Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих протективные антигены вирусов болезни Марека и гриппа птиц

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих протективные антигены вирусов болезни Марека и гриппа птиц"

На правах рукописи

Л

I/

КАРПОВ АНДРЕЙ ПАВЛОВИЧ

Конструирование рекомбинантных аденовирусов

птиц CELO, экспрессирующих протективные антигены вирусов болезни Марека и гриппа птиц

03 00.07 - микробиология 03.00 23 — биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008 г

003163408

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф Гамалеи РАМН (ГУ НИИ ЭМ им.Н.Ф Гамалеи РАМН) и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО МГУПБ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, г Покров (ГНУ ВНИИВ ВиМ)

Защита состоится «25» января 2008 г в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 001 007 01 в ГУ НИИ ЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ ЭМ им НФ Гамалеи

Народицкий Борис Савельевич

Официальные оппоненты:

член корр РАМН, доктор биологических наук, профессор Смирнов Георгий Борисович

доктор медицинских наук, профессор

Альтштейн Анатолий Давидович

РАМН

Автореферат разослан декабря 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы На сегодняшний день для вакцинации

сельскохозяйственных животных используют инактивированные и аттенуированные

формы возбудителей инфекций микробного или вирусного происхождения С целью

расширения спектра защиты при вакцинации применяют поливалентные вакцины,

представляющие собой смесь аттенуированных патогенов разных штаммов Такие

вакцины способны обеспечивать протективность против возбудителя инфекции на

длительный период Однако, в результате вспышек инфекций, вызванных патогеном,

против которого была проведена вакцинация, выявляют «новые» более вирулентные

штаммы, способные преодолевать сформированный иммунный барьер

(WHO/CDS/CRS/NCS/2002 5)

Причиной появления «новых» штаммов является генетическая вариабельность,

которая может привести к существенному изменению антигенной структуры В

результате специфический иммунитет, установившийся на аттенуированную вакцину,

может дать незначительную защиту или совсем ее не обеспечить (Pales Р , 1983)

В связи с вышесказанным на сегодняшний день существует потребность в создании

эффективной вакцины, технология получения которой позволяла бы быстрое

конструирование и переориентацию производства в зависимости от возникающей

опасности Традиционные вакцины и технологии их создания во многом несовершенны и

не отвечают данным требованиям Использование генно-инженерных вакцин может

обеспечить решение этой проблемы Генно-инженерные векторы, применяемые при

конструировании предполагаемых вакцин, являются хорошо изученными и имеют, как

правило, быструю и эффективную схему получения (Danthinne X, 2000, Lees С Y, 2002)

Одной из перспективных систем для доставки генетической информации,

кодирующей гены инфекционных возбудителей, является система, основанная на

аденовирусных векторах (Ад) (Kovesdi 1, 1997, Benihoud К, 1999) Данные системы

имеют ряд преимуществ перед другими системами Во-первых, пакующая емкость

существующих векторов на основе аденовирусов позволяет доставлять генетическую

информацию размером 7000-8000 п о Во-вторых, разработано большое количество

аденовирусных векторов с измененным тропизмом, который достигается модификацией

нуклеотидной последовательности структурных белков вириона (Kirby 1, 1999, Logunov

D Y, 2007) В-третьих, разработаны быстрые и гибкие технологии получения

рекомбинантных аденовирусов, позволяющие реализацию масштабного производства

различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной

технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента

Вышеперечисленные свойства делают Ад векторы привлекательными для создания на их

3

основе вакцинных препаратов нового поколения, позволяющих решать ключевые задачи микробилогии

Аденовирусные векторы могут быть использованы для создания на их основе генно-инженерных вакцин против инфекций, вызванных вирусом гриппа птиц (ГП) и вирусом болезни Марека (ВБМ) Эти вирусы вызывают развитие острого заболевания с высокой контагиозностью и многообразием вариантов патогенетического проявлений Инфекции, вызванные данными вирусами, сопровождаются высокой смертностью, что наносит значительный экономический урон сельскому хозяйству (Mayr GA, 2001, Wentao Gao, 2006)

В связи с этим изучение возможности использования аденовирусного вектора птиц CELO для конструирования кандидатного вакцинного препарата против потенциально опасных инфекций, вызванных вирусом болезни Марека или вирусом гриппа птиц, представляет самостоятельный научный интерес

Цель исследования Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих гены гликопротеинов вируса болезни Марека и вируса гриппа птиц, и последующее изучение на лабораторных животных индукции специфического иммунитета в ответ на экспрессируемые антигены В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи

1 Клонирование гена гемагглютинина из генома вируса гриппа птиц штамма H5N2 и генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома вируса болезни Марека штамма RB1B

2 Получение рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих ген гемагглютинина НА5 и гены гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ под контролем CMV-промотора в сайте делеции несущественной области генома вектора, методом гомологичной рекомбинации в Е coli

3 Изучение экспрессии целевых генов в составе рекомбинантных вирусов на основе аденовируса CELO в условиях in vitro

4 Изучение индукции специфического иммунитета в ответ на экспрессию гликопротеинов вируса болезни Марека и гриппа птиц в организме лабораторных животных при генетической иммунизации рекомбинантными вирусами CELO

5 Определение протективности гемагглютинин-специфического иммунного ответа у мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO, экспрессирующим НА5 вируса гриппа птиц H5N2

Научная новизна. Разработана эффективная технология получения рекомбинантных аденовирусов на основе CELO, основанная на гомологичной рекомбинации в Е coli

Впервые получен набор рекомбинантных аденовирусов CELO-HA, несущий ген

гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2, и CELO-gB, CELO-gE, CELO-gl,

несущие гены соответствующих гликопротеинов ВБМ штамма RB1B

4

Показана экспрессия мРНК генов гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ на культуре клеток, зараженных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO, несущим соответствующий целевой ген

Подтверждена идентичность антигенных свойств рекомбинантного гликопротеина gB, экспрессируемого вирусом CELO-gB, и природного гликопротеина gB ВБМ штамма RB1B Показана иммуногенность гликопротеина gB ВБМ, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом CELO-gB, на естественно восприимчивой для вируса болезни Марека модели птиц

Подтверждена идентичность антигенных свойств рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого вирусом CELO-HA, и природного гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2 Определено содержание рекомбинантного гемагглютинина НА5 в культуре клеток, зараженных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA

Определен оптимальный способ иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, при котором экспрессируемый гемагглютинин проявляет наибольшую защиту против вирулентного вируса гриппа

Впервые показана 95% защита мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, экспрессирующим гемагглютинин НА5, в условиях экспериментального заражения мышей летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2 (50LD5O)

Практическая значимость. Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2

и гены гликопротеинов gB, gE и gl вируса болезни Марека штамма RB1B, клонированные

в плазмидном векторе pGEM-T-Easy, коллекция рекомбинантных аденовирусов CELO-

HA, CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, - хранятся в музее лаборатории молекулярной

биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи РАМН (ГУ

НИИ ЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН)

Рекомбинантные аденовирусы CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, содержащие

изолированные гены, кодирующие гликопротеины ВБМ, используются в эксперименте по

определению их иммуногенности на естественно восприимчивой для ВБМ модели птиц

Рекомбинантный аденовирус CELO-HA, экспрессирующий гемагглютинин НА

вируса гриппа птиц штамма H5N2, используется в эксперименте по определению

протективности иммунизации на пермиссивной для вируса гриппа модели птиц

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и

обсуждены на IV международной научной конференции студентов и молодых ученых

«Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005),

международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию

Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006), V

международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и

5

биологическая безопасность населения» (Москва, 2006), IV Московском международном конгрессе «Экспо-биохим-технологии» (Москва, 2007), VI международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007), расширенном заседании кафедры биологии, вирусологии и генной инженерии ГОУ ВПО МГУПБ 1 ноября 2007 года, заседании отдела генетики и молекулярной биологии бактерий 13 декабря 2007 г ГУ НИИ ЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 статей в сборниках международных конференций

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список используемой литературы (214 источников, из которых 15 отечественных и 199 иностранных) Работа содержит 4 таблицы и 20 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2004 по 2007 год на кафедре биологии, вирусологии и генной инженерии ГОУ ВПО МГУПБ и лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им НФ Гамалеи РАМН Эксперимент по определению иммуногенности рекомбинантного аденовируса CELO-gB in vivo выполнен совместно с лабораторией диагностики вирусных болезней птиц Федерального государственного учреждения Федеральный центр охраны здоровья животных г Владимир (ФГУФЦО ЗЖ) Реакция торможения гемагглютинации проводилась совместно с лабораторией физиологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН

В работе были использованы

- аденовирус птиц CELO штамм Phelps (полученный от д-ра А Ван Дер Эба, лаборатория физиологической химии Лейденского университета), вирус болезни Марека штамм RB1B, предоставлен ФГУФЦО ЗЖ г Владимир, вирус гриппа птиц A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84 H5N2 любезно предоставлен руководителем лаборатории физиологии вирусов ГУ НИИ Вирусологии им ДИ Ивановского РАМН проф HB Кавериным,

- лабораторные штаммы Eshenchia coli DH5a и В J5183, клеточная линия LMH (leghorn male hepatoma), любезно предоставленная М Cotten (Австрия),

- плазмидные векторы pBssk (+) ("Fermentas MBI"), pcDNA3 l/Zeo(+) ("Invitrogen"), плазмидная система pGEM-T-Easy (Promega), плазмидный вектор pCShuttle,

6

- коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз и других ферментов фирм "Fermentas МЫ" (Литва), "Promega" (США) и NE BioLabs (США)

Для выращивания клеток Е coli использовали бакто-триптон, бакто-агар и дрожжевой экстракт фирмы "Difco" (США) Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор Reverse Tpanscnption System (Invitrogene, США) Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол» Сиквенирование проводилось в НПФ «Литех»

Эксперименты проводились на мышах линии BALB\c, возраст 8 недель, куриных SPF эмбрионах и 14-ти дневных цыплятах

Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методам, изложенным в Mamatis et al (1982) Все манипуляции, связанные с работой с аденовирусами, проводили согласно Graham & Prevec (1991) Работу с вирусом гриппа птиц проводили в соответствии с WHO/CDS/CRS/NCS/2002 5

Анализ антигенных свойств протективных гликопротеинов gB ВБМ и НА вируса ГП и оценку иммуногенности проводили с использованием методов иммуноблоттинга, непрямого и сэндвич-ИФА, РТГА

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Microsoft Excel В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с к б н Логуновым Д Ю, к б н Шмаровым М М, к б н Верховской Л В , мл науч сотр Тутыхиной И Л - сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН, сотрудником лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУФЦО ЗЖ г Владимир, квн Шульпиным М И, сотрудником лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН, к б н Рудневой И А, которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Клонирование генов гликопротеинов gB. gE и gl из генома ВБМ штамма RB1B и гена гемагглютинина из генома вируса гриппа типа H5N2

Гены гликопротеинов gB, gE и gl выделяли из генома ВБМ штамма RB1B методом ПЦР с использованием специфических праймеров (Табл 1)

Поскольку геном вируса ГП представлен сегментированной РНК, для изолирования полноразмерного гена гемагглютинина, на первом этапе была получена кДНК генома вируса В качестве матрицы в реакции обратной транскрипции использовали РНК, выделенную из препарата вируса гриппа птиц A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) Полноразмерный ген гемагглютинина (НА) получали в результате ПЦР, где в качестве матрицы использовали кДНК генома вируса гриппа птиц Для амплификации использовали праймеры, последовательности которых указанны в таблице 1

7

Полученные в результате ПНР последовательности ДНК были субклонированы в плазмидный вектор pGEM-T-Easy

Таблица 1. - Олигонуклеотиды, используемые при клонировании целевых генов из геномов ВБМ и вируса гриппа птиц

Геном вируса Ген Продукт Пара олигонуютеотидов

ВБМ gB gBl gBl-F 5'-cgc-ccc-cat-ctg-acc-cgt-cc gBl-R 5'-ccg-caa-tcg-tga-caa-tga-gg

gB2 gB2-F 5'-gat-gag-aga-caa-cag-gac-cg gB2-R 5'-cgc-aat-aaa-tga-gta-aac-c

gl gl MDI-F 5'-ggt-cag-ata-gac-ggc-gtg-tg MDI-R 5'-caa-gaa-acg-gct-cct-ccc-c

gE gEl MDE1-F 5'-gca-tgt-ctg-cga-gtc-agc-gtc MDEl-R5'-caa-tcc-agc-atc-gtc-tac-ctg-g

gE2 MDE2-F 5'-cgc-atc-caa-cat-tga-cat-tct-gc MDE2-R 5 '-gcc-aag-cgg-tat-aac-ccg-aac-cc

H5N2 НА5 HA5 HA5-For 5 -caa-tga-tgg-aga-aaa-tag-tgc-tlc-t HA5-Rev 5 -gac-ctt-aaa-tgc-aaa-ttc-tgc-att-gta-ac

Идентичность гена в составе плазмиды pGEM-T-Easy проверяли сравнением (BLAST) его первичной структуры с нуклеотидной последовательностью соответствующего гена вируса болезни Марека штамма RB1B (Gene Bank AF147806 2) или вируса гриппа птиц A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) (Gene Bank DQ234078 1)

Таким образом, в результате этого этапа работы был получен набор плазмидных конструкций pGEM-T-gB, pGEM-T-gE, и pGEM-T-gl, несущих ген соответствующего гликопротеина вируса болезни Марека штамма RB1B, и pGEM-T-HA, содержащей ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2

Конструирование рекомбипаитных аденовирусов, несущих целевые гены

Для конструирования рекомбинантных аденовирусов, гены gB, gE и gl вируса болезни Марека и ген НА вируса гриппа птиц были субклонированы из плазмиды pGEM-T-Easy в плазмидный вектор pCDNA3 1-BPL, содержащий нетранслируемый двучастный лидер BPL (bipartite leader - BPL) аденовируса птиц CELO на 3'-конце промотора цитомегаловируса человека (CMV)

Конструкции BPL-gB, BPL-gE, BPL-gl и BPL-HA были клонированы из вектора pCDNA3 1-BPL в челночный плазмидный вектор pCShuttle, несущий концевые фрагменты генома CELO и кассету, содержащую CMV промотор и сигнал полиаденилирования

Принципиальная схема клонирования целевых генов в челночный вектор, на примере генов гликопротеинов ВБМ, представлена на рис. 1 (А).

А

, I НА ,

Г

J д1

cet0

Правое плечо

CELO

Левое плечо

Asel

Гидролиз по сайтам I Обработка Nhel, фрагментом Smal и Apal | Klenow и Apal

-ÍPLCMV ^Правое плечо

pCShuttle-gB

" - - CELO

"" Asel

Л-ИКП су

Левое плечо

Области гомологичной рекомбинации

CELO

Линеаризация по Pací

Геном аденовируса CELO

cMv*pkL gB рл

Трансфекция клеток линии LMH

CELO-gB

Рис. 1. - Схема клоннривания целевых генов в челночный вектор (А), и принципиальная схема получения рскомбинантного аденовируса птиц CELO методом гомологичной рекомбинации в E.coli (Б)

Рекомбинантные аденовирусы CELO, несущие целевые гены, получали методом гомологичной рекомбинации в Е coli Метод основан на гомологичной рекомбинации между полноразмерным геномом аденовируса и челночным плазмидным вектором, который содержит последовательности, гомологичные концам генома вируса, и экспрессирующую кассету с целевым геном В результате рекомбинации получается плазмидная конструкция, содержащая сайт инициации репликации Orí, ген устойчивости к антибиотику и экспрессирующую кассету в составе генома аденовируса

Преимуществом метода является возможность использования клеток Е coli в качестве основного инструмента для проведения клонирования, рекомбинации и наращивания аденовирусной ДНК Возможность проведения гомологичной рекомбинации в Е coli позволяет работать с индивидуальными клонами, содержащими плазмидные конструкции только рекомбинантных аденовирусов, что исключает вероятность контаминации аденовирусом дикого типа

Принципиальная схема получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO методом гомологичной рекомбинации в Е coli представлена на на рис 1 (Б) В результате гомологичной рекомбинации в Е coli был получен набор плазмидных конструкций pCELO-gB, pCELO-gE, pCELO-gl и pCELO-HA, несущих геномную ДНК аденовируса CELO со вставкой в сайте делеции экспрессирующей кассеты, содержащей соответствующий ген gB, gE, gl ВБМ штамма RB1B или ген гемагглютинина вируса гриппа H5N2 Рекомбинантные аденовирусы CELO-gB, CELO-gE, CELO-gl и CELO-HA получали в результате трансфекции соответствующей плазмидной конструкцией пермиссивной линии клеток LMH

Полученные рекомбинантные аденовирусы CELO-gB, CELO-gE, CELO-gl и CELO-HA были проанализированы методом ПЦР Электрофореграмма результатов ПНР представлена на рис 2

В результате проведенного ПЦР анализа последовательностей ДНК полученных рекомбинантных аденовирусов было показано, что геном аденовируса содержит соответствующий целевой ген Примесей вируса CELO дикого типа не детектировали

Таким образом, была получена коллекция рекомбинантных аденовирусов CELO-gB, CELO-gE CELO-gl, несущих гены соответствующего гликопротеина ВБМ штамма RB1B, и аденовирус CELO-HA, содержащей ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2

А_ Б

1 2 3 4 5 6

CELO-gB —

CELO-gE — — ta»

CELO-gl _ — —

CELO-HA — — —

Рис. 2 - Электрофореграмма ПЦР анализа ДНК рекомбинантных аденовирусов CELO-gB, CELO-gE, CELO-gl и CELO-HA

При получении ПЦР-продуктов использовали праймеры, специфичные соответствующим генам gB, gE, gl или НА (А) и вирусу CELO дикого типа (Б). В качестве матрицы использовали:

трек 1,4 ДНК изолированную из вирионов соответствующего рекомбинантного аденовируса; трек 2 - плазмидную ДНК, содержащую соответствующий ген гликопротеина ВБМ (положительный контроль);

трек 3 и 6 - негативные контроли ПЦР;

трек 5 - ДНК вируса дикого типа (положительный контроль).

Изучение экспрессии целевых генов в составе рекомбинантных аденовирусов в экспериментах in vitro

Экспрессию нелевых генов в составе рекомбинантных аденовирусов CELO-gB, CELO-gE и СELO-gl анализировали на уровне экспрессии мРНК. Для этого клетки линии LMH, пермиссивной для вируса CELO, заражали рекомбинантным вирусом CELO-gB. CELO-gE или CELO-gl. Выбор пермиссивной клеточной линии обусловлен возможностью репликации рекомбинантного аденовируса, что приводит к синтезу большего количества мРНК. После 24 ч. инкубирования из клеток была выделена РНК, которую использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции. Полученную кДНК анализировали методом ПЦР с использованием праймеров, специфичных последовательностям целевых генов ВБМ, вирусной ДНК и последовательностям конститутивно экспрессируемых генов. Последовательности используемых праймеров указаны в таблице 2.

В качестве негативного контроля использовали клетки линий LMH. заражённые вирусом CELOwt дикого типа.

В результате проведённого ОТ-ПТДР была показана экспрессия мРНК целевых генов гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ в клетках LMH. заражённых рекомбинантным аденовирусом CELO-gB, CELO-gE или CELO-gl соответственно (Рис. 3).

Таблица 2. - Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для детекции экспрессии мРНК методом ОТ-ПЦР

Последовательность Праймер прямой Праймер обратный

Ген gB gB2-Forw 5'- gat-gag-aga-caa-cag-gac-cg MDB-control-rev 5cga-tac-agc-agc-gac-atc-ccc-c

Ген gl MDI-forw 5'- ggt-cag-ata-gac-ggc-gtg-tg MDl-REV-control 5'- cca-cag-cgt-ctc-tac-agc-c

Ген gE MDE2-forw 5cgc-atc-caa-cat-tga-cat-tct-gc MDEl-rev 5 '-caa-tcc-agc-atc-gtc-tac-ctg-g

Фибер CELO CFIB-F 5'-cct-ggt-cac-gta-tac-caa-g CFIB-R 5'-ctg-cag-gag-tta-aca-agt-tc

Птичий В-актин CHBact-Forw 5'-gtc-agg-tca-tca-cca-ttg-gca CHBact-Rev 5'-ccc-aag-aaa-gat-ggc-tgg-aag

12 3 4 5 6

III

Рис. 3. - Детекция экспрессии мРНК генов гликопротеинов gB, gE и gl методом ОТ-

ПЦР

При получении продуктов ОТ-ПЦР использовали праймеры, специфические целевым генам (ряд I), фиберу вируса CELO (ряд II) и птичьему ß-актину (ряд III). В качестве матрицы использовали РНК, изолированную из клеток LMH5 инфицированых:

трек 1,3,5- рекомбинантными аденовирусами CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, соответственно; трек 2,4,6 - вирусом CELO дикого типа.

Экспрессию гена гликопротеина gB в культуре клеток, зараженных аденовирусом CELO-gB, определяли методом иммуноблоттинга. Для этого клетки линии LMH заражали рекомбинантным аденовирусом CELO-gB. В качестве контрольного использовали аденовирус CELO дикого типа. После инкубирования инфицированные клетки LMH лизировали. Лизат клеток анализировали методом иммуноблоттинга. В реакции использовали гипериммунную сыворотку кур к вирусу болезни Марека типа I, позволяющую детектировать мажорные капсидные антигены вируса.

В результате анализа было показано специфическое взаимодействие антител сыворотки и рекомбинантного полипептида, соответствующего по электрофоретической подвижности гликопротеину gB ВБМ. (Рис.4)

12 3 4

Рис. 4. - Анализ экспрессии гликопротеина gB ВБМ в составе рекомбинантного вируса CELO методом иммуноблоттинга

1- лизат клеток, зараженных вирусом CELOwt (отрицательный контроль);

2- лизат клеток, зараженных вирусом CELO-gB;

3- лизат клеток, зараженных вирусом ВБМ (положительный контроль);

4- лизат незараженных клеток.

Данные анализа подтверждают идентичность антигенных свойств гликопротеина gB, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом птиц CELO-gB. и белка gB вируса болезни Марека RB1B. Таким образом, была показана экспрессия гликопротеина gB в культуре клеток, заражённых вирусом CELO-gB.

Экспрессию рекомбинантного гликопротеина НА5 в культуре клеток, заражённых аденовирусом CELO-HA, определяли методом иммуноблоттинга. Для этого культуру клеток линии LMH заражали вирусом CELO-HA. В качестве контрольного использовали аденовирус CELO дикого типа. После 24 часов инкубации, клетки обработали лизирующим буфером. Для определения рекомбинантного белка гемагглютинина НА использовали мышиные моноклональные антитела к НА5 вируса гриппа птиц штамма H5N2. Результат проведённого иммуноблоттинга представлен на рис.

1 2 3

Рис. 5. - Анализ гемаглютинпна НА5 в культуре клеток LMH, заражённых рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, методом иммуноблотинга

1 трек - лизат клеток лизат клеток, зараженных вирусом CELO-HA;

2 трек - лизат клеток, зараженных вирусом гриппа птиц штамма H5N2 (положительный контроль);

3 трек - лизат клеток, зараженных вирусом CELO дикого типа (отрицательный контроль).

В результате анализа было показано специфическое взаимодействие антител и рекомбинантного гемагглютинина, соответствующего по электрофоретической подвижности гемагглютинину вируса гриппа птиц штамма H5N2.

Данные анализа подтверждают идентичность антигенных свойств продукта экспрессии гена гемагглютинина НА5 рекомбинантным аденовирусом птиц CELO-HA и

белка НА вируса гриппа птиц штамма H5N2. Таким образом, была показана экспрессия гемагглютинина НА5 в культуре клеток, заражённых вирусом CELO-HA.

Для количественного определения содержания гемагглютинина НА5 вируса гриппа птиц в культуре клеток, заражённых рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, использовали ELISA набор (Avian Influenza). Этот набор предназначен для детекции гемагглютинина вируса гриппа птиц А штамма Н5, и позволяет провести количественное определение гемагглютинина в исследуемом образце. Для анализа использовали лизат клеток линии LMH, заражённых рекомбинантным вирусом CELO-HA. Результат проведённого анализа представлен на рис. 6.

Определение уровня экспрессии антигена с использованием НБ-НА(Ад) Bisa kit

О)"

* "i

О) I

N 11

О LIVH "К -" LWH + CELO-HA К+

Рис. 6. - Определение уровня экспрессии гемагглютинина в культуре клеток LMH, заражённых рекомбинантным CELO-HA

Согласно инструкции набора, оптическое поглощение OD450, соответствующее сигналу в 3.0 ОЕ соответствует 512 ГАЕ (гемагглютинирующих единиц). Чувствительность метода составляет 0,25 ГАЕ.

В результате проведённого анализа был определён уровень экспрессии рекомбииантного гемагглютинина НА5 вируса гриппа птиц в клетках линии LMH, который составил 570 ГАЕ. Высокая специфичность тест-системы подтверждает соответствие антигенной конформации рекомбииантного гемагглютинина, экспрессируемого аденовирусом CELO-HA, и нативного гемагглютинина вируса птиц штамма Н5.

Генетическая иммунизация рекомбинантными аденовирусами

Изучение иммуногенности гликопротеина gB ВБМ, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом CELO-gB. Для изучения иммуногенности гликопротеина gB, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом CELO-gB, в качестве экспериментальных животных использовали цыплят 14-суточного возраста. Цыплят подкожно иммунизировали рекомбинантным аденовирусом CELO-gB в количестве 1,2*10'" физических частиц на цыплёнка. Образцы сывороток получали через 3 недели после иммунизации.

Полученные образцы сывороток были исследованы на наличие специфических антител к ВБМ. Уровень специфических антител определяли методом непрямого ИФА. Для постановки непрямого ИФА в качестве антигена использовали очищенный ВБМ. Результат проведенного иммуно-ферментного анализа представлен на рис. 7.

В результате анализа сывороток цыплят, иммунизированных вирусом СЕЬО-§В. были детектированы антитела к вирусу ВБМ с титром до 8 1о§2.

Определение титра дВ-специфических антител методом ИФА

14

Титр антител, 1од 12 ■ 10 ■ 1

6 | _ 6

ВБМ CELOvt CELO-gB

Рис. 7. - Определение титра gB-специфических антител в сыворотке крови цыплят, иммунизированных CELO-gB, методом непрямого ИФА

Полученный результат свидетельствует об индукции ВБМ-специфического гуморального иммунитета, индуцируемого в ответ на подкожное введение рекомбинантного вируса на основе птичьего аденовируса CELO, экспрессирующего ген гликопротеина gB ВБМ штамма RB1В под контролем промотора CMV.

Таким образом, в результате генетической иммунизации рекомбинантным аденовирусом CELO-gB, показана индукция специфического иммунитета в ответ экспрессию гликопротеина gB

В настоящее время совместно с лабораторией диагностики вирусных болезней птиц ФГУФЦО ЗЖ (г. Владимир) проводится эксперимент на курах по определению иммуногенности рекомбинантных аденовирусов CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl. несущих гены гликопротеинов ВБМ.

Оценку иммуногенности рекомбинатного гемагглютииина, экспрессируемого аденовирусом CELO-HA, проводили методом РТГА. Для этого мышей линии BALB/c внутривенно иммунизировали аденовирусом CELO-HA. Повторную вакцинацию провели через 30 суток. Образцы сывороток отбирали через 21 день после повторной иммунизации. Полученные образцы сывороток анализировали на наличие специфических гемагглютинирующих антител к вирусу гриппа птиц штамма H5N2. Для постановки РТГА использовали очищенный вирус гриппа птиц штамма H5N2. Результат проведенной реакции торможения гемагглютинации представлен на рис. 8.

Определение титра вирус-агглютинирующих антител в сыворотке крови мышей методом РТГА

м Ю- О)

5 6 I 4. i

2- S в

К- CELOwt CELO-HA

Рис. 8. - Определение титра антител, препятствующих торможению агглютинации эритроцитов, в сыворотке крови мышей, внутривенно иммунизированных рскомбинантным аденовирусом CELO-HA, методом РТГА

В результате анализа сывороток мышей, внутривенно иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, были детектированы антитела, препятствующие торможению агглютинации эритроцитов вирусом гриппа птиц штамма H5N2, титр составил порядка 8,5 log2-

Полученный результат РТГА свидетельствует об индукции гуморального иммунитета, специфического к вирусу гриппа птиц, индуцируемого в ответ на внутривенное введение рекомбинантного вируса на основе аденовируса CELO, экспрессирующего ген гемагглютинина НА5 под контролем промотора CMV.

Определение оптимального способа иммунизации мышей линии BALB/c рекомбинантным CELO-HA. Ключевой характеристикой вакцинного препарата является протективность иммунитета, сформированного в ответ на иммунизацию вакциной, против вирулентного патогена. С целью установления защитных свойств рекомбинантного вируса необходимо было провести иммунизацию животных. Предварительным этапом является подбор оптимального способа введения рекомбинантного аденовируса, при котором проявляется наибольшая защита. Известно, что в некоторых случаях наибольшая эффективность достигается при внутримышечном (в/м) или интраназальном (и/н) способе иммунизации. В нашей работе лабораторных животных иммунизировали обоими способами. Схема эксперимента представлена в таблице 3.

Через 21 день после повторной иммунизации мыши всех групп были заражены сублетальной дозой (10 LD50) вируса гриппа птиц H5N2, адаптивного для мышей. Заражённых мышей наблюдали в течение 2 недельного срока. Результат выживаемости мышей с вариацией условий иммунизации представлен на рис. 9.

Таблица 3. - Схема эксперимента по установлению оптимальных условий иммунизации ¡мышей

№ Группа Количество мышей в эксперименте

1 Плазмида 100 мкг, в/м -V CELO-HA (5*10" ф.ч.), в/м 10

2 CELO-HA (5x10" ф.ч.), в/м + CELO-HA (5хЮП ф.ч.), в/м 10

3 CELO-wt (5x10" ф.ч.), в/м + CELO-wt (5x10" ф.ч.), в/м 10

4 Плазмида 100 мкг, в/м + CELO-HA (3x10" ф.ч.), и/н 10

5 CELO-HA (3x10" ф.ч.), и/н + CELO-HA (3x10" ф.ч.), и/н 10

6 CELO-wt (3x10" ф.ч ), и/н + CELO-wt(3xlO" ф.ч),и/н 10

7 РВБ50мкл, и/н + PBS 50 мкл, и/н 10

В результате проведённого эксперимента выявили протективность иммунного ответа в группах № 1, 4 и 5. В группах № 1 и 4. в качестве праймирующего агента иммунизации, использовали плазмидную конструкцию, несущую ген гемагглютинина НА5 под контролем эукариотического промотора.

Диаграмма выживаемости мышей линии BALB/c, иммунизированных вирусом CELO-HA

Рис. 9. - Диаграмма выживаемости мышей с вариацией условий иммунизации

Мыши были иммунизированы:

1 - Плазмида, в/м + CELO-HA, в/м; 5 - CELO-HA, и/н + CELO-HA, и/н;

2 - CELO-HA, в/м + CELO-HA, в/м; 6 - CELO-wt, и/н + CELO-wt, и/н;

3 - CELO-wt, в/м + CELO-wt, в/м; 7 - PBS, и/н + PBS, и/н.

4 - Плазмида. в/м + CELO-HA, и/н;

Наиболее технологичной является интраназальная иммунизация рекомбинантным вирусом, без праймирующего агента. Следовательно, условия иммунизации животных группы №5 являются оптимальными для индукции протективного иммунитета мышей линии BALB/c.

Таким образом, в данном эксперименте показано, что максимальный уровень защиты против последующего заражения вирусом гриппа птиц штамма H5N2. адаптивного для модели мышей, был детектирован при интраназальной двукратной иммунизации рекомбинантным аденовирусом CELO-HA.

Анализ протективности НА-специфического иммунного ответа мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, е последующим заражением летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2. В результате проведения предыдущего эксперимента установили, что оптимальным для вакцинации является двукратное интраназальное введение рекомбинантным аденовирусом CELO-HA. Целью этого эксперимента являлось изучение протективных свойств рекомбинантного аденовируса CELO-HA в условии заражения мышей летальной дозой (50 LD50) вируса гриппа птиц штамма H5N2. Для этого мышей линии BALB/c иммунизировали аденовирусом CELO-HA в соответствии с результатом, полученным в предыдущем эксперименте. В качестве отрицательных контролей использовали аденовирус дикого типа CELOwt или солевой изотонический раствор. Через 21 день после повторной иммунизации мыши были интраназально заражены летальной дозой вируса гриппа птиц штамма H5N2. Группы наблюдались в течение 2-х недельного периода после заражения. На рис. 10. представлена диаграмма выживаемости мышей по результатам двух экспериментов.

100

^ 80

■С &

о S0 £ о

ш 40

£

£

¿¡ 20

II—■— —я—■— 1

é-

........»-i

0 1 2 3 4 6 6 7 8 Э 10 11 12 13 14 16 Время, дни

I—*— СВ.О-НА —о— CELQ/v t —•— Control]

Рис. 10. - Диаграмма выживаемости мышей линии BALB/c, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим гемагглютинин НА5, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2

В результате эксперимента установлено, что мыши, интраназально иммунизированные рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, не восприимчивы к заражению летальной дозой вируса-пробойника В то время как в группах негативного контроля, где мышам вводили вирус CELOwt дикого типа или солевой раствор, падение наблюдали с 7 дня после заражения вирусом гриппа К концу срока наблюдения в контрольных группах пали все особи Данные анализа свидетельствуют о наличие протективного иммунитета, сформированного в ответ на интраназапьную иммунизацию рекомбинантным аденовирусом CELO, экспрессирующим ген гемагглютинина НА вируса гриппа птиц штамма H5N2

Таким образом, в результате эксперимента было установлено, что уровень защиты при экспериментальном заражении летальной дозой (50 LD50) вируса гриппа H5N2 мышей, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, экспрессирующим ген гемагглютинина НА5, составил 95%

выводы

1 Получен рекомбинантный аденовирус CELO-HA, несущий ген гемагглютинина НА вируса гриппа птиц H5N2, и набор рекомбинантных аденовирусов CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, содержащих гены гликопротеинов gB, gE или gl вируса болезни Марека штамма RB1B

2 Подтверждена идентичность антигенной структуры рекомбинантного гемагглютинина НА5, экспрессируемого аденовирусом CELO-HA, и гемагглютинина вируса ГП H5N2 Определен уровень экспрессии гемагглютинина НА5 в клетках, зараженных вирусом CELO-HA, который составил 570 ЕАЕ

3 Установлена иммуногенность рекомбинантного гемагглютинина на модели мышей, иммунизированных аденовирусом CELO-HA Титр НА-специфических антител в сыворотке крови иммунизированных мышей в реакции торможения гемагглютинации составил 8,5 log2

4 Показана 95% защита мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, экспрессирующим гемагглютинин НА5, в условиях экспериментального заражения мышей летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2 (5OLD50)

5 Детектирована экспрессия генов гликопротеинов gB, gE и gl, в составе рекомбинантных вирусов на основе CELO, на уровне мРНК Определена идентичность антигенной структуры рекомбинантного гликопротеина gB, синтезированного в клетках, зараженных аденовирусом CELO-gB, и белка gB вируса болезни Марека штамма RB1B

6 Показана иммуногенность рекомбинантного гликопротеина gB на модели цыплят, иммунизированных аденовирусом CELO-gB В сыворотке крови иммунизированных цыплят титр антител, специфических антигену вируса болезни Марека, составил 8 log2

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Карпов А П Конструирование рекомбинантного аденовируса 5 серотипа, экспрессирующего ген SEAP, методом гомологичной рекомбинации в Е coli /А П Карпов// Живые системы и биологическая безопасность населения Сб науч ст IV международной научной конференции студентов и молодых ученых, - M МГУПБ, 2005 - С 194-195

2 Шувалова ЕА Получение рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, методом рекомбинации в Е coli /Е А Шувалова, А П Карпов, О В Зубкова, Д В Щебляков, А Ф Валихов //Сб науч ст международной юбилейной научено-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, - Курск КГСА, 2006, - С 221-225

3 Карпов А П Конструирование модифицированного аденовируса птиц CELO с целью создания генно-инженерной вакцины нового поколения //А П Карпов, Е А Шувалова, О В Зубкова //Живые системы и биологическая безопасность населения Сб науч ст V международной научной конференции студентов и молодых ученых, - M МГУПБ, 2006 - С 231-232

4 Карпов А П Конструирование кандидатной генно-инженерной вакцины на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующего ген гликопротеина gB вируса болезни Марека /А П Карпов //Живые системы и биологическая безопасность населения Сб науч ст VI международной научной конференции студентов и молодых ученых, - M МГУПБ, 2007 - С 271-273

5 Карпов А П Идентификация генов аденовируса птиц CELO, кодирующие протеины, способные регулировать функцию транскрипционного фактора р53 /А П Карпов, Д Ю Логунов, А Ф Валихов, Б С Народицкий //Биотехнология состояние и перспективы развития Сб науч ст IV Московского международного конгресса - M ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им Д И Менделеева, 2007 - С 277-278

6 Карпов А П Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих гены гликопротеинов gB, gE, gl вируса болезни Марека /А П Карпов, ИЛ Тутыхина,ДЮ Лгауновидр //Биотехнология - Москва, № 5, 2007, - С 38-44

7 Logunov D Y Identification of Ш-like loop m CELO adenovirus fiber for incorporation of receptor binding motifs /Logunov D Y , Zubkova О V , Karyagma-Zhulina A S , Shuvalova E A, Karpov A P , Shmarov M M, Tutykhina IL , Alyapkina Y S , Grezma N M, Zmovieva N A, Ernst L К , Gintsburg A L , Naroditsky В S //J Virol 2007 Sep,81(18) 9641-52

Отпечатано в типографии ООО «Ника» Формат 210x297 Бумага офсетная Тираж 100 экз Заказ 1540

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпов, Андрей Павлович

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Генно-инженерные векторы, используемые при создании кандидатных вакцин.

1.1.1 Типы генно-инженерных векторов.

1.1.2. Вирусные векторы, используемые для создания кандидатных генно-инженерных вакцин.

1.1.3 Генно-инженерные векторы на основе аденовирусов.

1.1.3.1 Структурно-функциональная характеристика аденовирусов человека.

1.1.3.2 Векторы на основе генома аденовируса человека.

1.1.3.3 Структурные особенности аденовируса птиц CELO.

1.1.3.4 Векторы на основе генома аденовируса птиц CELO.

1.2 Вакцинно-профилактика инфекций, вызываемых вирусом гриппа птиц и вирусом болезни Марека.

1.2.1. Вакцины, используемые для предупреждения инфекции вируса гриппа птиц.

1.2.2. Вакцины, используемые для предупреждения инфекции ВБМ.ЗЗ 1.2.3 Необходимость использования генно-инженерных вакцин при инфекциях вируса гриппа птиц и вируса болезни Марека.

1.2.4. Кандидатные генно-инженерные вакцины против вируса гриппа птиц, полученные на основе вирусных векторов.

1.2.5. Кандидатные генно-инженерные вакцины против ВБМ, полученные на основе вирусных векторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1.1 Материалы.

2.1.2. Методы.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1 Клонирование генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома ВБМ и гена гемагглютинина из генома вируса гриппа H5N2.

2.2.1.1 Клонирование генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома ВБМ методом ПЦР.

2.2.1.2 Клонирование полноразмерного гена гемагглютинина из генома вируса гриппа типа H5N2 методом ОТ-ПЦР.

2.2.2 Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома CELO, несущих гены гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ и ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5.

2.2.3 Изучение экспрессии генов гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ и гена гемагглютинина вируса гриппа птиц рекомбинантными аденовирусами в экспериментах in vitro.

2.2.3.1 Анализ экспрессии генов гликопротеинов ВБМ в культуре клеток, заражённых рекомбинантными аденовирусами, методом ОТ-ПЦР.

2.2.3.2 Определение экспрессии гликопротеина gB ВБМ вирусом CELO-gB методом иммуноблоттинга в культуре заражённых клеток.

2.2.3.3 Определение экспрессии гемагглютинина вируса гриппа птиц методом иммуноблоттинга в культуре клеток, зараженных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA.

2.2.3.4. Определение экспрессии гена гемагглютинина НА вируса гриппа птиц штамма Н5 методом ИФА.

2.2.4 Генетическая иммунизация рекомбинантными аденовирусами.

2.2.4.1 Определение иммуногенности рекомбинантного гликопротеина gB ВБМ, экспрессируемого CELO-gB на цыплятах.

2.2.4.2 Определение иммуногенности рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого CELO-HA методом РТГА.

2.2.5 Определение протективности рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого CELO-HA, на лабораторных животных.

2.2.5.1 Определение оптимального способа иммунизации мышей линии BALB/c рекомбинантным CELO-HA.

2.2.5.2 Анализ протективности НА-специфического иммунного ответа мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

Принятые сокращения. Ад, Ad - Аденовирус (Adenovirus) БОЕ - бляшкообразующая единица ВБМ - вирус болезни Марека ГП - грипп птиц

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ед. к. - единица карты кДНК - ДНК, комплементарная РНК н. - нуклеотид н.п. - нуклеотидная пара

ОРС - открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция обратной транскрипции

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РКА - репликативно-компетентный аденовирус

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЦПД - цитопатическое действие

CAR - coxsackie adenovirus receptor - коксакьевирусный-аденовирусный рецептор

CELO - Chicken Embryo Lethal Orphan FAV1 (fowl adenovirus type 1) -аденовирус птиц типа 1.

HCMV - human cytomegalovirus - цитомегаловирус человека p - Plasmid - плазмида

PBS - фосфатный солевой буфер

SPF - specific pathogen free - свободный от вирусных и бактериальных контаминаций

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих протективные антигены вирусов болезни Марека и гриппа птиц"

Актуальность проблемы. На сегодняшний день для вакцинации сельскохозяйственных животных используют инактивированные и аттенуированные формы возбудителей инфекций микробного или вирусного происхождения. С целью расширения спектра защиты при вакцинации применяют поливалентные вакцины, представляющие собой смесь аттенуированных патогенов разных штаммов. Такие вакцины способны обеспечивать протективность против возбудителя инфекции на длительный период. Однако, в результате вспышек инфекций, вызванных патогеном, против которого была проведена вакцинация, выявляют «новые» более вирулентные штаммы, способные преодолевать сформированный иммунный барьер (202).

Причиной появления «новых» штаммов является генетическая вариабельность, которая может привести к существенному изменению антигенной структуры. В результате специфический иммунитет, установившийся на аттенуированную вакцину, может дать незначительную защиту или совсем её не обеспечить (8).

В связи с вышесказанным на сегодняшний день существует потребность в создании эффективной вакцины, технология получения которой позволяла бы быстрое конструирование и переориентацию производства в зависимости от возникающей опасности. Традиционные вакцины и технологии их создания во многом несовершенны и не отвечают данным требованиям. Использование генно-инженерных вакцин может обеспечить решение этой проблемы. Генно-инженерные векторы, применяемые при конструировании предполагаемых вакцин, являются хорошо изученными и имеют, как правило, быструю и эффективную схему получения (59, 123).

Одной из перспективных систем для доставки генетической информации, кодирующей гены инфекционных возбудителей, является система, основанная на аденовирусных векторах (Ад) (111, 32). Данные системы имеют ряд преимуществ перед другими системами. Во-первых, пакующая емкость существующих векторов на основе аденовирусов позволяет доставлять генетическую информацию размером 7000-8000 п.о. Во-вторых, разработано большое количество аденовирусных векторов с измененным тропизмом, который достигается модификацией нуклеотидной последовательности структурных белков вириона (106, 130). В-третьих, разработаны быстрые и гибкие технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие реализацию масштабного производства различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают Ад векторы привлекательными для создания на их основе вакцинных препаратов нового поколения, позволяющих решать ключевые задачи микробилогии.

Аденовирусные векторы могут быть использованы для создания на их основе генно-инженерных вакцин против инфекций, вызванных вирусом гриппа птиц (ГП) и вирусом болезни Марека (ВБМ). Эти вирусы вызывают развитие острого заболевания с высокой контагиозностью и многообразием вариантов патогенетического проявлений (16). Инфекции, вызванные данными вирусами, сопровождаются высокой смертностью, что наносит значительный экономический урон сельскому хозяйству (137; 73).

В связи с этим изучение возможности использования аденовирусного вектора птиц CELO для конструирования кандидатного вакцинного препарата против потенциально опасных инфекций, вызванных вирусом болезни Марека или вирусом гриппа птиц, представляет самостоятельный научный интерес.

Цель исследования. Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих гены гликопротеинов вируса болезни Марека и вируса гриппа птиц, и последующее изучение на лабораторных животных индукции специфического иммунитета в ответ на экспрессируемые антигены.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Клонирование гена гемагглютинина из генома вируса гриппа птиц штамма H5N2 и генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома вируса болезни Марека штамма RB1B.

2. Получение рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих ген гемагглютинина НА5 и гены гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ под контролем CMV-промотора в сайте делеции несущественной области генома вектора, методом гомологичной рекомбинации в E.coli.

3. Изучение экспрессии целевых генов в составе рекомбинантных вирусов на основе аденовируса CELO в условиях in vitro.

4. Изучение индукции специфического иммунитета в ответ на экспрессию гликопротеинов вируса болезни Марека и гриппа птиц в организме лабораторных животных при генетической иммунизации рекомбинантными вирусами CELO.

5. Определение протективности гемагглютинин-специфического иммунного ответа у мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO, экспрессирующим НА5 вируса гриппа птиц штамма H5N2.

Научная новизна. Разработана эффективная технология получения рекомбинантных аденовирусов на основе CELO, основанная на гомологичной рекомбинации в E.coli.

Получен набор рекомбинантных аденовирусов: CELO-HA, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2, и CELO-gB, CELO-gE, CELO-gl, несущие гены соответствующих гликопротеинов ВБМ штамма RB1B.

Показана экспрессия мРНК генов гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ на культуре клеток, заражённых рекомбинантным аденовирусом птиц CELO, несущим соответствующий целевой ген.

Подтверждена идентичность антигенных свойств рекомбинантного гликопротеина gB, экспрессируемого вирусом CELO-gB, в сравнении с природным гликопротеином gB ВБМ штамма RB1B. Показана иммуногенность гликопротеина gB ВБМ, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом CELO-gB, на естественно восприимчивой для вируса болезни Марека модели птиц.

Подтверждена идентичность антигенных свойств рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого вирусом CELO-HA, в сравнении с природным гемагглютинином вируса гриппа птиц штамма H5N2. Определено содержание рекомбинантного гемагглютинина НА5 в культуре клеток, заражённых рекомбинантным аденовирусом CELO-HA.

Определён оптимальный способ иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, при котором экспрессируемый гемагглютинин проявляет наибольшую защиту против вирулентного вируса гриппа.

Впервые показана 95% защита мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, экспрессирующим гемагглютинин НА5, в условиях экспериментального заражения мышей летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2 (5OLD50).

Практическая значимость. Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2 и гены гликопротеинов gB, gE и gl вируса болезни Марека штамма RB1B, клонированные в плазмидном векторе pGEM-T-Easy, коллекция рекомбинантных аденовирусов: CELO-HA, CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, - хранятся в музее лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН).

Рекомбинантные аденовирусы CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, содержащие изолированные гены, кодирующие гликопротеины ВБМ, используются в эксперименте по определению их иммуногенности на естественно восприимчивой для ВБМ модели птиц.

Рекомбинантный аденовирус CELO-HA, экспрессирующий гемагглютинин НА вируса гриппа птиц штамма H5N2, используется в эксперименте по определению протективности иммунизации на пермиссивной для вируса гриппа модели птиц.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005), международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006), V международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2006), IV Московском международном конгрессе «Экспо-биохим-технологии» (Москва, 2007), VI международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007), расширенном заседании кафедры биологии, вирусологии и генной инженерии ГОУ ВПО МГУПБ 1 ноября 2007 года, заседании отдела генетики и молекулярной биологии бактерий 13 декабря 2007 г. ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 статей в сборниках международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список используемой литературы (214 источников, из которых 15 отечественных и 199 иностранных). Работа содержит 4 таблицы и 20 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Карпов, Андрей Павлович

выводы

1. Получен рекомбинантный аденовирус CELO-HA, несущий ген гемагглютинина НА вируса гриппа птиц H5N2, и набор рекомбинантных аденовирусов CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, содержащих гены гликопротеинов gB, gE или gl вируса болезни Марека штамма RB1B.

2. Подтверждена идентичность антигенной структуры рекомбинантного гемагглютинина НА5, экспрессируемого аденовирусом CELO-HA, и гемагглютинина вируса ГП H5N2. Определён уровень экспрессии гемагглютинина НА5 в клетках, зараженных вирусом CELO-HA, который составил 570 ГАЕ.

3. Установлена иммуногенность рекомбинантного гемагглютинина на модели мышей, иммунизированных аденовирусом CELO-HA. Титр НА-специфических антител в сыворотке крови иммунизированных мышей в реакции торможения гемагглютинации составил 8,5 log2.

4. Показана 95% защита мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, экспрессирующим гемагглютинин НА5, в условиях экспериментального заражения мышей летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2 (50LD50).

5. Детектирована экспрессия генов гликопротеинов gB, gE и gl, в составе рекомбинантных вирусов на основе CELO, на уровне мРНК. Определена идентичность антигенной структуры рекомбинантного гликопротеина gB, синтезированного в клетках, заражённых аденовирусом CELO-gB, и белка gB вируса болезни Марека штамма RB1В.

6. Показана иммуногенность рекомбинантного гликопротеина gB на модели цыплят, иммунизированных аденовирусом CELO-gB. В сыворотке крови иммунизированных цыплят титр антител, специфических антигену вируса болезни Марека, составил 8 log2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпов, Андрей Павлович, Москва

1. Гловер Д. /Новое в клонировании ДНК. Методы. //Москва. Мир, 1989. С. 209-236.

2. Грин М. /Трансформация и онкогенез, ДНК-содержащие вирусы. // "Вирусология" под ред.Филдс, "Мир", 1989.

3. Григорьев В.П., Хилько С.Н., Тихоненко Т.И. /Условия стабильности четвертичной структуры и антигенная активность гексона аденовирусов // Биохимия, 1985.- т.50.-С. 258-263.

4. Коровин Р.Н, Рождественский И.К. /Аденовирусные инфекции птиц //Ленинград. 1990.

5. Кругляк В.А., Акопиан Т.А., Народицкий Б.С., Карташова И.М., Шевлягин В.Я., Тихоненко Т.И. /Молекулярная генетика, микробиология и вирусология //1988, № 5. С. 27-30.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. /Молекулярное клонирование //Москва, "Мир". -1982.

7. Патрушев Л.И. /Экспрессия генов //Москва. Наука, 1999. С.356.

8. Пейлиз П., Кингсберри Д.У./ Генетика вирусов гриппа. М.: Медицина, 1986.-С.336

9. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д./ Иммунология. //Москва "Мир", 2000.

10. Сюрин В. Н., Белоусова Р. В., Фомина Н. В. /Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. //М. Агропромиздат. 1991. С. 159166.

11. Фомина Н.В. /Аденовирусная инфекция животных //М.: Колос,1995.

12. Хорвиц М.С. /Аденовирусы и их репликация // "Вирусология" под ред.Филдс, "Мир", 1989.

13. Ярилин А.А. Основы иммунологии.// Москва. Медицина,2000, с. 350362.

14. Abdul-Careem MF, Hunter BD, Sarson AJ, Mayameei A, Zhou H, Sharif S. /Marek's disease virus-induced transient paralysis is associated with cytokine gene expression in the nervous system //Viral Immunol. 2006; 19 (2): 167-76.

15. Avakian AP, Poston RM, Kong FK, Van Kampen KR, Tang DC. /Automated mass immunization of poultry: the prospect for nonreplicating human adenovirus-vectored in ovo vaccines //Expert Rev Vaccines. 2007; 6 (3): 457-65

16. Akopian T.A., Doronin K.K., Karpov V.A., Naroditsky B.S./ Sequence of the avian adenovirus FAV-1 (CELO) DNA encoding the hexon-associated protein pVI and hexon. Arch.Virol.1996, vl41, p.l 1759-65.

17. Amalfitano A, Hauser MA, Ни H, Serra D, Begy CR, Chamberlain JS. Production and characterization of improved adenovirus vectors with the El, E2b, and E3 genes deleted. //J. Virol. 1998 v.- 72, pp. 926-933

18. Anderson J., V.J. Yates, et al. The in vitro transformation by an avian adenovirus (CELO). I.Hamster-embryo fibroblastic cultures. J. Natl.Cancer Inst. 1969, v42, pi-7.

19. Baigent SJ, Smith LP, Nair VK, Currie RJ. /Vaccinal control of Marek's disease: current challenges, and future strategies to maximize protection //Vet Immunol Immunopathol. 2006 Jul 15; 112 (l-2):78-86.

20. Baohong Cao, John R. Mytinger, Johnny Huard. Adenovirus mediated gene transfer to skeletal muscle.// Microscopy Research and Technique. 2002 Jul 58 (1):45-51

21. Barnett BG., Crews CJ., Douglas JT. Targeted adenovirus vectors. // 2002 Bioch. etBioph. Acta V.-1575, pp. 1-14

22. Babiuk LA, Tikoo SK. Adenoviruses as vectors for delivering vaccines to mucosal surfaces. // J Biotechnol 2000 v.-83(l-2), pp. 105-13

23. Baxi MK, Robertson J, Babiuk LA, Tikoo SK. Mutational analysis of early region 4 of bovine adenovirus type 3. // Virology 2001 v.-290(1), pp.153-63

24. Baxi MK, Deregt D, Robertson J, Babiuk LA, Schlapp T, Tikoo SK. Recombinant bovine adenovirus type 3 expressing bovine viral diarrhea virus glycoprotein E2 induces an immune response in cotton rats. // Virology 2000 v.-278(1), pp.234-243

25. Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G, Kurt-Jones EA, Krithivas A, Hong JS, Horwitz MS, Crowell RL, Finberg RW. Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. // Science 1997 v.-275(5304), pp. 1320-1323

26. Bergelson JM, Krithivas A, Celi L, Droguett G, Horwitz MS, Wickham T, Crowell RL, Finberg RW. The murine CAR homolog is a receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses. // J. Virol. 1998 v.- 72(1), pp.415-419

27. Berger J, Hauber J, Hauber R, Geiger R, Cullen BR Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells.// Gene. 1988 Jun 15; 66 (1):1-10.

28. Benihoud K, Yeh P, Perricaudet M. /Adenovirus vectors for gene delivery. // Curr Opin Biotechnol 1999 v.-10(5), pp.440-447

29. Bett A.J., L.A. Prevec, and F.L. Graham. Packaging capacity and stability of the human adenovirus type 5 vector. J.Virol. 1983, v67, p 5911-5921.

30. Boyle DB, Selleck P, Heine HG. /Vaccinating chickens against avian influenza with fowlpox recombinants expressing the H7 haemagglutinin //Aust Vet J. 2000; 78(l):44-8.

31. Blomer U, Naldini L, Kafri T, Trono D, Verma IM, Gage FH. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. // J Virol 1997 v.-71(9), pp.6641-9

32. Bruder JT, Jie T, McVey DL, Kovesdi I. Expression of gpl9K increases the persistence of transgene expression from an adenovirus vector in the mouse lung and liver. // J Virol 1997 v.- 71(10), pp.- 7623-7628

33. Buchschacher GL., Jr, Wong-Staal F. Development of lentiviral vectors for gene therapy for human diseases. // Blood 2000 v.-95(8), pp.2499-2504

34. Buller RM, Chakrabarti S, Cooper JA, Twardzik DR, Moss B. Deletion of the vaccinia virus growth factor gene reduces virus virulence. // J Virol 1988 v.-62, pp.866-874

35. Buscaglia C, Nervi P, Risso M. //Characterization of four very virulent Argentinian strains of Marek's disease virus and the influence of one of those isolates on synergism between Marek's disease vaccine viruses //Avian Pathol. 2004; 33 (2): 190-5.

36. Cao JX, Krell PJ, Nagy E. Sequence and transcriptional analysis of terminal regions of the fowl adenovirus type 8 genome. // J Gen Virol 1998 v.-79, pp.2507-16

37. Caravokuri C., K.N.Leppard. Constitutive episomal expression of a polipeptide pIX in a 293-based cell line complements the defiency of pIX mutant adenovirus type 5. J. Virol. 1995, v69, p 6627-6633.

38. Chu G., Hayakawa H., Berg P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cell with DNA. //Nucleic Acids Res 1987 v.-15, pp.1311-1326

39. Chen C., Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. // Mol. Cell. Biol 1991 v.- 7, pp.2745-2752

40. Chiocca S., Kurtev V., Colombo R., Boggio R., Sciurpi MT., Brosch G., Seiser C., Draetta GF., Cotten M. Hystone Deacetylase 1 inactivation by an adenovirus early gene product. // Curr. Biol 2002 v.-12, pp.594-98

41. Chiocca S., Kurzbauer R., Schaffner J., Baker A., Maunter V., Cotten M. The complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO. // J Virol 1996 v.- 70, pp.2939-2949

42. Chiocca, S., A. Baker, M. Cotten. Identification of a novel antiapoptotic protein, GAM-1, encoded by the CELO adenovirus. // J Virol 1997 v.- 71, pp.3168-3177

43. Child SJ, Palumbo GJ, Buller RM, Hruby DE. Insertional inactivation of the large subunit of ribonucleotide reductase encoded by vaccinia virus is associated with reduced virulence in vivo. // Virol 1990 v.-174, pp.625-29

44. Chirmule N, Hughes JV, Gao GP, Raper SE, Wilson JM. Role of E4 in eliciting CD4 T-cell and B-cell responses to adenovirus vectors delivered to murine and nonhuman primate lungs. // J Virol 1998 v.- 72(7), pp.6138-6145

45. Chen HH, Mack LM, Kelly R, Ontell M, Kochanek S, Clemens PR. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997 v.- 94(5), pp.1645-1650

46. Cheshenko N, Krougliak N, Eisensmith RC, Krougliak VA. A novel system for the production of fully deleted adenovirus vectors that does not require helper adenovirus. // Gene Ther 2001 v.- 8(11), pp.846-854

47. Chillon M., Kremer E.J. Trafficking and propagation of canine adenovirus vectors lacking a known integrin-interacting motif. // Hum Gene Ther 2001 v.-12(14), pp.1815-1823

48. Clemens PR, Kochanek S, Sunada Y, Chan S, Chen HH, Campbell KP, Caskey CT. In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with anadenoviral vector that lacks all viral genes. // Gene Ther 1996 v.- 3(11), pp.965972

49. Cowen B, Calnek BW, Menendez NA, Ball RF. Avian adenoviruses: effect on egg production, shell quality, and feed consumption. // Avian Dis 1978 v.-22(3), pp.459-470

50. Cotten M, Wagner E, Zatloukal K, Birnstiel ML. Chicken adenovirus (CELO virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants. // J Virol 1993 v.- 67(7), pp.3777-3785

51. Cummins JM., Rosenquist BD. Protection of calves against rhinovirus infection by nasal secretion of interferon induced by infectious bovine rhinotracheitis virus. //Am. J Vet Med 1978 V.-41, pp. 161-165

52. Curiel DT, Agarwal S, Wagner E, Cotten M. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. // Proc Natl Acad Sei USA 1991 v.- 88(19), pp.8850-8854

53. Curiel DT. High-efficiency gene transfer employing adenovirus-polylysine-DNA complexes. // Nat Immun 1994 v.-13(2-3), pp.141-164

54. Danthinne X., MJ. Imperiale. Production of first generation adenovirus vectors: a review. // Gene Ther 2000 v.-7, pp.1707-1714.

55. Douglas JT, Miller CR, Kim M, Dmitriev I, Mikheeva G, Krasnykh V, Curiel DT. A system for the propagation of adenoviral vectors with genetically modified receptor specificities. //Nat Biotechnol 1999 v.-17(5), pp.470-4

56. Duisit G., Salvetti A., Moullier P., Cosset F.L. Functional characterization of adenoviral/retroviral chimeric vectors and their use for efficient screening of retroviral producer cell lines. // Hum Gene Ther 1999 v.-10, pp. 189-200

57. Evans PS, Benko M, Harrach B, Letchworth GJ. Sequence, transcriptional analysis, and deletion of the bovine adenovirus type 1 E3 region. // Virology 1998 v.-244(l), pp. 173-85

58. Feigner PL. Improvements in cationic liposomes for in vivo gene transfer. // Hum Gene Ther 1996 v.-7, pp. 1791-1793

59. Feng M., Jackson WH Jr, Goldman CK, Rancourt C, Wang M, Dusing SK, Siegal G, Curiel DT. Stable in vivo transduction via a novel adenoviral/retroviral chimeric vector. // Nat Biotechnol 1997 v.-15, pp.866-870

60. Ferrari FK., Samulski T, Shenk T, Samulski RJ. Second-strand synthesis is a rate-limiting step for efficient transduction by recombinant adeno-associated virus vectors. // J Virol 1996 v.-70(5), pp.3227-3234

61. Flotte TR., Carter BJ. Adeno-associated virus vectors for gene therapy. // Gene Ther 1995 v.-2, pp.357-362

62. Francois A., Eterradossi N., Delmas B., Payet V., Langlois P. Construction of avian adenovirus CELO recombinants in cosmids. // J Virol 2001 v.- 75, pp.5288-5301

63. Gall J, Kass-Eisler A, Leinwand L, Falck-Pedersen E. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes. // J Virol 1996 v.- 70(4), pp.2116-2123

64. Gao GP, Yang Y, Wilson JM. Biology of adenovirus vectors with El and E4 deletions for liver-directed gene therapy. // J Virol 1996 v.- 70(12), pp.89348943

65. Geerligs HJ, Weststrate MW, Pertile TL, Rodenberg J, Kumar M, Chu S. /Efficacy of a combination vaccine containing MDV CVI 988 strain and HVT against challenge with very virulent MDV //Acta Virol. 1999; 43 (2-3): 198200.

66. Gimeno IM, Witter RL, Hunt HD, Reddy SM, Reed WM. /Biocharacteristics shared by highly protective vaccines against Marek's disease //Avian Pathol. 2004; 33 (l):59-68.

67. Graham F.L. Transformation by and oncogenicity of human adenoviruses. // The Adenoviruses. ed.H.S.Ginsberg, 1984

68. Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. // J Gen Virol 1977 v.-36(1), pp.59-74

69. Graham F.L. and van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.// Virology 1973 v.- 52, pp.456-467

70. Graham F.L. and Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol.Biol 1994 v.-7, pp.-109-127. (Ed.), The Humana Press Inc., Clifton, NJ.

71. Green K.Y., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay. // Methods Enzymology 1980 V.-80, pp.425-431

72. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // J Mol Biol 1983 v.166, pp.557-580

73. Hess M., Cuzange A., Ruigrok R.W.H., Chroboczek J., Jacrot B. The avian adenovirus penton: two fibres and one base. // J Mol Biol 1995 v.- 252, pp.379385

74. Higgins PC., Phillpotts RJ., Scott GM., Wallace J., Bernhardt LL., Tyrell DA J. Intranasal interferon as protection against experimental respiratory coronavirus infection in volunteers. // Antimicrob.Agents Chemother 1983 v.-24, pp.713-715

75. Hillerman M.R., Werner J.H. Recovery of new agents from patientes with acute respiratory illness. // Proc Soc Exp Biol Med 1954 v.- 85, pp. 183-188.

76. Hirai K, Sakaguchi M. /Polyvalent recombinant Marek's disease virus vaccine against poultry diseases //Curr Top Microbiol Immunol. 2001; 255:26187.

77. Hofmann C, Loser P, Cichon G, Arnold W, Both GW, Strauss M. Ovine adenovirus vectors overcome preexisting humoral immunity against human adenoviruses in vivo. // J Virol 1999 v.-73(8), pp.6930-6

78. Holland GP, Holland N, Steward MW. Interferon-gamma potentiates antibody affinity in mice with a genetically controlled defect in affinity maturation. // Clin Exp Immunol 1990 v.-82(2), pp.221-6

79. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. //Anal Biochem 1981 v.-l 14, p. 193

80. Hu H, Serra D, Amalfitano A. Persistence of an E1-, polymerase-. adenovirus vector despite transduction of a neoantigen into immune-competent mice. // Hum Gene Ther 1999 v.- 10(3), pp.355-364

81. Huang W., Flint SJ. The tripartite leader sequence of subgroup C adenovirus major late mRNAs can increase the efficiency of mRNA export. // J Virol 1998 v.-72(l), pp.225-235

82. Jacobs A, Breakefield XO, Fraefel C. HSV-1-based vectors for gene therapy of neurological diseases and brain tumors: part I. HSV-1 structure, replication and pathogenesis./ZNeoplasia 1999 v.-l,pp.387-401

83. Jacobs A, Breakefield XO, Fraefel C. HSV-1-based vectors for gene therapy of neurological diseases and brain tumors: part II. Vector systems and applications. // Neoplasia 1999 v.-l, pp.402-416

84. Jarosinski KW, Jia W, Sekellick MJ, Marcus PI, Schat KA. /Cellular responses in chickens treated with IFN-alpha orally or inoculated with recombinant Marek's disease virus expressing IFN-alpha //J Interferon Cytokine Res. 2001; 21 (5):287-96.

85. Kawaguchi T, Nomura K, Hirayama Y, Kitagawa T. Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. // Cancer Res 1987 v.- 47(16), pp.4460-4464

86. Korst RJ., Ailawadi M., Lee JM., Lee S., Yamada R., Mahtabifard A., Crystal RG. Adenovirus gene transfer vectors inhibit growth of lymphatic tumor metastases independent of a therapeutic transgene. // Human Gene Ther 2001 v.-12, pp. 163 9-1649

87. Kovesdi I, Brough DE, Bruder JT, Wickham TJ. Adenoviral vectors for gene transfer. // Curr Opin Biotechnol 1997 v.- 8(5), pp.583-589

88. Knoblich HV, Sommer SE, Jackwood DJ. /Antibody titers to infectious bursal disease virus in broiler chicks after vaccination at one day of age with infectious bursal disease virus and Marek's disease virus. Avian Dis. 2000 Oct-Dec; 44 (4):874-84.

89. Krasnykh VN, Mikheeva GV, Douglas JT, Curiel DT. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. // J Virol 1996 v.- 70(10), pp.6839-6846

90. Kremer E.J., Boutin S., Chillon M., Danos O. Canine adenovirus vectors: an alternative for adenovirus-mediated gene transfer. // J Virol 2000 v.- 74(1), pp.505-512

91. Kristiansen IS, Halvorsen PA, Gyrd-Hansen D. /Influenza pandemic: perception of risk and individual precautions in a general population / BMC Public Health 2007, 7:48

92. Kundig TM, Kalberer CP, Hengartner H, Zinkernagel RM. Vaccination with two different vaccinia recombinant viruses: long-term inhibition of secondary vaccination. // Vaccine 1993 v.-l 1, pp.1154-8

93. Labow D, Lee S, Ginsberg RJ, Crystal RG, Korst RJ. Adenovirus vector-mediated gene transfer to regional lymph nodes.//Hum Gene Ther. 2000 Mar 20;ll(5):759-69.

94. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature 1970 V.-227, pp.680-685

95. Laver WG, Younghusband HB, Wrigley NG. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). // Virology 1971 v.-45(3), pp.598-614

96. Laver WG, Younghusband HB, Wrigley NG. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). // Virology, 1971, v.-45(3), pp.- 598-614.

97. Leblois H., Roche C., Di Falco N., Orsini C., Yeh P., Perricaudet M. Stable transduction of actively dividing cells via a novel adenoviral/episomal vector. // Mol Ther 2000 v.-l, pp.314-22

98. Lee LE, Witter RL, Reddy SM, Wu P, Yanagida N, Yoshida S. //Protection and synergism by recombinant fowl pox vaccines expressing multiple genes from Marek's disease virus //Avian Dis. 2003;47(3):549-58.

99. Legerski R., Robberson D. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions.//J of Mol Biol 1985 v.-181, pp.297-312

100. Lehrmann H., M. Cotten. Characterization of CELO virus protein that modulate the pRB/E2F pathway. J.Virol., 1999, v73, p. 6517-6525.

101. Li P., Bellett A.J.D., Parish C.R. The structural proteins of chick embryo lethal orphan virus (fowl adenovirus type 1). // J Gen Virol 1984 v.- 65, pp.1803-1815

102. Lichtenberg D. Liposomes: preparation, characterization, and preservation. // Methods Biochem Anal 1988 v.- 33, pp.337-468

103. Lieber A, He CY, Polyak SJ, Gretch DR, Barr D, Kay MA. Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human hepatocytes by adenovirus-mediated expression of ribozymes. //J Virol 1996 v.- 70(12), pp.8782-8791

104. Lieber A, Steinwaerder DS, Carlson CA, Kay MA. Integrating adenovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of all viral genes. // J Virol 1999 v.- 73(11), pp.9314-9324

105. Lockett LJ, Both GW. Complementation of a defective human adenovirus by an otherwise incompatible ovine adenovirus recombinant carrying a functional El A gene. // Virology 2002 v.-294(2), pp.333-41

106. Loser P, Kumin D, Hillgenberg M, Both GW, Hofmann C. Preparation of ovine adenovirus vectors. // Methods Mol Med 2002 v.-69, pp.415-26

107. Loser Peter et al. Advances in the development of non-human viral DNA-vectors for gene delivery.// Curr.Gen.Ther, 2001, 2,161-171.

108. Markowski-Grimsrud CJ, Schat KA. /Cytotoxic T lymphocyte responses to Marek's disease herpesvirus-encoded glycoproteins //Vet Immunol Immunopathol. 2002; 90 (3-4): 133-44.

109. Mathias P, Wickham T, Moore M, Nemerow G. Multiple adenovirus serotypes use alpha v integrins for infection. // J Virol 1994 v.- 68(10), pp.6811-6814

110. Mayr GA, O'Donnell V, Chinsangaram J, Mason PW, Grubman MJ. Immune responses and protection against foot-and-mouth disease virus (FMDV) challenge in swine vaccinated with adenovirus-FMDV constructs. // Vaccine 2001 v.-19(15-16), pp.2152-2162

111. Medin JA, Fowler DH. Post-transduction events in retro virus-mediated gene therapy involving hematopoietic stem cells: beyond efficiency issues. // Cell Biochem Suppl 2002 v.-38, pp.46-54

112. Merigan TC., Hall TS., Reed SE., Tyrell DAJ. Inhibition of respiratory virus infection by locally applied interferon. // Lancet 1972 v.-l, pp.563-67

113. Michiels B, Philips H, Coenen S, Yane F, Steinhauser T, Stuyck S, Denekens J, Van Royen P. /The effect of giving influenza vaccination to general practitioners: a controlled trial NCT00221676. //BMC Med. 2006. 10; 4:17.

114. Michael SI, Hong JS, Curiel DT, Engler JA. Addition of a short peptide ligand to the adenovirus fiber protein. // Gene Ther 1995 v.- 2(9), pp.660-8

115. Michou A., Lehrmann H., Saltik M., Cotten M . Mutational analysis of the avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors. // J Virol 1999 v.- 73, pp.1399-1410

116. Mittal SK., L. Prevec, F. Graham, L.A. Babiuk. Development of a bovine adenovirus type 3-based expression vector. // J Gen Virol 1995 v-76, pp.93102

117. Moorhead JW, Clayton GH, Smith RL, Schaack J. A replication-incompetent adenovirus vector with the preterminal protein gene deleted efficiently transduces mouse ears. // J Virol 1999 v.- 73(2), pp.1046-1053

118. Morgan DA., Ruscetti FW., Gallo R. Selective in vitro growth of T limphocytes from normal human bone marrows. // Science 1976 v.-193, pp.1007-1008

119. Morrison MD, Reid D, Onions D, Spibey N, Nicolson L. Generation of E3-deleted canine adenoviruses expressing canine parvovirus capsid by homologous recombination in bacteria. //Virology 2002 v.-293(l),pp.26-30

120. Mosmann T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assay. // J of Immunol Methods 1983 v-65, pp.55-63

121. S.Nagata, H.Taira, A.Hall, L.Johnsrud, M.Streuli, J.Ecsodi, W.Boll, K.Cantell, C.Weissmann. Sinthesis in E.coli of a polypeptide with human leukocyte interferon activity. // Nature 1980 V.-284, pp. 316-320

122. Nair V. /Evolution of Marek's disease ~ a paradigm for incessant race between the pathogen and the host //Vet J. 2005 Sep; 170 (2): 175-83.

123. Nakane PK., Kawaio A.S. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. // J Histochem Cytochem 1974 v.-22, pp. 1084-1091

124. Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. // Science 1996 v.-272(5259), pp.263-7

125. Nguyen JT., Wu P, Clouse ME, Hlatky L, Terwilliger EF. Adeno-associated virus-mediated delivery of antiangiogenic factors as an antitumor strategy. // Cancer Res 1998 v.-58, pp.5673-5677

126. Nygren PA, Stahl S, Uhlen M. Engineering proteins to facilitate bioprocessing. // Trends Biotechnol 1994 v.-12(5), pp. 184-8

127. Okuda Y, Ono M, Yazawa S, Shibata I, Sato S. Experimental infection of specific-pathogen-free chickens with serotype-1 fowl adenovirus isolated from a broiler chicken with gizzard erosions. // Avian Dis 2001 v.- 45(1), pp. 19-25

128. Olsen JC. Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus.// GeneTher 1998 v.-5,pp.1481-1487

129. Ono M, Okuda Y, Yazawa S, Shibata I, Tanimura N, Kimura K, Haritani M, Mase M, Sato S Epizootic outbreaks of gizzard erosion associated with adenovirus infection in chickens. // Avian Dis 2001 v.- 45(1), pp.268-275

130. Paoletti E, Taylor J, Meignier B, Meric C, Tartaglia J. Highly attenuated poxvirus vectors: NYVAC, ALVAC and TROVAC. // Dev Biol Stand 1995 v.-84, pp. 159-63

131. Payet, V., C. Arnauld, J. P. Picault, A. Jestin, and P. Langlois. Transcriptional organization of the avian adenovirus CELO. // J Virol 1998 v.-72, pp.9278-9285

132. Pickles RJ, McCarty D, Matsui H, Hart PJ, Randell SH, Boucher RC. Limited entry of adenovirus vectors into well-differentiated airway epithelium is responsible for inefficient gene transfer .//J Virol. 1998 Jul;72(7):6014-23.

133. Poeschla EM, Wong-Staal F, Looney DJ. Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. // Nat Med 1998 v.-4(3), pp.354-7

134. Qiao C, Yu K, Jiang Y, Li C, Tian G, Wang X, Chen H. /Development of a recombinant fowlpox virus vector-based vaccine of H5N1 subtype avian influenza //Dev Biol (Basel). 2006; 124:127-32.

135. Rasmussen UB, Benchaibi M, Meyer V, Schlesinger Y, Schughart K. Novel human gene transfer vectors: evaluation of wild-type and recombinant animal adenoviruses in human-derived cells. // Hum Gene Ther 1999 v.-10(16), pp.2587-99

136. Reddy PS, Idamakanti N, Zakhartchouk LN, Babiuk LA, Mehtali M, Tikoo SK. Optimization of bovine coronavirus hemagglutinin-estrase glycoprotein expression in E3 deleted bovine adenovirus-3. // Virus Res 2000 v.-70(l-2), pp.65-73

137. Reddy PS, Idamakanti N, Chen Y, Whale T, Babiuk LA, Mehtali M, Tikoo SK. Replication-defective bovine adenovirus type 3 as an expression vector. // J Virol 1999 v.- 73(11), pp.9137-9144

138. Reddy PS, Idamakanti N, Hyun BH, Tikoo SK, Babiuk LA. Development of porcine adenovirus-3 as an expression vector. // J Gen Virol 1999 v.- 80(3), pp.563-570

139. Reddy PS, Idamakanti N, Babiuk LA, Mehtali M, Tikoo SK. Porcine adenovirus-3 as a helper-dependent expression vector. // J Gen Virol 1999 v.-80(11), pp.2909-2916

140. R.N.de Jong, P.C. van der Viet. Mechanism of DNA replication in eucariotic cells: cellular host factors stimulating adenovirus DNA replication. Gene, 236, 1999,1-12.

141. Roberts M.L., Athanasopoulos T., Pohlschmidt M., Duisit G., Cosset F.L., Dickson G. Post-mitotic, differentiated myotubes efficiently produce retroviral vector from hybrid adeno-retrovirus templates. // Gene Ther 2001 v.-8, pp.1580-1586

142. Roelvink PW, Mi Lee G, Einfeld DA, Kovesdi I, Wickham TJ. Identification of a conserved receptor-binding site on the fiber proteins of CAR-recognizing adenoviridae. // Science 1999 v.- 286(5444), pp. 1568-71

143. Romanczuk H, Galer CE, Zabner J, Barsomian G, Wadsworth SC, O'Riordan CR. Modification of an adenoviral vector with biologically selected peptides: a novel strategy for gene delivery to cells of choice. // Hum Gene Ther 1999 v.- 10(16), pp.2615-2626

144. Ross LJ, Binns MM, Tyers P, Pastorek J, Zelnik V, Scott S. /Construction and properties of a turkey herpesvirus recombinant expressing the Marek's disease virus homologue of glycoprotein B of herpes simplex virus //J Gen Virol. 1993; 74 (Pt3):371-7.

145. Roy S, Kobinger GP, Lin J, Figueredo J, Calcedo R, Kobasa D, Wilson JM. /Partial protection against H5N1 influenza in mice with a single dose of a chimpanzee adenovirus vector expressing nucleoprotein //Vaccine. 2007; 25 (39-40): 6845-51.

146. Schat KA. /Isolation of Marek's disease virus: revisited //Avian Pathol. 2005 Apr; 34 (2):91-5.

147. Schiaffino MV, Dellambra E, Cortese K, Baschirotto C, Bondanza S, Clementi M, Nucci P, Ballabio A, Tacchetti C, De Luca M. Effective retrovirus-mediated gene transfer in normal and mutant human melanocytes. // Hum Gene Ther 2002 v.-13(8), pp.947-57

148. Schwartz JA, Buonocore L, Roberts A, Suguitan A Jr, Kobasa D, Kobinger

149. G, Feldmann H, Subbarao K, Rose JK. /Vesicular stomatitis virus vectors expressing avian influenza H5 HA induce cross-neutralizing antibodies and long-term protection//Virology. 2007 15; 366 (1): 166-73.

150. Shenk T. Adenoviridae: the viruses and their replication. // Fields virology. / Eds Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. Fhiladelfhia: 3rd ed. LippincottRaven Publishers, 1996, pp.- 2111-2148

151. Sheppard M, Werner W, McCoy RJ, Johnson MA. The major late promoter and bipartite leader sequence of fowl adenovirus. // Arch Virol 1998 v.-143(3), pp.537-48

152. Sheppard M, Werner W, Tsatas E, McCoy R, Prowse S, Johnson M. Fowl adenovirus recombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induces protective immunity against bursal disease. // Arch Virol. 1998 v.-143(5), pp.915-930

153. Soifer H., Higo C., Logg CR., Ja-Lu Jih L., Shichinohe T., Harboe-Schmidt E., Mitani K., Kasahara N. A novel, helper-dependent, adenovirus-retrovirus hybrid vector: stable transduction by a two-stage mechanism. // Mol Ther 2002 v.-5, pp.599-608

154. Stevenson SC, Rollence M, Marshall-Neff J, McClelland A. Selective targeting of human cells by a chimeric adenovirus vector containing a modified fiber protein. // J Virol 1997 v.- 71(6), pp.4782-4790

155. Straus S.E. Adenovirus infection in humans. // The Adenoviruses, ed. by1. H.S.Ginsberg, 1984

156. Tan BT., Wu L., Berk AJ. An adenovirus-Epstein Barr virus hibrid vector that stably transforms cultured cells with high efficiency. // J Virol 1999 v.-6, pp.7582-7589

157. Tan P.K., Michou A., Bergelson J.M., Cotten M. Defining CAR as a cellular receptor for the avian adenovirus CELO using a genetic analysis of the two viral fibre proteins. // J Gen Virol 2001 v.- 82, pp. 1465-1472

158. Tompkins SM, Zhao ZS, Lo CY, Misplon JA, Liu T, Ye Z, Hogan RJ, Wu Z, Benton KA, Tumpey TM, Epstein SL. /Matrix protein 2 vaccination and protection against influenza viruses, including subtype H5N1 //Emerg Infect Dis. 2007; 13 (3): 426-35.

159. Toro H, Tang DC, Suarez DL, Sylte MJ, Pfeiffer J, Van Kampen KR. /Protective avian influenza in ovo vaccination with non-replicating human adenovirus vector//Vaccine. 2007 Apr 12;25(15):2886-91.

160. Tuboly T, Nagy E. Sequence analysis and deletion of porcine adenovirus serotype 5 E3 region. // Virus Res 2000 v.-68(2), pp. 109-17

161. Tuboly T, Nagy E. Construction and characterization of recombinant porcine adenovirus serotype 5 expressing the transmissible gastroenteritis virus spike gene. // J Gen Virol 2001 v.-82(l), pp.183-90

162. Van der Eb A.J., van Kesteren J.W., van Bruggen E.F.J. Structural properties of adenovirus DNAs. // Biochem Biophys Acta 1969 v.-182, pp.- 530-541

163. Vile R.G. A marriage of viral vectors. // Nature Biotech 1997 v.-15, pp.840841

164. Wang G, Williams G, Xia H, Hickey M, Shao J, Davidson BL, McCray PB. Apical barriers to airway epithelial cell gene transfer with amphotropic retroviral vectors. // Gene Ther 2002 v.-9(14), pp.922-31

165. Wang Q, Greenburg G, Bunch D, Farson D, Finer MH Persistent transgene expression in mouse liver following in vivo gene transfer with a delta El/delta E4 adenovirus vector. // Gene Ther 1997 v.- 4(5), pp.393-400

166. Wickham TJ. Targeting adenovirus. // Gene Ther 2000 v.- 7(2), pp. 110-4

167. Wickham TJ, Mathias P, Cheresh DA, Nemerow GR. Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. // Cell 1993 v.- 73(2), pp.309-319

168. Wickham TJ, Segal DM, Roelvink PW, Carrion ME, Lizonova A, Lee GM, Kovesdi I. Targeted adenovirus gene transfer to endothelial and smooth muscle cells by using bispecific antibodies. // J Virol 1996 v.- 70(10), pp.6831-6838

169. W.S.M. Wold, K. Doronin et al. Immune responses to adenoviruses: viral evasion mechanisms and their implications for the clinic. Current opinion in immunology. 1999, vl 1, p.380-386.

170. Xu ZZ, Hyatt A, Boyle DB, Both GW. Construction of ovine adenovirus recombinants by gene insertion or deletion of related terminal region sequences. // Virology 1997 v.-230(1), pp.62-71

171. Yao Y, Zhao Y, Xu H, Smith LP, Lawrie CH, Sewer A, Zavolan M, Nair V. /Marek's disease virus type 2 (MDV-2)-encoded microRNAs show no sequence conservation with those encoded by MDV-1 // J Virol. 2007; 81 (13):7164-70.

172. Yang Y, Nunes FA, Berencsi K, Furth EE, Gonczol E, Wilson JM. /Cellular immunity to viral antigens limits El-deleted adenoviruses for gene therapy. // Proc Natl Acad Sci USA 1994 v.-91, pp.4407-4411.

173. Yates V.J., Fry D.E. Observations on a chicken embryo lethal orphan (CELO) virus.//Am J Vet Res 1957 v.-18, pp.657-660.

174. Zabner J, Chillon M, Grunst T, Moninger TO, Davidson BL, Gregory R, Armentano D. A chimeric type 2 adenovirus vector with a type 17 fiber enhances gene transfer to human airway epithelia. // J Virol 1999 v.- 73(10), pp.8689-8695.

175. Zhang L., Sankar U., Lampe D.J., Robertson H.M., Graham F.L. The Himarl mariner transposase cloned in a recombinant adenovirus vector is functional in mammalian cells. //Nucleic Acids Res 1998 v.-26, pp.3687-3693

176. Zhou Y, Tikoo SK. Analysis of early region 1 of porcine adenovirus type 3. // Virology 2001 v.-291(l), pp.68-76.

177. Zhou H, Zhao T, Pastore L, Nageh M, Zheng W, Rao XM, Beaudet AL. A Cre-expressing cell line and an El/E2a double-deleted virus for preparation of helper-dependent adenovirus vector. // Mol Ther 2001 v.- 3 (4), pp.613-622.