Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интеграция генома вируса гепатита В в ДНК клеток нейробластом человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Интеграция генома вируса гепатита В в ДНК клеток нейробластом человека"

^ . российская академия наук

Л ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ии. В.А. ЗНГЕЛЬГАРДТА 1 V" \ " I

На правах рукописи УЖ 577.21:576.5

ТАГИЕВА Наиля Эдуардовна

ИНТЕГРАЦИЯ ГЕНОМА ВИРУСА ГЕПАТИТА В В ДНК КЛЕТОК НЕИРОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА.

Специальность 03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

/

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онко'генеза Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель: член-корр. РАН, доктор биологических

наук,профессор Л.Л. КИСЕЛЕВ Официальные оппоненты: доктор биологических наук С.М. ЛЕЕВ

доктор биологических наук О.О. ФАВОРОВА

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. ЛОМОНОСОВА, биологическим факультет

з Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117964, Москва В-334, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Зашита диссертации состоится _ _„_ 1993 г.

■/У

в /' часов на заседании специализированного Совета Д 002.79.01

Автореферат разослан

3/ ..

1993 Т.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Известно, что РНК- у. ДНК-содераэдие вирусы играют существенную роль в развитии некоторых новообразований «ловека. ДНК-содержаший вирус гепатита В относится к группе зирусов, для которых доказана причинно-следственная связь иеаау инфекцией и возникновением опухоли. Среди носителей ЯВУ в 200 раз чаще встречаются случаи первичного рака печени, чем среди незараженных людей. При исследовании печени больных гепатоцеллюлярнои карциномой (НСС) во многих случаях обнаружены интегрированные копии генома HBV в ДНК гепатоштов.

До недавнего времени"изучение онкогенных свойств HBY ограничивалось опухолями печени. Однако, исследование различных типов клеток и тканей больных гепатитом В показало, что HBV способен проникать не только в клетки печени. Успехи последних лет б исследовании интегрированных копий HBV и окружающих их последовательностей клеточной ДНК показали, что интеграция может сопровождаться перестройками ДНК клетки хозяина.

Способность ЛНК НВУ встраиваться в клеточную ДНК установлена для генеративных клеток человека, кроме того интегрированные копии вирусного генома выявлены в эмбриональных опухолях 1неиро- и нефробластомах). Серологический анализ сыворотки крови детей с эмбриональными опухолями на присутствие вирусных антигенов и антител к ним

установил, что среди детей с эмбриональными опухоля уровень зараженности HBV значительно превышает, средний, носители составляет 26,5". Возникновение эмбриональн опухолей связывают с генетическим нарушениями определенн локусов хромосом. Например, развитие нефробластомь; ¡опухо Вилмса) часто связано с делеиией в локусе хромосомы 11, ретинобластомы - с мутацией в локусе RBI хромосомы 13. Одн из возможных причин таких нарушении может бытъ внедрение локус или вблизи него вирусной ДНК, или ее фрагментов (хс подобных данных пока нет).

Цель работы.

Основной целью настоящей работы была молекуляръ биологическая характеристика интегрированного генома виру гепатита В в клетки нейробластомы человека и исследовав возможной роли интеграции вирусного генома в развит молекулярно-генетических патологий человека, в частности, развитии новообразований. Кроме того, необходимо бь получить молекулярно-биологическую характеристику клеточь IHK, участка интеграции ДНК вируса гепатита В в ДНК клет непеченочной ткани. В качестве экспериментальной модели бь выбрана нейробластома, в ДНК которой ранее была показа интеграция ДНК HBV. Экспериментальные задачи исследова* заключались в следующем:

- получение и скрининг геномной библиотеки из 1 нейробластомы;

- физическое картирование фрагмента ДНК неиробластомь участке интеграции;

- характеристика интегрированного генома ви?

/

гепатита В;

- клонирование фрагментов ДНК неиробластомы и получение нуклеотидной последовательности клеточной ДНК и ДНК HBY;

- компьютерный анализ интегрированного вирусного генома и фланкирующей клеточной последовательности.

Научная новизна работы.

Молекулярно-биологические v. клинико-морфологические исследования последнего десятилетия свидетельствуют о том, что инфицирование HBV может обусловливать, патологию не только печени, но и ряда других органов и' тканей. Методом молекулярной гибридизации показана интеграция ДНК HBV в ДНК клеток эмбриональных опухолей. Однако, в литературе до сих пор нет примера исследования интегрированного генома вируса гепатита В в клетках эмбриональных опухолей. В настоящей работе дана характеристика интегрированному геному HBV в ДНК клеток неиробластомы. Проведен анализ фланкирующеи клеточной нуклеотидной последовательноти.

Научно-практическое значение работы.

Полученные результаты позволяют более точно оценить роль вируса гепатита В в возникновении различных патология человека, в том числе и наследственного характера. Применение чувствительных методов исследования (полимеразная цепная реакция, молекулярная гибридизация) позволяет зыязлятъ ДНК вируса гепатита В в целях пренатальной диагностики и для прогностических целей...

Апробация работы.

Отдельные части работы докладывались на XYIII

Международной конференции "European, tumor virus group"

i

¡Стокгольм, 1969), Первой Всесоюзной конференции "Ген( человека" (Переславль-Залесский, 1990с.), на конкур! научных работ Института молекулярной биологии РАН в 1990г на LXII Сессии общего собрания Академии медицинских на СССР ¡Москва, 1991г. ).

По материалам диссертации подготовлены и находятся печати 2 статьи.

Структура и обьем диссертации.

Диссертация изложена на страницах машинописно текста, включая 13 рисунков. Состоит из введения, обзо литературы, экспериментальной части, результатов и »обсуждения,, заключения, выводов и . списка цитируем литературы, включающего 129 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы-и методы.

ДНК из замороженных тканей человека выделяли по мете Вlin et al.. (19Т6) с некоторыми модификациями; геномк библиотека получена в бактериофаге \SK22 ¡Zabarovsky Winberg, 1992). Все манипуляции с ДНК проводили соответствии с протоколами, приведенными в руководст (Маниатис и др., 1986!. Скрининг геномной библиотс методом гибридизации осуществляли по практическс руководству "cDNA cloning system - XgtlO" (Affiersham. 196$ с помошью полимеразноя цепной "реакции скрининг проводи как описано Innls et al.(1990). Клонирование фрагмен-геномной ДНК в плазмидном векторе pUC19 осуществляли

/

е -

соответствии с методиками, описанными в руководстве "Клонирование ДНК" (Гловер, 1966). Радиоактивно-меченные гибридизационные зонды получали методом ник-трансляции (Rlgby et al., 1977) и с использованием статистической олигонуклеотидной затравки (Feinberget al., 196?Перенос ЛНК с агарозных гелей на нитроцеллюлоэные фильтры и молекулярную гибридизацию осуществляли, как описано Southern (1975). Компьютерный анализ полученных результатов проводили в банках данных EMBL с помощью программ GENEBEE и PC GENE.

Результаты н их обсуждение.

Ранее было показано, что среди пациентов онкологических больниц, в том числе среди детей с эмбриональными опухолями частота заболевания гепатитом В выше нормы. Кроме того, при исследовании ДНК из эмбриональных опухолей методом блот-гибридизации с меченой ДНК рекомбинантной плазмиды рНВ320 IПумпен и др., 1961), содержащей полный геном HBV, показана интеграция ДНК HBV в клеточную ДНК (Haumova & Kisselev, 1990 1. Для продолжения исследовании в этом направлении необходимо было клонировать ДНК из эмбриональных опухолей, выделить фрагмент, содержащий интегрированную ДНК HBV, дать молекулярно-биологическую характеристику интегрированному вирусному геному и участку клеточной ДНК, куда произошла интеграция. В качестве обьекта исследований была выбрана неяробластома, в ДНК клеток которой была показана интеграция ДНК HBV.

1. Геномная библиотека и ее скрининг.

Из ДНК нейробластомы, содержащей интегрированную ДН1 HBV, гмдролизованной рестрикционной эидонуклеазои Есой полумена геномная библиотека в фаговом векторе ASK22 i титром фага 7,5х109 б.о.е. После скрининга гнбркдизационны! методом с меченой г Р] ДНК рНЕ320 рекомбинантных клоно1 (всего проанализировали 1,7x10® клонов) отобрали 6 клонов интенсивно гибридизуюшмхся с ДНК HBV . Скрининг этих клонгл продолжили методом полимеразной цепной реакции. Полимеразну» цепную реакцию проводили с использованием праймеров нг вирусные гены S, С, X (рис.1). Праямеры на ген i ограничивают последовательность гена S вируса гепатита I размером 300 н. Как видно из рис. 1, в результате проведение ПЦР с праимерами на ген S в двух случаях (дорожки 7 и 10: образуется фрагмент размером 300 н. Этим дорожка* соответствуют клоны 37.2 и 31, соответственно. Следовательно, эти клоны содержат вирусную ДНК. ' Клон ЗЕ (дорожа 9) дает неспеиифические фрагменты, в остальные клонах фрагмент отсутствует. Подобные результаты получили при использовании праймеров на вирусный ген X. В результате проведения реакции амплификации с праямероми на ген С вируса гепатита В все клоны были отрицательны. Поэтому мы сделали предположение, что часть вирусного генома, соответствующая области гена С частично или полностью утрачена при интеграции.

После проведения скрининга рекомбинантных бактериофагов с помощью ПНР мы отобрали два клона, содержащих ДНК HBV (клоны 37.2 и 31 ). Эти клоны были проанализированы методом

/ 2 5 А 5 6 7 S 9 10 12

Qizn.H

Рис. 1. Результат злектрофоретического разделения фрагментов, юлученных после проведения полимеразнои цепной реакции с 1раимерами на ген S вируса гепатита В.

1 - ДНК неироСластомы, содержащая ДНК HBV; 2 - фрагменты ДНК tara X, полученные в результате гидролиза Hindi11 ; 3 отрицательный контроль; 4 - положительный контроль с плазмидои РК3320;

5, 6, 7, 8, 9, 10, И, 12 - клоны 37.4, 37.3, 37.2, 37,1, 36, 31, 25, 23, соответственно.

12 3

Рис. 2 . Результаты

■(¿та*

<tr/Ht

4 т.пм.

блот-гибридизации с меченой ДНК НВУ ДНК рекомбинантного клона 37, содержащего фрагмент ДНК нейробластомы с

интегрированной ДНК НВУ. 1,2, 3 - гидролиз ЕсоЕ1,Х1ю1,Иог1, соответственно.

гибридизации на чашках Петри и затем мы провели рестрикционный анализ и блот-гибридизацию ДНК этих рекомбинантных бактериофагов с меченой ДНК HBV (рис. 2). Рестрикционный анализ проводили ферментами EcoRI, Notl, X'hol. Участки узнавания рестриктаз EcoRI и Notl находятся ь полилинкере бактериофага Л5К22, рестриктаза Xhol характерна для геномов некоторых подтипов вируса гепатита В. При гидролизе EcoRI и Notl образуется фрагмент ДНК размером около 6 т.п.н., который гибридизуется с ДНК HBV (рис. 2, дорожки 1 и 3, соответственно). В результате гидролиза Xhol (дорожка 2! образуются фрагменты ДНК размером около 4 ^т.п.н., 1,6 т.п.н. и 1,5 т.п.н., гибридизуюшиеся с ДНК HBV. Таким образом, рекомбинантный клон 37 (МЬНерВЗТ), действительно' содержит фрагмент ДНК нейробластомы размером около & т.п.н. с интегрированной последовательностью ДНК HBY.

2. Получение рестрикционноп карты фрагмента. ДНК нейробластомы, содержащего интегрированные копии генома HBV

Для молекулярно-биологической характеристи

интегрированных копий вирусного генома и участка интеграц клеточной ДНК на первом этапе необходимо было получи рестрикционную карту фрагмента ДНК из нейробластомы интегрированной ДНК HBV. Для этого ДНК рекомбинантно бактериофага \SK22, содержащего фрагмент ДНК нейробласто гидролизовали рестриктазой EcoRI. После фракционирования агароэном геле элюировали фрагмент длиной Ö т.п.н. и прове его. гидролиз различными рестриктазами, характерными д

к н

в нх в III!

В НХР

' II!

«■■■■и вирусная ДНК

гппишчит клеточная ДНК

Н-ЕеоШ В-ВатШ

Р-Рг« Н-ХЬо! Х-ХЪа!

««=> область ДНК,

обогащенная повторами

фрагмент ДНК размерен 3 т.п.н.,

содержащий вирусную ДНК фрагмент ДНК размером 1.7 т.п.н., содержащий фланкирующую клеточную последовательность

с

Рис. 3. Физическая карта фрагмента ДНК нейробластомы размером 3 т.п.н. (МЪНерВ37 ), содержащего ДНК НВУ.

Локализация вирусной ДНК получена в результате проведения гибридизационного анализа гидролизованных фрагментов с меченой ДНК НВУ; локализация вьсокоповторяющейся последовательности клеточной ДНК является результатом гибридизации с меченой тотальной ДНК человека.

геномов разных подтипов вируса. На основании величин фрагментов ДНК, образующихся в результате гидролиза Pstl, ВагоНI, Xbal, Xhol и их комбинации была построена рестрикционная карта участка ДНК нейробластомы человека с интегрированным вирусным геномом представленная на рис. 3.

3. Локализация ДНК HBV на фрагменте ДНК нейробластомы.

Для того, чтобы локализовать ДНК вируса HBV на рестрикционной карте фрагмента ДНК нейробластомы человека, мы провели гибридизационныи анализ гидролизованных фрагментов с меченой ДНК вируса HBV. В качестве меченого зонда использовали плазмиду рНВ 320, содержащую полноразмерный вирусный геном. Результаты гибридизационного анализа представлены на рисунке 4. В результате гибридизации видно, что дорожка 1, содержащая продукт расщепления рестриктазоя Pstl, имеет одну полосу гибридизации размером 3,1 т.п.н., содержащую всю интегрированную ДНК HBV. Отсюда можно сделать вывод, что ДНК вируса HBV в нашем случае не содержит сайта для рестрикционной эндонуклеазы Pstl. При гидролизе ДНК рестриктазами BatcHI и Xhol с меченой пробой гибридизуются несколько фрагментов, следовательно, сайты этих рестриктаз содержатся в интегрированной ДНК вируса HBV. Сопоставляя длины этих гибридизуюшихся фрагментов и учитывая, что интегрированная вирусная ДНК не содержит сайта для рестриктазы Pstl, мы локализовали ДНК вируса на рестрикционной карте фрагмента ДНК нейробластомы человека fрис.3). Таким образом, выявили фрагмент ДНК размером около 3 т.п.н., содержащий весь, фрагмент интегрированной вирусной

4 2.

3

Зт.пм. —

Рис. 4. Результаты блот-гибридизации ДНК неяробластомы с меченой 32Р ДНК НВУ.

1, 2, 3 - фрагменты ДНК неяробластомы, полученные в результате гидролиза Рвг1, ВатНГ, ХЪо1, соответственно'.

ДНК.

Исходя из полученных данных, можно также сказать, что интегрированный вирус относится к подтипам ayw , adyw, или к adr, ДНК которых не содержит участка PstI и содержит Xhol, BaoHI, Xbal участки.

4. Рестрикционная карта фрагмента ДНК размером 3 т.п.н., содержащего ДНК HBV.

Для изучения структуры интегрированной вирусной ДНК и фланкирующих последовательностей человека была получена рестрикционная карта фрагмента, полученного в результате гидролиза PstI исходного фрагмента ДНК нейробластомы, содержащего ДНК HBV, клонированного в плазмидном векторе pUC19. Для этого провели гидролиз следующими рестрмктазами: PstI, BamHI, Avail, Xhol, Xball, HincII, Bglll . Ha основании величин гидролизовакных фрагментов и их комбинации получили рестрикционную карту (рис.5). Сравнивая полученную нами физическую карту интегрированной ДНК HBV с картами геномов подтипов вируса гепатита В, мы определили, что интегрированный вирус относится к подтипу adyw.

5. Анализ нуклеотидной последовательности Фрагмента клеточной ДНК, содержащего ДНК HBV.

Нуклеотидная последовательность фрагмента размером 3 т.п.н., клонированного в pUCIS, установлена методом Сенгера с помощью автоматического секвенатора Applied Biosystems. Компьютерный анализ первичной структуры фрагмента показал, что вирусной геном в целом не, фрагментирован, однако делетирована область генома размером около 460 н.,

А V РА О

AHLJ

N V Н X V В

АХ

В V N НАР

Б

AUG

ГенС

AUG

Область npeSfreHS

=U>

ГенХ Область яреС+генС

Р- Pstl A- Alul V- Avo)) G— Bglll

В- Bam HI H- Xhol X- Xbal N- Hindi

ГенХ . ——Г>

ОбластьP

1 т.гг.н.

клеточная ДНК вирусная ДНК

Рис. 5. Физическая карта фрагмента ДНК неяробластомы, содержащего интегрированную ДНК HBV.

А. Интегрированнная часть вирусного генома. С, s, X и Р - гены вируса гепатита В. Обозначения рестриктаз, использованных для картирования приведены на рисунке. AUG - инициирующий кодон трансляции. Б. Область делеиии вирусного генома.

в

N

примыкающая к прямым концевым повторам ДНК НВУ. В участке соединения вирусной и" клеточной ДНК (с обеих сторон) находится повторение вирусной последовательности, непосредственно примыкающей к прямым концевым повторам НВУ: 5' -САААА/САСТТ-З'.

Из данных литературы (см. обзор лит. ) известно, что при интеграции гепаднавирусов ДНК вируса может быть фланкирована прямыми повторами вирусной ДНК в 9-15 н.

На 5'-конце интегрированной вирусной ДНК находится фрагмент гена С ( позиция 2240), затем - полный ген г ( область пре-б и ген Б) (рис. 5!. Заканчивается ДНК НВУ областью 3'-конца гена X ( позиция 1820 ). Позиция 2240 располагается в середине гена С, таким образом, интегрированным вирусный геном не содержит области пре-С и начала гена С. Позиция 1320 находится на четыре нуклеотида левее от начала прямого концевого повтора вирусной ДНК -ВН1. К нему примыкает короткая АТ-богатая последовательность. Это означает, что с одной стороны вирусная ДНК обрывается в непосредственной близости от и примыкающей к нему АТ-богатоя последовательности.

• Ген X в интегрированной молекуле вирусной ДНК укорочен, поскольку позиция 1820 находится в 3'-концевой области гена X, Известно (см. обзор лит. >, что продукт гена X трзнс&ктивирует ряд клеточных генов, а также промоторы и энхансеры некоторых вирусов . Трансактивируюшая способность продукта гена X сохраняется даже в случае утраты 3'-концевой области гена X в процессе интеграции. В этом случае синтезируются гибридные мРНК - продукты транскрипции

вирусной и фланкирующей клеточной последовательности. В результате такой транскрипции в клетках образуется химерный белок. В случае гепатомы и хронической инфекции печени показано, что экспрессия клеточных онкогенов трансактивируется химерным белком, N-концевая область которого кодируется геном X вирусной ДНК , а С-конец -клеточной ДНК.

Мы провели компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей интегрированного гена X и фланкирующей клеточной ДНК. Оказалось, что транскрипция с открытой рамки считывания гена X может включать клеточную ДНК (рис. 6). В участке терминации транскрипции находится клеточная последовательность:

5'-TAAATAGTAGAAGCAAATGTGTAAATTTTAA-3', которая может служить сигналом полиаденилирования.

Мы предполагаем, что в результате интеграции ДНК HBV в ДНК клеток неиробластомы, в данном конкретном случае, возможна экспрессия гена X с образованием химерного белка, обладавшего трансактивирующей способностью, что может влиять на возникновение опухоли.

В процессе интеграции ДНК HBV делетирована область вирусного генома, включавшая прямые концевые повторы вирусной ДНК t BRI и DB2 ). По-видимому, интеграция ДНК HBV произошла в результате рекомбинации DR1 и DR2; это соответствует одной из гипотез механизма интеграции вируса гепатита В.

Уникальная клеточная последовательность во фрагменте ДНК нейробластомы размером 3 т.п.н. составляет 305 п. н.

Поли(А)оигнал

1 СТОП у од сны

I-1

0.1 т.пл.

ГенХ

Клеточная ДНК

Рис. 6. Открытая рамка трансляции фрагмента гена X русной ДНК и фланкирующей клеточной ДНК.

б. Характеристика клеточной ДНК. методом блот-гиОридизаини в участке интеграции ДНК ИВУ.

Из данных, описанных в литературе известно, что интеграция ДНК НВУ происходит часто в участки генома, содержащие высокоповторяюшиеся последовательности ДНК . Нам было интересно узнать, содержит ли фрагмент ДНК неиробластомы с интегрированным вирусным геномом высокоповторяюшиеся последовательности. Для выяснения этого вопроса мы провели гибридизацию исходного фрагмента ДНК размером около В т.п.н. и фрагментов ДНК, полученных в результате гидролиза РбИ исходного фрагмента ДНК неиробластомы с тотальной ДНК человека, меченной радиоактивным фосфором (рис. 7!. По результатам гибридизации видно, что участок интеграции вирусной ДНК обогащен повторяющимися последовательностями (дорожка 2). При гидролизе РэН выявлены фрагменты размером 1,2 т.п.н. и 0.8 т.п.н. (дорожка 3 ), содержащие повторы человеческой ДНК. Для локализации области клеточной ДНК, содержащей высокоповторяюшиеся последовательности мы провели гибридизацию Фрагментов, полученных в результате гидролиза фрагмента ДНК неиробластомы рестриктазами ЕсоМ, РбИ, ВатН1 и их комбинацией с меченой тотальной ДНК человека Результаты гибридизации представлены на рисунке 8. При одновременном гидролизе Есой1 и ВашН1 (дорожка 3) образуется фрагмент размером 4,5 т.п.н., который дает сильный сигнал при гибридизации с тотальной ДНК человека. Фрагмент размером 1,7 т.п.н. значительно слабее гибридизуется с меченой ДНК

- £ г. Л *

Рис. 7. Результаты блот-гибридизации гидролизованных

32

фрагментов ДНК неиробластомы с меченой Р тотальной ДНК человека: 1 - тотальная ДНК человека, гидролизованная ЕсоШ; 2 -элюированный фрагмент ДНК нейробластомы с интегрированным геномом НВУ; 3 - фрагменты ДНК нейробластомы, полученные в результате гидролиза

/

$тпн —

4

{7т лм. —

/¿Г/1».

0.!тлн _

Рис. 8. Результаты блот-гибридизации с меченой тотальной НК человека гидролизованных фрагментов ДНК нейробластомы. , 2, 3, 4, 5, 6 - гидролиз ЕсоИ1 + Рвг1 + ВапШ; ЕсоЙ1; Есой1 + атШ; ВатН1 + РбИ; РзИ; Рэг1 + ЕсоШ, соответственно. Стрелка казывает неполностью гидролизованныя фрагмент.

человека. Учитывая длины гибридизующихся фрагхюнтов и сопоставляя их с физической картой фрагмента ДНК неиробластомы (рис. 3), мы локализовали участок клеточной ДНК, обогащенный повторами справа от интегрированной ДНК HBV".

7. Анализ клеточной нуклеотиднои последовательности в участке интеграции ДИК HBV.

Для получения молекулярно-биологической характеристики клеточной последовательности в участке интеграции вирусной ДНК мы проклонировали (в плазмилный вектор pUC19) фрагмент, расположенный левее ДНК HBV размером 1,7 т.п.н., образующийся в результате гидролиза исходного фрагмента EcoRI и BatoHI (рис. 3). Для нас он был интересен тем, что является менее обогащенным повторяющимися

последовательностями 1рис. 8). Нуклеотидная

последовательность фрагмента установлена методом Сэнгера с помощью автоматического секвенатора Applied Biosystems.

Клеточная последовательность в этом фрагменте составляет 1047 п.н. В результате компьютерного анализа четкой гомологии этий последовательности с каким-либо геном человека с известной нуклеотидной последовательностью выявить не удалось. Однако, мы выявили участки гомологичных последовательностей, относящихся к ССААТ-связывающим регуляторным белкам (HSHAP2A, HSNFYA) и к главному комплексу гистосовместимости (HSHLA1PS, HSMHCI, HSMHANTL ) 1рис. 9).

Известно (см. обзор лит.), что многие области ДНК, являющиеся мишенями для трансактивации геном X . вируса

Н5НАР2А ИЬМГУА

м

Р1

клегочная ДНК

с гаешташ шся»яомт«пвоет«>

Н5Н!_А1РЗ НЗМНАМТ'и НЗМНС1

Е1 - ЕсоИ

кРНК С1Д?«"С*т2мво«го

НЗЫГУА-

НЗНАР2Л~ *РНК ССиТ-е*ж1%»евв»г» бета* НЛИ Ц ЗР ЗАб * сан«*ст>о человека

0.1 т.п.н.

Н$Н1А1Р5 -нзмнаып. " к5мнс1 -

Р1 - Рви

Н1А-СК оеемоган клаееа 1 пел дог* я тмйихпгтвраого еттгтгва Н1А-Н , отяое*т*тоея % МНС кл.1 ДНК )ШС хя.1

В

САСССССАвАСССААТСААТСТТСАСАОТССАСССССАСАСС ЫЬНерВЗГ **** ******

САСССССАйАСССАйСАйКТСАТСАТС САО С Ав С С С С Ай АС 3 Н5НАР2А,Н8ЫРУА

ТСАвСТСАСЙАСАСОААОАТСССТСТТСССТССССТОАСССТА ЫЬНерВ37 *♦ ♦ ♦ ♦ ♦ *

ТСАССТСАСеАССАСААеТССС-ТаТТСССТССТСАеоеАСТА Н8НЬА1Р5,Н8МНС1

НвМНАЫИ.

ТТТТТТТТСТТТТСТТТТТСТТТТТТТТТТТТТТ ЫЬНерВ37

♦ * *

ТТТТСТТТСТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ НвВвАв

Рис. 9. Результаты компьютерного анализа по выявлению гомологии фланкируюшея ДНК НЗУ клеточной нуклеотиднои последовательности с генами человека с известной нуклеотиднои последовательностью.

А. Локализация участков гомологии.

Е. Гомологичные последовательности. 1

гепатита Б, связывают клеточные факторы транскрипции. К ним относятся промотор генов с-тус, & интерферона, НЬА-ВЕ. На клетках гепатобпастомы показано, что Х-белок трансактивирует транскрипцию с промотора МНС1. В результате взаимодействия НВх и клеточного фактора транскрипции С/ЕЕР происходит активация гена 11.-8. Однако, до сих пор остается неясным механизм активации геном X вируса гепатита В экспрессии клеточных генов. По одной гипотезе - Х-белок активирует клеточные факторы транскрипции в результате белок-белковых взаимодействий. По другой - Х-белок может—непосредственно связываться с ДНК. и активировать экспрессию определенных генов. Кроме того, интеграция ДНК ШУ в первый экзон и в не/транслируемую область генов с-шус может приводить к нарушению экспрессии генов с-тус. Учитывая это, выявленные нами участки гомологии показались нам интересными с точки зрения транс активирующей -способности гена-X НВУ.

В непосредственной близости от интегрированной- вирусной ДНК располагается участок, гомологичный семейству А1и-повторов (НЗНЗАб). Мотив поли(Т) характерен для одного из семейства А1й-повторов. По всея вероятности, интеграция •вирусного генома произошла в область гена, обогащенную А1и-повторами. Б состав А1и-последовательностей входит участок размером 14 п.н., практически идентичный последовательности, находящейся в точке начала репликации паповавирусов (таких, как БУ40) и вируса гепатита В. Для гепатоцитов показаны случаи интеграции НВУ в области генома, обогащенные А1и-повторами.

)

Заключение.

Исследования последнего десятилетия позволили значительно расширить спектр клеток, подвергающихся атаке НВУ. Рецепторы для вируса гепатита В обнаружены для различных типов ткани, в том числе и клеток неиробластомы . Способность НВУ встраиваться в ДНК клеток хозяина установлена для различных тканей, в том числе- и генеративных клеток человека. Среди детей с эмбриональными опухолями уровень зараженности НВУ значительно превышает средний, кроме того для кефро- и нейробластом показана интеграция ДНК НВУ. В связи с этим возникают новые вопросы об участии НВУ в мутагенезе, ' злокачественной трансформации клеток. о возможном проявлении онкогенного действия во втором поколении.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что интеграция вирусной ДНК в ДНК клеток неяробластомы произошла аналогично случаям интеграции ДНК НВУ в ДНК клеток гепатомы. Это позволяет предположить, что мутагенное и онкогенное действие ДНК НВУ может распространяться и на клетки непеченочной ткани, в данном случае неяробластомы. В случае эмбриональных опухолей у детей причины развития неоплазий следует искать скорее у родителей, чем у самих пациентов, так как опухоль развивается из эмбриональных клеток. Исходя из полученных результатов, мы предполагаем, что вирус гепатита В может вызывать нестабильность генома и представляет потенциальную онкологическую опасность не только для лиц'перенесших гепатит, но и для их потомства.

Выводы.

1. Показано, что ДНК HBV способна интегрировать е ДНК клеток спонтанной неиробластомы человека.

2. Фрагмент интегрированной вирусной ДНК фланкирован короткими обращенными повторами вирусной нуклеотиднок последовательности. Последовательность этих повтороЕ непосредственно прилегает к прямому повтору DRI, что указывает на участие DRI в процессе рекомбинации.

'3. В результате подобной интеграции возможно образование химерного белка, N - концевая область которого кодируется вирусным геном X, а С - конец - клеточной ДНК. Подобные химерные белки обладают трансактивируещеи способностью, поэтому можно предположить, что в случае неиробластомы возможна трансактивация экспрессии определенных клеточных генов.

4. Клеточная ДНК в участке интеграции обогащена повторяющимися последовательностями, непосредственно к вируснои ДНК прилегает участок, гомологичный семейству Alu-повторов.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Naumova А.К., Sotnikova E.N., Tsybinogin V.V., Serov S.M., Tagieva N.E., Kisselev L.L. Hepatitis В virus and embryonal tumors. - Abstracts of XYIIIth Meeting of the European tumor virus group, Sudbyholm's castle, Sweden, 1989, p. 24.

2. Наумова A.K., Цибиногин В.Б., Сотникова E.H., Тагиева Н.Э., Серов С.М., Киселев Л.Л. Вирус гепатита Е и

эмбриональные опухоли. - Первая Всесоюзная конференция "Геном человека", 1990, стр. 176-177. I

3. Тагиеза Н.Э., Гуляева А.Н., Гизатуллин P.S., Банников Е.М., Захарьев В.М., Наумова А.К., Киселев Л.Л. Интеграция ДНК вируса гепатита В в клетки неяробластомы человека. - ДАН, 1993, т. 331, N1, . ¿ßtf-f//

4. Тагиева Н.Э., Ломоносов М.Ю., Игнатова Т.М., Серов В.Е. Использование метода локальной амплификации нуклеиновых кислот для обнаружения ДНК вируса гепатита Б в фиксированных тканях. - Архив патологии, 1993,

Tag i ova N- Е- , Qulyaova A.N.. GizatuUin R. 2- . Bann г 1c ov V.M. . Sakharyev V.M. . Naumova A. K. . KÍssolov L-L- Integral ion hopa ti lis В virus DNA in to DNA of human neuroblastoma cells. The? EMBL Data Library, accession no. X7 2 21 3.

Тираж 100 экз.