Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности фрагментов клеточного генома, содержащих интегрированную ДНК вируса гепатита B

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности фрагментов клеточного генома, содержащих интегрированную ДНК вируса гепатита B"

"V '—3

1 8 0 7.3 «1

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

УДК 578.891:577.113.5 (043.3)

РИВКИНА МАРИАННА БОРИСОВНА

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

ФРАГМЕНТОВ КЛЕТОЧНОГО ГЕНОМА, СОДЕРЖАЩИХ ИНТЕГРИРОВАННУЮ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1988

Работа выполнена в Институте микробиологии им. Августа Кир-хенштейна АН Латвийской ССР

Научные руководители:

член-корреспондент ВАСХНИЛ, доктор биологических наук, профессор Т. И. ТИХОНЕНКО

академик АН Латвийской ССР, доктор медицинских наук, профессор Р. А. КУКАЙН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор К. Г. ГАЗАРЯН кандидат биологических наук П. М. ЧУМАКОВ

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Межфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского

Защита состоится ,, 4 " 1988 года в 14.00

на заседании Специализированного совета Д 025.01.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов „ВНИИ генетика" (Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института ВНИИ генетика.

Автореферат разослан ,, <? " (ЛЛХЛ^Р_1988.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

В. И. ЩЕРБАКОВА

• ,1 •

-• v. •

: Г J

2 * ВВЕДЕНИЕ

\

ихс^ :'.~'дий !

г.„——Актуальность проблемы. Вирус гепатита В (HBV) - этиологический агент гепатита В у человека. В настоящее время в мире насчитывается около 200 миллионов носителей HBV (NishiOKa,1986). С целью получения препаратов вакцин и диагностикумов структурные гены HBV были экспрессированы при помощи методов генной инженерии в клетках про- и эукариот. Особый интерес при этом представляла экспрессия гена S, кодирующего антиген наружной оболочки вириона HBV - HBsAg, обладающий сродством к мембране гепатоцитов и модулирующий таким образом развитие инфекции HBV. Для продукции иммуногенного HBsAg наиболее перспективным оказалось использование линий клеток млекопитающих (Christman et al., 1982; Asselberg et al., 1986). Клиническое проявление инфекции HBV отличается полиморфизмом, варьируя от скрытых Форм до острого и хронического гепатита и цирроза печени (Rubin,1979) Помимо этого имеется ряд убедительных данных, указывающих на наличие связи между инфекцией HBV и развитием гепатоцеллюлярных карцином (Beasley, 1982). Одним из определяющих факторов при этом может являться интеграция последовательностей генома HBV (двуцепочечная кольцевая ДНК) в ДНК клетки-хозяина. Интегрированные копии ДНК HBV найдены в геноме большинства исследованных гепатокарцином, а также в печени больных острым и хроническим гепатитом, циррозом печени и бессимптомных носителей (Koshy et al., 1981; Kämet al., 1982; Shafritz, 1982). Более того, показано, что родственные вирусы гепатита лесных сурков, пекинских уток, земляных белок вызывают гепатокарциномы у вышеназванных животных, причем в тканях опухолей содержатся интегрированные последовательности ДНК соответствующих вирусов (Popper et al., 1982; Marion et al., 1986). Однако, вопрос о роли интеграции ДНК HBV в репродуктивном цикле вируса и возможной связи ее со злокачественной трансформацией гепатоцитов до сих пор остается невыясненным.

Цель и задачи исследования. В связи с вышесказанным целью нашей работы являлось изучение специфичности интеграции ДНК вируса гепатита В в геном клетки и анализ структуры интегрированных последовательностей генома HBV.

В качестве модели исследования нами была выбрана линия клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека PLC/PRF/5, содержащая в своем геноме интегрированные последовательности ДНК HBV и продуцирующая иммуногенный HBsAg (Alexander et al.,1976; Marion et al., 1980).

В процессе работы нам необходимо было решить следующие задачи:

- клонирование фрагментов генома линии PLC/PRF/5, содержащих интегрированные последовательности ДНК HBV (конструирование библиотеки генов линии PLC/PRF/5; скрининг последовательностей ДНК HBV в библиотеке генов PLC/PRF/5); '

- определение нуклеотидной последовательности интегрированных фрагментов генома HBV и фланкирующих участков клеточной ДНК;

- компьютерный анализ данных секвенирования.

Научная новизна и практическая ценность работы. В нашей работе на основании нуклеотидной последовательности интегрированного в геном PLC/PRF/5 гена S, кодирующего основные антигенные детерминанты HBV, впервые был определен субтип HBV, инфекция которым предшествовала развитию гепатокарциномы; впервые на уровне нуклеотидной последовательности доказана стабильность интегрированной ДНК HBV в составе генома PLC/PRF/5. Доказательство стабильности интегрированных последовательностей HBV представляет практический интерес для целей конструирования линий клеток млекопитающих - продуцентов структурных полипептидов HBV. К практическим аспектам работы следует отнести также конструиро-рование библиотеки генов PLC/PRF/5, широко используемой для клонирования и последующего исследования уникальных последовательностей генома человека (Злочевский и др., 1982; Скрябин и др., 1988). В целом работа носит теоретический характер. Проведенный нами анализ структуры интегрированных в геном PLC/PRF/5 последовательностей HBV является необходимым этапом в изучении процесса интеграции вирусной ДНК в клеточный геном и выяснении причинно-следственной связи инфекции HBV и развития гепатокарциномы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста и содержит следующие раз-

делы: введение, обзор литературы (посвящен структурно-функциональной организации генома НВ\? и кодируемых им полипептидов) , материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы. Материал диссертации иллюстрирован 2 таблицами и 30 рисунками. Библиографический указатель включает 387 цитированных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых "Вирусы человека и животных" (Рига,

1984 г.), на 8-м Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии"( Рига,

1985 г.), на рабочем совещании и симпозиуме стран-членов СЭВ по проблеме "Вирусный канцерогенез" (Рига, 1985 г.), на конференции молодых ученых "Современные проблемы медицинской вирусологии" (Рига, 1987 г.), на конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединений"(Рига, 1987 г.), на рабочем совещании специалистов СССР-ГДР "Проблемы молекулярной биологии и иммунохимии" (Рига, 1987 г.), на Ученом совете Института микробиологии им.Августа КирхенштеЯна АН Латвийской ССР (24 апреля 1987 года) , на семинаре отдела биотехнологии ВНИИ генетика (8 Февраля 1988 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ последовательностей генома НВУ в составе ДНК клеток" линии гепатокарциномы РЬС/РКГ/5

Начальным этапом нашего исследования являлся гибридизацион-ный анализ линии, позволяющий оценить распределение интегрированной вирусной ДНК в геноме клеток и определить стратегию клонирования а

Из клеток РЬС/РКГ/5 была выделена высокомолекулярная ДНК и

тестирована на присутствие в ней последовательностей генома НВУ

методом блотинг-гибридизации. Радиоактивным зондом служили 32

Р-меченые ВатН1-Фрагменты ДНК НВУ, выделенные из рекомбинант-ной плазмиды рНВ320 (Пумпен и др^, 1981). Анализ нерестрицирован-ной ДНК РЬС/Р№/5 (рис.1 г) показывает отсутствие эписомных форм

а 5 Ь г а

р

Рис.1. Авторадиограмма блотинг-гибридиэации ДНК РЬС/РИР/Б, гидролизованноП Нл.псЛИ (а) , ЕсоИ (б); ДНК плаценты человека, гидролизованной ЕсоИ1 (в^ нерестрицирован-ной ДНК РЬС/РКГ/5 (г); ВатН1-фрагменты ДНК НВУ (Пум-пен и др., 1981) совместно с ДНК плаценты человека, гидролизованной ЕсоШ (д) . Цифры обозначают размеры ресгрикционных фрагментов ДНК Л Н1п<3111 в т.п.н.

ДНК HBV, в то же время высокомолекулярная фракция ДНК PLC/PRF/5

32

содержит последовательности, гибридизующиеся с Р-ЦНК HBV. Дискретные полосы гибридизации рестрикционных фрагментов Hindlll и EcoRI (рис.la, б) предполагают ограниченное число сайтов интеграции ДНК HBV в геноме PLC/PRF/5. При этом распределение гиб-ридизационных полос, соответствующих HindIII-рестрикционным фрагментам должно отражать локализацию и количество сайтов интеграции ДНК HBV, поскольку ни один из проклонированных к настоящему времени вариантов генома HBV не содержит сайтов рестрикции Hindlll (Pasek et al., 1979; Galibert et al., 1979; Ono et al., 1983; Okamoto et al., 1986). В то же время большинство геномов HBV (за некоторыми исключениями) имеют единственный сайт EcoRI (Galibert et al., 1979; Ono et al., 1983; Valenzuela et al., 1979). Соответственно этому гидролиз EcoRI дает целый спектр фрагментов, содержащих последовательности HBV с размерами от 2,0 до 10 т.п.н. В ДНК плаценты человека, гидролизованной EcoRI, не обнаружено каких-либо последовательностей, гомологичных геному HBV (рис.1в). Для дальнейшего анализа интегрированных последовательностей ДНК HBV необходимо было получить фрагменты генома PLC/PRF/5, содержащие вставки ДНК HBV, в виде клонированных элементов.

2, Клонирование фрагментов генома PLC/PRF/5,

содержащих интегрированные последовательности ДНК HBV

Поскольку PLC/PRF/5 является линией клеток человека, представлялось целесообразным получить полную библиотеку генов этой линии в перспективе изучения индивидуальных генов генома человека. В качестве вектора клонирования был выбран лямбдоидный фаг Харон 4А (Blattner, 1977).

Конструирование библиотеки геноЕ проводили как описано у Maniatis et al. (1978). ДНК PLC/PRF/5 была клонирована в фаге Харон 4А по сайту рестриктаэы EcoRI. Варьируя время инкубации фермента, мы получали статистический набор рестрикционных EcoRI-фрагментов ДНК PLC/PRF/5, который затем фракционировали центрифугированием в 10-40 % градиенте концентраций сахарозы. Фрагменты ДНК размером 10-20 т.п.н. лигировали с собственно векторной частью ("плечами") ДНК Харон 4А. Рекомбинантную ДНК упаковывали in vitro в фаговые частицы с использованием лизогенных штаммов

а

-а |-1 с

■ 1У1

X о.

и1

о Е -о а х со

^ -о

с

¡л .5= О. X

СИ 8

НС 217

а о о

. — СП X СО

1

-а с

—■и! а о со аз XX

а

О и

ш

НС 102

„ а ш X со

а 1

о

ШМ

о

X

^: "о £ .£ а- X

сс

X

Е _

а о

со ш

НС 22

0

2

3

I

А

6 I

8

10 —I

Т.П.Н.

Рис.2. Рестрикционные карты клонированных ЕсоМ-фрагментов генома РЬС/РИР/Б - НС217, НС102 и

НС22, содержащих интегрированные последовательности НВУ (выделены черными прямоугольниками). Стрелками обозначен инвертированный повтор клеточной ДНК

1

Escherichia coli BHB 2688, BHB 2690 (Collins and Hohn, 1978) и транс-фицировали E.coli, штамм LE 392. Полученная библиотека генов PLC/PRF/5 содержала 10 фаговых клонов. Фон исходного Харон 4А при тестировании на среде, содержавшей X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-ß-D-галактозид), составил менее 5 %. Если принять, что средняя величина клонируемого фрагмента ДНК 15 т.п.н., а размер гаплоидного генома человека 2,9 х 10^ т.п.н. (Тарантул и др., 1982), то, согласно формуле Clarke and Carbon (1976):

In (1 - p) где n - число клонов

In (1 - f) '

p - вероятность

£ __ размер вставки размер генома

мы можем заключить, что в данной библиотеке любая уникальная последовательность ДНК из генома человека с размером в 15 т.п.н. присутствует с вероятностью 90 %.

Библиотека PLC/PRF/5 была амплифицирована и скринирована гибридизацией in situ (Benton and Davis, 1977) на присутствие интегрированных копий ДНК HBV. Нами было проклонировано 3 фрагмента генома PLC/PRF/5, содержащих интегрированные последовательности ДНК HBV -НС217, НС102, НС22 (НС - hepatocellular carcinoma, англ.). Клоны НС217, НС102, НС22 (рис.2) представляют собой продукты полного гидролиза EcoRI ДНК PLC/PRF/5.

3. Анализ клонированных фрагментов генома PLC/PRF/5,

содержащих интегрированные последовательности ДНК HBV

Для клонированных фрагментов ДНК НС217, НС102, НС22 были построены рестрикционные карты (рис.2), определившие стратегию секве-нирования. Последовательность нуклеотидов определяли по методу Maxam and Gilbert (1977) в модификации Чувпило и Кравченко (1983) и Зайцева (1986). Компьютерный анализ данных секвенирования проводили с использованием пакета программ, разработанных в Институте молекулярной генетики АН СССР (Александров, 1984).

3.1. Структура интегрированной ДНК HBV; локализация сайтов интеграции. Структура интегрированной ДНК HBV в проанализированных нами клонах представлена на рис.3. В клонах НС22 и НС102 вирусные последовательности ограничены сайтом EcoRI, что является результатом полного EcoRI-гидролиза ДНК PLC/PRF/5. Клон НС22 содержит не-

ЕсоРГ ВатН1 Хйо!

рге5 ЕсоИ

этН1

ВдШ ВдШ ВдШ ЕсоИ Ват Н1

ЕпЬ

£

I

Ш ИВУ

ргеБ

ВатН!

НС 22

ХЬа ВатН!

ВдШ ХЬа!

НС 217

Я I ШШЩ

Ьш

О

НС 102 3 4

т.п.н.

Рис.3. Структура интегрированной ДНК НОТ в клонах НС22, НС217, НС102. Физические карты интегрированных

последовательностей НОТ изображены в виде черных прямоугольников. Для сравнения приведено линейное изображение карты генома НОТ в соответствии с субтипом ауи, (ИоНатз ей а1.,1985); горизонтальная прерывистая линия обозначает одноцепочечннй участок генома -НОТ. Участки генома НОТ, граничащие друг с другом в интегрированной ДНК НОТ в результате дупликаций и делений, соединены пунктирной линией

1

51

101

1 5 1

201

25 1

301

35 1

40 1

451

501

55 1

60 1

65 1

70 1

751

801

85 1

901

951

00 1

05 1

101

1 5 1

20 1

25 1

НС22 près 2

aaticcacag ccttccacca agctctgcaa gatcccagag tcaggggcct 50

gtattttcct gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgctcaga 100

atattgcctc tcacatctcg tcaatctcct cgaggactgg ggaccctgca 150 S

ccgaacáígg agaacattac atcaggattc ctaggacccc tgctcgtgtt 200

acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata ccacagagtc 250

tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggatc acccgtgtgt 300

cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcctg 350

tcctccaatt tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca 400

tattcctctt catcctgctg ctatgcctca tcttcttatt ggttcttctg 450

gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct ctaattccag gatccacaac 500

aaccagtacg ggaccctgca aaacctgcac gactcctgct сaaggcaact 550

ctatgtttcc ctcatgttgc tgtacaaaac ctacggatgg aaattgcacc 600

tgtattccca tcccatcatc ttgggctttc gcaaaatacc tatgggagtg 650

gggctcagtc cgtttctct.t ggctcagttt ac.tagtgcca tttgttcagt 700

ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg 750

tggtattggg ggccaaatct gtacaacatc ttgagtccct ttataccgct 800

S_

gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaa'acc ctaacaaaac 850

gaagagatgg ggttattccc taaa.cttcat gggatatgta attggaagtt 900

ggggtacctt gccacaggat catattgtac aaaaaatcaa atgctgtttt 950

aggaaacttc ctgtcaatcg gcctattgat tggaaagtat gtcaaagaat 1000

tgtgggtctt ttgggctttg ccgcgccctt tacacaatgt ggttaccctg 1050

Enh

ccttaatgcc tttatatgca tgtatacaag caaaacaggc ttttactttc 1100

tcgccaactt acaaggcctt tctaagtaaa cagtatatga acctttaccc 1150

cgttgcccgg caacggcctg gcctgtgcca agïgtttgct gacgacaccc 1200

Enh

ccactggctg gggcttggct atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt 1250

gtggctcctc tgccgatcca tactgcggaa cttcttgcag cttgttttgc 1300

Рис.4 (начало, окончание см. на стр.10)

130! тсссассссс тстссассса аастсатссв састсатаат тстсгссгсс 1350

X 13811 551

_ И1| Ь

1351 тттстсссаа ататасатса тттссат(й;с т?ртатсгттс сстсатсгтс 1400

140 1 стстасаааа сстасссатс саааттссас ствтаттссс атсссатсат 1450

145 1 сттссссттт сссаааатас статсссаст ссссстсаст сссптстст 1500

1501 дссстсасгт тас.тастссс аитсгтсас тссгтсстас ссстттсссс 1550

1551 састсттюс стттсастта татссатсат стсстаттсс сссссааатс 1600

hbv 817 -томам

1601 тстасаасат стюастссс тттатасссс тсттассаат тттстттшс 1650

1651 всссссссас стсстасасс сассассасс сюасссасс стссассттс 1700

170 1 тс.тссстсас тттас,ссасс тстсасастс ттссссссас ссатссссса 1750

175 1 сстсаатстб АСАвТСвТСА ТТТТвАССТТ САСААССААС сссаттсссс 1800

1801 сстстсассс тсасгттттс таасааатсс ссаттассат астасттайс 1850

185 1 тсатастаса сстсаатстт ассстаасст аатстасстс сассатаатт 1900

1901 ттсссгтатс татаааастс тааатю 1927

Рис.4 (окончание, начало см.на стр.9). Последовательность нуклеотидов клона НС2 2. Двумя вертикальными линиями обозначен участок стыка ДНК НВУ и ДНК клетки (НВУ-ниМАЫ). Одной вертикальной линией обозначен участок дупликации С-конца гена Э. Подчеркнуты цифры, указывающие положения нуклеотидов в соответствии с субтипом асЫ, (\7alen-гие1а et а1., 1980). Отмечены положения Ы-конца прев, (ргеБ2), N и С-концов гена Б, энхансера (ЕпЪ), Ы-конца гена X. Горизонтальными линиями выделены строго гомологичные последовательности ДНК НВУ клетки (см.также табл.1)

1

51 101 151 201 25 1 301 351 401 451 501 55 1 601 65 1 70 1 75 1 80 1 85 1 90 1 95 1

НС217

ggtatataxa tatatatata tatatatata tatatatata tatagttgca

AAjA

gataattcta agaaaajatgt tgttttaaaa tgcatccata acaaaatggt

<2_

Ф

—Ф (2b-

gaaatatIcat aggtgactat iagaaatgax agtcactgat а[гттстстат

--ф <D--j-

TTTGTTATGG CTGCATTTTA TAAT^ATAT|G AAAXGATAGT CAXATAC3TAX

p^r^H^^Tj © HUMAN £2. HBV Qr-

CATATTTTAA TAATAAAATA TTAXAlAGGAA GljcTGGTGGC TCCAGTTCAG --ф=-

gaacagtaca ccct'

-ctgctcag aatattgcct ctcacatctc gtcaatctcc

tcgaggactg gggaccctgc accgaacatg gagaacatta catcaggatt

cctaggaccc ctgctcgtgt tacaggcggg gtttttcttg ttgacaagaa

tcctcacaat accacagagt ctagactcgt ggtggacttc tctcaatttt

ctagggggat cacccgtgtg tcttggccaa aattcgcagt ccccaacctc

caatcactca ccaacctcct gtcctccaat ttgtcctggt tatcgctgga

tgtgxctgcg gcgttttatc atattcctct tcatcctgct gctatgcctc

atcttcttat tggttcttct ccactatcaa ggtatgttgc ccgtttgtcc

tctaattcca ggatccacaa caaccagtac gggaccctgc aaaacctgca

cgactcctgc tcaaggcaac tctatgttxc cctcaxgxtg cxgtacaaaa

cctacggaxg gaaaxxgcac ctgtattccc axcccatcat cxigggctxx HBV 637^ HUMAN

cgcaaaatJta cxgccagaxg caactcaaxt aaacccacca ggtgtctccc

ctcaggxxag agxacctcat agaatccxxg cxacg

AAXAA AATAT

igaac

agcagaacgc xaagtatgxa acgaaccctt сatgaagcag xxgaxaggta

ggctxaaaca

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 960

"Рис. 5. Последовательность нуклеотидов клона НС217. Двумя вертикальшт-и

линиям! обозначены участки стыка ДНК НТО и ДНК клетки (HBV - HUMAN). Подчеркнуты цифры, указывайте положения нуклеотидов в соответствии с субтипсм adw2 (Valenzuela et al., 1980). Рамкой вдцелена открытая фаза трансляции гибридного полипептвда, кодируемого генсм S и последовательностью ДНК клетки. Стрелкам! (1), (2), (3) обозначены потенциальное шпилечные структуры по направлению к петле. Последовательность из 10 нуклеотидов ААТААААТАТ, присутствукщая слева и справа от интегрированной ДНК HBV, Еьщелена прямэугольниксм,

нс1 02

1 acccagttat tttgcaggct

5 1 тааттасаст tgggtaatta

101 асатсттата tcacaataaa

1 5 1 ataaagatca aatgcataaa

201 ccgcgtcgca gaagatctca

25 1 ggactcatаа ggtgggaaat

301 атстттаатс ctgaatggca

35 1 cgaggacatt attaataggt

401 atgaaaagag aacattaaaa

45 1 agcactaaat , 2684 atttgtctct

501 tcaagtagtt aatcattact

551 ggaaggctgg gattctatat

601 tgcgggtcac catattcttg

65 1 ctctagacaa cgggattaaa

701 тасттссaga cccgacatta

75 1 "tata" atataaIsagg gaaactacac

801 cttgggaaca agagctacat

85 1 gggacttcaa ccccacaaag

90 1 gtgggagcat tcggcccagg

95 1 gtggagctct caggctcaag

1 00 1 ctcctgcctc caccaatcgg

1 05 1 ccacctctaa gagacagtca

tttttaaaga atgacaagga atgaattagt 50

cttttttttt agtttttaaa aattagatct 100

acaaatgcta tggaggttaa agaattaaac 150

HUMAN ¿398 HBV

gtaattaca|: gcagacgaag atctcaatcg 200

atctcgggaa tctcaatgtt agítattcctt 250

tttactgggc tttattcctc tactgtccct 300

aacgccttcc tttcctaaaa tccatttaca 350

gtcagcaatt tgtaggccct ctcactgtaa 400

ttaattatgc ctgctagatt ttatcctaac 450

agacaacggg attaaaccgt attatcctga 500

tccagacccg acattattta catactcttt 550

aagagggaaa ctacacgtag cgcctcattt 600

2867 |2684

ggaacaagag ctacatcatg ggaggttg

f

650

с cgtattatc ctgatcaagt agttaatcat 700

2784

tttacatact ctttggaagg ctgggattcit' 750

gtagcgcctc attttgcggg tcaccatatt 800

preSl

2879

2978

kg~act 850

Del

catgggaggt tggttaccaa aaccí?

gaccactggc cacaagccaa ccaggtagga 900

gttcacccct ccacacggag gtcttttggg 950

gcacattgca tactgtgcca gcagtgcctc 1000

cagtcaggaa ggcagcctac tcccatctct 1050

preS2_

tcctcaggcc atccagtgga attc 1094

Рис.6. Последовательность нуклеотидов клона НС102.

Двумя вертикальными линиями обозначен участок стыка ДНК HBV и ДНК клетки (Нипяп - H3V), Одной вертикальной линией обозначены участки дупликации и делении (Del) ДНК HBV. Подчеркнуты цифры, указывающие поло'кенич нуклеотидов в соответствии с субтипом ads^. Отмечены голошения М-конца npeS^ (preSl), npeS^ (preSjf, ТАТА-промотора гена S (выделено прямоугольником) , С-конца гена С

прерывную последовательность ДНК HBV от 0 до 1381 нуклеотида (рис.3, 4), включающую область npeSj (за исключением первых 9 ну-клеотидов, отщепляемых при гидролизе EcoRI), ген S, участок энхан-сера, промотор гена X (Treinin et al., 1987). К положению 1381 прилегает дупликация С-концевой части гена S (нуклеотиды 551 -817), которая граничит с клеточными последовательностями (рис.3, 4)= Аналогичная дупликация описана Koch et al. (1984) в клоне А - 4„0. При этом сайт интеграции ДНК HBV и фланкирующие клеточные последовательности в клонах НС22 и А-4.0, а также в клоне 15, описанном Ziemer et al. (1985), полностью совпадают, что указывает на общее происхождение этих клонов. Фрагмент ДНК HBV в клоне НС217 представляет район генома HBV от 62 до 637 нуклеотида (рис. 3, 5) и содержит, таким образом, неполную последовательность гена Si Последовательности нуклеотидов ДНК HBV в клонах НС22 и НС217 идентичны, за исключением замены А С в положении 88. Интегрированная ДНК HBV в клоне НС102 включает последовательность от 2398 нуклеотида до сайта EcoRI, содержащую промоторы гена S (Qu et al., 1985; Siddiqul et al., 1986) и участок связывания ядерного фактора I клетки (Shaul et al., 1986) (рис.3, 6). При этом нукпеотилы 2684 - 2867 образуют прямой повтор, перекрывающийся с лелепиен в положении 2880 - 29 77. Аналогичные перестановки внутри рирусного генома описаны также Ziemer et а]. (1985) для клоча 8. Более того, последовательность нуклеотидов в участках образования дупликации и делеции в районе интеграции в клонах FC102 и Ь совпадает. Такое совпадение нуклеотидных последовательностей улонсь, полученных независимо в разных лабораториях, является прямым доказательством стабильности интегрированной ДНК в геноме линии PIC/FPF/5. Исходя из этого, мы можем предположить, что описанные нами перестановки вирусного генома могли произойти при интеграции ЛНК HBV з клеточный геном или в результате постинтеграционных рекомбинаций в процессе неопластической трансформации клетки и не л?-яктгя следствием длительного пассирования линии PLC/PFF/5 или экспериментов по клонированию.

3.2. Анализ последовательности гена S iPPsAg , интегрированного в геном PLC/PRF/5. Ген S, кодирующий глэвиь'н структурой полипептид HBsAg, содержащий основные антигенные детерминанты HBV, является наиболее консервативной областью геном? ЧЪ7 (Fujiyama et al., 1983; Okamoto et al., 1986). Его последовательность пред-

2 2Э асЫ2 асЫ ас! г 1

ауи

ауыЗ

ауг

223

асЫ

ас!г1

ас!г

аум

ауиЗ

а\-г

22Э

аак

ас!г1

ас!г

ау у/

ауыЗ

ауг

- 14 -

1|Г5СР1СРЬЬУЬдАСРР^ТЯ11Л'1Рд51,05Кт,51Л(РЬСС5

уиг

Ё V

т

т

I

Г

т

СЬС 50

(}мз(ззртзмнзртзсре

СРСУЮгаСЬКЯРПРЬРИисириУЫЛЯ 100

V и г гбы

у г

dw уу

dw

(^ИРУСР!

ре

зт

ПЭТвРС

гст

рас^С

РЭСССТКР

ОСМСТС! 150

2 2Б

а(5г 1 ас!г ауьг а у к 3 а\'г

ргрэгичр

л к

А А А А А А А

крзкьзььуррудитусьзртукьзуттку 2 оо

А А

223 а а IV 2 аЛк а<3г 1 ас!г ауу ауыЗ ауг

КСР.Ч'ЬУМИЗРР

РЫР1РРСЬК\'У1

Рис.7. Последовательность аминокислот НВзАд-223, кодируемая интегрированным в геном РЬС/РВЕ/5 генсм Б (рис.3,4). Для сравнения приведена замены аминокислот в последовательности НВгАд субтипов аЛ/2 (\7а1епгие1а ей а1.,1980), аеЗи (Ою ей а1. ,1983), асЗг. (Опо ей а1.,1983), а<3г (Сап ей а1.,1984), ayw (В1сЬко ей а1., 1985), а^, (СаХДэегй ей а1.,1979), ауг (Окатойо ей а1.,1986). Положения аминокислот, формфукших антигенные детерминанты НВБАд, обозначены прямоугольникам, вверху которых указаны вариации соответствукщих антигенных детерминант.

Б

Р

Г

I

т

Б

ставлена полностью в клоне НС22 (рис.3, 4) и частично - в клоне НС217 (рис.3, 5). При этом нуклеотидные последовательности гена S в клонах НС22 и НС217 идентичны. Последовательность HBsAg, кодируемая геном S, интегрированным в геном PLC/PRF/5, была обозначена 22S (рис.7). Сравнительный анализ аминокислотной последовательности 22S показал, что данный вариант HBsAa (гена S) отличается от всех известных в литературе последовательностей HBsAg разных субтипов. Как видно из рис.7, в последовательности 22S аминокислоты в положениях, формирующих антигенные детерминанты, соответствуют субтипу adw. Однако, при этом 22S отличается от субтипа adw - по 5 положениям аминокислот и от субтипа adwj - по 6. Распределение замен аминокислот в последовательности 22S соответствует общему правилу, определяющему последовательность аминокислот HBsAg всех известных субтипов (Норр and Woods, 1981). А именно, гидрофобный N-конец HBsAg консервативен и почти не содержит замен, в то время как антигенные различия определяются вариабельностью аминокислотных остатков в участках высокой локальной гидро-фильности (положения 32-74 и 110-168), а также в гидрофобном С-конце. Таким образом, наблюдаемая дивергенция между последовательностями adw и 22S, по-видимому, отражает генетическую гетерогенность данного субтипа и не является следствием спонтанных мутаций в результате селективного давления клетки на интегрированные вирусные последовательности.

Последовательности аминокислот минорных полипептндоз HBsAg, кодируемые участками npeS^ и npeSj, интегрированными в клонах НС102 (рис.6) и НС22 (рис^Б), соответственно, также обнаруживают наибольшую гомологию с субтипом adw. Таким образом, все три независимо клонированных нами фрагмента генома PLC/PRF/5 содержат интегрированные последовательности HBV, субтипа adw.

3,3. Анализ синонимических мутаций в интегрированных последовательностях ДНК HBV. Анализ синонимических замен нуклеотидов (не приводящих к заменам аминокислот) был проведен нами с целью выявить влияние клеточных мутаций на интегрированные в геном PLC/PRF/5 последовательности ДНК HBV. В геноме HBV наибольшее количество синонимических мутаций локализовано в неперекрывающихся участках генов HBV, то есть в последовательности, кодирующей Фазу трансляции только одного из генов (Mandart et al., 1984; Bichko et al=, 1985). Такие области генома HBV, соответствующие участкам

Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val Pro Ile Phe Asn Pro Glu Trp

НС102 ATT CCT TGG ACT CAT AAG GTG GGA AAT TTT ACT GGG CTT TAT ТСС TCT ACT GTC CCT АТС TTT AAT CCT GAA TGG 31S

ayw G С T A G £ I 2530

Val His

Gin Thr Pro Ser Phe Pro Lys Ile His Leu His Glu Aap Ile Ile Asn Arq Cys Gin Gin Phe Val Gly Pro Leu

НС102 CAA ACG CCT TCC TTT CCT AAA АТС CAT TTA CAC GAG GAC ATT ATT AAT AGG TGT CAG CAA TTT GTA GGC CCT CTC 393

ayw A А A T T A С А С A AA G A G A 2605

Lys Asn Gin Lys Lys Glu

Thr Val Asn Glu Lys Arg Thr Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Ser Thr Lys Tyr Leu Pro

НС102 ACT GTA AAT GAA AAG AGA АСА TTA AAA TTA ATT AT G CCT GCT AGA TTT TAT CCT AAC AGC ACT AAA TAT TTG CCT 468

ayw A T G A G G С G С G A G GTT С A A 2680

Arg Gin Lys Val

Leu Asp Asn Gly Ile Lys Pro Tyr Туг Pro Asp Gin Val Val Asn His Tyr Phe Gin Thr Arg His Tyr Leu His 5<t3

HC 102 СТА GAC AAC GGG ATT AAA CCG TAT TAT CCT GAT CAA GTA GTT AAT CAT TAC TTC CAG АС С CGA CAT TAT TTA CAT

ayw T G T G T T A A T A T A С С 2755

Lys Glu His

Thr Leu Trp I.ys Ala Gly Ile Leu Туг Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser

HC102 ACT CTT TGG AAG GCT GGG ATT СТА TAT AAG AGG GAA ACT АСА CGT AGC GCC TCA TTT TGC GGG TCA CCA TAT TCT 618

ayw

A T 2830

His

Trp Glu Gin Glu Leu His

НС 102 TGG GAA CAA GAG СТА CAT 636

ayw T G 2848

Asp Gin

Рис„8. Анализ синонимических замен нуклеотидов в последовательности гена Р, интегрированной в клоне НС102 (рис.б).

Указаны замзны нуклеотидов в соответствукией последовательности генсма HBV субтипа ayw (Galibert et al., 1979). Замены нуклеотидов, приводящие к заменам аминокислот подчеркнуты.

А

А

фазы трансляции гена Р (ген ДНК-полимеразы НВУ), входят в состав интегрированной ДНК НВУ в клонах НС22 (положения нуклеотидов 8371373; рис.4) и НС102 положения нуклеотидов(244-636; рис.6). Известно, что в последовательности, кодирующей биологически важную функцию, доля синонимических замен нуклеотидов от общего числа мутаций превышает 50 % в отличие от 20 % при случайном распределении (Иванова и др., 1986). Доля синонимических мутаций в проанализированных нами участках гена Р, интегрированных в клонированных нами фрагментах составляет около 70 % (рис.8), что характерно также для аналогичных последовательностей геномов НВУ, клонированных из нативных вирионов всех известных субтипов (КосЗата et а1., 1985 ; В1сЬко et а1 ., 1 985). Таким образом, в клетках РЬС/РИР/5, по-видимому, достаточно низкий уровень клеточных мутаций, вследствие чего отсутствует селективное давление на интегрированные в геном РЬС/РКЕ/5 последовательности ДНК НВУ.

3.4. Последовательности генома РЬС/РР.Е/5, фланкирующие интегрированную ДНК НВУ. Нам не удалось проклонировать фрагменты генома РЬС/РКЕ/5 с интактным сайтом ЕсоМ внутри последовательности НВУ, как можно было предполагать, исходя из частичного гидролиза ДНК РЬС/РРЕ/5 при конструировании библиотеки генов. Как следствие этого в двух клонах, НС22 и ВС102, фланкирующие участки клеточного генома представлены только с одной стороны от интегрированной ДНК НВУ (рис.2). Фланкирующие клеточные последовательности из разных клонов не обнаруживают между собой какой-либо гомологии. Они также не содержат прямых или инвертированных повторов в участках стыка вирусной и клеточной ДНК, характерных для интеграции ретровирусов (Уагтиэ, 1983; РапаагЛЬап, 1985). Мы провели поиск гомологичных последовательностей между ДНК НВУ и фланкирующими участками клеточного генома (табл.1). Клеточные последовательности в клоне НС22 содержат участок в 13 нуклеотидов , ТСССТСАСТТТАС , строго гомологичный последовательности НВУ. Этот участок входит в состав дуплицированного С-конца гена Е е клоне НС22 (рис.3, 4) и поэтому представлен дважды в интегрированной вирусной последовательности. Можно предположить, что такие гомологичные последовательности могут способствовать процессу рекомбинации, ориентируя ДНК в определенном направлении. В остальных случаях (табл.1) гомология была не строгой и не превышала 6-8 нуклеотидов, что отвечает случайному распределению.

Таблица 1. Фланкирующие последовательности генома человека (HUMAN), гомологичные интегрированной ДНК HBV

Клон Последовательность Локализация Расстояние от сайта

,с, в геноме НВ\Г § интеграции (п.н.) х

hbv human

нс22 tggctcagtttac "" aagaJatgggg g 670 852 - 682 - 862 979 147 707 54 54 173

нс 102 agatciacatc "" g 2845 - 2855 447 731 CD CO

at^aaftagttaat "" g g 2718 - 2731 320 504 138 138

нс217 gttat£gctg£at g g 368 - 380 310 78

gcigc^ttttatiata g g с 387 - 402 329 72

§ - положения нуклеотидов указаны в соответствии с субтипом adw- (Valenzuela et al., 1980);

х - указано положение 1-го нуклеотида приводимой последовательности; "" - последовательность, присутствующая в составе дуплицировэнного участка интегрированной ДНК НВУ; + - замены нуклеотидов (нуклеотида, соответствующие ДНК НВУ, приведены внизу)

В клоне НС217 Фланкирующие участки клеточной ДНК представлены АТ-богатыми, высокоповторяющимися последовательностями, потенциально способными образовать шпилечные структуры с совершенным стеблем, длиной до 30 нуклеотидов (обозначены стрелками (1), (2), (3) на рис.5). Последовательность из 10 нуклеотидов ААТААААТАТ в клоне НС217 присутствует с обеих сторон от интегрированной ДНК HBV (выделена прямоугольниками на рис.5). В клоне НС217 обращает на себя внимание симметричное расположение сайтов рестриктаз EcoRI, SalGI, Hindlll, Pstl (рис.2). Мы частично просеквенировали участки ДНК клона НС217, прилегающие к сайтам этих рестриктаз (рис.9). При этом симметрично расположенные нуклеотидные последовательности, секвенированные нами в противоположных направлениях, оказались идентичными. Данное обстоятельство указывает на присутствие в клоне НС217 совершенного инвертированного повтора клеточной ДНК (обозначен стрелками на рис.2). Гетеродуплексный анализ клона НС217 (рис.10) позволил оценить общую длину этого повтора, составляющую около 3,5 тап.н. Нуклеотидная последовательность НС217 SalGI-Pstl образована из 3-х пар нуклеотидов, что характерно для сателлитной ДНК (Тарантул и др., 1982).

Нами был проведен также поиск гомологичных участков между определенными нами нуклеотидными последовательностями генома PLC/PRF/5, фланкирующими интегрированную ДНК HBV, и последовательностями геномов млекопитающих и вирусов, содержащихся в Банке последовательностей Heidelberg-8. Данная работа была проведена совместно с сотрудниками' Научно-исследовательского вычислительного центра в г.Пущино А.С.Кондрашовым и Л.А.Писаковой. Были использованы программы Дарвин (быстрый поиск гомологичных последовательностей) и Линнеус (выравнивание гомологичных участков). Однако какой-либо существенной гомологии найдено не было.

Исходя из наших данных, а также по сообщению Ziemer et al.(1985) в геноме HBV отсутствуют преимущественные участки интеграции или рекомбинации. Таким образом, у нас есть основания предполагать неспецифичный механизм интеграции ДНК HBV в геном клетки, аналогично аденовирусам и SV40 (Doerfler, 1982; Тихоненко, 1986). В то же время рядом авторов в тканях гепатокарциномы сайты интеграции ДНК HBV были локализованы в участках концевых повторов вирусного генома (Dejean et al.,1986;Hino et al.,1986).Это дало повод предположить специфичную интеграцию ДНК HBV в клеточный геном посредством прямых повторов.

НС217 EcoRI-Hindlll

1 CAATTTTCCT GCTAACATAT TCATAATTCA GTAATAAACC ATTCGTAAAA 50 5I AAATAAACTT GTAAAATATG ATACCTGCTA ACTGAAAGTG TAATCATGTA 100 101 ATCACAGCAT ATTAATGACT TAGAATGACA CTAAAACAAC CTTTCTAAAA 150 151 CTGTACCAGC ATATCTACTA GTTATTCCGG CAGGCTTAAA TGATTTCTTA 200

201 AGAAAAATTT TATGAATTGA AATGTTTAGT CACATTTTAT CAT 243

HC217 SalGI-EcoRI

I CACGGTGCTA ATATAAAAAC CACGCAGGTA ACAGTGCTGC CTGTTTTCAT 50

5 1 GCTACTTACC TGGAAAAACA GTCTAAAACC TGGTAGGGAT TGGTCATTTC 100

101 CTTTTGAGGA TGGGAGAACA GTAGGGTATA TTTTGTGGAG AAATAAAATG 150

151 GGCTAGTTTT CAAGTCTGCT GATACATACA GTGCCTAAGC ATAGCCTCTA 200

201 TATTTAC 207

HC217 SalGI-Pstl

1 TTTCCTTAAT AACTCAAATA TTTTTCATAT ATTCATATAT TTCAAATATT 50

5 1 TTTCATATAT TCATATATTT СAAATATATT TCATATATTC ATATATTTCA 100

101 AATATTCATA TATTCATATA TTCATATATT TCTCATATAT CATATATTTT 150

15 1 TCGTATATTC ATATATTATA TACTCATATA TTCAATCATT ACACTCGTTA 200

201 А 201

HC217 Hindlll-Pstl

1 TGTGAGTTCA TTTTCTTACA ACCTATTATA ATTCAGCCAG ATATGCTGTT 50

51 TCCTTACTTT TGCATTTAAA CTACTAGTTT AATTTTTCTA AATTGAAGAC 100

101 AAATGTGCTA TTTTAAATGC GCAAATGAAA CTGTTAGCCT TCAGCCAAAA 150

151 TTCTC 155

Рис.9. Последовательность нуклеотидов участков клеточной ДНК в клоне НС217 (рис.2), щэилеганших к сайтам реслриктаз EcoRI, SalGI, Hindill, Pstl и входящих в состав инвертированного повтора генома PLC/PRF/5 (обозначен стрелками на карте НС217 на рис.2)с

Рис.10. Электронная микрофотография (выполнена научным

сотрудником Института вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР А.С.Маховым) и рисунок гетеродуп-лекса, полученного при отжиге самой на себя ДНК клона НС217. Жирной чертой на рисунке выделен ДЕуцепочечный участок, соответствующий инвертированному повтору ДНК клетки (обозначен стрелками на карте НС217 на рис.2), одноцепочечная петля содержит интегрированную ДНК НВУ вместе с фланкирующими клеточными последовательностями (рис. 2) .

аналогично ЬТИ ретровирусов. Однако интегрированная по концевым повторам полноразмерная копия генома НВУ была найдена только в одном случае (Нд.по ей а1. , 1986). Можно допустить, что первичный акт интеграции ДНК НВУ в клеточный геном происходит с участием концевых повторов генома НВУ, а затем, в результате рекомбинаци-онных процессов распределение и структура интегрированных вирусных последовательностей может измениться. Существует также гипотеза, согласно которой интеграция ДНК НВУ в геном клетки происходит преимущественно в одноцепочечном участке вирусного генома (КоэЬу ей а1. , 1983; КосЬ ей а1., 1984; Уад1пиша ей а1. , 1985). Предложенная модель постулирует переход эндогенной ДНК-полимеразы НВУ на клеточную матрицу в участках неспецифических ников в процессе застройки одноцепочечного района вирусного генома и, как следствие этого, - интеграцию ДНК НВУ в геном клетки. Таким образом, ь настоящий момент не существует единой точки зрения на механизм интеграции ДНК НВУ в клеточный геном. Возможно, что в данном случае имеет место как специфичная, так и неспецифичная интеграция. Следует также учитывать, что между инфекцией НВУ и развитием гепатокарциномы временной интервал составляет, как правило, 15-40 лет (МэМока, 1986), поэтому определить первичные сайты интеграции как вирусной, так и клеточной ДНК представляется чрезвычайно сложным.

ВЫВОДЫ

1. На основе фагового вектора Харон 4А сконструирована библиотека генов линии гепатоцеллюлярной карциномы человека РЬС/РКР/5. В данной библиотеке любая уникальная последовательность генома РЬС/Р1*Р/5 (генома человека) размером в 15 т.п.н. присутствует с вероятностью 90 %.

2. Из библиотеки РЬС/РКГ/5 проклонировано 3 фрагмента генома РЬС/РИР/5, содержащих интегрированные последовательности ДНК НВУ -клоны НС217, НС102, НС22. В полученных клонах определена попная нуклеотидная последовательность интегрированной ДНК НВУ, включающей также ген Б, и фланкирующих участков клеточного генома на расстоянии 200-300 нуклеотидов от сайтов интеграции.

3. Ни один из проанализированных нами клонов (НС217, НС102, НС22) не содержит полного генома НВУ. Интегрированные последова-

тельности ДНК HBV фрагментированы и содержат перестановки (дупликации, делеции). Анализ нуклеотидной последовательности показал, что интегрированные в геном PLC/PRF/5 последовательности ДНК HBV стабильно сохраняются в продолжение длительного пассирования линии PLC/PRF/5. Наблюдаемые нами перестройки вирусного генома могли произойти при интеграции ДНК HBV в клеточный геном или в результате постинтеграционных рекомбинаций в процессе неопластической трансформации клетки.

4. Последовательность гена S, интегрированного в геном PLC/PRF/5, представляет собой один из вариантов субтипа adw. Кодируемая ею последовательность HBsAg отличается от субтипа advi по 5 (6) положениям аминокислотных остатков, что, по-видимому, отражает генетическую гетерогенность внутри субтипа.

5; На основании собственных исследований и данных литературы обсуждается механизм интеграции ДНК вируса гепатита В в геном клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ривкина М.Б., Народицкий Б.С., Кукайн P.A., Тихоненко Т.И. Клонирование и рестрикционный анализ последовательностей ДНК вируса гепатита В, интегрированных в геном клеток линии PLC/PRF/5. // ДАН СССР. - 1983. - Т.269, № 6. - С.1505-1509. Ривкина М.Б., Скрипкин Е.А., Худяков ¡O.E. Клонирование и анализ первичной структуры фрагментов клеточного генома, содержащих интегрированные последовательности ДНК вируса гепатита В. // Вирусы человека и животных. Тезисы докладов конференции молодых ученых. - Рига. - 1984. - С.49.

3. Ривкина М. Б. , Кукайн P.A. Анализ последовательностей ДНК вируса гепатита В, интегрированных в клеточный геном. // Проблемы современной биохимии и биотехнологии. Тезисы докладов 8-го Объединенного симпозиума биохимических обществ СССР-ГДР. - Рига. -

1985. - С.192,

4. Ривкина М.Б., Лунин В.Г., Кукайн P.A., Тихоненко Т.И. Нуклеотид-ная последовательность фрагментов генома Еируса гепатита В (HBV), интегрированных в ДНК клеток линии PLC/PRF/5. // ДАН СССР. -

1986. - Т.288, № 2. - С.503-506.

5. Ривкина М.Б. Анализ интегрированных последовательностей генома вируса гепатита В и фланкирующих участков клеточной ДНК в линии РЬС/РЕГ/5с // Современные проблемы медицинской вирусологии. Тезисы докладов конференции молодых ученых. - Рига. - 1987. - С.54.

6. Ривкина М.Б. Последовательности клеточного генома линии РЬС/РИГ/5, фланкирующие интегрированную ДНК вируса гепатита В.// Синтез и исследование биологически активных соединений. Тезисы докладов 9-й конференции молодых ученых. - Рига. - 1987. - С.64.

Подписано в печать 25.03.88. ЯТ 05227. Тираж 100 экз. Зак. № 204. Отпечатано на ротапринте Экспериментального завода Института органического синтеза Академии наук Латвийской ССР,

226065 Рига, ул. Крустпилс, 53.