Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация генома аденовирусов и конструирование вектора для эукариотических клеток

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация генома аденовирусов и конструирование вектора для эукариотических клеток"

" и;? о .

ВСЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕ)1ЬСКОХОЗЯ11С1ВШШХ НАУК. им ,В .И .ЛЕНИНА ВНИИ СЕШЖОЛШЙСТШМЮИ Ш0ТЕХНСЛ01Ш

На правах рукописи • УДК 578.826:578.56

НАРОД1ЦЙШ БОРИС САВЕЛЬЕВИЧ

СТТЛШРНО-ФУНКЦЙОШЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА АДЕНОВИРУСОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ ВЕКТОРА ДЛЯ ЭУКАШОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

.Москва - 1988 г.

Работа выполнена:

- во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХШШ ;

- в Институте вирусологии им: Д.И.Ивановского АМН СССР.

Официальные оппоненты: доктор, биологических наук,

профессор Ы. Ф.Шемякин

доктор медицинских наук, профессор А.Д.Альтштейн

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки, профессор Б.А.Сергеев

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Защита состоится "//» 198 <?г. в „/¿"часов

на заседании специализированного совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ЬАСШЙ (127253, Москва, ул. Псковская, д.12, кор.4).

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСШМЯ.

Автореферат разослан £98</ г.

Ученый секретарь-специализированного совета, кандидат биологических наук

С.А.Ыеликова

"м

j " f , ОВДЛЯ ХЛРЛКТЕНЮТИКА РЛБОШ

Актуальность проблемы. Семейство Adenoviridae включает около ста видов аденовирусов, которые поражают mnpoitnii спектр хозяев: от человека до рыб, В этот список также попадают важные сельскохозяйственные 'объекта: крупный рогатый скот, овцы, птици (куры и утки). Аденовирусы вызывают тяжелые заболевашш глаз, дыхательных органов и пищеварительного тракта у человека и животных. Особенно опасна аденовирусная инфекция для детей и молодняка у * животных. У птиц аденовирусы резко сни;иают продукцию яиц.

Аденовирусы способны вызывать неопластяческую трансформацию культуры клеток in vitro , а некоторые из них индуцируют злокачественные новообразования у лабораторных животных. Поэтому изучение последовательности событий, приводящих к такому взаимодействию вируса и клетки, приближает нас к расшифровке проблем вирусного онкогенеза.

Аденовирусы представляют собой хороший инструмент для изучения процессов хранения и экспрессии генетической информации в эукариотической клетке, так как синтез аденовирусных компонентов осуществляется, в основном, с использованием клеточного биосинтетического аппарата. Для иллюстрации этого тезиса достаточно вспомнить, что сплайсинг РНК в эукариотической клетке был впервые открыт при изучении экспрессии генов аденовирусов. Учитывая постоянно растущую информацию о структурно-функциональной организации генома аденовирусов и быстрое совершенствование методов генной инженерии, модно ожидать, что представители этого семейства виру сов' будуг одними из первых кандидатов на роль векторов, с помощью которых можно будет вводить чужеродную генетическую информацию не только в культуру клеток, но и в целый организм.

Рекомбинантные аденовирусы, созданные in vitro и содержащие экзогенную генетическую информацию, могут быть использованы для решения широкого спектра задач. В частности, для клонироваи«* и амплификации фрагментов ДНК различного происхождения в мотках человека и -тавотных, для исследования особенностей экспрессии отдельных генов (или их групп) как вирусного, так и клеточного происхождения, для решения ряда биотехнологических задач. В этом случае рекомбинантные аденовирусы могут быть с успехом использованы дая иработки в культуре клеток белков, функциональная активность' которых определяется правильностью посттрансляционкоп модификации

исходного полипептида в процессе его синтеза в эукариотической клетке. Весьма перспективны исследования по конструированию ре-комбинанИшх аденовирусов на основе невирулентных и слабовиру-лентних штаммов для получения геино-инженерних вакцин против различных возбудителей инфекционных болезней человека и животных.

Все вышеизложенное обусловливает актуальность изучения структурно-функциональной организации аденовирусов человека и животных и разработки методов получения рекомбинантных аденовирусов и создания на их основе многоцелевых эукариотических векторов.

Цель и задачи доследования. В процессе диссертационной рабой предстояло решить следующие основные задачи:

1. Изучить структурную организацию Д1К аденовирусов зсивот-ных и птиц и выявить общие закономерности топографии генома аденовирусов человека и животных. -

Для этого необходимо было предварительно отработать универсальные п хорошо воспроизводимые методы физического картирования ранее не изучавшихся ДНК аденовирусов и клонирования концевых фрагментов аденовирусного генома.

2. Охарактеризовать комплекс ДНК-терминальный белок аденовирусов человека и животных, определить особенности взаимодействия ДШК - ИЗ с пермиссивныма и непермиссивными клетками, а также изучить возмокность экспрессии и репликации ДНК и ДНК - ТБ в овоцитах X.Laevis и в системе in vitro , полученной из' экстрактов ядер зараженных клеток.

3. Локализовать онкогены в ДНК изучаемых аденовирусов. Определить минимальный фрагмент ДНК, способный трансформировать первичные клетки грызунов. Выявить возможные закономерности взаимодействия ДНК аденовирусов и клеточного генома в линиях клеток, трансформированных изучаемыми вирусами.

4. Разработать новый методический подход для введения линейных высокомолекулярных ДИК в эукариотические клетки с помощью протеолипосом.

5. Отработать универсальный способ получения рекомбинантных аденовирусов, содержащих экзогенную ДНК, в условиях селективного отбора рекомбинантных вирусных популяций. Селективный отбор гибридных Ад долден осуществляться за счет введения в ДНК Ад после-

цовательности генома Ад-0В40 гибрида, кодирующего Т-антиген 0В40.

Научная новизна и практическая ценность. В результате прове-ценного исследования впервые получены данные о структурно-функцио-шльной организации ДНК и комплекса ДНК - терминальный белок аде-ювирусов животных (s-16, S-8H, 3-5, BAV2, EDS), а также впервые )характеризован геном аденовируса человека типа 6 и I. Выявлены збщие принципы в организации генома аденовирусов человека, животных и птиц. Сформулировано положение о генном тигшровашш изолятов 1деновирусов (основанном на рестрикционном анализе ДНК этих виру-¡ов) в качестве альтернативного метода идентификации и классификации аденовирусов.

Предложен универсальный,метод получения популяции рекоыби-гантных аденовирусов на основе ДНК аденовируса человека, содержа-1ей экспрессируемую гетерологическуго ДНК (в нашей работе геном ви->уса гепатита В) и участок ДНК вируса 0В40. Фрагмент генома 0В40, ишэченный в рекомбинант, позволяет селективно отбирать популяции ■ибридных аденовирусов в процессе их пассирования на клетках обе-ьяны.

Впервые изучены физико-химические свойства терминальных белов аденовирусов животных и показана высокая степень консерватяв-ости в структуре ТБ аденовирусов человека и животных. Получены риоритетные данные о биологических свойствах комплекса ДНК - ТБ. оказано, что онкогены аденовирусов неспособны реализовать транс-ормирущие потенции в составе комплекса ДНК - ТБ, выделенного из чищенной вирусной суспензии.

Впервые показано, что комплекс ДНК - ТБ аденовирусов человек обезьяны транскрибируется (по крайней мере, ранние гены) й репли-ируется в овоцитах x.Laovia.

Получены новые данные о возможности высокоэффективного перэ-эса интактной ХйК аденовируса в клетки с использовлнием липосом. эторие связаны с гликопротеидом (ГА) вируса гриппа (протеолппосо'яД,

Сконструирована модель недефектного вектора тся эукарпотиче-ких клеток на основе рекомбинанта между ДНК H-I и Н-5 с делецией э "несущественной" области с координатами 75,5 - 83,4 %.

Работа носит теоретический характер. Методу и выводы работа эгут быть использованы в лабораторных исследованиях, а также дая азработки новых способов диагностики аденовирусной инфекции.

Способ создания рекомбинантных аденовирусов колет б'.'ть исполь-

зован для накопления в культуре оукариотических клеток различных биологически активных белков, в том числе и препаратов дня диагностики и профилактики вирусной инфекции.

Разработанная технология полупроизводственного получения специфических эцдонуклеаз бияа внедрена в лабораторное производство на базе Московского ЦНШШС им. И.И.Мечникова.

Апробация работы. Материалы диссертации доклада вались на всесоюзных конференциях по генной шменерии и биотехнологии в г.Пущино (I98Q и 1982 гг.), на всесоюзных рабочих совещаниях по молекулярной биологии ДНК-содеркащих вирусов, имеющих практическое значение дог сельского хозяйства и медицины в г. Киеве (1984 ¡1 1987 гг.), на 1У Всесоюзной конференции по методам получения и 'анализа биохимических препаратов в г. Риге (1982 г.), на П-м двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ по проблеме структуры и функции ге- • нома в г.Баку (1977 г.), на международном симпозиуме "йолекулугриая биология вирусов и генная инженерия", г.Москва (1983 г.). Апробация диссертации проведена на заседании Совета предварительной экспертизы по молекулярной биологии Института вирусологии АШ СССР и кд семинаре отдела генной инженерии ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХННЛ.

Структура и объем диссертации, .диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, в которых описываются и обсуждаются результаты собственных исследовании, общего заключения и выводов. Работа изложена на 394 страницах машинописного текста и документирована 74 рисунками и 28 таблицами. Список цитируемой литературы включает 456 работ отечественных и зарубежных авторов.

х х х

Автор выражает благодарность члену-корреспонденту ВАСЖШ Т.'Л.Тихоненко, в лаборатории которого выполнялась работа, и коллегам за помощь в проведении экспериментов и обсуждение результатов: Р.С.Дрейзин, Т.И.Пономаревой, Н.А.Гродшцкой, Т.И.Калишшов, Б.А.Завизиону, В.Н.Лопареоу, Ь.З.Гольдберг, А.Ьклнису, О.И.Мирош-Ш1чбнко, В. II.Кругляку, С.Н.Хилько, В.Т.Григорьеву, С.Е.Глушаковой, Т.Н.Платоновой, Е.Н.Скрипкину.

- 5 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Структурный анализ ДИК Ад человеку и тавотных с использованием специфических эндонуклеаз (реотриктаз)

Физическое картирование ДОС аденовирусов.

К моменту начала наших исследований аденовирусов человека и животных, методы физического картирования ДИК вирусов были весьма примитивны и их во змошюсти ограничены. Количество исследованных с помощью СЭ аденовирусов ограничивалось пятьга-оемью серОтилами из различных подгрупп Ад человека. Выбранные нами модели Ад ранее не были охарактеризованы методами молекулярной биологии.

В процессе работы по определению количества и чередования фрагментов генома Ад после гидролиза ДНК СЭ мы отработали комплекс методических подходов, позволяющих быстро и однозначно выделять нужный участок генома и определять его координаты в ДНК исследуемого вируса. В ряде случаев наши методы были оригинальны. К таковым мо;шо отнести способ физического картирования с использованием "блоттинг" гибридизации, идентификацию концевых фрагментов с помощью ТЕ, возможность электрофоретического фракционирования в одном геле фрагментов с молекулярной массой от десятка ВД до 0,1 1ЛД и др. В результате использования различных комбинаций методов определения чередования фрагментов ДНК, полученных после ее гидролиза рестрик-тазами, были построены физические карты генома H-I, Н-5, S-8H, S-5, 's-16, EAV3, EDS (pnc.I).

Анализ ДНК популягшд эталонных штаммов аденовирусов

S-16 я H-I

Клонирование вирусов и изучение их физико-химических и биологических свойств ва:кно для определения гомогенности (или гетерогенности) вирусной популяции. Наш было выделено и проанализирован? 12 клонов вируса S-16 (эталонный штамм).

Анализ проводили с помощью СЭ, гидролизуя ДНК кавдого из двенадцати клонов девятью ферментами, и шощими в сумме 87 мест гидролиза в геноме s-16 . Было обнаружено, что ДНК двух из двенадцати клонов (кл.230и и кл.47) имеют.дополнительные места гидролиза, или изменешше координаты участков гидролиза для одного или нескольких ферментов. Остальные десять клонов по характеру гидролиза их ДИК -СЭ из отличались от генома исходной популяции s-16 . Как видно из

Рио.1 Физические карты днк н~1, а-16, ¡з-вн, вауз, . . Б-5, н-б, из.

Слава от карты находится индекс соответствующего фермента. . Буквами обозначены фрагменты ДНК, цифрами - процент величины генома.

КГ"! -

ый-

> -а

ХМ

ь»и I, И—М_

-

Ы1 :__£_

(у./ . г.ь

_8_

»-(•А_I_(_£_

к! с » с . Е

¡—1 « ЯП'* с . » ■ 1 . « Л, *г! Г . I А г /

Т.».».*

К М

1, с Л ,г. в

Ь-И А. е , с . А. К»

е , 1 , А «', в . 6

1. А 1 ,_,. е 10. с

бае Г'

С£а I Х£а1

, Б С

I-1-1-

? ¿5

ч > ЕЙб

за б -•

/о го за на £о 60 го во

Ш0%

с. (

А

А

£

А

¡и

а

Pao.I (npoROJiseHHe)

t < i" » <

ii:i"»)1 » ......L_

tu. t > t >u> . ff.-t-i ■ t». » H ■ tu

L f c t*ovrPStpa* ' fr yvMft ft I !

111 T,—3 s >1* »I «f 1J! in jji >ic vi «5 I

sit!

IL0«aO . » C » c ' «

r ► « t I *

lullt

folL

TuiBHil isTsio m »tJ Mi

„ • • » s r ( t H »03 C ygt & CfW. t 1 a

s-ie

----!-e-1---,--j_0_

In 1 ;_i lui i ;

Ul __: '!"

fiVT_

4

%-vr. * . » . e . » a « r i

■Wr-

_ _ ■ * r^_c ■ 7*- ft-

t- i • r .-

¡7^,-r f f r . 3 i

-_«

Jf ,T

//-r

A

f t s

c c

рисунка 2, ДЛК клона 230 имеет десять дополнительных сайтов для СЭ Sail, Small, iiindxi, iicoKi и Hpai . Причем все точки гидролиза ДНК 230 клона, отличающие его от исходной популяции 3-16 , сосредоточены на участке ДНК с координатами 50-59 % величины генома вируса. Для клона 47 S-16 выявлены изменения в структуре правого концевого участка ДНК (рис.2). Увеличена масса "Е" фрашеита Baniil, "А" фрагмента Bgii и "I" фрагмента Pati (правые концевые фрагменты генома). Разница составляет 0,32 ЫД дли 500 н.п. Следовательно, можно предполагать вставку клеточной ДНК ш дупликацию участка генома вируса в области, расположенной в непосредственной близости от правого И.К.П. ДНК.

Нам удалось ташке идентифицировать клон (Д-I) вируса H-I, геном которого отличается по характеру гидролиза СЭ от ДНК исходной популяции H-I. Как видно из данных, приведенных на рисунке 2, в ДНК кл.Д-I элиминировано по I сайту для СЭ iicoRX и Sail . Причем делеция, или точечные мутации произошли в "несущественной" области генома вируса H-I с координатами 79-85 ед.физической карты.

Следует особо отметить, что стандартный серологический анализ, применяемый при типировании штаммов, не показал каких-либо различи^ в антигенной структуре исследуемых кланов.

Сравнение биологических свойств различных клонов S-1G и H-I

Данные о серологической идентичности исследуемых клонов S-16 ие подтверждаются результатами рестрикционного анализа ДНК этих же клонов. В связи с этим интересно было изучить биологические характеристики исследуемых клонов: чувствительность культур клеток ПЗМ и .накопление вируса в них, а также онкогенную активность вирионов. Как видно из данных, представленных в таблице I, изученные клетки оказались высокочувствительными к ЩД и накоплению клонов 47 и 230, Причем клон 230 давал выход вирусной продукции выше, чем клон 47, л исходная популяция s-16 . Данные об онкогенности клонов (табл.1) свидетельствуют, что клон 47 и эталонный штамм обладают одинаковой туморогенной активностью для грызунов, а клон 230 менее онкогенен.

Следует заметить, что уровень накопления в инфицированных клетках эталонного штамма H-I и его клона Д-I также различается. Вирус клона Д-I дает выход потомства на порядок выше, чем вирус H-I эталонной популяции.

Таким образом, рестршсциошшй анализ и физическое картирование ДНК Ад позволяет выявить вариабельность генетического материала па-

23а s>

«. J '-53 1 «Mi1

Smai

1* 'i

Sem Ml Д// Bjil

uer

HO*

,TÄ ....... 1

Рж;,2 Сравнительный анализ ДЕК различных клонов s-16 а H-I с помощью СЭ.

' Треки с I по 10 ДНК s-1'6 (кл.230) и исходной популяции s-16 . Тоеки 11-14 ДЕК исходной популяции H-I и H-I (кл.Д-1). Трека 15-20 ДНК исходной популяции S-16 и S-16 (кл.47).

Под электройореграммамя обозначены ферменты, с помощью которых были получены анализируемые гидролизаты ДЕК.

На схемах, приведенных под соответствующими треками, заштрихованы области генома, в которых сосредоточены детектируемые изменения в первичной структуре ДНК изученных клонов s-16 а H-I.

х - полосы на электрофореграммах, соответствующие фрагментам, по которым различаются анализируемые пары ДНК. .

i

ш i

Таблица I

Биологическая характеристика клонов S-16 1 1 : ' в,1ут ! Туморогенность

клона бляшек (мы) репли-! кацди ¡(часы) i ' вируса ( le/мл) i 1 ' j доза время ¡вируса прояв-; (lg) ,ления ¡хомяки ¡(дни) частота индук-

Исходная популяция 0,45±0,05 IS 8,7*0,Б 7,5 6,5 30-45 ■ 52-Í20 100 44

230 3,5 ±,0,5 ' 12 9,V±0,5 6,0 5,0 32-Í00 32-100 100 75

47 4,5 ¿0,05 - 8,5¿0,5 6,0 5,0 35-100 35-100 100 78

х) Определейо на клетках ПЗМ.

XX) Процент животных с опухолями по отношению к общему количеству ЖИВОТНЫХ, взятых в опыт.

пуляции Ад, которая другими методами не тестировалась.

■ Поэтому мы предложили дополнительный подход к классификации Ад, основанный на рестрикционном анализе ДШ. Этот тест может быть весьма полезен при дифференцировке отдельных эпидемических изоля-тов, которые по иммунологическим тестам неразличимы, но могут обладать различной вирулентностью для человека и животных.

В I9S4 году Международный комитет по изучению и классификации Ад узаконил новый термин - "генный тип" Ад. Генное титрование не заменяет и не исключает серологические метода классификации Ад. Тест с использованием рестриктаз является альтернативным или дополняющим способом идентификации исследуемых Ад.

Получение рекомбинантних плазмид, содержащих последовательности ДНК аденовирусов и их анализ

Клонирование внутренних фрагментов ДНК Ад проводили в плазмй-дах PBR 522, Per 325, рАТ-153. В качестве примера, иллюстрирующего стандартный путь клонирования внутренних фрагментов Ад, разберем схему получения рекомбинантных плазмид, содержащих Bgill фрагменты ДНК S-16 .

Внутренние ВдШ-фрагменты ДНК S-16 имеют сравнительно больше размеры (за исключением участка "Е" - 2,3 % генома) и поэтому рекомбинантние плазмиды могут быть легко идентифицированы по под-влшюсти их ДНК из клонов трансформированных кяеток E.ooli (рис.За)

Рио.З Анализ фрагментов ДНК плазмид pes - серии электрофорезом в 0,8 % агарозном геле и ДНК-Д1Ж гибридизацией.

А - электрофореграмма разделения Bgiii-ipan.ieHToB ДНК: s-16 (I) вектора рВС \7) и рекомбинантных плазмид (2-6).

Б - радиоавтографа нитроцеллплозного фильтра после переноса на него BgiH -гидролизатов ДНК и гибридизации с 32Р-ДНК s-16. Рекомбинантные шшзшды содержат:

рСЗХ (2) - "А" фрагмент ДНК S-16)

pQ32 (3) и реэз (4) - "О" фрагмент ДНК з~16, pCS6 (5) и pes? (6) - "Д" фрагмент ДНК S-16) I - гидролизат ДНК з-1б СЭ Bglll! 7 - плазмида рВС, гидролизованная Bglll.

При данных условиях электрофореза не идентифицируются "Е" и 'Ф "-фрагменты ДНК s-16.

Яга Plff

eta

) i ' * s в ? ' i з у s e • f-

Для анализа полученных клонов использовали метод рестрякцион-ного картирования гибридных плазмид и гибридизационный тост с

3^Р-мечешюй ДНК соответствующего аденовируса. Продукты гидролиза рекомбинантних плазмид СЭ Bgin переносили на штроцеллшозный фильтр'и гибридизироваяи с ^2Р-ДНК S-16 (рис. 36). В результате клонирования в состав рекомбинантных плазшд переведены следуюсФе Bglll фрагменты S-16i "A" (pCSl), "С" (р032 и pCSj) и "Д" (pCS6 и pes?). ' 1

При исследовании структуры рекомбинантных плазмид и- ориентации в них участков вирусной ДНК использовали СЭ EooRi," Bamin а Зша1 , для которых были ранее картированы участки гидролиза в ДНК H-I и s-16.

В результате клонирования внутренних Bglll-фрагаентов S-16 в с;отав рекомбинантных плазшд переведено 74,2 % генома этого вируса (рис.4).

Рис.4 Физические карта ДНК Ад: а-16, н-1, э-5, Ваур, Се1о,£Д^,/Н н-2+нхп, на которых отмечены йрагменты генома, переведен-ние в состав рекомбинантних олазмид (эти участки отмечени утолщенными линиями).

На физической карте Н-г"*" Ш)1 отмечен участок ДНК 0В40, присутствующих в составе генома этого вируса (заштрихованный прямоугольник).

f í f с л &

А В J) с

Л С с Г 0 /1 с

, а а г г с к и na с ш в üftpl ь i

, tea R Г

-—¡ I IM ' I ' I.

' -» 1 ' ' '■■...»

fbnlll

Ы I

Eco i/,-«,

U 6

S15

-----ub—a-¿t„*j

к-i

Ц.1 -U-

(iwll í

/М Ш £t»iИ

* t , t

í, £ j О , л . « , Í

А .С . i . (1

........ lytl—' ■ 1

BAVJ

4 Cltlo

Scoftl ®

i-

*ms

a

A

L• .U.

Аналогичными методами была изучены и проанализированы реком-бинантные плазмиды, содержащие внутрешше фрагменты ДНК других Ал которые являются объектом наших исследований. На рисунке 4 отмече ны внутрешше участка ДНК S-16, Н-6, Н-1, s-5, Bavj и Н-2 шл , переведенные в состав плазшд.

Клонирование концевых фрагментов ДЖ H-I д s~ie

Ми уже оточат, что кяояироваиие концееих .ЭДгагаэятов да Ал имеет свои сложности, связанные с тем, что 5'-гонцы ДНК вируса блокированы остатками аминокислот ТБ и не доступам для действия целого ряда ферментов, в том числе для полииуклпотидюшазч, пуклеазы п ряда других. Блокировка 5'-конца ДНК Ад препятствует прямому "приши-вашш" линкера к иитактной молекуле, но не препятствует работе ноли-иук.чоотидалтра«ефсраз11, « ¡помощью которой на 3'-концах ДЖ Ад можно синтезировать гомополимеры {коннекторы) из 20-30 или, комплементарных гомополямсрам, синтезированным на концах векторной молекулы, гпдролизованной СЭ Pstl.

С помощью коллекторного метода нам удалось лолу-шть "баблло-теку" всех Pstl фрашеятов ДНК S-16 (рис.4).

Клонирование с помощью коннекторов требует строго контролируемых условий трансф:еразюй реакции, так как введение более двадцати нуклеотидов в состав коннектора нарушает матричную активность ИШ в инициации репликации in vitro . В то же время известно, что реакция пршпивгл гомополимеров с помощью полипуклеотидаотрапсйеразн весьма чувствительна к разным факторам и трудно контролируется. Поэтому более предпочтительным нам представляется клонирование с помощью линкеров. Для удаления ТБ ДНК Ад обрабатывали сначала сначала ДШ-полимеразой I (фрагмент Кленона), обладающего З'-зкзонук-леазной активностью в присутствии одного дНТФ, а зятем нуглоазой Зг. После реакпии ДНК Ад с Бг -нуклеазой проводили достройку возможных 'брешей в молекуле с помощью ДНК-полимерази I (фрагмент Клгнова), но ужо в присутствии всех четырех дНТФ.

В качестве вектора для клонирования i^.oRl фрагментов ДЕК 5- lfj была использована плазмидд рАТ153, Получении? после трансформации бактерий колонии анализировали методом гибридизации in situ с соответствующим изолированном фрагментом клонируемо JI ЛИК. Были собраны iuroHU, дащяе положительный сигнал засветки, которые затем ана лизировали с попоцчо рестриктаз (рис.5).

Анализ ИМ! ДНК S-16 и ц_1

Кощ'-.пив Пгчсергировшшые повтори генома S-16 пютазпровали в составе вирионной ДНК, а также в составе юпзтт рАТВ (рис.6). Аналогичным образом изучали состав ИГЛ ДНК H-I. Установлено, что 5'-концевым нуклеотидом в ДНК H-I и s-16 является I-iUi, который спаре:: с ГШ, то есть, ДНК имеет "тупой" конец, й-'16 состоит из Ш н.п. и может бить условно разделен 1'? два домена: АТ--богатув

FiiOf^ а) Рестрикцяонный анализ ДНК плазмиди рАТВ, содержащей фрагмент генома s-16.

Над треками электрофореграмми обозначены СЭ, которые использовали для анализа плазмад.

Буквами на злектрофореграмме обозначены полосы, соответствующие фрагментам ДНК S-16.

Звездочками отмечены полосы, соответствующие, но подвижности, векторной молекуле (рАТ153) с концевыми участками ДНК 3-16 , остающимися после расщепления исходной рекомбинантной ДНК 03 Sali или Bglll.

Цифрами над треками обозначают:

I - Ш ; 2 - ДНК рАТВ ; 3 - ДНК вектора рАП53 ; 4 - ДНК рАШ ; 5 - ЙШ s-16 ; 6 - ДНК рАТВ ; 7 - ДНК 3-16.

б) Схема структуры плазмиди рАТВ

Широкая полоса - участок клонированной ДЦК S-16. Цифры - координаты клонируемой ДНК S-16 , а также координаты мест гидролиза в ДНК S-16 дня используемых СЭ.

в) Физические карты ДНК s-16 для используемых СЭ.

fco *] Bjiü S.el

Рзо.6 Последовательность нуклеотядов ИКП различных Ад.

а) Последовательность нтклеотздов ИКП ДНК 3-16 5'

СТАТС'ХАП?

A21°AA2AIACCTi,2QAraTGGGjUC30GGX'GCCAATA^

CATCAICA

80 $0 100 110 ' 120 . 130 140

iatgcggaaa 2gggcggag2 iaggggcggg g2ttggcggt aggcg2ggci gggggagtgt ccgggggigg•

15Q 1ьо 170 1S0T 190 с гтр_,

gaacggaag2 gacgiagggg gggcggcgga ggtgacgigg li'i'ggggagt tt

i-аепь

б) Сравнение последовательностей ИКП ДЕК s-16 , полученных в настх экспериментах а до данным Тулин (1979)

5'

Наш данные: gatcctaiai aaiasaccee ahigggaac ggigccaata iggtaatgag gigggcg ' Данные Тулин: ~—аесаая; aax-a'iaccra atttgggaac gctgccaa-xa igceaatgag gigggcg -Точками (•) отмечены различия в НП.

в) и г) Нуклеотлдяые послеаовательностя участков соединения концевых грагаентоз ДНК Н—I si'

¿--jo о ¿¿д cA'i-iixi в составе' секомЬаяэнтках плззг.цд, л последовательности ЯМ jlPM a ti-l в составе плаз;,адн"о;; и. вдридштаа ¿¿Ж

(прохзгзс-Еле)

£1 10 £С 50 40

г) Зираояная Д5К Н-1

ДЭК рва 5'---вАЯЯСССЛ! ^^¿»и^^гСЖг:1:^!^^

рл.1Ч53 линкер В-1

£1 Ю 20 30 рВ

г) Вгрпоякая ШК ¡3-1 б 5' —^¿^^¿гдосздуакЕОийьдсастсзу**.

йК рА53 5' —(шдгсоаюаАгтеззки^^^ ^"

рЛТ153 2 линкера 6-16

>:) Стоелкамг отмечены участки линкеров и точка васаепленкя 3,,-нуклеазой аденовирусных гекоыоь.

д) Последовательности ¡ЕЛ Н-1 е К-2

Ю 20 40

ш1-. а^ 5' са.тсатоаа? ¿аяанасст? а2иг5зааиссай'а'д ейатлат

дНК н-2 5< СлТсдзслАг ААьлтАоегг ¿шгаз^гг С-А^ССААТЛ Т-ААХЛАТ

область (1-50 н.п,) и ТЦ-обогащеиаую часть (50-180 н.п.). В 1ШП 3-16 и H-Í присутствует консервативная последовательность в районе 9-22 н.п., найденная во всех изученных ИШ Лд. Показана идентичность ШЛ Д5!К H-I и Н-2. Отмечена гетерогенность участка с I по 8 н.п. в ИКП ДИК S-16,

Функциональное картирование ДИК аденовирусов человека и животных

Локализация онкогена в геноме изучаемых аденовирусов

Построенные нами физические карты Лд человека и животных позволили изучить биологическую активность отдельных фрагментов генома этих вирусов и локализовать участок ДНК, ответственный за трансформирующие свойства вируса.

Результаты анализа трансформирующей активности нативной" вирусной ДНК, ее гидролизата, а также отдельных арагментов представлены в таблице 2.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, ДНК всех изученных наш вирусов обладает способностью трансформировать культуру клеток почек новорожденных крыс или фибробластов эмбрионов «рис. Трансформирующая активность сохранялась в тех же препаратах ДНК, подвергнутых действию ряда СЭ, а также проявлялась при введении в первичные клетки грызунов изолированных фрагментов ДНК, занимающих концевое положение на физической карте генома и имеющих размер не менее 10 % (0-10 %) величины генома. Этот конец ДНК считается "левым".

Нам не удалось зафиксировать трансформирующую активность комплекса ДНК-ТБ Н-6, s-16 , S-BH и Celo при обработке клеток крыс препаратами, содержащими 70-80 % ДНК-ТБ.

В. результате изучения трансформирующей и оикогенной актявпо-сти ДНК Лд человека и обезьян из "фокусов" трансформации и нескольких опухолей был выдален набор перевиваемых клеточных линий. При изучении их биологических свойств было, установлено, что все они обладают общими характеристиками, присущими культурам трансформированных клеток. Не было найдено значительных отличий молду линдр-ми клеток, полученных в присутствии генома онкогенного (S-16) ш неонкогенного (Н-6) по таким параметрам, как плотность роста, способность образовывать колонии в полужидком агаре, продукция Т-ан-тигена. В то ле время изученные меточные линии резко отличались . по способности вызывать опухоли у новорожденных хомяков. Особо "выдающейся" била линия sh-2 , полученная в результате ко-трансфор-

Таблица 2

Трансформирующая активность комшгакса ДНК-ТБ, Д1Ж (или ее фрагментов) H-I, Н-6, s-16, s-5, s-ен, celo

Материал

¡Количество¡Количество "фокусов"

! чашек ' !

х)

!

¡всего ¡на I мкг-экв.ДНК

!

Н-6 ЙШ-ТБ

да

fIK Bß-lII Ж SmaX

-öjpai'MQHT Buiaiix А-Лрашент ВидН1 Д.Ж ВщаНХ II-6 + PBR32a

15 15 6 3 3 3 6

О 12

7 О 6 О

8

О

0,7 0,9 О

1,4

П-1, ДНК

да Bgixi Д1Ж Бшв! .А фрагмент ВшШХ Д фрагмент ВшдИХ

12 9 9 3 3

0,6 o;s о

Í'2

S-16

i

XÍI-ТБ

ДНК ТБ+лрошза ДНК Suir ШЖ Bgin *'G" фрагмент ДНК-клон 230

Sali

56 16 7 19 10 5 12

30 О 4 22 О 6 7

0,53 О

0,5

У

1,3 0,6

■JbL.

ДНК

А фрагмент Ш ДНК-Нра!

0,5

о'3

S-8H

дж

ДНК-ТБ ДНК Bglll "А" фрагмент Bglll ДНК Hibdlll

Colo

ДНК ДНК-ТБ

10 3 6 3 6

10 12

4 О

0,6

О

0,8

°0'7

°0'4

На одну чашку наносили I мкг Д1Ж вируса.

мации первичных клеток крыс ДИК s-16 и HBV (таблица 3).

Таблица 3

Время появления опухолей у ксеногешгах и аллогенных животных после введения им различного количества клеток линии зн-2

Вид ¡Воз- ¡Коли' живот;раст ¡чеси

НОГО UCyT-jHilBO' ки) : н

¡Живот í шло: -¡иноку--¡лиров

!с опу-! холздм

I niAUJa—

;чество

i аоут-,'мвот-I ки) ¡ных в j ¡опыте

i

Доза ¡Сроки появления опухолей

клеток

(дли)

10-И

¡ Г2- 18- ¡20-

¡17 20 25 i i

J07" 7

Ю6

I04

26-Í3I-Í60-

30 ¡60 ¡00

■\% образо-j вания ¡опухолей ¡у иноку-¡лирован. потных

Крысы 1-3 WAG

7

8 3

1,5 ■ Г I

12

12

7/7 11/12 13/13

100 100 100

Хомяки 1-3 10 10? 10 10/10 100

13 5*10® 13 13/13 100

14 I.I01 10 4 14/14 100

19 I-X03 4 5 3 12/19 63

22 МО2 43 5 2 10/22 42

Хо- 14-16 2 5.10й 2 2/2 100

мя- б I.I06 2 I 3/6 50

16 I-ICf4 6 I 7/16 42

8 I-I03 2 I 3/8 37

Хомя- 23 16 I-I04 3 I 4/16 25

ки 12 2-Ю6 2 3 2 7/12 53

Способность вируса S-16 трансформировать клетки грызунов была показана еще в 1967 году. Так же, как и способность таких клеток вызывать.опухоли у сингенных животных. Однако, клетки линии SH-2 вызывали появление опухоли,у ксеногениых яивотных (í-3-дневные хомяки) поме введения грего 100 клеток на жявота.ю. Прямой анализ ДИК клеток SH-2 , проведенный на десятом пассак»; (рис.7), не выявил присутствия в препаратах последовательностей ДНК ifflV и показал наличие в меточном геноме не более пяти копий левой концевой области ДНК S-16 (0-30 % величины генома). Специальные исследования показали, что в ДИК клеток зн-2 не присутствует область ЕЫ ДНК s-16 и правый конец генома.

Рис.? Анализ ДНК аз тгешсЛормировац-ных клеток SH-2 методом "0лоттинг"-габридизации.

--- ' I - да вируса гепатита В (HBV) ,

гядролизованная ВашЩ.

'в - ■«• к * S „ 2 - ДУШ клеток лишш SH-2 ко-транс-5* Г с-<* Формация ДНК S--16 и ДЛК HBV.

ä„g' Гидролиз ВшаШ.

" * 3 - да S-16 . Гидролиз Bgixx.

4 - ШЕК клоток линии SH-H . ж« *" Гидролиз Bglll.

5 - WIK S-16 . Гидролиз BamHI.

- *• 6 - ДНК теток лапая SH-2 .

- ГиДрОДПЗ ВатШ.

13-

t- — , •f - —

3 Ч ss Буквами отмечены полосы засветки, со.—-----—_ ---. , ответствующис, по положению в агароз-

• Ли"" пом геле, фрагментам ДИК Ад, которые

образуются после ее гидролиза соответствующей СЭ.

Ивоздочкой отмечены концевые фрагменты гидролдзованной ДНК вируса, Стрелками отмечены полоси засветки, не совпадающие по подвижности с сигналами, которые дают фрагменты вирионной ДНК, использовании}! для трансформации. .

Над треками указан радиоактивный зонд, который использовали для гибридизации.

Несмотря на то, что мы не обнаружили в клетках SH-2 последовательностей HBV , мы не можем исключить влияние ДНК HBV на процесс трансформации, приводящий к образованию лишш SH-2 , так как возможно участие генетического материала HBV в инициации трансформации по механизму "hit tmd Hun1'.

Локализация гена, кодирующего гексоп (П полинептид)

в геномах Н-6. Н-[. В~1б и S-tffl

При сравнении олигопептидных карт гекеонов П-2, Н-6 и 3-16 выявлена высокая степень гомологии между исследованными белкаш. Из 50-ти пептидов в суммарном химиотриптическом гидролизате гексо-нов Н-2 + Н-6 общи/ли для обоих гексонов являются 41 пептид. Аналогичные цифри для смесей Н-2 + s-16 и Н-6 + 3-16 составляют 30 из 5? пептидов и 34 из Б4 пептидов, соответственно. Из высокого сходства олигопеатэдшх карт гексонов Н-2, Н-6 и s-16 следует наличие в этих белках протяженных областей с идентичной аминокислотной последовательностью. Вероятно, именно эти последовательности а обеспечивают антигенное сходство гексоновых полипептидов всех Ад

рода Mastadeboviridae. Аналогичное данные била получены для гек-сонов а-5 и з-бН и 1I-I.

Ъисокан степень гомологии первичной структуры гексонов должна бить отражена в гомологии соответствующих пукяеотидних последовательностей гексоновых генов в геноме различных Ад, Если условия сходства аминокислотных и нуклеотадшх последовательностей гексоновых генов различных серотипов Ад соблюдаются, то можно картировать гексоновие гены этих вирусов методом блоттинг-гибридизациа с использованием в качества зонда фрагмента ДНК Н-2, содержащего ген П полилептида.

Согласно данным Philipson(I979), гексоновиц ген 11-2 локализован в районе с координатами 50-59 единиц физической карта гслома. Такой участок наиболее легко видоляется из ДШ Н-2 в виде фрагмента, с координатами 50,1-60,2 ед. карти, получаемого при совместной регистрации ДНК СЭ Hindiü + в^ш. . ■

На рисунке 8 представлена схема опыта и результаты определения локализации гена, кодирующего гексон в геноме 3-16 -с помощью метода гибридизации ИИ ,3-16 с соответствующим фрагментом ДНК Н-2. Как видаю из рисунка, фрагмент ДНК Н-2, содордадан ген гексона, гябридизуется с фрагментами: d - BamHl, в-Sali к А п Q Нра! ДИК 3-16 . Расположив эти фрагменты на физических картах ДНК 3-16 в порядке их перекрывания, мы видам, что область генома S-16 , гомологичная гену, кодирующему гексон Н-2, расположена в ДНК s-16 в участке с координатами 50,2-52,1 ед.физ.карта. Координаты гена, кодирующего гексон в геноме Н-2 и s-16 , практически совпали.

Аналогичным методом установлена локализация гексонового гена в геноме а-Ы1 (координаты 49,3-58,1 ед.физ.карты) и Н-6 (50-60 ед. фаз.карты).

Использование плазмидч. со^аржаыац ген гексона BAVj в качестве зонда дт,ч молекулярной диагностики аденовирусной 1ш(|'скцни

Уникальные особенности первичной структуры гена, кодирующего П полипелтид (гексон) в сочетании с технологией получения рекомби-аантаих ДЖ, позволят использовать участок генома Ад, несущий ген гексона в качестве зонда для детекции широкого спектра Ад как в культуре клеток, так и в полевом материале, полученном от животных. 3 частности, ъ результате проведенных исследований нами отработан метод тестирования аденовирусной инфекция («а уровне ¿31К) на основе роакцаа ?ибридаззц»ш в точка;: с яомакьз ^Р-зоида - плаз-

ЕиоЛЗ . Локализация участка ДНК в-16 , имеющего гомологичние последовательности с геном, кодирующим синтез П полипептида (гексона) вируса Н-2.

а) Схема эксперимента.

Заштрихованный участок физ.карты ДНК Н-2 - область генома, кодирующая синтез II полипептида (использовано в качестве зонда при • гибридизации).. Зачерненные участки на &из.карте ДНК э-1б й.раг-менты, гибридизующиеся с зондом. "

б) ¡Злектрофореграммы (треки 1,3,5) фракционированных в агарозном геле гидролизатов да ¡3-16 ; радаоавтограшы (треки 2,4.6) {¡игроцеллатозного йшьтра, после гибридизации ¿¿р-зонда с теми же гидролизатами ДНК з-ль , иммобилизованными на фильтре.

Под треками обозначены ОЭ, использованные для гидролиза ДНК

Я 6 •

пик г-м

»**• - t-H

-1

-в '

-Л

е

=t f -s

Hp г

почте ш

$-lt на ттташмгой* «".п,тт я птгашит с •пиит» "p-jsw/r-1{ J t пя raccoHi

f-

F-

Sail

c-

2)

e -

'4'| ¡¿j

VI

5 6 --------.-/

Bam A .

с

■мида., содержащей область генома ВАУЗ , кодирующей гексон. Метод был использован для тестирования аденовирусных последовательностей у экспериментально зараженных телят, пополъэуя со держилюе смывов слизистой •носоглотки к оскалин (рис.9). Чувствительность метода составляем 10-30 пг в пробе.

J_ V- эр** 1) „ 3) Ж Ч) (О ffUt

и а Sflu г) г- 1) Я. V) Г>, я -X ■л, ^

т 1) щк &AV 3 1oom<r 0А* i 40 вкг V * ре у) н, Sytu 4? т.

I • • •

д & а

~ [о -

4 S

Рис.9 Диагностика последовательностей генома Ад, в выделениях животных, с помощью гибридизационнои техника.

cj а) Схема опита.

б) Радпоавтограмыа нитроцеллю-лозного фильтра после блот-тинг-гибридиэациц.

IIa фильтре, в точках, иммобилизовали клетки (50—100-IQb), собранные и отмытые из выделений живот-_ них, и гибридазовали с зондом ) (5.10' шп/шн).

Арабскими цифрами отмечены на схеме клетки, соответствующие пятнам засветки на радиоавтограф®.

В клетках на схеме указан день взятия пробы и источник пробы.

В качестве зонда использовали' зонд: «Р-ДНК плазмиди РЕ, содержащий фрагмент генома вмгз. Анализировали смывы носовой полости(Н) и фекалии (а). Пробы для анализа брали на 5, 7 и IX дни после заражения.

В качестве положительного контроля попользовали различные конструкции да вауз и ДНК шгазмида РЕ (полоса Ш пятно 1,2,3).

Отрицательным контролем служили смывы, полученные от здоровых телят (полоса Ш, пятно 4 и 5).

I полоса - пробы, полученные от ных вирусом ВДУ1. П полоса - пробы, полученные от животних ных вирусом ВАУ?.

вшотних, экспериментально заракен-экспериментально заражен-

з

Кроме гена П полипептида, нами с высокой степенью вероятности локализованы участки ДНК, кодирующие синтез ТБ и "несущественной" области в ДНК Н-6, Н-1, ¡3-16 и 3-8Н , а также идентифицирована область генома, ответственная за онкогенез; Показано, что все перечисленные функционально активные области ДНК Ад человека и животных шлеют весьма близкие координаты на физической карте генома Ад.

Определение молекулярной массы терминального белка Определение молекулярной массы ТЕ исследуемых вирусов проводили методом ЗФ в ЛААГ в присутствии ДЗН. Для этого эксперимента были подготовлен препарат ТБ, меченный I по методу Болтояа-Хал-тера. Только б условиях такой мягкой обменной реакции удается получить высокомолекулярный ТБ. Молекулярные массы ТБ 3-16, 3-8Е , Н-1 и В.О?з идентичны а составляют 55 Кд.

Биологические свойства комплекса ДНК-1Б .аденовирусов

Данные, характеризующие биологическую активность ДНК-Т-Б приведены в таблице 4.

Таблица 4

Сравнительная характеристика допротошшзировшшон ДПК и комплекса ДНК-ТБ вируса 8-1 ь

jПроникающая \ ТранссТ.ормиру-¡Инфекционная jТуыороген-Иопользуемий}способность ¡пщая актив- ¡активность в ¡пая актив-преиарзт радаоак- ¡ность на клетнклетках почек,ноитъ хх)

■ тивнои мстк11.ч|ках эмбриона ¡зеленок ¡(число {от нсходпойг ¡крыо (количв-iтиики (коли- j опухолей j-j-jCTBO "фокусов"; 4GOTOO 6ЛЯШК04- число

■ в це- ;в ядро¡трансформации¡образующих | животных) {луп кяет- ¡на 10 мкг ¡единиц на :

_j метку ¡ки ¡ДНК)_j! мкг ДНК) j

ДДК-ТБ 13,3 9,7 0 350-500 1/22

№ 11,8 8,2 9 10-20 ' 8/47

gK-те + да _ _ 8 • _ 3/16

днк-тб, гягоо-

лизованная СЭ 2 0

Sali

Контроль (без

внесения ДНК - 0 0.0

или ДНК-ТБ)

-------------------.

х) ДНК или ДНК-ТБ, предварительно меченные in vitro вводили

в киетки методом СА+'+-(г",осйатпой прецигштц.ции, Время от внесения в сроду до снятия''клеточного данослоя составляло 8 часов. В каждую пробу исходно вносили по 100000 имп/мин. XX) Каждое штатное (3-5-дпевные хомяки) било инокулировапо 3-5 мкг Тподко.тао),

Как видно из результатов экспериментов,'суммированных в таблице 4, инфекционные титры ДНК-ТБ в 30-50 раз превосходили таковые для депротешшзировашшх препаратов. Различия в титрах обусловливались именно присутствием ковалептносвязашюго ТВ, так как обработка препаратов проназой снижала их ин^екцпонпость до уровня, характерного для свободной -WIK. Кратковременный гидролиз ДЩ-азой и расщепление препарата СЭ Sali приводили к полной элиминации ин-фекционлости. Введение ДНК 3-16 и эдушх Ад в клетки почек или фибробласты эмбрионов крыс, вызывает образование "фокусов" трансформации. После обработки таких клеток (кенермносивных для Ад человека и обезьян) ДНК-ТВ в-1б , S-8H , s-5 , II—X и Н-6 нагл не удаюсь зафиксировать появление "фокусов" трансформация. Комплекс ДНК-ТБ ¡5-16', предварительно гддролизованный СЭ Sali индуцлровцл обрызо-

ванне "фокусов" трансформации, ио эффективность этого процесса била на порядок ши;е, чем в экспериментах с использованием Зь11-гидроллзата денротоипизированпой ДНК 3-16 (см,таблиц 2).

Сшгаыие или полное отсутствие тршшфоршруь^ец активности моино всецело приписать ТБ, поскольку после ого удаления проназой трлнсфорыпруш.ая активность ДИК восстанавливалась до нормального уровня. ШшнЗпрунщШ эффект ТО, как это следует из дашшх, приведенных б таблице <1, обладает только «ас-функцией, поскольку препарат комплекса ДЖ-ТБ, сиешдшшй ш vii.ro с деаротешшзнрэвац-яой ДЖ Ад, обладал трансформирующей и туморогонной акшвооопо, соответствуй: ;ой по эД^ектаипоста внесенному халачеошу ДШК.

Как видно иь Тиблаци -1, ДНК з-1 с> обладает высокой гдюрогеи-пои активностью. Через 49-55 дней после подковного введения пово-ровдвшш хсияим 3-5 то* ДНК возникали опухши. Туморогенная активность ДНК-ТБ оказалась существенно ппд'е до сравнении с денро-теанпзировлнной причем даже эта остаточная активность, вероятное воет, связана о присутствием свободной ¿ЦК в препаратах

11 связи с тем, '¡то одной из шоможшх причин, объясняющих ппгибируедее действие ТБ па проявление трансформирующей и туморо-генной актпиюати ДЖ-ПЗ, но.мет схуздгь влияние ТБ на этап проникновения ДЖ черзз цптопла ' ми про-

(таблица 4), здо оба типа молоку л генома Ад проштао* в клетки с одинаковой э 1фек пшностыз: 8-13 % от исходно виссонного в среду рддиоактлвкого матери-ига.

В тлйядце 5 суш. трона пи дшмо нескольких независимых экспериментов, цекалшяйдае, что инъекция готзрологачной вирусной ДЖ приводит, через 22 часа инкубации, к 3-6-кратнол стимуляция включения р.: 1 г'. 1 о л к х: 1 ь; I о го прсдоествешшш -и кис;: с то нерастворимую. фракцию по ¿¡ммгодю с контролен. Б качеств г.о школьно го следует считать вчразит, ь котором о сводит инъецируется суммарная сыесь •Хрзшонто» ДЦС Лд поело шаролаза СЗ. Ьведзнно в обоцят тамусиой ДК ле ;.'.о.«т еч^т.шоа адекваттг.; контролем, ик как в о том случае возаоаио пзв^-.-ниое ркжзчоние "*"Р во ееедом^» ДЖ, хотя бы за счет реилртишх про иссов.

Длн:;1.:^, с у; г шсов дшшо в таблице 5, соод/и? того, что в ошцитхе после яиьездии Д'Л.-.аЬ гц^ДОходят синтез ьа-

ДЖ-ТБ

вели пряьл« эылго^пшшеч

Показано

русного гецома de novo : I) включение Р-метки не стимулируется смесью фрагментов ДНК Лд или изолированным фрагментом ; 2) комплекс ДШС-ТБ значительно эффективнее стимулирует включение 32Р-мет-ки в геном вируса, чем депротешшзированная ДШС.

Таблица 5

Стимуляция синтеза ДНК в овоцитах X.Laevis после инъекции гетерологичной ДНК s-16 или Н-6

Инъецированная3^ ДНК имп/мин | Кратность

¡на один овоцит' i стимуляции

Без матрицы*3^ 1500 1,00

Тимуспая ДНК 0600 2,4 ,

ДШ-ТБ Ад ххх) 8600 5,73

Д!К Лд 6700 4,50

Смесь фрагментов ДШ-ТБ s-16 ,

гидролнзованной Sail 1800 1,20

Изолированны!} ВкШ А-фрагмент ДНК-ТБ S-16 1300 0,87

ДНК-ТБ S—16 , инъецированный в 1600 1,0

цитоплазму овоцита

х) ДНК, инъецированная в зародышевый пузырек овоцнта. за исключением специально оговоренного варианта введения /У НС в цитоплазму. Время инкубами 22 часа.

хх) Инъекция 'смеси дНТФ и "^Р дТТФ без ДШС.

ххх) Уровень включения Т метки п кпслотонорасг.юримую Фракцию при инъекции матриц 3-16 и Н-6 был практически одинаков.

Протоолиносрми как перепосчики ДНК аденовирусов в э.укэриотичесл'де кя^то'

Дяя получения лппосом (везикул) нами был избран метод обращенных фаз (0*-везикулн). Это способ является наиболее эффективным но степени захвата водорастворимого материала внутрь лотосом (до 65 %). Б доступной нам литературе мы не встретили работ по включению высокомолекулярных линейных ДНК в ОТ-возикулы, вероятно, дз-за деградации ДНК под действием ультразвука (у.з.). Для преодоления этого препятствия нами бита изучена возможность конденсации .и защиты от у.з. ДНК Лд с помощью полиямпна спермина.

Полученные нами в присутствии спермина конденсаты вирусных ДНК оказались малочувствительными к ультрпзвушкой обработке, что было продемонстрировано при анализе конденсатов ДНК, обработанных у.з., 'электрофорезом в аглпозном гело (рис.Ш).

.Г и r¡4

\ ! I ■

!

\ж.Ш А шита иирусных ДНК, конденсированных различными агентами и затем подвергнутых обработке у.з.

Олектрофореграмма агарозного голя после фракционирования в нем.

1 - ДНК фага , обработанной у.з.

2 - ДНК S-16 , обработанного у.з.

3 - JUÍIC фага , конденсированная спермином

(концентрация спермина - 200 мкм ; HaCl - 50 мкм ; ДНК - 20 мкг/мл) и затем обработанная у.з.

4 - ¿ÜiK фага , интактная (контроль).

5 - ДЫС а-16, конденсированная спермином

(условия см. п.З) и затем обработанная у.з.

6 - интактная ДНК 3-16 (контроль).

Для усиления активности взаимодействия липосом с эукариоти-еской клеткой обычно используют модифицированные везикулы, несуще на своей поверхности лиганды к рецепторам цитоллазматической ¡ембрани,

В качества белков-лигандов мы использовали поверхностные лпкопротепди (гемагглютишш) вируса гриппа. Встраивая гликопро-'еид снаружи в мембрану фосфолипидных везикул, нагруженных интере-ующим нас веществом, мо:;шо создать "контейнер", способный эффек-шзно переносить свое сокер^шмоо в недеградированном состоянии в дтоплазму клетки.

Химическую модификацию гликопротеида осуществляли с помощью альмитлновой кислоты, которая ковалентно связывалась с нк^ -груп-:аш белка гемагглютишша (ГА). Остатки лирных кислот служили за-'ем "якорями" при встраивании ГА в мембрану липосом. Проводя прочее рекоиструыцш, мы получили везийулы, которые юсле очистки фло-ацией в фиколе, проявляли ГА-активность.

Для отделения "пустых" протеолипосом от "нагруаешшх" везикул и использовали метод фракционирования липосом флотацией в ступен-;ато"м градиенте }икола.

Транс^ецирующуа активность включенных в очищенные протеолипо-юми ДНК 0М0 и проверяли на культуре глеток 11&1»

Как следует аа дэшшх, приведенных в тибдиде 6, использование

"иги.ружя'дах" лшмзом позволяет получить более высокий уровень ия$окп«оШ1ой аютвноста ,ШК Ад по сравиешт с результата!.«!, полученными, с применением метода Са-фосфатпой преципитации.

Таблица 6 Инфекциониость ДНК ¡3-16 и 0В40

Й««гтоат ?И«<1ею№М1~ '¡Отношение , ¡Отношение

^ тность ЬОй/мкГ)удельной ин- }удельной ин-

I включенной ¡фекциошюстя ¡дскшюнности }ДШ< I) {лшгосом к 0а~;' протеолпносом : ¡¿.ос(Татно51 ¡к стандартным

■ { ¡преципитации ¡лшгосомам 3)

| 0МО I 8-16 { 01И0 | 5-16 то | ! з-'?б

Стандартные линосокш 'с ротацией 612,4 7,6 34,5 2,8 •

•дез (Тяотаддя 332,2 - 18,5 - - -

%>02.еолатюоома 1*Л5 <ь флотацией 990,6 290,5 55,0 .107,6 1,6 38,3

без -«иотации '895,5 243,4 49,7 90,2 2,7 -

'%чдаоляпосомы 1:2 <о ротацией 66,6 „ 24,7 8,8

;боз флотации - - - - - -

у.р'едатктеддаа ■ 18,0 2,6 - - - -

;'[) В случае ^а-фте^атной преципитации на I ыкг дик, взятой в опят. "1:5'" а "1:2'' - обозначение весового соотнсиония балок/лшгад,

взятого дли получения иротоолипосом.

3) Сраг-игоэди значения удельной ишТокциошюсти препаратов протео-лииоосо)! и лапосом, прошйдаих 'одинаковые этаии очистки от не-вглтешых гчаруеиих Д11К я белков.

!;, I, .(Ут ¡Ш получева следующие значения возрастания у«?ль-

¿¡^.¿Лг/етсциошзоста по сравнению с Са-нрецшштационным методом: Шр^фяЬохьпо г> три раза выше для препарата стандартных липосом и в ¿С? 'раз 'больше для протеолилосом (препарат "1:5").

^..суоуирстапде текоибянантных ДНК на огякгое ' рД&НОВНсов

- ■ 'стратегической задачей пашах жсследо&ашй было кон-

в.труировш!е 'рекоыбинантпых да на основе генома Ад, то есть создание вектора для зукариотических клеток. Результаты изучения Ад, предстаачонкне в дэшюй работе, а такге информация об особенностях

структурно-функциональной организации Ад, имеющаяся в научной литературе, позволили нам впервые сконструировать рекомбанантную Д11К, содержащую помимо генов Ад и участка генома 0В40 генетический материал вируса иву • Причем гибридная ДНК была упакована в вирусную капсиду и пассировалась на культуре клеток. Один из генов ЯВУ в составе рекоыбинантного вируса экспрессировался и был обнаружен в культуральной жидкости.

Исходным материалом для получения рекомбинантного вируса были пяазмиды, содержащие следующие участки ДНК: правый конец ДНК Н-1, включающий "несущественную" область генома Н-1; фрагмент ДНК гибрида Ад-01340, содержащий участок ДШС Ад с последовательностью генома 0В40, кодирующий С-конец Т-антигена 0В40 ; геном вируса НВУ (см.рис.£1). ........ .....

I

!(>' N -4*4 •"-»г.'.'1

• ■ ; II•

£иСдП. Схема трансфекции рецапиентних (линия 293) и селективных

(линия су-1 ) клеток лиглрованной смесью ДНК плазмиды разно (или 13) и Есош: гадролизата ДНК Н-1. Под схемой приведены микрофотографии клеток СУ-1 .

1. Клетки оу-'| , инфицировашме лизатом незараяешшх клеток 293 (контроль) (щД не выя&тяется).

Идентичная картина наблюдалась при заражении клеток ли-

затом клеток 293, предварительно трансформированных ДНК вируса

2, Клетки ОУ—1 , иноицаровэнные лизатом клеток 293, поело предварительной трансаекцаи последних лиги£ованноЗ смесьа ДНК плазмн-да рАЗКо (или 13) п Есонх глдролазата ¿¿К Н-1,

Участок генома 0B4D был введен в рекомбинантнуто ДНК в качестве селективного маркера,' так как этот фрагмент ДНК 0М0 придает геному H-I способность репродуцироваться в клетках обезьян.

Проводя ко-трансфекцию оуперчувствительных клеток линии 293 гибридной плазмидой рАЗШЗ (содержащей селективный маркер /ДНК ОВ40/ и геном HBV), а также фрагментом генома H-I (выделенный из вирионной ДНК), мы получили популяцию вируса HI-SH13 , содержащую рекомбишштные формы ДНК. Рекомбинация в данном опыте прошла за счет перекрывающихся вирусных последовательностей, содержщихся в составе плазмидя и. фрагмента шрионноц ДНК, введенных в клетку.

Экспрессия гена S вируса гепатита В в составе .

рекомбинантного аденовируса,

Рекомбинантная вирусная популяция HI-SH13 была. трижды про-клонкровдна через "бляшку" на клетках CV-1 . Клонированный вариант Ш-ЭШЗ, получил индекс 92.

Вопрос о возможности экспрессии гена вируса' гепатита В в составе частиц популяции 92 был решен с помощью иммунологического теста. Иммуноферментным методом анализировали пробы культуральной среда, взятой с монослоя клеток Hala , зараженных популяцией 92. Анализируемую культуральную жидкость перед постановкой ишунофер-ментного теста центрифугировали в градиенте плотности хлорида цезия. Как видно из рисунка 12, в пробах культуральной жидкости клеток Hela , зараженных вирусом популяции 92, после центрифугирования в csQl выявляется четкий пик HBsAg в зоне с плотностью 1,20 г/см3, который соответствует локализации нативной формы этого антигена в виде частиц 22 им, продуцируемых клетками Александра. Продуктивность меток, зараженных рекомбинантным вирусом, составляла 0,5-1,0 мкг HBsAg 11а 10 мл среды.

ра основе HI-I15 рекомбинанта

При изучении вирусного генома недефектного вектора H-I-5 ЕЗ мы использовали исходную' плазмиду, содержащую "В" и "С"- EcoRl фрагменты ДНК H-I, в которой был заменен участок генома H-I с координатами 75-98 % на фрагмент ДНК Н-5 с теми же координатами. Такая' замена обусловлена тем, что только в ДНК Н-5 (из всех изученных Ад) несущественная область (78-85 %) удается столь точно и полно действием одной СЭ: хъо1 . Поскольку геном H-I является у нас базовой ДНК при конструировании векторов, мы .использовали

Q5 Q4 Q3

02 h

fi-csce 1,20 1,21 г/см3

20

Рис.13 Результата иммуно-фешентного анализа функции градиента csci после равновесного центрифугирования кулиуралъной ;ждкости о монослоя клеток Hela , заражениях различными вируеныьщ

ПОПУЛЯЦИЯМИ.

По оси абсцисс - номера фракций гпадиента СзС1; по оси ординат - поглощение при 490 им (оптическая плотность продуктов иммунофер-ментноп реакции в зависимости от концентрации Hbsüg).

1 - вирус- 92 ;

2 - вирус 92 + анти- нвэла-

сыворотка ;

3 - культуральная жидкость

с монослоя клеток гепато-нарцинош (линия Алексан-дш), положительный контроль ;

4 - вирус H-I - эталонный

шташ (отрицательней контроль).

его и в данном случае, произведя соответствующую замену участка ДЖ H-I на последовательность Н-5 по гомологичным сайтам ОЭ. После удаления в гибридной H-I-5 плазмиде "несущественной" области МЧ лигировали фрагмент ДНК H-I-5 из плазмиды с соответствующим участком генома H-I из вирионной ДНК, с восстановлением целостности генома Ад за исключением "несущественной" области. После транс-фекцни клеток 293 била получена гомогенная вирусная популяция Н-Г - 5 ЕЗ, содержащая заданную делецию в геноме и не требующая вируса-помощника.

Полученный вектор H-I-5 ЕЗ имеет емкость 3,8 тнп (с учетом возможной упаковки 105 % мол.массы генома в капсиду Ад).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итогом настоящей работы является комплексный анализ структурно-функциональной организация ДЖ группы ранее ле изучавшихся аденовирусов человека и животных. Выявлены общие закономерности организации генома аденовирусов человека и животных. Полученные данные позволила отработать различные схемы получения и селекции

дефектных н недефектных рекомбинантных аденовирусов. Используя эти метода, впервые была получена популяция рекомбинантного аденовируса, содержащего геном вируса гепатита В (HBV). Впервые показана экспрессия S -гена нот в составе рекомбинантного аденовируса.

Предложенная схема использования ДГ£К аденовирусов в качестве вектора для введения экзогенной ДНК в эукариотические метки может иметь широкий спектр применения. Это касается как уводимого в клетку генетического материала, так и спектра трансфецируемых клеток.

Таким образом, изучение молекулярной и субмолекулярной организация генома Ад и их рекомбииантов, а также развитие техники генной ишазнерии, позволит приступить к целенаправленному создании аденовирусов с запланированной структурой генома.

ВЫВОДЫ

1. Предложен универсальный способ получения'рекомбинантных аденовирусов, содержащих экспрессируемуго гетерологачную генетическую информацию. Впервые на основе ДНК вирусов H-I и Н2+га>1 получена популяция рекомбинантного аденовируса, содержащая геном вируса гепатита В (KBV).

Показана экспрессия гена HBV , кодирующего HBsAg в составе рекомбинантного аденовируса при его репродукции в культуре клеток. Концентрация KBaAg в культуральной жидкости составляла I мкг/10 мл среда.

2. Впервые с использованием технологии генной инденерии проведено комплексное сравнительное изучение структурно-функциональной организации ДНК аденовирусов человека (II—I и 'Н-6) и дивотнчх (s-5, S-8H, s-16, BAV7 и üds). Выявлены общие закономерности топографии генома аденовирусов человека и животных.

а) Построены физические карты геномов восьми исследованных в работе аденовирусов человека и животных с помощью набора рест-риктаз. Полученные нами физические карты для ДДК вирусов H-I, Н-6, S-5 » S-8H и s-16 приняты в качестве эталонных Международным Комитетом по таксономии аденовирусов. Па основании рестрикцяонного анализа ДШ аденовирусов предложен метод "генного" типирования вирусных популяций и отдельных изолятов.

б) Проведено функциональное картирование ДНК вирусов H-I, IÍ-6, s-5 , S-8H , S—16 и bavj . Определены координаты, расположения

онкогена (0-Л ед.флз,карта) ; гена, кодирующего синтез балка II (гексона) (50-60 ед.аиз.карта) ; гена, ответственного за экспрессию терминального балка (23-28 ед.(¿яз.карты), идентифицирована "несущественная" для репликации вируса область (78-85 ед.физ.карты) в геноме названных вирусов. Выявлена аналогия в локализация перечисленных выше генов в ДЩК аденовирусов человека и животных. Локализованы консервативная и вариабельная области гена, кодирующего белок II (гексон) у аденовирусов человека и животных.

3. Впервые обнаружена неспособность онкогенов аденовирусов к реализации их трансформирующей активности в составе янтактного комплекса ДНК-терминальный белок. Впервые выделен и изучен терминальный белок аденовирусов Н~1, Н-6, Ц-5 , з-вн , Э-16 и ВАУЗ.

Установлена с помощью олигоиуклеотидкого картирования высокая степень гомологии первичной структуры терминального белка аденови-' русов человека и животных.

4. Получена и охарактеризована коллекция линий клеток, трансформированных с использованием: .

- ДНК (или ее фрагментов) Н-1, Н-6, 3-5, 3-16, Оо1о}

- плазмиди, содержащей онкоген ¡3-16}

- ко-трансфекциек ДНК ¡3-16 и плазмидой, содержащей геном вируса гепатита В (яву) или плазмидой РВН322.

Во всех изученных меточных линиях наблюдается стабильная интеграция с клеточной ДНК я экспрессия только онкогена аденовирусов. Не обнаружено специфических локусов интеграции аденовирусных последовательностей с меточной ДНК,

Получела а охарактеризована линия меток бн-2 , обладающая уникальными онкоганнымд потенциями. Сто меток БН-2 способны индуцировать опухоль у ксеиогенпого животного.

5. Разработан и апробирован тест для диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота,с помощью "ДНК-зонда". В качестве "зонда" использована рекомбинантная плазмида, содержащая ген, кодирующий оелок £1 (гексон) аденовируса вауз . Использование плазмиды-зонда позволяет детектировать наличие последовательностей ДНК аденовирусов крупного рогатого скота I и П подгрупп в экскретах тестируемых ;хивотных. Чувствительность метода 10-30 пкг в пробе,

6. Впервые продемонстрирована возможность использования овсця-тов х.Ьавтг!£ в качестве спаренной системы транскрипции а репликации ДНК аденовирусов. Показана корректность процесса репликация

ДНК S-16 и Н-6 в овоцитах X.Laevis . Продемонстрировано, что гены аденовирусов Н-6 a S-16 , как в составе интактной ДНК, так и в составе рекомбинаитных плазмид, .эффективно транскрибируются В ОВОЦИТах X.Laevis.

7. Впервыо показана высокая эффективность переноса интактной Д!К аденовируса в клетки с-использованием протеолипосом. Эффективность трансфекция ДНК S-16 при введении в пермиссивные клетки

с помощью протеолипосом на два порядка выше, чем при использования классического метода Са-фосфатной преципитации. Разработан новый метод эффективного включения ДНК аденовирусов (и друхмх высокомолекулярных ДНК) в моноламелярние липосомы с использованием конденсирующего агента - спермина. При этом сохраняется биологическая активность генома.

8. Сконструирована модель недефектного вектора для эукариоти-ческях клеток на основе рекоыбинанта между ДНК Н-1 и Н-5' с деленной по "несущественной" области с координатами 75,5-83,4 Емкость вектора (возможность включения чужеродной генетической информация) - 2,4 ЫД.

9. Предложена общая схема очистки специфических эндонуклеаз, основанная на использовании аффинной и гидрофобной хроматография. Выделены рестриктазы: EcoKI, BemHI, Sail, Saol и и , Sgl I n II, Ssp16, Kpnl и другие. Выделен новый фермент S3p16, у которого идентифицирован уникальный сайт узнавания ЦЦ IT.

На способ очистки рестриктирующих эндонуклеаз и новый фермент получены два авторских свидетельства. МРТУ и ТУ на производство рестрактаэ EcoBI.Bomiil и Sali передани в Московский ЙМВС им. И.И.Мечникова МЗ СССР.

Работа по разработке и внедрению методов выделения рестриктирующих эндонуклеаз удостоена в 1981 году премии Совета Министров СССР.

• СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

I. Народицкий Б.С., Карамов Э,В., Чаплыгина K.M. и др. Фрагментация ДНК аденовируса человека типа 6 с помощью рестриктаз // Вопр.вирусол. - 1976. - 4. - С.63-86,

'2. Народицкий Б.С., йелищна Т.Ф., Карамов Э.В. и др. Анализ генома аденовируса человека типа 6 с помощью рестриктазы //

Докл. АН СССР, - IS77. - Т.237. - С.228-232.

3. Завизион Б.А., Народицкий Б.С., Карамов Э.В. и др. Фрагментация ДНК аденовирусов обезьян S&7 (G8) рестриктазами //Вопр. вирусол. - 1978. - là I, - С.48-52.

4. Naroditsky В.S., 2avi2ion Б.A., Xaramov B.V. et al. Analys of adenovirus ЗА? genome by restriction endonuclease3 // Hucl.Scids Hea. - 1978. - V.5. - Р.999-Ю4.

ionomareva Ï.I., Grodnitskaya H.A., Goldberg K. 2., Chap-ligiba Ы.М., Haroditsky B.S., Tichonenko i'.I. Biologioal activity of intact and cleaved 1ЖА of simian adenovirus ЗА? // Huol. Acid, fiea., - V.6, И 9, 1979- - P.3119-3132.

6, Borovic A.3., aavizion B.A., Haroditsky B.S, Kinetio studies of the Ad6 DHA cleaved by restriction endomclaaae BaaHI // 3?1!BS Symposium on ША, Prague, 1979»

7. iJinitrov V.X. , Karoditsky B.S. , Tichonenko T.X., I/ubitchev A.G. Restriction. шара and physical properties of SVJ8 // J.Gen. Virol. ,-1979,-V.- P.09-80.

8• Народицкий Б.С., Грубер И.IL, Цветкова Н.В., и др. Способ получения бактериальной эндомклеази Sali // Авторское свидетельство - й 767197 от 6 июня 1280 г.

9. Народицкий Б.С., Гарасв М.М., Бобков А.Ф. и др. Клонирование фрагментов ДШ аденовируса обезьян 7 в бактериях с исполь-зованиал^цктора рвй 32г // Докл. АН СССР. - 1980. - Т.253. -

10. lJarouituky B.ti., Kulinina 'i'.I., Goldberg E.2. et al. Analysis of DHA froia human adenovirus type 6 vd.tS restriction endonucloases Hindlll, Byeli and BamHX // Biochem. et Biophy3,

Acta. - 1980. - V.606. - P.214-227.

11. Haroditsky B.S., Kalinina Ï.X., Goldberg B.2. et al. Analyses of ША from human Adenovirus ъуре 6 witE restriction endonucleases HindXXX, BglXI, BaaHI // Biochem. et Biophys. Aota,

1980,-V.606. - P.214-22?.

12. I.Iedvedsky P., Zavizion B.A., Berenchy Gy., Ch'aplygina JJ.Iti., Haroditsky B.S. et al. HindXIl restriction sits шар of hynan Adenovirus type 1 DHA // Archives of Virol., 1980,-V.67,

- p.bs-90.

13. Хилько С.П., Григорьев В.Г., Народицкий Б.С. а др. Анализ структурных белков аденовирусов обезьян и человека // Вопр.виру-сол. - 1981. - Л I. - С.48-51.

14. Лопарев В.П., Завизион Б.А., Народицкий Б.С. и др. Физическое картирование аденовирусов обезьян // Вестник АМН СССР. -

1981. - Т. 2. - С.52-59.

15. Пародацкий Б.С., Хилько С.Н., Лопарев В.Н. Современные методы выделения специфических эндонуклеаз // Вестн.АМГСССР.

- 1931. - И 2, - С.26-28.

16. Xlchoiwnko Т.Т., Chaplygina if.U., Kalinina T.X., Narodit-ky B.S. Integration of foreign genoiie fragment into cells tr&ns-ornmd or oortansforiued witli fragment Ad ША // Gens. - 1981. -.15. - P.349-359.

17. Хилько С.П., Григорьев В.Г., Народицкий Б.С. а др. ■налаз структурных белков аденовирусов обезьян и человека. // !опр.вирусол. ,-1981,1,-0. 48-51.

18. Goldberg К,2., iiaroditsky B.S., Felgengauer Je.iS., Ticho-neoko T.I. Replication of heterologous DIM injected into Xenopus Laevis // FtfBS Letters. - 1981. - V.124. - P.215-225.

19. Tichonenko T.I., Pubichev A.G., Chaplygina N.M, , Kalinina T.I., Naroditsky B.S. The distribution of guanino-cytosino pairs in adenovirus ШЛЗ // J. Gon. Tirol., - 1981. - V.54. -

20. Мирошниченко О.И., Народищшй Б.О., Хилько С.Н. и др. Использование методов айТинной хроматогоаами для очно тки споцийи-ческих^эн^онукяеаз ЕсоВГ и Bglll // Биохимия. - 1982. - Т.47 .

21. Народицкий B.C. Онкогены аденовирусов // Вирусные онкогена // М.: 1982. - С.37-59.

22. Мирошниченко О'.И,, Народицкий Б.С., Пономарева Т.Н. и др. Синтез S&7 и Ad5 аденовирусной ДНК в ядрах и ядерных экстрактах клеток зеленых мартышек //Молекуляр.биология. - 1982. - Т.16.

С.782—789. *

23. Народицкий Б.С., Вилнис А., Лопаров В.Н., Клонирование и трансформация клеток плазмлдами, содермцими фрагменты ДИК аденовирусов, в том числе и онкоген // Рекомбинантные ДНК. - Пущино. -I9B2. — С,88-89.

24. Дебов С.С., Тихонешсо Т.И., Упорова Т.М., Народицкий Б.С. и др. Способ получения рестриктазы ВсоСК!// Авторское свидетельство - ii I06704I от 15 сентября 1983 г.

25. Глушакова С.Е., Кислина О.С., Народицкий Б.С. и др. Включение высокомолекулярных вирусных ДНК в липосомы с использоваш1ем конденсирующих агентов // шлекуляр.генетика, микробиология и вирусология. - 1983. - № 6. - С.ЗЙ-ЗБ.

26. Скшшкин Е.А., Мирошниченко О.И., Народшдкий Б.С., Тихо, ненко Т.И, Первичная структура инвертированных концевых повторов

аденовируса обезьян SA7// Молекуляр.генетика, вирусология и микробиология. - 1983. - № 12. - С.43-46.

27. Мирошниченко О.И., Скрипкин Е.А., Народицкий E.G., Тихо-ненко Т.Н. Клонирование концевых фрагментов аденовирусов II—I и S-16 //^Ыолек^ляр.генетика, микробиология и вирусология. - 1983, - JS12.

28. Пономарева Т.И., Гродницкая Н.А., Тюяшшов Г.И., Народиц-кий Б.С, и др. Получение ланий клеток, трансформированных высоко-онкогенным аденовирусом обезьян SA7 и неонкогенным аденовирусом человек типа 6 и их ДЩ // Вопр.вирусологии. - 1983, -й 3, -

С.337-341.

29. Глушакова С.Е., Гродницкая Н.А., Народицкий Б.С. и др. Оптимизация переноса и внедрения в ¡слетки вирусных JKtK с помощью лилосом, связанных с гликопротеидагли вируса гриппа // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. - 1985. -S7. - С.32-35.

30. Кислина О.С., Народищшй Б.С., Григорьев В.Г. и др. Эффективность включения конденсированных спермином вирусных ДНК

в липосомы. Взаимодействие липосом с метками // Молекуляр,генетика, микробиология и вирусология. - 1985. - 1Ь 2. - С.17-21.

31. Мирошниченко О.И., Народицкпй Б.С. Молекулярная биология природных и сконструированных in vitro рекомбинантов аденовщ>уса человека и 0В40 // Молекуляр.генетика. - I986. - й 2. - С.З-1Г.

32, Народицкий B.C., Мирошниченко О.И., Пономарева Т.Н. и др. Экспрессия гена s вируса гепатита В в составе рекомбинант-ного аденовируса // Молекуляр.генетика.Í986. - Ii I. - С.42-44,

33. Кругляк В.А., Еелоусова Р.В., Народицкий Б.С. и др.' Клонирование фрагментов шрионно{) ДНК Ag крупного рогатого скота DAV3 в плазмиде рис19 // Докл. ВАСХЙМ. - 1987. - Ä II.

- С.4.1 -44.

34. Мирошниченко О .И., Народицкий E.G., Тихоненко Т.Н. и др. Использование метода гибридизации с клонированным фрагментом генома ЕАВЗ для диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота // Вестник сельскохозяйственных наук. - 1987,- № 9.

- С. 91-93.

35. ïllcclionetiko T.I., G^uahakova З.Е., Hialina O.S., Manykin A.A., Haroäitsky U.S. Transfer of condensed viral DMA lato euka-ryotio cells using proteoliposomea // Gene. - 19SS. - -

Ï. 321-330.