10 . 0,0003 7,4x10""/ 74

2, Ох 10 6, OxIO Z 3, ОхЮ~3

V

7,2x10

ЦЗ 72

Для проверки возможности наследственной передачи PAAr-маркера от . одного штамма ВПГ-1 другому мы трансфицировали кульуру клеток Vero

смесью ДНК, содержащей инфекционную ДНК штамма Л2, чувствительного к ФУК, и фрагментироввнную рестриктазой Hpal ДНК мутантного штамма F РААг. В работе D.H.Kntpe и соавт.(1979) было установлено, что рест-риктаза Hpal не повреждает локуса РААг. В результате трансфекции был выделен рекомбинантный клон, обозначенный нами R55I, который обладал резистентностью к ФУК, вместе с тем он сохранил маркер syn- исходного инфекционного штамма Л2. Для подтверждения того, что выделенный клон R55I является рекомбинантный, а не явился результатом селекции, мы провели сравнительный анализ карт расщепления JHK исходных и рекоби-нантного штаммов с помощью рестриктаз: EcoRl, 'Hindi II, Bg11I,Hpai, BaraHI и ICpnI.

Проведенный анализ позволил установить, что карты расщепления ре-комбинантного штамма R55I в целом сходны с таковыми родительского штамма Л2, однако HMeKfr и четкие различия по рестриктазам Hpai.Bglll, Hindi II,BamHi и Kpnl, что можно считать следствием рекомбинации между штаммами по нескольким областям вирусного генома, в результате чего был передан маркер РААг от штамма F штамму - Л2. Полученные данные могут также свидетельствовать о тон что выделенный нами мутант F РААг является генетически стабильным и этот маркер может бьггь передан другому штамму в процессе рекомбинации.

Получение мутантов ВПГ-1, несущих 2 селективных маркера.

В ряде исследований была показана возможность использования гена тимидинкиназы (ПО в качестве селективного маркера для направленного конструирования штаммов вируса простого герпеса типа I. Впервые такие исследовния были проведены E.s.Nocarjkl и соавт.(1980), которые встраивали фрагменты ДНК, взятые из различных областей вирусного генома, в клонированный ТК-ген, а затем полученный таким овразом рекомбинантный ген переносился в геном ВПГ-1, приобретавший в результате рекомбинации генотип (ТК-). Аналогичным путем удалось сконструировать делеционные ТК-мутанты БПГ-1 методом рекомбинация, достигаемой при ко-

- 32 -.

-трансфекции в клетки нагивной вирусной ДНК и клонированного в плаз-миде ТК-гена с искусственно созданной делецией. В дальнейшем этот подход открыл возможность и стал широко использоваться для конструировавши рекомбинантных штаммов вирусов герпеса и вируса осповакцины, в геном которых были встроены самые различные экспрессируемыа гены.

В нашей работе был использован этот же подход, в результате которого нам удзлось получить мутант ВЛГ-1, обладающий 2 селективными маркерами (РААг и ТК-).

В плазмиду роа504, содержащую клонировавнный функционально-активный ген тнмидинкинззы ВПГ-2, встраивали последовательность рибосомно-го оперона крысы (РОК), в результате чего бьиа получена новая реком-бинантная плазмида, обозначенная нами рТ1?4, содержащая встроенный РОК с собственным сильным промотором и инициирухвдм кодоном. (Рис Л О).

Ргк Ри&

Вавь'&дСи

! йТ Кгп! н Мр*я/ Ч р!

; I I_________1 "

мтж&т

в б! I

п н

У

гт

йаИ

ей Р^И * в Ю Кб

Рис. 10. Схема рекомбинантной плазмида рТ»г4. • .

Незаштрихованный участок - фрагмент ДНК ВПГ-2, содержащий ген тиммдинкиназы; заштрихованный участок — фрагмент ДНК рибосомного оперона крысы; тонкая линия - ДНК рВЯ322; р1к и рпь - точки инициации транскрипции. „

6

У

Методом ко-трансфекцин ДНК ВИГ-I штампа F РААг и плазкиды pTR4 в культуре клеток Vero проводили рекомбинацию вирусной ДНК и ДНК плаз-миды pTR4. Селекцию рекомбинантов проводили в присутствии ара-Т, взятого в концентрации 100мкг/мл, что является достаточным для создания селективных условий. Из полученной популяции рекомбинантнго пула были выделены отдельные ТК-клоны, ДНК которых мы анализировали методом электрофореза в агарозном геле, предварительно обработанных рестрик-тазами EcoRI и Hpal. Мы ожидали в результате рекомбинации встраивания в ТК-ген ВПГ-1 последовательностей рибосомного оперона крысы. Однако, в действительности мы обнаружили появление делеции во фрагменте ДНК, несущего ген тимидинкиназы (фрагмент ДНК BamHi-o). (Рис. II).

. Рис. ii. Электрофореграмма расщепления ДНК клонов ВПГ-1 рестриктазой Вд1П. Размер делеции составлял около О, 3 мЕ Частота появления делеци-онных мутантов составляла 14-20%. Следует отметить, что подобные де-леционные мутанты среди ТК- популяции нами не обнаруживались в том

F» Ей £0<. 506 6J3 610 611 д{5 51S ¿'Л viC

случае, когда для трансфекции использовали плазмидую ДНК pTR4, обработанную рестриктазой EccRí, и среди спонтанных ТК- мутантов ВПГ-1 штаммов F и JI2 (всего было проанализировано 57 ТК- клонов).

Таким образом, полученные клоны несли делецию в гене тимидинкина-зы и, следовательно, генетически стабильный маркер ТК-, а поскольку исходный клон обладал маркером РААг, то получение мутанты стали обладать двойным селективным маркером и приобрели резистентность к химическим ингибиторам, воздействующим на функцию тимидинкиназы и ДНК-по-лимеразы.

Для проверки функциональной активности ТК-генов у делеционных мутантов был проведен сравнительный анализ индукции тимидинкиназной активности в клетках, инфицированных делеционными, спонтанными ТК-му-тантами. В качестве положительного контроля были использованы ТК+ штаммы JI2 и K0S. Данные представлены в табл. 8. ""

Таблица 8.

Индукция активности тимидинкиназы в клетках VERO.

(9 ч. после заражения, 10 БОЕ/клстка)

Штамм ВПГ-1 Активность ТК, имп/мг белка

Клетки vero 1,69

L2 клон Gil ТК- 1,26

Клон 603 (f-0 1,16

Клон <11615 1,00

KOS клон F6 (тк+) 4,22

L2 (ТК+) ч 4,84

Полученные сравнительные" данные показали, что делеционные

*

(ТК-) мутанты неспособны к индукции ТК-активности в клетках.

- 35 -

Использование мутантов ВПГ для оценки Эффективности ингибирующего действия химиопрепаратов.

Герпетическая инфекция широко распространена среди людей и животных и характеризуется разнообразием поражений. Для разработки эффективных лекарственных средств во многих лабораториях мира ведутся широкие исследования с целью поиска новых эффективных лекарственных препаратов, обладающих терапевтическим действием. Вирус герпеса обычно эффективно ингибируется веществами нуклеозидной природы, и действие некоторых из них носит избирательный характер. Так, их фосфори-лирование и , включение .в вирусную ДНК катализируеся либо тиыидинкиназой, либо ДНК-полимеразой, либо преимущественно ими в сравнении с собственно клеточной тимидинкиназой и ДНК-полимеразой.

Вместе с тем, рядом исследователей было отмечено, что в отдельных случаях от герпетических больных выделяются изоляты ВПГ, которые обладают естесственной резистентностью к химиопрепаратам, мишенью которых является вирусная тимидинкиназа или ДНК-полимераза. В той же степени это может относится и к некоторым лабораторным штаммам ВПГ, которые прошли большое количество пассажей в условиях культуры клеток.

Так, в наших исследованиях с 5 различными штаммами ВПГ-1 и ВПГ2 была обнаружена повышенная устойчивость вакцинных штаммов ВПГ-1 и ВПГ -2 к высоким дозам фосфоноуксусной кислоты Поскольку эти штаммы за время их , истории прошли несколько десятков пассажей в культуре фиб-робластов куриных эмбрионов, то. мы предполагаем," что'в этой культуре, которая является полупермиссивной для ВПГ, происходит накопление популяции вирионов с мутациями, в соответствующих локусах.

Вышеприведенные сообщения, как и наши наблюдения, могут свидетельствовать о необходимости поиска химиопрепаратов, у которых механизм ингибирующего действия не был бы связан с этими ферментами. Очевидно, что для поиска и оценки таких препаратов могут оказаться

весьма полезными мутанты ВПГ , которые являются дефектными по тими-динкиназе и ДНК-полимеразе или одновременно по обоим ферментам.

Сказанное выше пожег быть проиллюстрировано результатами наших исследований, которые мы провели с рядом химиопрепаратов, различного механизма действия на штаммах ВПГ-1, которые включали в себя как штаммы дикого типа, так и мутанты, полученные в нашей работе.

В работе были использованы следующие химиопрепаратьп 9—о-адени-нарабинозид (ара-А), I—о-тиминарабинозид (ара-Т), 9-(2- оксиэтокси-метил) гуанин (ацикловир, АИВ), Е-5-( 2-бромвинил) -2-дезоксиуридин (БВДУ), 5-бром-2-дезоксиуридин (БУДР), рибавирин и н1-адемантил -N[2-(диметиламино) этокси]-ацетамида (АДЭА), а также фосфоноуксусная кислота (ФУК).

Химиопрепараты испытывались на следующих штаммах ВПГ-1: -12 дикого типа, чувствительного к ара-Т и к ингибитору вирусной ДНК -полимеразы - ФУК

-1.2(тк-), клон получен нами путем селекции в присуствии возрастающих концентраций ара-Т, устойчив также к БУДР в концентрации 10 - 100 мкг/мл.

-Р дикого типа, стандартный, клонироваванный штамм, высокочувствителен к ара-Т и к ФУК

-г (рааг) - генетически стабильный мутант, полученный нами путем пассажей с возрастающими концентрациями ФУК Мутант сохранил высокую чувствительность к ара-Т. -<Л 615 - делеционный мутант, полученный из штамма г(рааг) методами генной инженерии, несущий делецию 0,3 МД в области ТК-ге--на, обладающий также устойчивостью к ФУК Как было нами установлено, все мутанты утратили функциональную способность к индукции в клетках тимидинкиназы.

Антивирусную активность химиопрепаратов определяли по методу е.

Ое С1 егся и сотр. (1980), связанный с определением минимальной кон-

центрации химиопрепарата, которая подавляет на 50% цитопатнческое действие вируса на клетки через 72ч. после заражения. Полученные данные средние по 3 экспериментам представлены в табл. 9.

Таблица 9

Эффективность ингибирующего действия химиопрепаратов на репродукцию вирусов простого герпеса г>

ИД/50, мкг/мл

Штаммы

ФУК ара-Т ара-А АЦВ Рибавирин АДЭА

1.2 12,0 0,5 5, 0 0,18 22 65

12(ТК-) 12,5 >200 4,5 3,5 20 70

Г Дик. тип 15 0,5 4, 65 0,2 25 75

( (РААг) >100 0,5 20, 0 3,5 25 65

<11615 >100 >200 25 ' 3,75 23 60

Из данных табл. 9 видно, что штаммы ВПГ дикого типа ь2 и т эффективно подавляются всеми использованными соединениями, что согласуется с данными литературы. Штаммы 12 (ТК-), как и следовало ожидать, обнаружил резистентность к ара-Т и к АЩ но не к другим соединениям. Такой эффект определялся дефектностью этого штамма ВПГ -I по тимидинки-назе, которая не индуцировалась этим штаммом, а следовательно, не могло иметь места фосфорилирования ара-Т и А.ИВ. У этого штамма не изменилась чувствительность к ара-А, рибавирину, активация которых не зависит от функции гимидинкиназы, а также к ФУК и в особенности АДЭА, которые обладают принципиально отличными от ара-А и АЦВ механизмами действия.

В случае мутантного штамма * (рааг) наряду с резистентностью к ФУК (мутация по гену ДНК-полимеразы) одновременно значительно снижена

чувствительность к ара-А и AUB, что объясняется механизмом действия этих 2-х нуоеозидов, которые в форме грифосфатов подавляют активность ДНК-полимеразы. Однако, изменения в ДНК-полимеразком гене у штамма г(рааг) привели к одновременному снижению чувствительности репродукции ВПГ к ара-А и AUE

Штамм ВПГ-1 dl 615, имеющий двойной дефект, резистентен одновременно к ФУК и ара-Т по сравнению с исходным штаммом F, а также снизил ■Чувствительность к ара-А и ABB Характер его ингибирования как бы суммирует снижение чувствительности, наблюдаемой с ВПГ-I L 2( ТК-) и F(PAAr), взятый каждый в отдельности.

Однако, характерно, что во всех 5 случаях рибавирин и АДЭА проявляют антигерпетическое действие независимо от вышеуказанных изменений в геноме ВПГ, т. к. антивирусной действие этих соединений не связано с функционированием тимидинкиназы и ДНК-полимеразы. Рибавирин действует, вероятнее всего, на уровне транскрипции вирусного генома (R. A. Smith, 1984), а АДЭА-адамантан содержащий ингибитор может действовать на ранний и .заключительный этапы - депротеинизацию и сборку вирионов (К. S. Rosental еt. al. , 1982).

Представленные данные могут свидетельствовать о том, что полученные мутанты ВПГ могут бьггь использованы для отбора и оценки эффективности химиопрепаратов антигерпетического действия. Кроме того, они свидетельствуют о необходимости комбинированного использования химиопрепаратов, механизм действия которых связан с различными точками-мишенями с тем, чтобы спонтанно возникшая мутация в том или ином гене не придавала вирусу резистентности к химиотерапевтическому воздействию.

- 39 -Глава 3.

Вир/с осповакцины. Конструирование рекомбинантных штаммов ВОВ, экспрессирующ вирусные белки.

Первый рекомбинант BOß который нам удалось сконструировать на основе генома лабораторного штамма WR, был рекомбиньнт, экспрессирую-щий гемагглютинин вируса гриппа А. С этой целью в инсерционную плаз-миду pGS-20 был встроен ген гемагглютинина вируса гриппа А, штамм Удорн/30Г?/72 (Н3н2), который был выделен из плазмиды pYHAl2, полученную ранее В IL Юферовым (Рис. 12).

После трансфекции клеток и рекомбинации с геномом ВОВ, был выделен и получен рекомбинантный штамм, обозначенный нами rV840HA. Частота встречаемости рекомбинантных клонов среди ТК- популяции вируса в этом опыте составляла 12, 51

Способность рекомбинантного штамма экспрессировать ген ГА вируса гриппа А в инфицированных клетках определялась наш методом ИФА. Культуру клеток cv-I (300 тыс.) заражали рекомбинантом rv840ha с множественностью 1-2 БОЕ/клетка. Через 48 ч. после заражения цитопатичес-кое действие в культуре достигало 4+. Инфицированные клетки разрушали 3-кратным замораживанием и оттаиванием, а затем определяли в них титр ГА в реакции ИФА. Титр ГА при этом достигал разведения I: 64 - 1:128 (табл.10).

. Эти результаты свидетельствуют о том, что рекомбинантный штамм ВОВ способен индуцировать достаточно высокий уровень синтеза ГА вируса гриппа, если учесть при этом, что этот титр был достигнут при заражении всего 300 тыс. клеток в объеме среды 2 мл. Для изучения способности рекомбинантного штамма ВОВ индуцировать специфические антитела к продукту экспрессии встроенного гена мы иммунизировали

Чо-

кроликов путем 1-кратного введения 100 млн. БОЕ рекомбинантного штамма. Реакция иммунного ответа у животных определялась в РТГА. Резуль-

Рис. 12. Конструирование рекомбинантной плазмиды рНА 33.

нд-ген гемагглкггинина вируса гриппа А, штамм Удорн/ 307/72 (нЗн2). ТК1, ТКг - последовательности ТК-гена вируса осповакцины. 7,5К - область инициации транскрипции белка 7, 5К ВОВ. тэты определения показали, что у кролика, иммунизированного в/к титр антител достигал I: 2560 через 2-3 недели после иммунизации, а через 4 недели титр снижался до 1:1280. При в/в иммунизации титр антител достигал 1:5120 через 4 недели после иммунизации.

Полученные данные свидетельствуют о том, что рекомбинантный штамм ВОВ после однократного введения индуцирует у кроликов уже через 2 недели высокий уровень антител к ГА вируса гриппа. Эти данные указывают на перспективность использования рекомбшантных штаммов ВОВ-для получения иммунных моноспецифических сывороток.

I-

Локирование

нЫ1 I'¿к

Таблица 10.

Экспрессия ГА вируса гриппа в культуре клеток су-1, зараженных рекомбинантным штаммом гУ840на.

Но опыта Разведение антигена Индекс ИФА

I I 16 4,3

I 32 3,2

I 64 2,9

I 128 2,7

2 I 16 6,1

I 32 4,5

I 64 3,2

I 128 1,4

Конструирование штамма ВОВ гУ895да1, эхспрессирующего бета-галактоэидазу.

Эта часть нашей работы носила главным образом методический характер, целью которой была отработка условий получения рекомбинантних штаммов ВОВ, на основе инсерционной плазмиды рБС-П, несущей в к^ честве маркера экспрессируемую бета-галакгозидазу. Отбор рекомбинант-ных клонов проводили путем добавления в агаровую среду индикаторный реагент х-ваГ, который при взаимодействии с бета-галактозидазой окрашивал бляшки в голубой цвет. Такие рекомбинантные штаммы, которые н( сут цветной маркер, могут быть использованы для получения новых ре • комбинантов, с использованием инсерционньи плазмид, не обладают маркерами, так как в результате новой рекомбинации бляшки ВОВ сшн приобретают белый цвет, вследствии замещения гена бета-йа! новым г«

- 42 -

ном в результате рекомбинации (рис.13).

Следует однако отметить, что использование плазмид типа рБС-П наиболее целесообразно применять для тех областей генома ВОВ, которые не содержат селективных маркеров, поэтому окрашивание бляшек в голубой цвет значительно облегчает отбор рекомбинантных клонов. В нашей работе в подавляющем большинстве случаев мы встраивали чужеродные гены в область ТК-гена ВОВ, поэтому в качестве инсерционной использовы-али плазмиду рио25, сконструированную в нашей лаборатории (рис.14).

V 1 г з < 5 е 7 а 5 10 II ч ^

* Ф Ф р&■ 1.

.ц,______ _ _________ соохе м1с30т1тея « _.___________ __________4,.

Рис. 13. Индикация экспрессии бета-галактозидазы рекомбинантным штаммом гУ895да1 вируса осповакцины.

>Лри добавлении в культуры инфицированных клеток индикатора X—да 1 изменение цвета среда происходит в лунках, содержащих рекомбинантные клоны гУ895да1.

- 43 -

Конструирование рекомбинантных штаммов ВОВ, экспрессирующих антигены вируса гепатита В.

Для конструирования штамма ВОД экспрессирующего нв5Ад, вначале на основе плазмнды р1^25 была сконструирована инсерционная плаз гада р011. содержали ген ИВвАд вируса гепатита В, субтип а<)и, под промотором белка 7,5К. После трансфекции ДНК плазмиды в культуру клеток су -I, инфицированных ВОВ, был выделен рекомбинантный штамм, обозначенный нами Р0В854НВ5. Уровень экспрессии нв$Ад полученного штамма был достаточно высоким. Ниже приводятся показатели синтеза нв$Ад в монос-

н

Рис. 14. Схема конструирования плазмид рил25 и рю1.

лойной культура клеток су-1 при различной множественности заражения через 24 часа после инфекции(табл. II).

Следует отметить, что уровень экспрессии нввАд был неодинаковым в различных видах клеток. Нами был изучен уровень синтеза нвэАд в 9 видах первичных и перевиваемых культур в условиях монослойного и суспензионного культивирования (табл.12).

Таблица II.

Множеств. Количество HBsAg (нг/млн. клеток) в: Уровень секреции

заражения HBsAg

БОЕ/клетка клетках культ, среде суммарное кол-во в %%

0,2 312 443 755 58,7

20 268 680 948 71.7

100 320 800 1120 71,4

Таблица 12. "

Показатели уровня внеклеточного HBsAg, синтезированного P0B854hbs, в различных клеточных системах.

Вид культуры клеток Метод культивирования HBsAg нг/мл среды

HeLa (суспензионная) суспензионный > 500

RKI3 роллерный 1000

Почка кролика (перв.) суспензионный 100

CV-I роллерный > 500

CV-I суспензионный > 500

ФКЭ суспензионный < 100

ФКЭ роллерный 100

VERO роллерный < 500

Почка зеленой мартышки сусйезионный 100

Наиболее высокий уровень синтеза HBsAg был достигнут в суспензионной культуре клеток Hela, монослонных RK-I3, cv-I и несколько менее в Vero. Низкий уровень экспрессии отмечался в культурах клеток почки кролика, фибробластах куриных эмбрионов, а также в клетках ПЗМ.

Для характеристики плавучей плотности синтезированного рекомби-нантного HBsAg его центрифугировали в равновесном грлдиенте плотности CsCl при 170000 g в течение 64 ч. Распределение HBsAg в градиенте плотности определяли методом РИА (рис. 15).

Результаты анализа свидетельствовали, что рекомбинантный HBsAg имеет гомогенную плавучую плотность в с s с 1 и составляет 1,2 г/см. куб., что соответствует плотности натурального HBsAg, получаемого из плазм:,i крови больных.

При электронной микроскопии очищенного HBsAg в препарате были обнаружены структуры, морфологически идентичные структурам антигена, вы • являемым в сыворотке крови больных гепатитом В и антигеноносителей: это структуры, главным образом, сферической или близкой к ней формн размером 18-36 нм. Серологическая специфичность указанных структур была подтверждена при иммуноэлектронной микроскопии.

При однократном введении кроликам 100 млн. БОЕ рекомбинантного штамма РОВ 854 hbs обнаруживали индукцию у них антител к HBsAg, выкь ляемых в реакции РИА на антитела. Титр антител достигал 1:1 ООО чере-? 3-4 недели после иммунизации.

Таким образом, полученный наш рекомбинантный штамм вируса оспо-вакцины способен в условиях культуры клеток экспрессировать HBs-анти-ген, который по многим своим свойствам является близким к HBsAg, выделенному из плазмы крови больных.

Представленные данные показывают достаточно высокий уровень синтеза HBsAg в культуре клеток, вместе с тем физические и антигенные свойства антигена оказались близки к натуральному. Исходя из этого, очевидно, что такие штаммы-продуценты могут быть использованы для

Рис.15. Характеристика плавучей плотности рекомбинантного НВхАд в градиенте плотности С5С1, экспрессируемого вирусом ос-повакцины. На вставке изображен очищенный нв$Ад под электронным микроскопом.

продукции рекомбинантного антигена с целью его использования в диагностических тест-системах." Тем не менее, мы предприняли попытку уве-; личить уровень синтеза рекомбинантного НВзАд, направляемого геномом ВОВ, путем увеличения дозы гена нв $ Ад в рекомбинатном штаммае ВОЕ

С этой целью на основе инсерционной плазмиды рЫ25 бьша сконструирована новая рекомбинантная инсерционная плазмида, в которой имелось 2 копии последовательностей ш$Ад, каждая из котбрых контролировалась независимо своим промотором белка 7,5К После рекомбинации с геномом

ВОВ был получен новый штамм, обозначенный нами ГДД9331, который отличался более высоким уровнем синтеза нв$Ад в культуре клеток. На сконструированый нами штамм было получено авторское свидетельство за N 1515698 с приоритетом от 27 января 1988г.

На основе этого штамма-продуцента НВ5Ад совместно с лабораторией клеточной инженерии и НПО "Вектор" была разработаиэ диагностическая иммуноферментная тест-система "Рекоматгеп В', которая приказом Заместителя министра здравоохранения СССР за N 174 от 28 апреля 1990г. была внедрена практику в 1990г. Производство тест-системы было начато в августе 1990г. Данная тест-система является полностью биотехнологической, т. к. в ней используется рекомбинантный антиген и моноклональ-ные антитела. Чувствительность тест-системы является весьма высокой и достигает С^5 - I нг нв$ Ад/мл.

Конструирование рекомбинантных штаммов ВОВ. экспрессирующих НВеАд2 Овйруса гепатита В.

Как известно, выявление антител к НВеАд вируса гепатита В имеет важное диагностическое и прогностическое значение. Исходя из нашего предыдущего опыта по созданию ВОВ - продуцента нВзАд, мы осуществили конструирование рекомбинантных штаммов ВОВ, продуцирующих НВеАд нвV. На основе инсерционной ллазмиды р1и25, мы сконструировали 3 варианта рекомбинантных инсерционных плаз мид, которые содержали соответственно I, 2 и 3 копии последовательностей гена НВеАд гепатита Е

После осуществления рекомбинации плазмид с геномом ВОВ, были получены 3 рекомбинантных штамма ВОД экспрессирующих НВеАд. Особенность всех 3-х вариантов рекомбинантных шташов состоит в том, что НВеАд секретировался в культуральную среду, что представляет значительное удобство для технологических целей. Уровень секреции нвеДд у всех 3-х штаммах был приблизительно одинаковым,' однако по количеству

внутриклеточного антигена все 3 штамма отличались друг от друга пропорционально числу копий встроенного гена.

На основе штамма - продуцента НВеАд совместно с предприятием НПО "Диагностические системы" (Нижний Новгород) была разработана иммуно-ферментная тест-система для выявления антител к НВеАд, составлена ВФС и Лабораторный регламент. Тест-система представлена на государственные испытания в ГИСК им. Тарасевича.

Конструирование рекомбинантных штаммов ВОВ, экспрессируюших антигены ВИЧ-1.

Опыт по созданию рекомбинантных штаммов, продуцирующих антигены вируса гепатита В, свидетельствует о возможности, использования рекомбинантных ВОВ з биотехнологических целях в качестве продуцентов рекомбинантных антигенов. Исходя из этого, мы предприняли попытки получить рекомбинантные штаммы ВОВ, продуцирующие белки различных генов ВИЧ-1. Всего было сконструировано 6 рекомбинантных штаммов ВОВ, содержащие встроенные гены: gag-pol, gag-pol-env, gpI60, gp4I, pI7-gag, а также слитные последовательности генов gag/gp4I.

Оценка уровня синтеза ВИЧ-антигенов в инфицировнных клетках определялась методом Вестерн-блота, используя различные аликвоты фракции клеток. Следует отметить, что 3 из вышеуказанных рекомбинантных штаммов, а именно, содержащих соответственно последовательности генов р17 -gag, gp4I и gpI60, обладали низким уровнем экспрессии рекомбинантных антигенов, что, по-видимому, было обусловлено низким уровнем активности промотора белка ПК, под контроль которого они были встроены в составе плазмнды pYV-I. Эти штаммы не представляли никакой практической ценности. * ',.-.'■."'

3 других штамма, а именно, содержащих встроенные последовательности генов gag-pol, gag-pol-env И СЛИТНЫе gag/gp4I, отличались ВЫСО-

ким уровнем экспрессии. Все они были построены на основе плазмиды pUJ25, под контролем промотора 7, 5К.

Состав экспрессируемых белков.

Как уже указывалось выше, состав экспрессируемых белков у реком-бинантных штаммов определялся методом Вестерн-блота, используя маркеры молекулярного веса и ВИЧ-позитивную человечески сыворотку. Так, рекомбинатньй штамм, содержащий встроенные последовательности gag-pol -env, продуцировал 5 полипептидов с молекулярным весом от 30 до 67 кД (рис.16).

Они реагировали специфически не только с человеческой ВИЧ-позитивной сывороткой, но и с моноспецифической сывороткой кроликов, полученной против рекомбинантных антигенов, синтезированных в E.coli. Интересной особенностью данного штамма ВОВ является формирование в инфицированных клетках вирусоподобных частиц (ВПЧ), которые напомнили сформированный нуклеоид природных частиц ВИЧ, наблюдаемых в кул: туре клеток. Этот штамм является перспективным с точки зрения исследования морфогенеза ВПЧ, который будет изучаться нами в дальнейшем (рис.17).

Другой рекомбинантный штамм, содержащий слитные последовательно ти генов gag/gр41, экспрессировал белок с молекулярным весом >90к который целиком был связан с клеточными структурами. Он прояв; двойную антигенную специфичность: белков гена gag, а также гликоп^ теида gp4I, что было установлено наш с помощью моноклональных am тел в реакции Бестерн-блот. Этот штамм ВОВ не индуцировал в клетк ' морфогенеза ВПЧ, как показали результаты исследований методом элеь ронной микроскопии.

Наконец, рекомбинантный штамм ВОВ, содержащий встроенные после; вательности генов gag-pol, индуцировал синтез полипептидов с моле1 лярным весом соответствено 24, 40 и 55 кД (рис.18).

Некоторые из этих белков (24 и 55 кД) секретировались также

культуральную среду и выявлялись в среде как методом ИФА, так и методом Вестерн-блота.

i "А. ; i

Р ЕК É¡;

м

и И

•ез 2

.

3

Í

U

'sk:

Í-6//Y- /K>¿vn/¿fwr сыбсуюгка, нетоир».

4 - MiuwSHa/t

C*/Afae>r«4r

а/Лсуютляг ir - /ули^лл анги даа

5 - ¿/М- *es¡m/á"*Jt

Рис. 16. Иммуноблот лизата культуры клеток CV-I, инфицированных рекомбинантным штаммом ВОД содержащего Sacl-фрагмент генома ВИЧ-I. Видно аномальное расположение некоторых полипептидов гена gag.

Мы ожидали, что этот штамм способен индуцировать в клетках формирование ВПЧ. Однако, при исследовавнии культур клеток Cv-I и Hela, зараженных данным штаммом с разной множественнстьго заражения, на протяжении до 72 часов не обнаруживали формирования ВПЧ. Поскольку у данного штамма в последовательностях gag-pol нами был элиминирован сайт упаковки РНК, то мы предполагаем, что это могло обуславливать отсутствие формировавния ВПЧ. 'В дальнейшем мы предполагаем сконструировать новый штамм ВОВ, который будет содержать те же последовательности, но с сохраненным сайтом упаковки РНК.

Рис. 17. Формирование вирусоподобных частиц ВИЧ-I в культуре клеток. НЕр —2, инфицированных рекомбинантным штаммом ВОЕ Верхний ряд частицы натурального ВПЧ-I, средний ряд - ВПЧ формируемые рекомбинантным штаммом ВОЕ нижний ряд - ВПЧ, образуемые белком р50 gag. .

"" ва

-ог

Ьб8 55_а

.30

1 г

. I - вИУ-полити£мо& сыворотка 2. - ВИЧ-негатиВиая сыЗоротха

Рис. 18. Иммуноблот лизата культуры клеток СV—I, инфицированных рекомбинантньм штаммом ВОД содержащего дад-ро!-фрагмент ДНК генома ВИЧ-1.

Использование рскомбинантного дад-антигена для диагностики СПИД.

Определение специфичности рекомбинантных антигенов определяли ые- . тодом ИФА в конкурентной тест-системе "Вектор", используя панель положительных и отрицательных сывороток (табл. 13).

Всего в опыт было взято 144 сыворотки, кз которых 52 составляли ВИЧ-позитивные и 92 ВИЧ-негативные сыворотки. Все сыворотки были

Таблица 13.

ВзаимодеЙствиэ рекомбинантного gag-антигена с панелью положительных и отрицательных сывороток в конкурентном иммуноферментном анализе.

Всего по Классификация Содержание антител Реакция с рекомбинантн

группам сывороток к натура ль н. gag- gag-антигеном в ИФА

антигену в wb. t

48 позитивные позитивные позитивная

4 позитивные негативные негативная

79 негативные негатнвные негативная

I негативная негативная ложно-позитивная

12 ложно-пози- негативные негативная

тивные

Всего: 144------------------------------------------------------------

классифицированы на основе данных подтверждающего теста. Из 52-х положительных сывороток рекомбинантный антиген правильно выявлял в тесте ИФА специфические антитела в 48 сыворотках. Остальные 4 сыворотки, не давшие позитивные реакции с рекомбинантным антигеном, по данным подтверждающего теста не содержали антител к белку р24. В то же время из 92-х отрицательных сывороток с помощью рекомбинантного антигена правильно была идентифицирована 91 сыворотка, и лишь в одном случае был получен ложно-позитивный ответ.

Следует отметить, что среди отрицательных сывороток нами было ■взято также 12 ложно-позитивных сывороток, выявленных ранее по другим тестам. Важно подчеркнуть, что сыворотки реагировали с рекомбинантным дад-антигеном как отрицительные. Эти данные позволяют сделать заключение о том, что причины ложно-позитивного ответа в случае натурального и рекомбинантного антигенов различны. В случае последнего ложно-

позитивный ответ может быть обусловлен присутствием в анализируемой сыворотке высокого титра антител к растворимым белкам вируса осповак-цины.

В следующем разделе опытов рекомбинантный gag-антиген был использован нами для анализа ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных сывороток методом иммуноблота. В реакцию брали смесь gag-белков, экстрагированных из зараженных клеток и выделенных из культуральной среды. Полученная таким образом смесь белков была представлена приблизительно в равной степени белками р24 и р55.

В опьгг было взято 142 сыворотки, которые были предварительно исследованы на присутствие в них ВИЧ-антител различными методами, включая иммуноблот с натуральным вирусным антигеном, двумя иммунофермент-ными тест-системами "Вектор" и "Abbott", а также методом иммунофолюо-ресценции. Результаты этого исследования показаны в табл. 14.

Как видно из данных таблицы, 60 позитивных сывороток дают четкий и положительный ответ с рекомбинантным gag-антигеном в реакции иммуноблота. 13 сывороток, позитивных только по некоторым тестам или слабо-позитивных по ряду тестов, дают слабо-позитивную реакцию с рекомбинантным gag-антигеном. Очевидно, что эти сыворотки содержат сниженный уровень антител к белкам, кодируемым геном gag, что обычно является характерным для поздних клинических стадий инфекции. В то же время все отрицительные сыворотки в реакции иммуноблота. с рекомбинантным gag-антигеном были идентифицированы абсолютно правильно, т.е. не давали ложно позитивно го ответа.

Следует также отметить, что все 23 ложно-позитивные, '.сыворотки, дающие ложно-позитивные реакции по 1-му или 2-ум тест-системам, идентифицировались рекомбинантным gag-антигеном как отрицательные. Более того, ряд сывороток, которые дают ложно-позитивную реакцию с натуральным антигеном р24 в Вестерн-блоте в аналогичном тесте с рекомбинантным антигеном определяется, как отрицательные.:

Таблица 14

Анализ панели сывороток в различных тест-системах.

Всего Кол-во Классиф сыв-к Конкурент. ИФА в Метод Реакция с

по исслед. с натуральн. ИФА с натур. тест- иммуно- рекомбин.

груп- сыв-к ВИЧ-антигеном ВИЧ-антиге- систе- флюорес- антигеном

пам по гр. в р-ции "«в" ном же ценции gag-pot В

"Abbott" "WB"

I 2 3 4 5 6 7

60 37 позитивные + 4 4 4

23 позитивные + н. и. н. и. 4

I позитивная + 4 4 4-

I позитивная 4- 4- 4-

6 позитивные 4- 4- 4-

13 I позитивная 4- 4 4 4-

I позитивная - 4 4 4-

I позитивная 4 4 - 4-

2 позитивные - 4 4 4

I позитивная - - - 4-

"старая"

3 - " - - - 4 4-

7 I - " - - - 4- 4-

I - " - - - 4 4

I - " - 4- - 4 4

I «1 - - - 4

только к р9

I I ложно-поз итивн. - - 4- -

I

2

3

4

5

6

7

22

22 ложно-позитивн.

+

+

н. и.

39

39 негативные

Обозначения:

(+) - соответствует четко выраженному поло жите ль но му ответу. (+-)- соответствует слабо выраженному положительному ответу. (-) - соответствует отрицательному ответу (н. и.) - сыворотка по данному тесту не использовалась.

В отдельных случаях на иммуноблоте с рекомбиннатным дад-антигеном наблюдались полосы белков, дающих положительную реакцию с негативными сыворотками. Однако расположение этих белков на иммуноблоте не соответствовало молекулярным массам белков, кодируемых геном gag (р24 и р55). Мы предполагаем, что эти полосы белков соответствуют растворимым антигенам вируса осповакцины Действительно, обработка мембраны противооспенной антисывороткой позволила блокировать появление этих неспецифических полос.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что gag-антиген, синтез которого направляется рекомбинантным вирусом осповакцины, может быть с успехом использован в качестве источника антигена для разработки верифицирующих тестов при серодиагностике СПИД. В настоящее время составлена техническая документация на диагностическую тест-систему иммуноблот ВИЧ-1, которая была утверждена на Ученом Совете Института вирусологии им. Д. И. Ивановского и представлена в Государственный ' комитет по медицинским и иммунобиотехнологическим препаратам." К настоящему времени Минздравом СССР утверждено техническое задание на разработку и испытание данной тест-системы.

выводы

1. Впервые изучена структурно-функциональная организация генома и установлена антигенная принадлежность обезьянего аденовируса типа ба-7р(м7/$у-20), выделенного ранее из первичной культуры клеток почки зеленой мартышки.

2. Впервые осуществлено картирование области вирусного генома ба-7 р(м7Ду-20), обладающей онкогенной функцией и. установлена обширная гомология между последовательностями областей Е1а и Е1в онкогена аденовируса обезьян с соответствующими областями аденовирусов человека серотипов н5.н7 и н12.

3. На основании серологических свойств, физического картирования и анализа нуклеотидных последовательностей обезьяний аденовирус $а-7р ( Ш/бV20) в соответствии с вновь принятой номенклатурой предложено классифицировать как новый серотип, с обозначением его как аденовирус 5-25.

4. Анализ карт расщепления геномной ДНК 3-х лабораторных и 3-х вакцинных штаммов вирусов простого герпеса позволил впервые установить межтиповые и ыежштаммовые отличия у данных представителей вирусов простого герпеса, а вакцинные штаммы Л2 и Ус были впервые идентифицированы нами как вирусы 1-го типа, тогда как штамм ВН идентифицирован как вирус 2-го типа.

5. Методами генетической инженерии и селекции был впервые сконструирован мутант ВПГ-1, несущий одновременно 2 генетических маркера резистентности к химическим ингибиторам, действие которых связано соответственно с функцией тимидинкиназы и ДНК-полимеразы, позволяющий определять механизм ингибирующего действия химиопрепаратов уже на стадии скрининга.

6. На моделях полученных мутантов ВПГ-1 изучена активность 6 антивирусных препаратов, в результате чего было показано, что анти-

герпетическое действие рибавирина и н-1-адемантил-н[ 2-( диметилами-но)этокси]-ацетамидз (АДЭА) не связано с ингибированием функции тими-динкиназы и ДНК-полимеразы.

7. С целью создания штаммов-продуцентов рекомбинантных антигенов методами генной инженерии сконструирован ряд рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессирующих соответственно структурные белки БИЧ-I, вируса гепатита В, вируса гриппа А.

8. Впервые получен рекомбинантный штамм ВОВ, продуцирующий вирусоподобные частицы ВИЧ-I, морфологически сходные с натуральным вирусом, которые могут служить удобной моделью для изучения процесса морфогенеза вирусов иммунодефицита человека,

9. Рекомбинантный gag-антиген ВИЧ-I, продуцируемый вирусом оспо-вакцины, обладает высокой иммунореактивностью и.может быть использован для разработки диагностических тест-систем.

10. На основе рекомбинантного штамма ВОВ - продуцента HBsAg вируса гепатита В разработана и внедрена в 1990г. в производство диагностическая иммуноферментная тест-система "Рекоматгеп В" для выявления HBsAg в сыворотках человека.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Денисова Т.С., Ситников ЕС., Гибадулин P.A. "Изучение фрагментации ДНК птичьего аденовируса СЕЮ с помощью специфических эндонук-леаз Hpal, EcoRI, Hindill." -ж. Мол. биол. (СССР), 1979,N5, стр. I02I-I034.

2. Денисова Т. С., Гибадулин Р. А., Ситников Е С., Сенкевич Т. Г., 0. А. Медведкина "Изучение генома обезьянего аденовируса. Сообщение I. Построение физических карт с помощью рестриктаз: BamHI, EcoRI, Xbal, Sail, Hind III." -ж. Мол. биол. (СССР), 1980, т. 14, N3, стр. 708-720.

3. Гибадулин Р. А., Денисова Т. С. "Сравнительный анализ 2-х линий крысиных клеток, трансформированных специфическими фрагментами ДНК

обезьянего аденовируса." , -В сб. : "Вирусы рака и лейкоза", M., 1981, стр. II9-I2I.

4. Гибадулин P.A., Денисова Т.С. "Идентификация фрагмента ДНК обезьянего аденовируса (антигенный вариант SA-7), обладающего трансформирующей активностью. " - там же, стр. II7-II9.

5. Сенкевич Т. Г., Гибадулин P.A. "Упрощенный мзтод выделения ДНК вируса простого герпеса. " -там же, стр. 147-148.

6. Гибадулин Р. А., Сенкевич Т. Г. "Сравнительный анализ 4-х штаммов вирусов простого герпеса типа I. Выделение и частичная характеристика. " -там же, стр. I5I-I52.

7. Сенкевич Т. Г., Згурская Г. Н., Гибадулин Р. А. "Исследование межштаммовых различий ДНК вируса простого герпеса типа I с помощью рестриктаз. " -Вопр. вирусол., 1981, N6, стр. 753-757.

8 . Гибадулин P.A., Дейкема Р., Денисова Т. С,, Ван Ормондт X, "Изучение генома аденовируса обезьян. 11. Идентификация специфического фрагмента вирусной ДНК, обладающего трансформирующей активностью. " -ж. Мол. биол. ( СССР), 1982, т. 16, в. 2, стр. 315-321.

9 . Денисова Т. С., Махов А. № , Гибадулин P.A. "Идентификация нового антигенного варианта аденовируса обезьян SA-7P." -Вопр. вирусол., 1982, N4, стр. 483-488.

10. Денисова Т. С., Гибадулин Р. А "Детальное изучение структуры ДНК генома обезьянего аденовируса и идентификация ее последовательностей в трансформированных клетках. " -Вопр. вирусол., 1982, N5, стр. 589-595.

11. Сенкевич Т. Г., Гибадулин Р. А "Простой метод получения'. ДНК вируса простого герпеса. " -Вопр. вирусол., 1982, N4, стр. 505-506.

12. Сенкевич Т. Г., Гибадулин Р. А., Угрюмов Е П., Посевая Т. А., Ба-ринский И. Ф. "Типирование штаммов вируса простого герпеса, используемых для изготовления противогерпетической вакцины, методом анализа вирусной ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз. " -Вопр. виру-

сол., 1982, N3, стр. 330-335.

13. Gibadulin R. А. , Denl sova Т. S. , Zavgorodny S. G. "Isolation and Characterization of herpes virus type I reslstent to the Inhibitory activity of phosphonoacetiс acid". -V Intern. Symp. Soc. Countries "Antiviral compounds", Ri ga, 1982, p. 161.

14. Гибадулин P. A., Мухина P. M., Завгородний С. Г., Флорентьев Е JL, Баринский И. Ф. "Изучение устойчивости различных штаммов вирусов герпеса простого к действию химических ингибиторов. " -Вопр. вирусол., 1983, N4, стр. 87-90.

15. Гибадулин Р. А., Денисова Т. С., Завгородний С. Г., Флорентьев Е JI, Жданов В. М. "Выделение и характеристика PAAr-мутантов вируса простого герпеса типа I." -Вопр. вирусол., 1983, N4, стр. 59-63.

16. Гибадулин Р. А., Носиков R Е , Денисова Т. С,, Брага 3. А., Завгородний С. Г., Флорентьев ЕЛ,Жданов ЕЕ "Получение делеционных мутантов вируса герпеса простого типа I (БПГ-1) методом рекомбинации с клонированным инактивированным геном тимидинкиназы ВПГ-2." - Мол. генетика, микробиох вирусол.", 1984, Н9, стр. 28-33.

17. Львов Д К., Вязов С. 0., Гибадулин Р. А., Кущ А. А. -"Иммунобиотехнология гепатита В'. - ж. Всесоюзн. химического об-ва им. Д. И. Менделеева, 1989, т. 34, Nol, стр. 60-67.

18. Dekker В., Van Ormondt H.,Den1sova Т. S. , Gi badull n R. A. "Nucleotide sequences of leftmost Xhol DNA fragment of Simian Adenovirus Genome", -J. of Gen. Vi rol., 1984, v. 6, pp. 1699-1708.

19. Денисова Г. Ф., Лидеман Л. Ф., Гродницкая Н. А., Галиулин Ф. Г., Гибадулин Р. А., Жданов В М. "Получение банка и анализ клонированных фрагментов ДНК вируса осповакцины с помощью рестриктаз и ДНК-гибридизации". -В-сб. "Мол. биол. вирусов", 1985, стр. I27-I3I, под ред. ЕМ. Жданова, Е

20. Николаева С. Н., Галегов Г. А., Гибадулин Р. А., Жданов Е М., "Ин-гибирование репродукции вируса простого герпеса типа I, несущего му-

тации в тимидинкиназном и ДНК-полимеразном генах", -"Генетика", 1986, N5, стр. 892-894.

21. Гибадулин Р. А., Денисова Г. Ф., Лидеман JL Ф., Гродницкая Е А., Лазаренко А. А., Константинова Л. А., Жданов ЕМ, "Экспрессия гена HBsAg вируса гепатита В в клетках, инфицированных рекомбинантным штаммом вируса осповакцины". -В сб. "Акт. вопр. общ. и мед t вирусол. под ред. Д К. Львова, M 1986, стр. 55.

22. Лазаренко А. А., Лидеман Л. Ф., Денисова Г. Ф., Гибадулин Р. А., Юферов ЕП.Урываев Л.В "Экспрессия гена гемагглютинина вируса гриппа А в культуре клеток, инфицированных рекомбинантным штаммом вируса осповакцины". -там же, стр.54.

23. Гибадулин Р. А., Денисова Г. Ф., Лидеман JL Ф., Гродницкая Е А , Лазаренко А.А.,Заиров Г. К , Ананьев В. А., Жданов ЕМ. "Рекомбинантный штамм вируса осповакцины, экспрессирующий HBsAg вируса гепатита В". -В сб. "Вирусные гепатиты" под ред. . В. М. Яданова и Е. С. Кетиладзе, k, 1987, стр. 63-66. '

24. Гибадулин Р. А., Денисова Г. Ф. ,й(цанов В М., Лидеман JL Ф., Пауко-ва M. R -Авторское свидетельство, n I43I329, приоритет от марта 1987г.

25. Симонов В. И., Воробьев С. М. , Момот А М., Успенский М. В , Гродницкая Н. А., Кущ . А. А., Венгеров 1Q Е , Грановский Е Н., Гибадулин Р. А. "Использование аффинных иммуносорбентов на основе моноклональных антител для очистки антигена вируса гепатита К'. -"Биотехнология", 1987, т. 3, N6, стр. 725-729.

26. Van Ormondt H., GibaduHn R. A. -"Nucleotide sequence compari-zi on of simian adenovirus SA-7P and SA-7: Implication for classification of SA-7P". In: "Virus diseases In Labor. Ani mal s", (Marti nus Nij-hoff Publ. ), Bos ton, 1988, pp. 267-277.

27. Гибадулин P. A , Лазаренко A. A., Юферов В П., Лидеман JL Ф., Денисова Г. Ф., Гродницкая Е А., Урываев Л. H , Жданов & Е "Конструирование

рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего экспрессируе-мый ген гемагглютинина вируса гриппа А". -Вопр. вирусол., 1988, N3, стр. 275-278.

28. Гибадулин Р. А , Юферов RR , Лидеман Л.Ф., Парасюк Н. А, Ионова К С., Гродницкая Н. А , Урываев Л. В., Жданов В. М. "Методы получения и селекции рекомбинантов вируса осповакцины, экспрессирующих чужеродные вирусные антигены". -Вопр. вирусол., 198Э, N4, стр. 428-431.

29. Гибадулин Р. А , Денисова Г. Ф., Дзюбенко 0. Е , Михайлова 3. К., Лидеман JL Ф., Кара но в Э. R "Экспрессия антигенов ВИЧ-I рекомбинантными штаммами вируса осповакцины". -Веб. "Фунд и прикл. вопр. вируса СПИД', М. , 1988, стр. 97-99.

30. Денисова Г. Ф., Дзюбенко 0. Е , Чаплинскас С.А.Михайлова 3. К., Руднева И. А , Карамов Э. Е, Гибадулин Р. А "Использование рекомбинантного gag-антигена для серодиагностики СПИДа". -Там же, стр.100 -104.

31. Гибадулин Р. А , Гродницкая Н. А , Денисова Г. Ф., Дзюбенко 0. Е , Лидеман Л.Ф., Долгушина К И. "Авторское св-во", N1515698, приоритет от 27 января 1988г.

32. Гибадулин Р. А , Денисова Г. Ф., Лидеман Л. Ф., Гродницкая Д А, Михайлова 3. К , Дзюбенко 0. R "Рекомбинантные штаммы вируса осповакцины, экспрессирующие антигены вируса иммунодефицита человека и вируса гепатита В". -Матер-лы XVIII съезда микробиол. эпидемиол. и парази-тол., Алма-Ата, сент. 1989, стр. 202.

33. Лидеман JL Ф., Шарафанова ЕЕ, Гибадулин Р. А "Вирус осповакцины - продуцент антигенов вируса гепатита В'. "Итоги науки и техники", сер. "Вирусология", 1990, т. 22, стр. 56-57.

34. Трушинская Г. К , Симонов R Н., Сазыкин А Е , Тугизов IIL Н., Кущ А А,Гибадулин Р. А "Иммуноферментная тест-система для выявления антигена ВИЧ в биологической жидкости, основанной на применении монокло-нальных антител к белкам ВИЧ-I". -Матер-лы симп. "Совр. направл. созд мед диагн.", М., 1990, стр. 46. .

35. Сазыкин А. Ю., Кущ А. А., Симонов Е И., Тугизов EL М., Денисова Г. Ф. Дзюбенко 0. R, Сакаян И. А , Гибадулин Р. А. "Диагностический иммунобло-тинг для определения антител к антигену р24 ВИЧ-I". -там же, стр.55.

36."The development of a L1 posome-based rapid diagnostic method for HIV infection". -Intern, conf. on Med.Blotec. Immunization & AIDS , Leningrad, 1991, p,Pl-I.

37. Ammosov A. D. , Ruka vl shnikov M.Y.,Belyaev A. S. , G1 badul 1 n R. A. "The Ыotechnological basis for manufacture of the New generation enzymoimmune assay kits for the detection of the HBs antigens and its antibodies". -Intern.conf on Med. Bi otec. I mmuni z a 11 on & AIDS, Leningrad, 1991, p 2-10.

38. Сазыкин A. E , Дзюбенко 0. В , Кущ A. A., Гибадулин P. А. "Использование диагностического иммуноблота на основе рекомбинантных gag/pol -и env-антигенов ВИЧ-I при анализе позитивных.и ложнопозитивных сывороток". Тезисы докл. 1-го съезда иммунологов России, г. Новосибирск, 23-25 июня 1992г., стр. 415-416.