Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO для экспрессии генетической информации в организме млекопитающих и птиц

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO для экспрессии генетической информации в организме млекопитающих и птиц"

¡А-ЪЪСЪЧ-

На правах рукописи

Логунов Денис Юрьевич

JlH

Конструирование рекомбинактных аденовирусов птиц CELO для экспрессии генетической информации в организме млекопитающих и птиц

(специальность 03.00.03 — молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2002 г.

Работа выполнена » лаборатория генной инженерии эукарнот ВНИИ сел ьс кохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научный руководитель: кандидат биологических наук, К.К.Доронин Научный консультант доктор биологических наук, Б.С.Народнцкнй Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук Н.В. Каверин

доктор биологических наук, профессор Б.П. Копнин

Ведущая организация — Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита диссертации состоится " "_ 2002 г,

в_ часов на заседании Диссертационного Совета Д.006.027.01

при ВНИИ сельскохозяйственно» биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42., тел. 211-38-10, факс 977-09-47

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " " _2002 г.

Ученый секретарь

Мел и ко ва С. А.

ОБШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аденовирусы, наряду с другими ДНК-содержащими вирусами, представляют собой широко используемую модель в молекуляряо-биологическнх, биомедицинских и ветеринарных исследованиях. Это обусловлено рядом особенностей их структуры и цикла развития.

Экспрессию аденовирусных генов осуществляет ферментативный аппарат клетки-хозяина, что позволило эффективно использовать аденовирусы для изучения фундаментальных механизмов транскрипции н трансляции.

На поздних стадиях инфекции происходит селективный синтез вирусных белков, в то время как трансляция мРНК клетки-хозяина блокируется. Это делает аденовирус идеальной моделью для экспрессии чужеродных генов, встроенных а вирусный геном. С другой стороны, трансформирующие, а в ряде случаев, онкогенные потенции аденовирусов, обусловленные активностью ранних вирусных генов, позволяют использовать их в качестве ценного инструмента для изучения путей молекулярных взаимодействий продуктов ранних вирусных генов с регуопорными элементами клеточного цикла.

Накоплены обширные знания о возможностях применения аденовирусов человека в качестве векторов дня лечения заболеваний человека и животных. Масштабные научные исследования и наличие значительного количества точек практического приложения аденовирусных векторов, обусловлены целым рядом их биологических свойств. Широкая трогтностъ, высокая пакующая емкость и способность расти в высоком титре, определили преимущество аденовирусов над большинством других вирусных векторов.

Значительное распространение получили аденовирусные векторы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа (Ад5). Наряду с неоспоримыми преимуществами этих векторов существует ряд недостатков, среди которых значимыми являются их иммуногенностъ и наличие у большинства людей предсуществующего иммунного ответа.

Активация иммунной системы на введение вирусного вектора существенно ограничивает время экспрессии целевых генов в организме человека, что в свою очередь отрицательно влияет на эффективность генной терапии. В связи с этим, многих исследователей привлекают возможности создания векторов на основе аденовирусов животных и птиц.

Новой и перспективной представляется векторная система на основе аденовируса птиц 1 серотипа (CELO). Вирус неспособен р-ппмтмрлнятьг« и i^yjya* млекопитающих. обладает повышенной пакующей емкостью и большей i iKWteoW Aótóuíoctbio по

сравнению с Ад5. Иммунная система человека несснсибилизирована х вирусу, что позволяет предположить эффективное применение векторов на основе CELO (отдельно или последовательно с Ад5) дня увеличения периода экспрессии целевых генов в организме человека.

Важным достоинством CELO является его способность к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах. Это делает процесс накопления вируса технологичным к экономически привлекательным.

Оруктурно-функииональная организация элементов капсида (пентонов) CELO позволяет их направленную модификацию для повышения тропности вируса по отношению к определенным типам клеток, что может быть значимо для практического применения вектора.

В настоящее время опубликвано незначительное количество работ, посвященных изучению биологии вируса CELO и, практически отсутствуют экспериментальные данные характеризующие "поведение" рекомбинаншых вирусов in vivo. В связи с чем, исследование основных характеристик (иммуногенностн, эффективности доставки целевых генов, времени экспрессии и др.) векторной системы CELO в различных организмах представляет самостоятельный научный интерес.

Цель и зшачн исследования

Целью настоящей работы являлось изучение векторной системы CELO в различных животных моделях, с использованием генов SEAP и р53.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1 .Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих ген SEAP или р53 под контролем CMV-промогора в сайт« делении несущественной области генома CELO.

2. Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих ген SEAP или р53 под контролем CMV-промотора в месте делении фрагмента EI области аденовируса человека 5 серотипа.

3. Сравнение эффективности векторных систем на основе Ад5 и CELO путем транедукции различных культур клеток.

4. Изучение кинетики накопления трансгенов на модельном примере SEAP в аллонтоисе куриного эмбриона, в зависимости от количества инокулированных частиц вируса С ELO-SÉAP.

г

5, Изучение экспрессии целевых генов, встроенных в геном вируса CELO, в организме пермиссивных и непермиссивных животных.

6, Определение функциональной активности гена р53, встроенного в геном CELO in vitro и in vivo,

7, Изучение возможности ннгибироваиня опухолевого роста вектором CELO, экспрессирующим ген опухолевого супрессора р53.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые получены рекомбкнантные векторы CELO-SEAP н CELO-p53. Путем трансдукции различных клеточных культур определена эффективность вектора CELO-SEAP, в сравнении с аналогичным вектором на основе Ад5.

Впервые была изучена кинетика накопления трансгенов, встроенных в геном CELO, в аллонтоисе куриных эмбрионов.

Впервые показана принципиальная возможность детекции экспрессии траяспева (SEAP), встроенного в геном CELO, в сыворотке крови животных, при различных путях введения вектора CELO-SEAP.

Определено время персистенции экспрессии трансгена (SEAP) при многократных внутриопухолевых инъекциях CELO-SEAP, и влияние на уровень экспрессии трансгена гуморального иммунного ответа.

В хеше работы была показана эффективная экспрессия и функциональная активность гена р53, встроенного в геном CELO, в различных линиях опухолевых клеток.

Впервые показано ингибирование роста опухолей вектором CELO-pS3.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, но и в перспективе может иметь практическое приложение. Векторы на основе CELO могут быть использованы дня создания средств профилактики различных заболеваний и в качестве терапевтических агентов для коррекции повреждений в геноме клеток млекопитающих.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы. Результаты работы представлены на 10 международной конференции "СПИД, РАК и Родственные проблемы".

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на Ш страницах машинописного текста и состоит нэ введения; обзора литературы;

экспериментальной части; результатов и их обсуждения; выводов; списка цитируемой литературы, включающего 137 библиографических ссылок. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 2 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В экспериментальной части работы использованы рекомбниактный аденовирус CELO-GFP, любезно предоставленный Шмаровым М.М. (ВНИИСБ), аденовирус человека AdS - прототипный штамм, аденовирус ггтиц CELO штамм FELPS.

В работе использован лабораторный штамм Escherichia coli DH5a

В работе использовались клетки линий : Н1299, А431, НСТ-116 (карциномы легкого человеках получены от д.б.н. Чумакова П.М.(ИМБ); В16 (меланома мыши) получены от д.б.н. Казанского Д.Б.(РОНЦ); LMH (leghorn male hepatoma) предоставлены доктором M. Копен (Австрия); 293(клетки эмбриональной почки человека, трансформированные El область Ad5); А549 (карцинома легкого человека).

В качестве животы моделей использовались: мыши линий D2&1, CS7BL/6 и 40-дневные цыплята.

В работе использовались стандартные шшмидные векторы pQEM2, pGEM3z(f-) ("Promega"), pRc/CMV ("liwitrogen"). Плазмиды pJM-17 и pdlEIspIA получены от Dr. F. Graham (McMaster University, Hamilton, Канада).

Синтез дезоксиолнгонуклеотндов проведен ЗАО «СИНТОЛ»,

Траисфехцню клеточных линий проводили методом кальций-фосфатной преципитации (Graham & van der Eb, 1973). Все манипуляции, связанные с получением рехомбинактных аденовирусов проводили согласно Graham & Prevec (1991).

Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методикам, изложенным в Mamatiü et at. (1982). Определение активности SEAP (секретируемой щелочной фосфатазы) проводили по методу Berger (1988). Экспрессию ß-галактозноазы олрелялн методом Li (1998). Определение анрусспецифическнх антител проведали методом непрямого ИФА.

Аденовирусы человека накапливали в культуре клеток линии 293 по методике Green (1980). Аденовирусы птиц CELO накапливали в куриных эмбрионах (Laver et al. 1971).

1, Результаты и их обсуждение. 2.1. Конструирован не рекомбнкантных аденовирусов на основе генома CELO и генома аденовируса человека S серотнпа

Конструирование рекомбннантных аденовирусов CELO (ÇELO-SEAP и CELO-p53), несущих в составе геномной ДНК ген SE АР или р5 3 проводилось методом гомологичной рекомбинации в культуре (слеток LMH.

В плазмндный вектор pCBEtllRV, несущий фрамент генома CELO от 88,8 до 100 ед. карты, в сайт делеции несущественной для репликации вируса области (от 95,3 до 99,7 ед. карты) субклон ировалн экспрессирующие кассеты (промотор ранней области цитомегаловируса, ген SE АР или геи р53, сигнал полнаденилировання гормона роста КРС).

Полученными плазмидными конструкциями pCBEdtRV/SEAP и pCBEd[RV/p53, совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной по эндонуклеаэе рестрикции SwaI, трансфицировалн клетки LMH. В результате гомологичной рекомбинации восстанавливалась инфекционность вирусного генома с включением экзогенной последовательности (промотора и целевых генов) (см. рис. 2).

Получение рекомбинантных аденовирусов Ад5-р53 и Лд-SEAP проводили в соответствии с методом, предложенным А. Бетт {221-

Ген SEAP или ген р53 под контролем CMV-промотора с сигналом полиаденилирования были субклон ированы в плазм иду pdlEIsp! А, несущую фрагмент генома аденовируса человека 5 серотнпа от 0 до 16,1 ед. карты.

Полученными плазмидными векторами pdIEIspI A/SEAP или pdlElsplA/p53, совместно с пяазмидой pJMl?, несущей полноразмерный геном делеционного мутанта di309, котрансфнцировалн клетки линии 293. В результате гомологичной рекомбинации получали вирусы Ад5-р53 и Ад5-5ЕАР.

Чистоту препаратов рекомбинантных вирусов CELO-SEAP, CELO-p53, Ад-SEAP, А Д-р 53 определяли полимеразно-цепной реакцией (см. рис. 3). Для определения в исследуемы» образцах ДНК CELO-SEAP Я АдЗ-ЭЕАР использовали праймеры SEAPD1 и SEAPR1.

Отсутствие примесей ДНК вирусов дикого типа детектировали с помощью праймеров СВЕ1 и CBE3(CELO)b прайм еров P25 и WTElR(Ao5).

Для определения ДНК CELO-p53 использовали праймеры р53М2 я СВЕ4. Определение ДНК ре комби нантного вируса Ад5-р5Э проводили с использованием

праймеров Р25 и р53-1 (см. рис. 3).

Все исследованные препараты содержали ДНК рекомбинантных вирусов и не содержали примеси ДНК вирусов дикого типа.

Геком аденовируса CELO „ - ж.,

— — Ш» —7—I М

О t.K.

рСВEd 1RV/SE АР СГ /

/р53 SEAP

. p¿3

I SEAP |

Геком рекомбинаитного аденовируса CELO Рис. 2. Смма получения рекомбкиантных аденовирусов CELO

i.ic.< единицы карты. .

Рнс. 3. Электроф регрям и а ПЦР-аналюа ДНК

рекомбюшпных ищет

F**"^ CELO-SE АР, CELO-pS3, Ad5-SEAP, Ad5-p53 IA, tt IR - отрицательные юнифолы режциц ¿4.- ДНК пчшииды pCBEd¡RV/SEAP (паюжитетъный конпфаяь

реакций (А), Ж- ДИК пяазмиды pCBEdtRV/p53, ¡A -ДНКщзуоа CELOSEAP, ЗЕ-ДИКвщка СЕШр53,4Áu4R- оггрщат&ьные контрошр&щш, М бК-ДНКщжаСЕЮ-

р$3, 7А. u 7В • отрицательные коктрояи режущ 8Á - ДНК птзмчды pdlEIspIAfcE,4P (пашхясипельный конпропъ pe¿*w4-8K -ДНК пнзмиды péEispiA-'pS'i (гктэкщтяьщютрая» реаафш} 9А -ДИК щуса AáSSEAP, 9К- ДНК труса Ад5-р53, Ш и 10Б. - отрицательные хонтрояиреаат Н А.-ЩШвчРусаАдЬ-5ЕЛР, JIE-ДНК вируса AÓ5f>53,12А и12& -ДНКвыруса AóS Ыжоео trono. М-ьицмерматехулярных весов VPstl

22. Трансдукцин клеточных культур рекомАнинтиым аденовирусом CELO-SEAP

Для исследования кинетики накопления транс генов in vitro, рекомбннантнымн вирусами CELO-SEAP и Ад 5-SEAP был трансдуцкрован ряд клеточных культур (рис. 4). По литературным данным, уровень трансдукцин культур клеток человека рекомбннантными вирусами CELO сравним с данными по трансдукцин для Ад5 [85]. Это может объясняться тем, что длинный фибер CELO способен взаимодействовать с CAR (coxsakie-adenovírus receptor) [130]. CAR является высокоаффннным рецептором для Ад человека подгруппы С. Первичное взаимодействие пентона Ад5 с CAR и вторичное с интетринами через RGD последовательность опосредуют иетернализацию и эндоцитоз вируса f J30). Похожий механизм, возможно, реализуется при проникновении вируса CELO в клетки человека. Однако следует отметить, что вторичное взаимодействие с интегринами если и происходит, то оно не опосредовано взаимодействием с консенсусом RGD, так как данная аминокислотная последовательность отсутствует в составе основания пенотона CELO.

В наших экспериментах наибольший уровень экспрессии SEAP (до ЗООмЕд) наблюдался в пермисснвных как для Ад5 так и для вируса CELO культурах клеток (293 и LMH соответственно). Высокий уровень экспрессии объясняется возможностью репликации одного кз вирусов. Культуры клеток А549 и HI299 не способны поддерживать репликацию вирусов CELO и Ад5. Уровень экспрессии SEAP в этих культурах не превышал 120 мЕд/мл для CELO и 180 мЕд/мл для Ад5 (рис. 4).

При трансдукцин линии клеток В16 (меланома мышн) уровень экспрессии составил 3,4 мЕд/мл (для CELO-SEAP) н 2,9 мЕд/мл (для Ад5-5ЕАР).

Мы предполагаем, что низкий уровень трансдукцин клеток меланомы связан с тем, что на поверхности меланоцнтов мышн отсутствуют рецепторы, которые используют для проникновения Ад5 и CELO.

В ходе проведенного эксперимента мы варьировали множественности

инфекции CELO-SEAP от 10 до 1000 БОЕ на клетку. Наибольший уровень экспрессии секретаруемой щелочной фосфатазы наблюдался при использовании множественностей инфекции от 100 до 500 БОЕ на клетку. Эти данные полностью воспроизводились в аналогичных экспериментах по транедукиии культур клеток вирусом CELO-GFP.

Повышение соотношения клетка/инфекционная вирусная частица до 1/1000 вело к возникновению иитотокснческого эффекта и снижению уровня экспрессии секретнруемой щелочной фосфатазы в купьтуральной среде.

Полученные нами результаты расходятся с данными А. Мишу, в работе которой показано, что векторы CELO не менее эффективны, чем Ад5 при транедукции клеток человека. Но при этом результаты эксперимента согласуются с результатами П. Тана [121J. Автор считает, что векторы CELO на 3-2 порядка (по уровню экспрессии люциферазы) менее эффективно, чем Ад5, транедуцируют клетки человека, сравнимы с Ад5 при переносе генетической информации в . клетки мыши н более эффективны при транедукции клеток птиц.

По результатам экспериментов in vitro следует отметить необходимость увеличения тропности векторов CELO по отношению к клеткам человека. Решения данной проблемы можно добиться путем модификаций структурных белков капе и да. В частности, для вируса CELO повышение тропности возможно за счет изменения длинного фибера (внесения в кпоЬ-домен последовательностей полилизина, RGD и др.) или его замены на фиберы аденовирусов человека [121]. Эти модификации предположительно позволят значительно поднять эффективность транедукции клеток человека.

LMK

о « 3v зо 40

м ти

N12M

14*

М <«

8р*ми, часы

«О

i

м «в im

Рве.4 Кинетика накопления SEAP в культуральяой среде

Клетки А549. 293, Н1299, LMH были транедуцированы вирусами CELOSEAP и Ад5-SEAP. Множественность инфекции составляла ¡00 БОЕ на клетку. Уровень активности SEAP определялся ио скорости конверсии п-нитрофенияфосфата. Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов. Отклонения в измерениях не превышали 3%.

2J.1. Экспрессия декретируемой щелочной фос+атазы рекомбмнантным аденовирусом CELO in ovo Куриный эмбрион представляет собой удобную систему для накопления биологически активных белковых продуктов, гены которых встроены в вирусные векторы CELO. Ранее в нашей лаборатории было показано, что продукция IL-2 в аллоктоисной жидкости куриного эмбриона после заражения его рекомбинантным вирусом достигает концентрации 2мкг/мл. Однако в ходе предыдущих экспериментов не было установлено минимальное время необходимое для накопления такого количества продукта.

В задачу данного эксперимента входило определение времени, за которое

9

достигается максимум экспрессии щелочной фосфат азы в зависимости от количества инфекционных частиц CEI.O-SEAP, вводимых в аллонтоисную полость.

Мы варьировали различные дозы заражения в интервале от 10* до 10* БОЕ на эмбрион.

Максимальный уровень и скорость накопления SEAP наблюдались при наибольшей множественности инфекции. По истечении четырех дней все кривые накопления SE АР выходили на плато.

В случае инъекций небольшого количества инфекционных частиц CELO-SEAP (lO'-IO*) в аллонтоисную полость куриного эмбриона, активность SEAP на финальный момент эксперимента была в 2 раза меньшей, чем при использовании высоких множественностей инфекции (I О7" 10*>. Незначительная разница в уровне экспрессии SEAP может быть обменена тем фактом, что в курином эмбрионе происходит многораундовая инфекция. Однако оптимальной множественностью инфекции (из использованных в эксперименте) для получения максимального количества SEAP была 10* БОЕ (см. рис. 5).

В этом случае максимум активности SEAP наблюдался на 2 сутки. В последующие дни, вследствие развития эмбриона, происходило уменьшение количества аллонтоисной жидкости в эмбрионе, что вело к ' снижению абсолютного выхода SEAP.

Полученные данные позволили установить время достижения максимума экспрессии транс генов на примере SEAP.

В ходе эксперимента также установили, что уменьшение количества аллонтоисной жидкости при развитии эмбриона не ведет к увеличению удельной активности SEÁP, а наоборот, влечет за собой ее незначительное снижение. Полученные нами результаты могут быть использованы для получения максимальных количеств биологически активных белков в аллонтоисной жидкости куриного эмбриона, а данная система экспрессии может стать альтернативой существующим системам в тех случаях, когда получение функционально активных белков в прокариотнческнх системах экспрессии или в системах экспрессии в дрожжах будет затруднено или невозможно.

soo

Рис. 5. Экспрессия гена секретируемой щелочной фосфаты вектором CELO-SEAP в аллонтоисе КЭ.

о го

Время, часы

40

«О 00 100 120

11 -дневным эмбрионам в аилонтоисную полость были инъецированы

препараты вируса CELO-SEA Р, содержащие

различное количество

инфекционн ых частиц.

Пробы аллонтоиса отбирались через определенные интервалы времени. Активность SEAP « аллонтоисной жидкости измерялась колориметрически.

23, Исследование векторной системы на основе аденовируса CELO ta vivo 2.3.1.Экспрессия секретируемой щелочной фмфапзы рскомбннянтным вирусом

Полученные рекомбинантные вирусы CELO являются делеционкыми векторами. Одна из первоочередных задач заключается в исследовании "поведения" таких вирусов в лермисснвных моделях, так как данные по изучению времени экспрессии целевых трансгенов могут учитываться при создании вакцин.

Биология вируса CELO: тропность к различным тканям кур [7, 8] и отсутствие выраженного патогенеза предполагают его использование в качестве эффективного и безопасного средства переноса генетической информации. Кроме того, вирус CELO способен к ограниченному размножению в цыплят, что также может быть значимо для развития напряженного иммунного ответа.

Ранее французскими учеными было показано эффективное'проникновение вируса CELO в различные тканц однодневных SPF (свободных от патогенов н содержащихся в стерильных условиях) цыплят без развития патологических процессов. ДНК вируса CELO обнаруживалась в различных органах вплоть до 7 дня. При этом у всех животных развивался гуморальный иммунный ответ на вирус CELO. Однако вируснейтрализующие антитела появлялись только у 20-25% цыплят [43]. Это

CELO-SEAP в пермнссивной метели

может свидетельствовать в пользу того, что гуморальный иммунный ответ не принимает значимого участия в элиминации вируса.

Среди нерассмотренных вопросов, на которые указывают сами авторы, остались изучение "поведения" (способности к репликации и эффективной экспрессии целевых генов) вектора в цыплятах, содержащихся в нестерильных условиях птицеводческих хозяйств, которые могут быть сенсибилизированы к вирусу CELO.

Для оценки уровня и Бремени экспрессии щелочной фосфатазы 40-дневным цыплятам внутривенно вводили по 10* ЮЕ рекомбинантного вируса CELO-SEAP на животное.

Экспрессию щелочной фосфаты детектировали в течение 9 дней (см. рис. 6). Уровень экспрессии SEAP в сыворотке крови достигал 83,1 мЕд/мя.

После введения вируса CELO-SEAP, тнцы не проявляли видимых признаков болезни.

Положительным моментом в пользу возможности использования вируса CELO в качестве вакцинного вектора может выступать тот факт, что в ходе эксперимента не наблюдалось повышение титра вирусспецнфнческих антител в сыворотках крови птиц, получавших инъекции вируса CELO-SEAP, по отношению к неинъецированным животным.

Результаты нашей работы позволяют предположить, что в цыплятах происходило ограниченное размножение рекомбинантного вируса. На это указывает уровень активности щелочной фосфатаэы в сыворотке крови (83,1 мЕд/мл). Объем крови 40 дневного цыпленка составляет приблизительно 40-60 мл, следовательно, общий уровень активности SBAP достигал ** 4 Ед, что соотносится с уровнем экспрессии, получаемом в курином эмбрионе.

Ограниченное размножение вируса может быть существенным условием для развития протектавного иммунного ответа, так как уровень экспрессии целевых генов, по нашим данным, при репликации увеличивается в 5-10 раз.

Максимум экспрессии щелочной фосфатазы в сыворотке крови птиц, как и в непермиссивных системах приходился на третий день, после чего наблюдалось снижение уровня активности. Время экспрессии составило 9 дней, что сопоставимо с данными по персистенцин вируса CELO в организме 1-дневных SPF цыплят [43].

Факт элиминации вируса может свидетельствовать в пользу безопасности векторной системы CELO, а высокий уровень экспрессии в пользу возможного применения рекомбинаэтных вирусов CELO, зкспрессирущкх гены структурных белков возбудителей различных инфекций, в качестве генно-инженерных вакцин.

Следует отметить, что для развития гуморального иммунного ответа на белковые продукты целевых генов необходимо продлить время экспрессии последних. Этого можно будет достичь увеличением числа инъекций.

Работа проводилась совместно с к.б.н. Новиковым Б.В. ВНИИВВиМ.

Рис. 6. Экспрессия гена

■■ ^ .

еекретируемой щелочной фосфятазы в сыворотке крови цыплят.

40-дневным цыплятам

внутривенно были инъецирован препарат «ируса CELOSEAP, содержащие инфекционн ых частиц. Пробы крови отбирались через указанные интервалы времени.

Активность SEAP в сыворотке измерялась колориметрически.

2J.2. Экспрессия секретируемой щелочной фосфятазы рекомбинянтным вирусом CELO-SEAP в непермнееявных моделях

Для исследования возможности переноса целевых генов векторной системой на основе генома CELO в непермиссивные мотели, мыши линии C57/BLÓ были Тренсдуцированы вирусом CELO-SEAP в количестве 10* БОЕ на животное. Введение вектора производилось тремя различными способами: ннтраназальной, внутривенной и внутриопухслевой (в подкожный трансплантат меланомы В16) инъекцией. Экспрессия SEAP была детекпфовака в образцах крови (при всех способах введения) на второй день (рис.7).

<

0,01 ---

2345678» 10 Время, днк

5Жн»ап10> №1 ЖиишнМ! У ЖиМ1яо# №3

S Животно* №4 Жявотнм НИ, отрмцвтимый имтрвль

Максимальная концентрация секретаруемой щелочной фосфэтазы в сыворотке крови мышей была детектирована на 3 сутки. Время экспрессии SEAP в сыворотке крови мышей составило 21 день. Полученные результаты сравнимы с данными по времени экспрессии целевых генов для Ад5 [28].

Уровень экспрессии щелочной фосфатазы значительно варьировал в зависимости от способа введения вектора. Минимальный уровень экспрессии щелочной фосфатазы (до 5 мЕц'мл) детектировался при мпраназальиом способе введения. Известно, что воздухоносные пути неэффективно трансдуцируются. векторами на основе Ад5. Ворсинки мерцательного эпителия препятствуют связыванию вируса с CAR на поверхности клетки [20]. Мы предполагаем, что низкий уровень экспрессии SEAP при интраназальном способе введения рекомбинангаого вируса CELO-SEAP обусловлен той же причиной.

Дни лоея* инъмцмм

Рис. 7, Экспрессия гена секретрусмой щелочной фосфатазы вирусом CEI.O-SEAP в сыворотке крови мышей линии C57BU6

Мышам линии CS7/BL6 тремя различными способами (внутривенным, внутриопухапевым, интранаэачъхым) быя введен вирус CELO-SEA Р в количестве ¡tf БОЕ/животное, Из хвостовой вены отбирали SÚ-ЮОмкл крови и приготавливали сыворотку. Активность SEAP в сыворотке оценивалась колориметрически. Данные приведены за вычетам значений активности SEAP в отрицательных сыворотках (не превышали значения 0J7 мБд/мя)..

При внугрнопухолевом и внутривенном введении вектора CELO-SEAP уровень активности секретируемой щелочной фосфатазы в сыворотке крови достигал 40,2 и 187,5 мЕд/мл соответственна Это предположительно связано с более высоким уровнем трансдукции гепатоцнгов и опухолевых клеток, а также с большей интенсивностью протекания метаболических процессов в этих клетках.

Кроме этого, исследование экспрессии SEAP проводились на крысах линии Wistar (см. рис. 8). Рекомбннангиый вирус CELO-SEAP вводили внутривенным и внутримышечным способом (10* БОЕ на животное). Максимальное значение активности SEAP в сыворотке было детектировано на 3 день. Уровень активности составил 14,1 мЕд/мл для внутривенного введения и 0,66 мЕд/мл для внутримышечного способа.

Низкий уровень экспрессии SEAP при внутримышечном введении объясняется Отсутствием CAR-рецепторов на мышечных клетках [18].

Таким образом, мы определили уровень и длительность экспрессии гена SEAP при различных способах введения рекомбинантого вируса CELO-SEAP.

Как и в пермиссивиой системе, максимум экспрессии приходился на третий день после чего происходило снижение содержания SEAP в сыворотке крови животных. Это, по-видимому, также свидетельствует в пользу того, что основную роль в элиминации вируса из организма после однократной инъекции играет клеточный иммунный ответ. В появившихся в последнее время работах с векторами на основе Ад5 показано, что развитие иммунного ответа в организме реципиента не блокирует проникновения вируса в клетки и последующей экспрессии терапевтических генов (131]. Это согласуется с результатами нашей работы, из которых видно, что развитие гуморального иммунного ответа не препятствует экспрессии щелочной фосфатазы. Однако, нельзя не отметить значительного снижения уровня экспрессии целевого гена SEAP, несмотря на повторяющиеся инъекции рекомбннантного вируса. Этот факт может играть существенную роль в снижении эффективности генной терапии.

Мы предполагаем, что эффективным способом поддержания стабильного уровня экспрессии, в будущем, будет сочетание инъекций векторов на основе Ад5 и CELO. Работа проводилась совместно со Шмаровым М.М. и Авдеевой С .В .(В НИИ СБ)

i Внутртмим ннънцм

> Виутримымчнаи ииъвсция

> Отр*цат*льиъ»й «онгроль

Рис. 8. Экспрессия гена секретеру «мой щелочной фосфатазы вирусом CELO-SEAP в сыворотке крови крыс линии Wbtar

Крысам линии Whtar двумя способами (внутривенным и внутримышечным) быя введен вирус CELO-SEAP в количестве 5x1 (f БОЕ/животмое. Из хвостовой вены отбирали 50-100

сыворотку.

мкя крови и приготавливали Активность SEAP в сыворотке оценивалась калориметрически.

3.4. Исследование возможности использования векторной системы на основе аденовируса CELO для целей генной терапии рака 3.4.1. Исследование влиянии гуморального иммунного ответе на уровень экспрессам целевых генов при внутриопухолевых инъекциях вируса CELO

Известно, что множественные инъекции рекомбинантных вирусов человека в опухоли обеспечивают большую экспрессию терапевтических генов и способствуют большей регрессии злокачественных образований, нежели однократные введения.

В задачу эксперимента входило определение возможности продления уровня и времени экспрессии целевого гена SEAP путем многократных инъекций вируса CELO-SEAP.

Одновременно, задачей эксперимента было исследование зависимости между уровнем экспрессии щелочной фосфатазы {при однократной и многократных внутриопухолевых инъекциях вируса CELO-SEAP) и уровнем титра внрусспепифических антител в сыворотке крови животных.

Экперимент проводился по следующей схеме. Мышам линии C57BL/6 (однократно или многократно) в опухоли меланомы В16 вводилось 5x10®

1«

инфекцннных частиц вируса CELO-SEAP. Многократные инъекции проводились с интервалом в 2 дня.

Как и ожидалось, многократные инъекции CELO-SEAP соответствовали более длительному периоду экспрессии SEAP, нежели однократное введение вируса (рис. 9).

Исследование гуморального иммунного ответа показало, что при многократных вкутриопухолеьых инъекциях рекомбинаитного вируса CELO-SEAP происходит увеличение титра вирус-специфических антител <3 двоичных логарифма по отношению к сывороткам крови мышей, получившим инъекцию CELO-SEAP и 4 двоичных логарифма по отношению к сывороткам крови мышей не инъецированных вирусом) (см. рис. 10).

Эти данные, по-видимому, свидетельствуют в пользу того, что вклад В-лнмфоиитов в элиминацию вируса при однократных внутриопуколевых инъекциях несущественен и ограничение времени экспрессии SE АР вызвано развитием

клеточного иммунного ответа.

В случае многократных инъекций вируса CELO-SEAP возрастание уровня антител в сыворотке крови коррелирует с уменьшением активности SEAP.

Нельзя исключать также тот факт, что снижение уровня щелочной фосфатазы в сыворотке крови вызывается развитием гуморального иммунного ответа против SEAP.

hic, 9. Эислрсссня щелочной фосфатом в

•^МюмрапмтьмдотчфаСОДдеАР сьвороп* |фмн мышей, получииива -О— Одеафвтни тмин« Мфус* CEL04EAP

»юговрчим мтмжии ируя сшхур вцутрмяутлмые иныюшх вирус* CELO-

SEAP.

Мышам лшш CS7SL/6 6-8 недеяыюю всфааж на 1 бок /риалcm ¡& кяеток мтгюмы В1& Инъекции mf^coe CELO-SEAP и CEL0-GFP непша/ш на 7 доа> после гривихгнш спухахй Отбор крови фсяаводюся ш сяедроupat деть так введенш трусов Измерения SEAP в эдти фодапюпись тшжг*, до гг&пи живогтых. Активность SEAP оченипалась каюри-мп^иххи

Рис. 10, Определение уровня антител к вирусу CELO-SEAPnpH однократных и многократных инъекциях методом непрямого ИФЛ

Сенсибилизирующая доза антигена (очищенного вируса CELO-SEAP) составила , ¡¿Ug/мл. В качестве отрицательного контроля

исполъзовапась сыворотка мышей, не инъецированных вирусом CELO-SEAP. В качестве положительного контроля использовалась гипериммунная

Сыворотка к вирусу CELO-SEAP. В качестве антивидового конъюгата использовались антитела против IgG мышей, меченных пероксидазой, в рабочем разведении 1:10000. Работа проводилась совместно с Верховской Л.В (ВНИИСБ).

2.4.2. Детекция экспрессии генаpS3 рекомбянантным вирусом CELO-pS3 in vitro

Изучение экспрессии и функциональной активности р53 проводили в опухолевых линиях клеток. Для этого клетки А4Э 1/waflConA, H1299/waflConA и HeLa/waflCofiA транедуцировшш вирусами CELO-SEAP и CELO-p53.

Выбранные для исследования экспрессии р53 клетки содержат в составе генома 2 элемента (waf-t и СопА), которые узнает и связывает р53> Под транскрипционным контролем ЦМВ-промотора и этих элементов находится ген LacZ. Взаимодействие белка р53, (одной из функций которого является активация транскрипции) с последовательностью wafl-ConA ведет к индукции экспрессии гена LacZ. Накопление продукта гена LacZ - Д-галактозидазы определяли по стандартной методике [78] .Клетки транедуцироваикые вирусом CELO-p53 давали специфическое окрашивание на продукт экспрессии гена LacZ, что свидетельствует об эффективной экспрессии и функциональной активности гена р53. (см. рис. 12).

Рве. 12 Детекция экспрессии р-галактоэндазы к клетка* A43J/waflCoDA, H1299/waflCoaA н HeL»/waflConA после транедукцни вирусами CELO-SEAP к CELO-p53,

Множественность инфекции составила ¡00 БОЕ/клетку. По истечении 36 часов клетки фиксировали и окрашивали для выявления экспрессии 0-галактозидазы.

Работа проводилась совместно с Ильинской Г.В. (РОНЦ).

3.4А Экспрессия гена p$i ta vivo

На следушем этапе мы показали эффективную экспрессию гена р53 (в составе вектора CELO) непосредственно в опухолях.

Оценка эффективности экспрессии гена р5) проводилась на безтимусньгх (голых) мышах линии D2&I. Для этого 8-недельным самкам на четыре точки (шею, спину и ноги) прививались опухолевые клетки линии НСТ-116/waflConA или клетки Hl299/waílConA в количестве 2 миллиона на точку. Инъекции вирусов CELO-p53 и CELO-SEAP проводили через 1 неделю после установления опухоли в количестве 5x101 инфекционных частиц на животное. Как и ожидалось, срезы тех опухолей, в которые вводился вирус CELO-p53, давали специфическое окрашивание (см. рис. 13). Небольшое фоновое окрашивание наблюдалось при введении вируса CELO-SEAP в опухоли, образованные клетками Н1299/wafl СопА. Возможно, этот эффект может объясняться стрессорным воздействием эндогенных вирусных трансактнваторов транскрипции.

Для клеток НСТ-116/waflConA был отмечен меньший уровень экспрессии /3-галактозидаэы, что, предположительно, связано Для линии НСТ-116/waflConA был отмечен меньший уровень экспрессии ^-галактозидазы, что, возможно связано с

нарушением активации р53 в этих клетках.

19

CELO-SEA? CELO-p53 К-

Рис. 13. р53-индуцировання« экспрессии геи* LacZ в опухолях НСГ-116ДуиПСог»А н Н12»М»ПСооА

Через ¡дня после вкутриопухолевых инъекцийрекамбинантных вирусое опухши изштпи и окрашивали с целью выявления экспрессии гена LacZ 2.4.4. И шнбнровапме рост* поокажных трансплантатов опухолей рекомбинантным

вирусом CELO-P53

Способность векторной системы на основе аденовируса CELO осуществлять перенос генетической информации в клетки человека обусловливает потенциальную возможность ее применения в генной терапии злокачественных новообразований.

Для изучения данного вопроса мы сконструировали рекомбинантный вирус CELO, экспрессируюшнй ген супрессор опухолевого роста р53. На следующем этапе работы нами была изучена способность рекомбииактного аденовируса CELO-p53 вызывать замедление роста опухолей аденокаршшомы человека A431/waflConA у голых мышей линии D2&I при многократных внутриопухолевых инъекциях.

Клетки линии A431i'waflConA прививались 8-недельным самкам мышей подкожно из расчета 5x10! клеток на инъекцию. В каждой группе было по б сформированных опухолей. Опухоли объемом приблизительно 200 мкл на 19 день были инъецированы препаратами вирусов в количестве 5x10" физических частиц вируса/инъекцию. Инъекции вирусов проводили через день. Всего группы получали

no 4 инъекции. Животные в контрольных труппах были инъецированы PBS н рекомбннантным вирусом CELO-GFP. Объем опухолей оценивали как произведение длины, ширины и 1/2ширнны.

Эффекгивное проникновение вектора в клетки А431 /waftСопА оценивали по экспрессии белка GFPt после внутрнопухолевой инъекции рекомбннантного вируса CELO-GFP. Замедление роста опухолей в труппе, получавшей CELO-p53 (по отношению контрольным труппам) наблюдалось после первой инъекции. При этом 3 опухоли ш 4 частично регрессировали после второй инъекции. Средний объем опухолей (на последний день эксперимента) в группе мышей, получавших инъекции CELO-p53 был в 2,6 раза меньше по отношению к группе получавшей CELO-GFP и в 6,9 раз меньше по отношению к труппе, получавшей инъекции PBS. Измерения продолжались до достижения размера опухали 2,5 мл, после чего мыши считались погибшим».

Замедление роста опухолей в труппе получавшей CELO-GFP может быть объяснено или ингнбнрутошим действием самого вектора или оверэкспрессией репортерного гена GFP. И тот, и другой фактор могут негативно влиять на пролиферацию транедуцированных опухолевых клеток.

CELO-GFP К-

Рис. 14, Экспрессия белка GFP после внутрнолутквой ннышш вируса CELO-GFP.

Множественность шъехцш щзуса CELO-GFP 5xlÚ' фшшеаак частиц. По истечении 2 дней огутыиз&яемжимщхкхогщоеаяи.

Рис, 15 Мыши лянии D2&I с опухолями А 431 на И день после начала инъекций.

I' Мышь, получавшая инъекции PBS, П - Мышь, получавшая инъекции CELO-pSX Ш - Мышь, получавшая инъекции CELO-GFP.

Для Ад5 было показано, что введение вектора вне зависимости от экспрессии терапевтических генов вызывало уменьшение количества метастаз в региональных лимфатических узлах. Однако в нашем эксперименте противоопухолевая активность вектора увеличивалась при наличии в его составе терапевтического гена р51 (см. рис. 15).

Работа проводилась совместно с Ильинской ГЗ.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о возможности использования векторов CELO в генной терапии злокачественных новообразований.

В перспективе, для безопасного использования вектора в медицине, возможно усовершенствование генома вируса. Необходимо делегировать два ранних гена GAM-1 и ORF22, которые, по-видимому, выполняют антналоптические функции и участвуют в образовании трансформированного фенотипа клеток.

Кроме того, в будущем необходимо детальное изучение ранних областей CELO, ответственных за взаимодейстие с клеткой, что позволит понять молекулярные механизмы взаимодействия вируса с клеткой.

выводы

1) Впервые получены рекомбинантные аденовирусы CELO, содержащие под контролем ЦМВ-промотора гены SEAP и р53. In vitro в клетках линий НСГПбЛтеОСспА, H129WwaflCcnA, А431ЛмДСспА, HeLa/wattConA, LMH, А549 и др. показана эффективная экспрессия генов SEAP и р53 в составе вирусных геномов. Изучена кинетика накопления продуктов экспрессии целевых генов в культуральной среде с использованием рекомбинаитного аденовируса CELO-SEAP.

2) Впервые показана экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP) в сыворотке крови животных (мышей, крыс, кур) после различных видов инъекций (внутриопухолевой, внутривенной, внутримышечной, интраназальной) рекомбинаитного вируса CELO-SEAP, Впервые определен период экспрессии целевого гена SEAP в* организме иммунокомпетентных животных, получавших инъекции рекомбинаитного вируса CELO-SEAP. Максимальное время экспрессии SEAP в сыворотке крови составило 21 день.

3) Определена корреляция между временем и уровнем экспрессии целевого гена SEAP (при многократных внутрнопухолевых инъекциях вируса CELO-SEAP) и уровнем вирусспецифических антител в сыворотке крови лабораторных животных (мышей линии CJ7BL/6). Титр вирусспецифических антител достигал максимального значения (1:3200) к 24 дню. Одновременно детектировали четырехкратное снижение уровня экспрессии целевого гена.

4) Определена кинетика накопления продукта экспрессии целевого гена SEAP in ovo (в аллонтоисной жидкости куриного эмбриона), в зависимости от количества инъецированных инфекционных частиц CELO-SEAP, Максимум экспрессии 8ЕАР(до 460мЕд/мл) получали при инъекции 10s БОЕ вируса CELO-SEAP.

5) Впервые, в экепрериментах на живопшх моделях (голых мышах линии D2&1) показана возможность ингнбирования роста опухолей (аденокаршмомы легкого человека) а 6,78 раза, по сравнению с контрольными животными, посредством внутрнопухолевых инъекций рекомбинаитного вируса CELO-pí3.

Основные результаты диссертация изложены я следуюшнх публикациях:

1) Д.Ю. Логунов, Л,В. Черенова, М.М. Шмаров, Е.В. Шашкова, Л .В. Верховская, К,К. Доронин, B.C. Народ ицкнй. In vitro и in vivo доставка гена секретируемой плацентарной щелочкой фосфатаэы (SEAP) в составе рекомбинантного аденовируса ггтнц CELOV/ Мол, Ген, Микробиол. Вирусол. 2002 (4):34-9

2) М.М. Шмаров, Л.В. Черенова, Е.В. Шашкова, Д JO. Логуно&Л.В. Верховская, A.B. Капитонов, Г.Л. Неугодова, К,К. Доронин, Б.С. Народнцкий.Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO, несущие гены GFP и 1L-2 человека. Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. 2002;(2):30-5.

3) Л.В. Черенова» Е.В. Шашкова, Д.Ю. Логунов, М.М. Шмаров. Генная терапия рака векторами на основе генома аденовируса птиц CELO. // Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы», 2002, т.6, №1, стр.150, Санкт-Петербург

4) Д.Ю. Логунов Изучение векторной системы на основе генома аденовируса птиц CELO in vitro и in vivoJt Вторая молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИИСБ, 2002

Отпечатано с готового оригинал-макета Объем /,S «Л._Зак. ЧШ_Тираж /О?

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул, Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Логунов, Денис Юрьевич

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональная характеристика аденовируса

CELO.

1.1.1. Общая характеристика аденовируса CELO.

1.1.2. Структурно-функциональная организация генома аденовируса

CELO.

1.1.3. Структурные особенности вируса CELO.

1.2. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO.

1.3. Опухолевый супрессор р53.

1.3.1 Структурно-функциональная характеристика р53.

1.3.2. Биологическая роль гена р53.

1.3.3. Активация белка р53.

1.3.4. Мишени белка р53.

1.3.5. Применение р53 в генной терапии.

1.4. Аденовирусные векторы, экспрессирующие ген опухолевого супрессора человека р53.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Ферменты и другие реактивы.

2.1.5. Животные.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.

2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазам.

2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля.

2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.7. Трансформация клеток Е. coli.

2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.9. Полимеразная цепная реакция.

2.2.10. Синтез дезоксиолигонуклеотидов.

2.2.11. Трансфекция клеток линии 293 или LMH для получения рекомбинантных аденовирусов.

2.2.12. Накопление вирусов.

2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов.

2.2.14. Титрование вирусов.

2.2.15. Выделение вирионной ДНК.

2.2.16. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом.

2.2.17. Определение авктивности секретируемой щелочной фосфатазы.

2.2.18. Определение экспрессии /?-галактозидазы in vitro и в подкожных трансплантатах опухолей.

2.2.19. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE - SDS)

2.2.20. Иммуноблотинг (WESTERN BLOT IMMUNOASSAY)

2.2.21. Иммуноферментный анализ (ELISA)

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома CELO и генома аденовируса человека 5 серотипа.

3.2. Трансдукция клеточных культур.

3.2.1. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы in ovo.

3.3. Исследование векторной системы CELO in vivo.

3.3.1. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в пермиссивной модели.

3.3.2. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в непермиссивных моделях.

3.4. Исследование векторной системы CELO, как геннотерапевтического агента.

3.4.1. Исследование влияния гуморального иммунного ответа на уровень экспрессии целевых трансгенов при внутриопухолевых инъекциях вируса CELO.

3.4.2. Детекция экспрессии гена р53 в составе генома вектора

CELO in vitro.

3.4.3. Экспрессия гена р53 в составе генома вектора CELO in vivo.

3.4.4. Ингибирование роста подкожных трансплантатах опухолей вирусом CELO-p53.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO для экспрессии генетической информации в организме млекопитающих и птиц"

1. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Аденовирусы, наряду с другими ДНК-содержащими вирусами, представляют собой широко используемую модель в молекулярно-биологических, биомедицинских и ветеринарных исследованиях. Это обусловлено рядом особенностей их структуры и цикла развития.

Экспрессию аденовирусных генов осуществляет ферментативный аппарат клетки-хозяина, что позволило эффективно использовать аденовирусы для изучения фундаментальных механизмов транскрипции и трансляции.

На поздних стадиях инфекции происходит селективный синтез вирусных белков, в то время как трансляция мРНК клетки-хозяина блокируется. Это делает аденовирус идеальной моделью для экспрессии чужеродных генов, встроенных в вирусный геном. С другой стороны, трансформирующие, а в ряде случаев, онкогенные потенции аденовирусов, обусловленные активностью ранних вирусных генов, позволяют использовать их в качестве ценного инструмента для изучения путей молекулярных взаимодействий продуктов ранних вирусных генов с регуляторными элементами клеточного цикла.

Накоплены обширные знания о возможностях применения аденовирусов человека в качестве векторов для лечения заболеваний человека и животных. Масштабные научные исследования и наличие значительного количества точек практического приложения аденовирусных векторов обусловлены целым рядом их биологических свойств. Широкая тропность, высокая пакующая емкость и способность расти в высоком титре определили преимущество аденовирусов над большинством других вирусных векторов.

Значительное распространение получили аденовирусные векторы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа (Ад5). Наряду с неоспоримыми преимуществами этих векторов существует ряд недостатков, среди которых значимыми являются их иммуногенность и наличие у большинства людей предсуществующего иммунного ответа.

Активация иммунной системы на введение вирусного вектора существенно ограничивает время экспрессии целевых генов в организме человека, что в свою очередь отрицательно влияет на эффективность генной терапии. В связи с этим, многих исследователей привлекают возможности создания векторов на основе аденовирусов животных и птиц.

Новой и перспективной представляется векторная система на основе аденовируса птиц 1 серотипа (CELO). Вирус неспособен реплицироваться в клетках млекопитающих, обладает повышенной пакующей емкостью и большей физической стабильностью по сравнению с Ад5. Иммунная система человека несенсибилизирована к вирусу, что позволяет предположить эффективное применение векторов на основе CELO (отдельно или последовательно с Ад5) для увеличения периода экспрессии целевых генов в организме человека.

Важным достоинством CELO является его способность к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах. Это делает процесс накопления вируса технологичным и экономически привлекательным.

Структурно-функциональная организация элементов капсида (пентонов) CELO позволяет их направленную модификацию для повышения тропности вируса по отношению к определенным типам клеток, что может быть значимо для практического применения вектора.

В настоящее время опубликовано незначительное количество работ, посвященных изучению биологии вируса CELO, и практически отсутствуют экспериментальные данные характеризующие "поведение" рекомбинантных вирусов in vivo. В связи с чем, исследование основных характеристик (иммуногенности, эффективности доставки целевых генов, времени экспрессии и др.) векторной системы CELO в различных организмах представляет самостоятельный научный интерес.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы являлось изучение векторной системы на основе аденовируса птиц CELO в различных животных моделях, с использованием генов SEAP и р53.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1.Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих ген SEAP или р53 под контролем CMV-промотора в сайте делеции несущественной области генома CELO.

2. Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих ген SEAP или р53 под контролем CMV-промотора в месте делеции фрагмента El области аденовируса человека 5 серотипа.

3. Сравнение эффективности векторных систем на основе Ад5 и CELO путем трансдукции различных культур клеток.

4 . Изучение кинетики накопления трансгенов на модельном примере SEAP в аллонтоисе куриного эмбриона, в зависимости от количества инокулированных частиц вируса CELO-SEAP.

5. Изучение экспрессии целевых генов, встроенных в геном вируса CELO, в организме пермиссивных и непермиссивных животных.

6. Определение функциональной активности гена р53, встроенного в геном CELO in vitro и in vivo.

7. Изучение возможности ингибирования опухолевого роста вектором CELO, экспрессирующим ген опухолевого супрессора р53.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

В результате проведенной работы впервые получены рекомбинантные векторы CELO-SEAP и CELO-p53. Путем трансдукции различных клеточных культур определена эффективность вектора CELO-SEAP, в сравнении с аналогичным вектором на основе Ад5.

Впервые была изучена кинетика накопления трансгенов, встроенных в геном CELO, в аллонтоисе куриных эмбрионов.

Впервые показана принципиальная возможность детекции экспрессии трансгена (SEAP), встроенного в геном CELO, в сыворотке крови животных, при различных путях введения вектора CELO-SEAP.

Определено время персистенции экспрессии трансгена (SEAP) при многократных внутриопухолевых инъекциях CELO-SEAP, и влияние на уровень экспрессии трансгена гуморального иммунного ответа.

В ходе работы была показана экспрессия и функциональная активность гена р53, встроенного в геном CELO, в различных линиях опухолевых клеток.

Впервые показано ингибирование роста опухолей вектором CELO-p53.

Результаты работы могут быть использованы в лабораторной практике для решения проблем доставки генетической информации в клетки млекопитающих и птиц.

Работа представляет не только научный интерес, но и в перспективе может иметь практическое приложение. Векторы на основе CELO могут быть использованы для создания средств профилактики различных заболеваний, и в качестве терапевтических агентов для коррекции повреждений в геноме эукариотических клеток.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Логунов, Денис Юрьевич

ВЫВОДЫ

1) Впервые получены рекомбинантные аденовирусы CELO, содержащие под контролем ЦМВ-промотора гены SEAP и р53. In vitro в клетках линий HCT116/wafIConA, H1299/wafIConA, A431/wafIConA, HeLa/waflConA, LMH, A54 9 и др. показана эффективная экспрессия генов SEÄP и р53 в составе вирусных геномов. Изучена кинетика накопления продуктов экспрессии целевых генов в культуральной среде.

2) Впервые показана экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP) в сыворотке крови животных (мышей, крыс, кур) после различных видов инъекций (внутриопухолевой, внутривенной, внутримышечной, интраназальной) рекомбинантного вируса CELO-SEAP. Впервые определен период экспрессии целевого гена SEAP в организме иммунокомпетентных животных, получавших инъекции рекомбинантного вируса CELO-SEAP. Максимальное время экспрессии SEAP в сыворотке крови составило 21 день.

3) Определена корреляция между временем и уровнем экспрессии целевого гена SEAP (при многократных внутриопухолевых инъекциях вируса CELO-SEAP) и уровнем вирусспецифических антител в сыворотке крови лабораторных животных (мышей линии C57BL/6) . Титр вирусспецифических антител достигал максимального значения (1:3200) к 24 дню. Одновременно детектировали четырехкратное снижение уровня экспрессии целевого гена.

4) Определена кинетика накопления продукта экспрессии целевого гена SEAP in ovo (в аллонтоисной жидкости

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Логунов, Денис Юрьевич, Москва

1. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы.// Москва. Мир,1989, с.209-236

2. Григорьев В.П., Хилько С.Н., Тихоненко Т. И. Условия стабильности четвертичной структуры и антигенная активность гексона аденовирусов. // Биохимия. 1985. Т5 0. С. 258-263.

3. Коровин Р.Н, Рождественский И.К. Аденовирусные инфекции птиц. Ленинград. 1990.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Молекулярное клонирование. М.1984.

5. Патрушев Л.И. Экспрессия генов.// Москва. Наука,1999, с. 353-356.

6. Сюрин В. Н., Белоусова Р. В., Фомина Н. В. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. М. Агропромиздат. 1991, стр. 159-166.

7. Фомина Н.В. Аденовирусная инфекция животных. М. Колос19 95.

8. Ярилин A.A. Основы иммунологии.// Москва. Медицина,2000, с. 350-362.

9. Abe T, Wakimoto H, Bookstein R, Maneval DC, Chiocca EA, Basilion JP. Intra-arterial delivery of p53-containing adenoviral vector into experimental brain tumors.//Cancer Gene Ther. 2002 Mar; 9 (3):228-35.

10. Agoff SN, Hou J, Linzer DI, Wu B. Regulation of the human hsp70 promoter by p53.// Science. 1993 Jan 1; 259 (5091):84-7.

11. Akhiles K. Nagaich et al. Architectural accomodiation in the complex of four p53 DNA binding domain peptides with the p21/wafl/cipl DNA response element. J. Biol. Chemistry. 1997, v7, p. 14380-14382.

12. Akopian T.A., Doronin K.K., Karpov V.A., Naroditsky B.S./ Sequence of the avian adenovirus FAV-1 (CELO) DNA encoding the hexon-associated protein pVI and hexon. Arch.Virol.1996, vl41, p.11759-65.

13. Akopian T.A., Kaverina E.N., Naroditsky B.S., T. I.Tikhonenko. Nucleotide sequence analysis of the avian adenovirus CELO (FAV-1) DNA fragment (92-100%) Mol. Gen. Microbiol. Virol. 1992, vll, p. 19-23

14. Anderson J., V.J. Yates, et al. The in vitro transformation by an avian adenovirus (CELO). I.Hamster-embryo fibroblastic cultures. J. Natl.Cancer Inst. 1969, v4 2, pl-7.

15. Anderson J., V.J. Yates, et al. The in vitro transformation by an avian adenovirus (CELO). III.Human amnion cell cultures. J. Natl.Cancer Inst. 1969, v4 3, p575-580.

16. Baohong Cao, John R. Mytinger, Johnny Huard. Adenovirus mediated gene transfer to skeletal muscle.// Microscopy Research and Technique. 2002 Jul 58 (1):45-51

17. Benihoud K, Yeh P, Perricaudet M. Adenovirus vectors for gene delivery.// Curr Opin Biotechnol. 1999 Oct; 10 (5) :440-7 .

18. Berger J, Hauber J, Hauber R, Geiger R, Cullen BR Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells.// Gene. 1988 Jun 15; 66 (1):1-10.

19. Bett A. J., L.A. Prevec, and F.L. Graham. Packaging capacity and stability of the human adenovirus type 5 vector. J.Virol. 1983, v67, p 5911-5921.

20. Buttgereit P, Schakowski F, Marten A, Brand K, Renoth S, Ziske C, Schottker B, Ebert 0, Schroers R, Schmidt-Wolf IG. Effects of adenoviral wild-type p53 gene transfer in p53-mutated lymphoma cells.//Cancer Gene Ther. 2001 Jun; 8 (6) :4 30-9 .

21. Caravokuri C., K.N.Leppard. Constitutive episomal expression of a polipeptide pIX in a 293-based cell line complements the defiency of pIX mutant adenovirus type 5. J. Virol. 1995, v69, p 6627-6633.

22. Chin KV, Ueda K, Pastan I, Gottesman MM. Modulation of activity of the promoter of the human MDRl gene by Ras and p53.//Science. 1992 Jan 24;255(5043):459-62.

23. Chiocca S, Kurtev V, Colombo R, Boggio R, Sciurpi MT, Brosch G, Seiser C, Draetta GF, Cotten M. Histone deacetylase 1 inactivation by an adenovirus early gene product.// Curr Biol. 2002 Apr 2; 12 (7) :594-8 .

24. Chiocca S., Adam Baker, Matt Cotten. Identification of a novel antiapoptotic protein, GAM-1, encoded by the CELO adenovirus. Journal of Virology, 1997, v80, p. 3168-3177.

25. Chiocca S., Robert Kurzbauer, Gotthold Schaffner, Adam Baker, Vivien Mautner, Matt Cotten. The complette DNA sequence and genomic organization of the avian adenivirus CELO.

26. Chowdary DR, Dermody JJ, Jha KK, Ozer HL Accumulation of p53 in a mutant cell line defective in the ubiquitin pathway.//Mol Cell Biol. 1994 Mar; 14 (3) :1997-2003.

27. Chumakov P.M. Function of the p53 gene: choice between life and death .//Biochemistry (Mose). 2000 Jan;65(1):28-40. Review.

28. Cirielli C, Riccioni T, Yang C, Pili R, Gloe T, Chang J, Inyaku K, Passaniti A, Capogrossi MC. Adenovirus-mediated gene transfer of wild-type p53results in melanoma cell apoptosis in vitro and in vivo.//Int J Cancer. 1995 Nov 27;63(5):673-9.

29. Clayman GL, Dreiling LK. Injectable modalities as local and regional strategies for head and neck cancer.//Hematol Oncol Clin North Am. 1999 Aug; 13 (4):787-810, Review.

30. Clayman GL, el-Naggar AK, Roth JA, Zhang WW, Goepfert H, Taylor DL, Liu TJ. In vivo molecular therapy with p53 adenovirus for microscopic residual head and neck squamous carcinoma.//Cancer Res. 1995 Jan 1;55(1) :1-6 .

31. Cowen B, Calnek BW, Menendez NA, Ball RF. Avian adenoviruses: effect on egg production, shell quality, and feed consumption. // Avian Dis., 1978, v.- 22(3), pp.- 459-470.

32. Dameron KM et ai. Control of angiogenesis in fibroblast by p53 regulation of trombospondin-1 Science. 1994. v265, p 1582-1584.

33. De Stanchina E, McCurrach ME, Zindy F, Shieh SY, Ferbeyre G, Samuelson AV, Prives C, Roussel MF, Sherr CJ, Lowe SW. E1A signaling to p53 involves the pl9(ARF) tumor suppressor.//Genes Dev. 1998 Aug 1; 12 (15) :24 3 4-4 2.

34. Deichman GJ, Matveeva VA, Kashkina LM, Dyakova NA, Uvarova EN, Nikiforov MA, Gudkov AV. Cell transforming genes and tumor progression: in vivo unified secondary phenotypic cell changes.// Int J Cancer. 1998 Jan 19; 7 5 (2) : 277-83 .

35. Donehower LA, Harvey M, Slagle BL, McArthur MJ, Montgomery CA Jr, Butel JS, Bradley A. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours.//Nature. 1992 Mar 19; 356(6366) :215-21.

36. Eastham JA, Grafton W, Martin CM,Williams BJ. Suppression of primary tumor growth and the progression to metastasis with p53 adenovirus in human prostate cancer.J Urol 2000,164(3 Pt 1),814-9.

37. Eizenberg 0, Faber-Elman A, Gottlieb E, Oren M, Rotter V, Schwartz M. p53 plays a regulatory role in differentiation and apoptosis of central nervous system-associated cells.//Mol Cell Biol. 1996 Sep; 16 (9) :5178-85.

38. Francois A, Eterradossi N, Delmas B, Payet V, Langlois P.// Construction of avian adenovirus CELOrecombinants in cosmids. J.Virol. 2001 Jun;75. 11:5288-301. J Virol. 2001. 11:5288-301.

39. Giatromanolaki A. et al. Vascular endothelial growth factor, wild-type p53, and angiogenesis in early operable non-small cell lung cancer. Clinic.Cancer Res. 1998, v4, p. 3017-3024.

40. Glotzer JB, Saltik M, Chiocca S, Michou AI, Moseley P, Cotten M. Activation of heat-shock response by an adenovirus is essential for virus replication. Nature. 2000 Sep 14; 407 (6801) :207-ll.

41. Gottlieb TM, Oren M. p53 in growth control and neoplasia.//

42. Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7;1287(2-3):77-102. Review.

43. Graeber TG, Osmanian C, Jacks T, Housman DE, Koch CJ, Lowe SW, Giaccia AJ. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours.//Nature. 1996 Jan 4; 379 ( 6560) :88-91.

44. Graham F.L. and Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol.Biol., 1994, v.-7, pp.-109-127. (Ed.), The Humana Press Inc., Clifton, NJ.

45. Graham F.L. and van der Eb A.,J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.// Virology, 1973, v.- 52, pp.- 456-467.

46. Green M., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay. Metotds Enzymology.,1980, v58, p.425-431.

47. Guenal I, Risler Y, Mignotte B. Down-regulation of actin genes precedes microfilament network disruption and actin cleavage during p53-mediated apoptosis.//J Cell Sci. 1997 Feb;110 ( Pt 4) :489-95.

48. Hamada K, Alemany R, Zhang WW, Hittelman WN, Lotan R, Roth JA, Mitchell MF. Adenovirus-mediated transfer of a wild-type p53 gene and induction of apoptosis in cervical cancer.//Cancer Res. 1996 Jul 1; 56 (13) : 304754 .

49. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // Journal of Molecular Biology, 1983, v.166, pp.- 557-580.

50. Hermeking H, Lengauer C, Polyak K, He TC, Zhang L, Thiagalingam S, Kinzler KW, Vogelstein B. 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression.//Mol Cell. 1997 Dec;1(1):3-11.

51. Hess M et al. The avian adenovirus penton: two fibers and one base. J.Mol.Biol. 1995, v252, p397-385

52. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. // Anal. Biochem., 1981, V.-114, p.- 193.

53. Introgen therapeutics News Release (www.introgen.com)

54. Jacks T, Remington L, Williams BO, Schmitt EM, Halachmi S, Bronson RT, Weinberg RA. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.//Curr Biol. 1994 Jan 1;4 (1) : 1-7 .

55. Jiang D, Lenardo MJ, Zuniga-Pflucker C. p53 prevents maturation to the CD4+CD8+ stage of thymocyte differentiation in the absence of T cell receptor rearrangement.//J Exp Med. 1996 Apr 1; 183 ( 4):1923-8.

56. Kastan MB, Onyekwere 0, Sidransky D, Vogelstein B, Craig RW. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage.//Cancer Res. 1991 Dec 1;51(23 Pt 1) :6304-11.

57. Ko LJ, Prives C. p53: puzzle and paradigm.//Genes Dev. 1996 May 1;10(9):1054-72. Review.

58. Komarova EA, Diatchenko L, Rokhlin OW, Hill JE, Wang ZJ, Krivokrysenko VI, Feinstein E, Gudkov AV. Stress-induced secretion of growth inhibitors: a novel tumor suppressor function of p53.//Oncogene. 1998 Sep 3; 17 (9) :1089-96.

59. Komarova EA, Gudkov AV. Suppression of p53: a new approach to overcome side effects of antitumor therapy.//Biochemistry (Mosc). 2000 Jan;65(1):41-8. Review.

60. Kopnin BP. Targets of oncogenes and tumor suppressors: key for understanding basic mechanisms of carcinogenesis.//Biochemistry (Mosc). 2000 Jan;65(1):2-27. Review.

61. Kristen K. Walker and Arnold J. Levine Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression // PNAS 93: 15335-15340

62. Labow D, Lee S, Ginsberg RJ, Crystal RG, Korst RJ. Adenovirus vector-mediated gene transfer to regional lymph nodes.//Hum Gene Ther. 2000 Mar 20; 11 ( 5) :759-69.

63. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 . // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

64. Lane DP. Cancer. p53, guardian of the genome.// Nature. 1992 Jul 2;358(6381):15-6.

65. Laver WG, Younghusband HB, Wrigley NG. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). // Virology, 1971, v.- 45(3), pp. -598-614.

66. Legerski R., Robberson D. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions. // Journal of Molecular Biology, 1985, v.- 181, pp.- 297-312.

67. Lehrmann H., M. Cotten. Characterization of CELO virus protein that modulate the pRB/E2F pathway. J.Virol., 1999, v7 3, p. 6517-6525.

68. Leppard K. . E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. J.Gen. Virol. 1997, v78, 2131-2138.

69. Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumor supressor gene.Nature. 1991, v351, 453-6.

70. Li R, Waga S, Hannon GJ, Beach D, Stillman B. Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication and repair.//Nature. 1994 Oct 6; 371(6497) :534-7 .

71. Li Z., A. Rakkar,et al. Efficacy of multiple administration of a recombinant adenovirus expressing wild-type p53 in an immune-competent mouse tumor model. Gene Therapy. 1998, v5, 605-613.

72. Li.P et al. The structural proteins of chick embrio lethal orphan virus (FAV-1). J.Gen.Virol. 1984 , v.65, p. 1803-1815.

73. Liu X, CW Miller, PH Koeffler, and AJ Berk The p53 activation domain binds the TATA box-binding polypeptide in Holo-TFIID, and a neighboring p53 domain inhibits transcription.//Mol. Cell. Biol. 1993 13: 3291-3300.

74. Loser Peter et al. Advances in the development of non-human viral DNA-vectors for gene delivery.// Curr.Gen.Ther, 2001,2,161-171.

75. Lowe SW, Bodis S, McClatchey A, Remington L, Ruley HE, Fisher DE, Housman DE, Jacks T. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo.//Science. 1994 Nov 4; 266 (5186) :807-10.

76. Maltzman W, Czyzyk L. UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells.//Mol Cell Biol. 1984 Sep; 4 ( 9) :1689-94.

77. Mancini LO, J. Anderson, V.Jasty, V.J. Yates. Tumor induction in hamster inoculated with an avian adenovirus (CELO). Arch. Gesamte Virusforsch 1970, v3 0, p.261-262.

78. Michou A-I. et al. Mutational analysis of the avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors. J. Virol.,1999, v73, p.1399-1410.

79. Miyashita T, Harigai M, Hanada M, Reed JC. Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl-2 gene.//Cancer Res. 1994 Jun 15;54 (12) :3131-5 .

80. Miyashita T., et al Tumor supressor p53 is regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene 1994, v.9,12028-32.

81. Murphy M, Hinman A, Levine AJ. Wild-type p53 negatively regulates the expression of a microtubule-associated protein.//Genes Dev. 1996 Dec 1;10 (23) .-2971-80.

82. Nagayama Y, Yokoi H, Takeda K, Hasegawa M, Nishihara E, Namba H, Yamashita S, Niwa M. Adenovirus-mediated tumor suppressor p53 gene therapy for anaplastic thyroid carcinoma in vitro and in vivo.//J Clin Endocrinol Metab. 2000 Nov;85(11):4081-6.

83. Nakane P.K.,Kawaio A.S. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. // J.Histochem.Cytochem. 1974. V. 22. P. 1084-1091.

84. Nishizaki M., T. Fujiwara et al. Recombinant adenovirus expressing wild-type p53 is antiangiogenic: a proposed mechanism for bystander effect. Clinic. Cancer Res., 1999, v5, 1015-1023.

85. Oakley R, Phillips E, Hooper R, Wilson D, Partridge M. A Preclinical Model of Minimal Residual Cancer in the Muscle Highlights Challenges Associated with Adenovirus-mediated p53 Gene Transfer.//Clin Cancer Res. 2002 Jun;8(6):1984-94.

86. Okuda Y, Ono M, Yazawa S, Imai Y, Shibata I, Sato S. Pathogenicity of serotype 1 fowl adenovirus in commercial broiler chickens. // Avian Dis., 2001, v.-45(4), pp.- 819-827.

87. Okuda Y, Ono M, Yazawa S, Shibata I, Sato S. Experimental infection of specific-pathogen-free chickens with serotype-1 fowl adenovirus isolated from a broiler chicken with gizzard erosions. // Avian Dis., 2001, v.- 45(1), pp.- 19-25.

88. Ono M, Okuda Y, Yazawa S, Shibata I, Tanimura N, Kimura K, Haritani M, Mase M, Sato S Epizootic outbreaks of gizzard erosion associated with adenovirus infection in chickens. // Avian Dis., 2001, v.- 45 (1), pp.- 268-275.

89. Parker LP, Wolf JK, Price JE. Adenoviral-mediated gene therapy with Ad5CMVp53 and Ad5CMVp21 in combination with standard therapies in human breast cancer cell lines.//Ann Clin Lab Sci. 2000 Oct;30(4):395-405.

90. Payet V. et al. Transcriptional organization of the avian adenivirus CELO. J. Virol.,1998, p. 9278-9285.

91. Pickles RJ, McCarty D, Matsui H, Hart PJ, Randell SH, Boucher RC. Limited entry of adenovirus vectors into well-differentiated airway epithelium is responsible for inefficient gene transfer.//J Virol. 1998 Jul; 72 (7) :6014-23 .

92. R.N. de Jong, P.C. van der Viet. Mechanism of DNA replication in eucariotic cells: cellular host factors stimulating adenovirus DNA replication. Gene, 236, 1999,1-12. .

93. Ravi R, Mookerjee B, van Hensbergen Y, Bedi GC, Giordano A, El-Deiry WS, Fuchs EJ, Bedi A. p53-mediated repression of nuclear factor-kappaB RelA via the transcriptional integrator p300.//Cancer Res. 1998 Oct 15; 5 8(20) :4531-6.

94. Riccioni T.et al. Adenovirus-mediated wild-type p53 overexpression inhibits endothelial cell differentiation in vitro and angiogenesis in vivo. Gene Therapy, 1998,v5, p. 747-754.

95. Rosse T, Olivier R, Monney L, Rager M, Conus S, Fellay I, Jansen B, Borner C. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c.//Nature. 1998 Jan 29; 391 ( 6666) :496-9.

96. Sakamuro D, Sabbatini P, White E, Prendergast GC. The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest.// Oncogene. 1997 Aug 18; 15 (8) : 887-98

97. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, pp.-5463-5467.

98. Schwartz D, Goldfinger N, Rotter V. Expression of p53 protein in spermatogenesis is confined to the tetraploid pachytene primary spermatocytes.// Oncogene. 1993 Jun;8(6):1487-94.

99. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a.//Cell. 1997 Mar 7; 88 ( 5) : 593-602 .

100. Seto E,Usheva A, et al. Wild-type p53 bins to the TATA-binding protein and repress transcription. Pros. Natl. Acad.Sci. USA 1992, v89, p 12028-32.

101. Shaulian E, Haviv I, Shaul Y, Oren M. Transcriptional repression by the C-terminal domain of p53.//Oncogene. 1995 Feb 16; 10 (4):671-80.

102. Shenk T. Adenoviridae: The viruses and their replication. Philadelphia. 1996. Raven Publisher.2115-2119 .

103. Shimada H, Shimizu T, Ochiai T, Liu TL, Sashiyama H, Nakamura A, Matsubara H, Gunji Y, Kobayashi S, Tagawa M, Sakiyama S, Hiwasa T. Preclinical study of adenoviral p53 gene therapy for esophageal cancer.//Surg Today. 2001; 31 ( 7):597-604.

104. Smith ML, Chen IT, et al . Interaction of the p53-regulated protein GADD45 with proliferating cell nuclear antigen. Science 1994, v266, p 1376-80.

105. Soussi T., P. May. Structural aspect of the p53 protein in relation to gene evolution: a second look. J.Mol. Biol. 1996, v2 60, p.623-637.

106. Srinivasula SM, Ahmad M, Fernandes-Alnemri T, Alnemri ES. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization.//Mol Cell. 1998 Jun; 1(7): 949-57 .

107. Tan M. et al. PTGF-fi, a type ¡3 transforming growth factor (TGF-/3) superf amily member, is a p53 target gene that inhibits tumor cell growth via TGF-/? signaling pathway.

108. Tan P.K., Michou A., Bergelson J.M., Cotten M. Defining CAR as a cellular receptor for the avianadenovirus CELO using a genetic analysis of the two viral fibre proteins. //J Gen Virol. 2001 Jun;82 6: 14 65-,72 .

109. Tishler RB, Lamppu DM, Park S, Price BD. Microt.ubule-active . drugs taxol, vinblastine, and nocodazole increase the levels of transcriptionally active p53.//Cancer Res. 1995 Dec 15; 55 ( 24) :6021-5.

110. Trant R, Xiao H, Ingles CJ, Greenblatt J. Direct interaction between the transcriptional activation domain of human p53 and the TATA box-binding protein.

111. Valenzuela MT, Nunez MI, Villalobos M, Siles E, McMillan TJ, Pedraza V, Ruiz de Almodovar JM. A comparison of p53 and pl6 expression in human tumor cells treated with hyperthermia or ionizing radiation.//Int J Cancer. 1997 Jul 17;72 (2) :307-12 .

112. Van der Eb A. J., van Kesteren J.W., van Bruggen E.F.J. Structural properties of adenovirus DNAs. // Biochem. Biophys. Acta, 1969, v.- 182, pp.- 530-541.

113. W.S.M. Wold, K. Doronin et al. Immune responses to adenoviruses: viral evasion mechanisms and theirimplications for the clinic. Current opinion in immunology. 1999, vll, p.380-386.

114. Waldman T, Kinzler KW, Vogelstein B. p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells.//Cancer Res. 1995 Nov 15; 55 (22) :5187-90.

115. Weill D, Mack M, Roth J, Swisher S, Proksch S, Merritt J, Nemunaitis J. Adenoviral-mediated p53 gene transfer to non-small cell lung cancer through endobronchial injection.//Chest. 2000 Oct;118(4):966-70 .

116. Wickham TJ. Targeting adenovirus.//Gene Ther. 2000 Jan;7 (2) :110-4 .

117. Wilson Deborah R. Viral-mediated gene transfer for cancer treatment.// Curr. Phar. Biotech. 2002,3,151164 .

118. Woo RA, McLure KG, Lees-Miller SP, Rancourt DE, Lee PW. DNA-dependent protein kinase acts upstream of p53 in response to DNA damage.//Nature. 1998 Aug 13; 394 (6694) : 700-4.

119. Wu Q. et al. Growth supression of human ovarian carcinoma OV-MZ-2a and OV-MZ-32 cells mediated by gene transfer of wild-type p53 enhanced by chemotherapy in vitro.

120. Xiong Y, et al. p21 is a universal inhibitor of cycline kinases . Nature 1993, v366, p701-4

121. Y Yang, FA Nunes, K Berencsi, EE Furth, E Gonczol, and JM Wilson Cellular Immunity to Viral Antigens Limits El-Deleted Adenoviruses for Gene Therapy PNAS 91: 4407-4411.