Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биологической активности рибозимов, специфически расщепляющих мРНК гена РВ1 вируса гриппа А в культуре клеток

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение биологической активности рибозимов, специфически расщепляющих мРНК гена РВ1 вируса гриппа А в культуре клеток"

на правах рукописи

ЛАЗАРЕВ Василий Николаевич

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РИБОЗИМОВ, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСЩЕПЛЯЮЩИХ мРНК ГЕНА РВ1 ВИРУСА. ГРИППА А В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

(специальность 03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генной инженерии микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научный руководитель - доктор биологических наук,

Народицкий B.C.

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук

Альтштейн А.Д. доктор химических наук Шатский И.Н.

Ведущая организация - Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Зашита диссертации состоится " " _ 1998г.

в _ часов на заседании Диссертационного Совета

Д.020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной

биотехнологии по адресу: 127 550, г. Москва, ул.Тимирязевская, д.42.'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " " _ 1998г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

(уСшл Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одним из значительных событий в биохимии и молекулярной биологии последнего десятилетия стало обнаружение каталитических свойств у

полирибонуклеотидов, впоследствии выделенных в отдельный класс каталитически активных молекул рибонуклеиновых кислот и получивших название "рибозимы".

Благодаря небольшим размерам они являются очень удобной моделью как для изучения механизма действия каталитических РНК, так и для их практического применения. Весьма интенсивно, особенно в последние годы, развиваются исследования рибозимов, связанные с использованием их в качестве терапевтических агентов. В частности, как удобные и эффективные инструменты для ингибирования экспрессии генов клеточного и вирусного происхождения, рибозимы открывают путь к созданию новых подходов к терапии вирусных инфекций, опухолевых и наследственных заболеваний. Кроме того, для нужд сельского хозяйства принципиально возможно создание трансгенных растений и животных, стабильно синтезирующих рибозимы строго направленного действия (за счет фланкирующих антисенс-последовательностей) против определенных патогенов. Такие животные и растения будут обладать устойчивостью к определенным инфекциям вирусного или бактериального происхождения. Особую ценность рибозимам как потенциальным терапевтическим агентам придает их практически абсолютная специфичность и нетоксичность.

По своей биологической активности рибозимы сходны с антисмысловыми РНК. Однако, использование антисмысловых РНК для ослабления экспрессии генов сильно ограничено из-за стехиометрической природы ингибирования. Создание

антисмысловых молекул с рибозимной активностью, которые способны не только образовывать комплекс с РНК-мишенью, но и расщеплять в ней определенную фосфодиэфирную связь, позволяет снять это ограничение, поскольку каталитически активные молекулы не расходуются в процессе расщепления.

Дальнейшее применение риОозимов в качестве потенциальных терапевтических агентов будет зависеть от разработки оптимальных способов переноса, эффективности и стабильности экспрессии искусственных генов рибозимов в клетке.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось конструирование и изучение биологических свойств in vitro и in vivo генов рибозимов, направленных на ингибирование вирусных инфекции на примере вируса гриппа А.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Создать искусственные гены функционального и дефектного рибозимов типа "головка молотка", направленные против мРНК гена РВ1 субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А.

2. Создать генно-инженерные конструкции, содержащие гены рибозимов под контролем различных регуляторных элементов для исследования биологической активности рибозимов в бесклеточной системе и в культуре клеток.

3. Получить дефектные рекомбинантные аденовирусы на основе Ad5 человека, несущие гены рибозимов, направленные против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А. Исследовать экспрессию генов рибозимов и их биологическую активность при инфекции этими рекомбинантными вирусами культуры клеток.

Научная_новизна_и_практическая_значимость.

Сконструированы искусственные гены рибозимов, направленные против мРНК гена РВ1 субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А. Исследована биологическая активность рибозимов в бесклеточной системе. Обнаружена способность

функционального рибозима расщеплять модельный субстрат in eis (внутримолекулярно) и in trans (межмолекулярно).

Создана серия генно-инженерных конструкций, содержащих гены рибозимов под контролем промотора цитомегаловируса человека и в составе гена вирус-ассоциированой РНК аденовируса птиц CELO (VA РНК CELO). С использованием этих конструкций получены линии клеток, стабильно экспрессирующие гены рибозимов; показано ингибирозание синтеза вирусных белков и репродукции вируса гриппа А различных штаммов в этих линиях клеток.

Впервые получены дефектные рекомбинантные аденовирусы на основе Ad5 человека, несущие гены функционального и дефектного рибозимов, направленных против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А под контролем промотора цитомегаловируса человека в районе делетированной El области генома. Показана экспрессия функционального и дефектного рибозимов в линии клеток CV-1, инфицированных рекомбинантными аденовирусами, и ингибирование репродукции вируса гриппа А в этой линии клеток.

Работа представляет не только научный, но и, в перспективе, может иметь и практический интерес, так как сконструированные рибозимы могут быть использованы для получения трансгенных животных, устойчивых к вирусу гриппа А. В частности, в свиноводстве, весьма актуальным является вопрос получения трансгенных свиней, устойчивых к вирусу гриппа. Кроме того, рибозимы в составе геномов

рекомбинантных аденовирусов могут применяться в дальнейшем

для эффективного ингибирования инфекции вирусов гриппа А сельскохозяйственных животных и птиц.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 151 библиографическую ссылку. Работа изложена на 115 машинописных страницах, включая 4 таблицы и 15 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Материалы и методы исследования. В экспериментальной части работы использованы вирусы гриппа A/Singapore/1/57 и A/WSN/33, любезно предоставленные чл.-корр. АМН д.мед.наук Кавериным Н.В. (Институт вирусологии, Москва, Россия) и рекомбинантный аденовирус на основе Ad5 человека - Ad5neo, полученный от Dr.Gluzman (Cold Spring Harbor Lab., США).

В работе использовались следующие клеточные линии: 293, CV-1. Клетки линии MDCK получены от к.мед.н. Гродницкой Н.А. (Институт вирусологии, Москва, Россия).

Трансфекцию клеточных линий проводили методом кальций-фосфатной преципитации (Graham & van der Eb, 1973). Все манипуляции, связанные с получением рекомбинантных аденовирусов проводили согласно Graham & Prevec (1991).

В работе был использован лабораторный штамм DH5a и плазмидные вектора pGEM3zf(-) ("Promega"), pRc/CMV ("Invitrogen"). Плазмиды pJM-17 и pHCMVspl3 получены от Dr. F. Graham (McMaster University, Hamilton, Канада). Плазмида pPBl любезно предоставлена чл.-корр. АМН

я.мед.наук Кавериным Н.В. (Институт вирусологии, Москва, Россия).

Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методикам, изложенным в Maniatis et al. (1982) .

Первичную структуру ДНК определяли по методу Sanger (1977) . Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировал на автоматическом синтезаторе н.с. ВНИИ СБ КузуОов А.В.

Тестирование специфической эндорибонуклеазной

активности риОозимов in vitro проводили в присутствии 10 мМ трис-HCl рН 7.5 и МдС12 в концентрации 5, 10, 50 мМ. Реакция проводилась при постоянных температурах инкубации 37°С, 5 6°С и с их циклической сменой в интервале от 37°С до 90°С.

Выделение РНК из культур клеток проводили по методу Chomczynski (1993).

Реакцию обратной транскрипции РНК проводили с использованием AMV ревертазы ("Promega").

Все манипуляции с вирусами гриппа А различных штаммов проводили согласно Barret et al. (1988).

2. Результаты исследований и их обсуждении.

2.1. Исследование специфической эндорибонуклеазной

активности рибозимов в бесклеточной системе.

Для атаки рибозимом был выбран сайт GUC (координата 1568 н.) мРНК гена РВ1 субъединицы РНК-зависимой РНК полимеразы вируса гриппа А/Киев/59/79. Этот ген является высококонсервативным. Последовательности рнк-полимераз вируса гриппа А человека, животных, птиц имеют обширные гомологичные участки. Это дает возможность получить рибозим, способный расщеплять мРНК генов полимераз различных штаммов вируса гриппа А.

При выборе сайта расщепления мы руководствовались компьютерными программи PC FOLD и "RNA prediction secondary structure".

К выбранному сайту химически синтезировали олигодезоксирибонуклеотиды генов функционального и дефектного рибозимов типа "головка молотка", включающие в себя последовательности, кодирующие каталитический домен (24 н.) и фланкирующие антисенс-последовательности, комплементарные мРНК - мишени (по 11 н. с каждой стороны от каталитического домена). Дефектный рибозим содержал единичную нуклеотидную замену в каталитическом домене, критическую для специфической эндорибонуклеазной активности рибозима.

Для исследования способности рибозима расщеплять РНК-субстрат in trans (межмолекулярно), ДНК рекомбинантных плазмид pRc4D и рРВКН были использованы для синтеза in vitro радиоактивномеченых РНК-транскриптов с помощью РНК-полимеразы фага SP6. Один из транскриптов (субстрат) длиной 340 н. должен расщепляться на два фрагмента длиной 27 6 и 64 н. Другой транскрипт (рибозим) имел длину 160 н. Совместное инкубирование транскриптов в присутствии ионов Mg2* приводило к специфическому расщеплению субстрата на фрагменты ожидаемой длины (Рис.2). Молярное соотношение транскриптов составляло примерно 1:1.

При температуре инкубации 56 °С реакция проходила быстрее, чем при 37 °С. По результатам денситометрии радиоавтографа через 1.5 часа после начала реакции продукты расщепления составляли 20% (инкубация 37 °С) и 40% (инкубации 56 °С ) от количества РНК-субстрата.

Для исследования специфической эндорибонуклеазной активности рибозимов в Оесклеточной системе был сконструирован ряд рекомбинантных плазмид на основе стандартных плазмидных векторов серии рСЕМ и плазмидного вектора рЯс/СМУ1, несущих в своем составе димеры генов рибозимов "голова-к-хвосту" (рРс40, рЯс40-Ы), мономер гена дефектного рибозима (рКс40т) и фрагмент гена РНК-субстрата (рРВКН). Схемы рекомбинантных плазмид приведены на рис.1.

SP6

■*• 5' Rz 3' 5' Rz У

pRc4D

HindlH

Xbal

poly A

T7

"*" ^.„iiiiII^III«i iL ^jui^mjua Лддд°Ш Hint1Ш Xbal S £coRV

pRc4D-N

SP6

pPBKH

Kprill

Hir>m\

SP6

5' Rz -mutant У

pRc4Dm

Hindm

Xbal

poly A

_5' Rz 3' CMV pro 5' Rz 3' 5' Rz 3' _

A box В bor term 1 | ДДШИД———

^ '' '—-Hind III Xba I

celoVarna polyA

pRc4D-VA

Рис.1. Схемы рекомбинантных плазмид. Яг- ген рибозима, Б-фрагменты последовательности кДНК мишени, Иг-пи^аг^ дефектный рибозим, ро1уА - сайт(ы) полиаденилирования. Стрелки показывают направление транскрипции с промоторов РНК-полимераз фагов БР6 и Т7.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 2 Радиоавтограф электрофореза продуктов расщепления рибозимом РНК-мишени in trans. S- субстрат; R- рибозим; PI и Р2- продукты реакции. Реакция проводилась при 37°С (2—4) и 56°С (5—7). Время инкубации: 2 и 5- 30 мин; 3 и 6- 60 мин; 4 и 7- 90 мин; S- в качестве маркера использованы меченные у-"~Р HintI-фрагменты ДНК фага фХ174.

Для исследования способности рибозима расщеплять модельный РНК-субстрат in eis (внутримолекулярно), в реакции in vitro транскрипции рнк-полимеразой фага Т7 использовали ДНК плазмиды pRc4D-N (рис.1). Одновременно с реакцией in vitro транскрипции должна протекать реакция специфического расщепления РНК-транскрипта, катализируемая рибозимом, так как и рибозим, и его> мишень входят в состав молекулы РНК-транскрипта, , а условия реакции in vitro транскрипции и реакции специфического расщепления субстрата совпадают. При этом полноразмерный РНК-транскрипт длиной 516 н. должен расщепляться на фрагменты длиной 170 и 346 н. (Рис. ЗА). Это подтверждается радиоавтографом гель-электрофореза радиоактивномеченных продуктов реакции (Рис. ЗБ) . После окончания реакции in vitro транскрипции, которую проводили 1ч при 37 °С, по

А). Расщепление (сайт GUC, координата 170 н.)

1

п

. 516 н.

346 н.

вт

170 н.

Б).

1 2

516 346

170

Рис.3. Специфическое расщепление рибозимом РНК-мипгени in eis.

(A) Схема, поясняющая образование в результате реакции продуктов длиной 516 н. (полноразмерный транскрипт), 346 н. и 170 н. (фрагменты, образующиеся- в результате расщепления полноразмерного транскрипта). Полноразмерный транскрипт и фрагмент длиной 170 н. содержит в своем составе две молекулы рибозима.

(B) Радиоавтограф электрофореза продуктов - расщепления рибозимом РНК-мишени in eis. 1- аликвота, непосредственно после завершения реакции- in vitro транскрипции; 2- инкубация 1 ч 37°С после завершения реакции in vitro транскрипции; 3-инкубация 1 ч 56°С после завершения реакции in vitro транскрипции.

5

5

5

н

данным денситометрии радиоавтографа, 8 3% полноразмерного РНК-транскрипта расщепляется на фрагменты соответствующей длины. Однако, 17% молекул остается нерасщепленными и после 1 часа дальнейшей инкубации при 37 °С. Повышение температуры инкубации до 56 °С приводит к полному расщеплению молекул полноразмерного РНК-транскрипта на фрагменты соответствующей длины.

Неполное расщепление РНК - транскрипта при температуре инкубации 37 °с, по-видимому, обусловлено тем, что некоторая часть молекул РНК вовлечена во взаимодействие друг с другом и имеет вторичную (или третичную) структуру, которая препятствует взаимодействию рибозима с участком молекулы, соответствующей субстрату.

Рибозим с заменой одного нуклеотида в каталитическом домене специфической эндорибонуклеазной активностью не обладал.

Анализируя полученные результаты, можно отметить, что относительно невысокая активность рибозима при 37 °С (1015% расщепления субстрата за час), возможно, объясняется большой длиной фланкирующих антисенс-последовательностей, что понижает число оборотов рибозима. Повышение температуры реакции ферментативного расщепления или температурная циклизация приводила к повышению эффективности работы рибозима. Полученные данные согласуются с ранее опубликованными данными других авторов.

Однако, необходимо подчеркнуть, что данные об активности рибозима, полученные в бесклеточной системе, не всегда согласуются с данными об эффективности работы рибозима в системе in vivo. Молекулы субстрата и рибозима имеют в клетке другую длину, и , следовательно могут иметь другую вторичную и третичную структуры. Кроме того,

влияние на ферментативную активность могут оказывать белки. Важное значение имеет также локализация рибозима и субстрата з клетке. Поэтому следующий этап наших исследований был посвящен изучению активности рибозимов и их экспресии з клеточных линиях.

2.2. Исследование биологической активности рибозимов, направленных против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А в линиях клеток, стабильно экспрессирующих гены этих рибозимов.

Для исследования биологической активности рибозима, направленного против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А, а также дефектного рибозима в культуре клеток мы получили линии клеток CV-1, стабильно экспрессирующие гены этих рибозимов. Последующий анализ включал в себя следующие стадии : определение синтеза рибозимной РНК в стабильно трансфицированных линиях клеток, определение уровня ингибирования синтеза вирусных белков и уровня ингибирования репродукции вируса гриппа А штаммов A/Singapore/1/57 и A/WSN/33 в этих линиях клеток.

Для получения линий, стабильно экспрессирующих гены рибозимов, направленных против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А мы использовали плазмиды pRc4D, pRc4D-N, pRc4Dm (рис.1), которые, кроме последовательностей промоторов фагов Т7 и SP6, содержат промотор цитомегаловируса человека (CMV) и ген устойчивости к антибиотику неомицину. Для исследования биологической активности рибозима в составе промотора гена вирус-ассоциированной РНК аденовируса птиц CELO (VA РНК CELO) в плазмиду pRc4D была клонирована последовательность, которая содержала ген функционального рибозима между прсмоторными боксами последовательностей VA RNA CELO. Эта плазмида получила название pRc4D-VA (рис.1).

После проведения трансфекции методом кальций-фосфатной преципитации и последующего отбора неомицин-устойчивых колоний линии клеток СЯ-1, были отобраны и охарактеризованы индивидуальные клоны для каждой линии, трансфицированной плазмидами рИс40т, рИсЮ, рИс4С-М и рКс40-УА (линии получили название СУ-Ит, СУ-Б, СУ-Ы и СУ-УА соответственно). Тотальная клеточная РНК была выделена и проанализирована с помощью реакции обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). На рис.4 приведена электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР-амплификации РНК, выделенной из нескольких индивидуальных клонов линий клеток, стабильно экспрессирующих гены рибозимов. По максимальному уровню сигнала, для дальнейшего анализа, мы выбрали клон 1 линии СУ-йл и клон 2 линии СУ-О.

M 1 2 3 4 5 е 7 8 9 10 11 12 13 M

Рис. 4. ОТ-ПЦР анализ тотальной РНК, выделенной из линий клеток, стабильно экспрессирующих гены рибозимов. 1 - РНК из нетрансфицированной линии клеток CV-1; 2-4 - РНК из клонов 1, 4, 2 линии CV-Dm (амплифицируемый фрагмент - 117 п.о.); 5-7 - РНК из 'клонов 8, 5, 2 линии CV-D (амплифицируемый фрагмент 185 п.о.); 8-10 - РНК из клонов 5, 7, 1 линии CV-N (амплифищгруемый фрагмент 167 п.о.); 11-13 -РНК из клонов б, 5, 3 линии CV-VA (амплифицируемый фрагмент 175 п.о.). М-маркер молекулярного веса ДНК (ДНК плазмиды pUC19, гидролизованная Mspl).

Для определения уровня ингибирования синтеза белков вируса гриппа А в линиях клеток, стабильно экспрессирующих гены рибозимов, мы использовали метод введения радиоактивной метки 2Ъ5-метионина в вирусные белки, которые синтезируются в зараженных клетках. Для выявления различий в ингибировании синтеза белков вируса гриппа на разных стадиях инфекции, радиоактивную метку добавляли к клеткам через 8 и 16 часов после инфекции. Заражение проводили , различными штаммами вируса гриппа (A/Singapore/1/57 и A/WSN/33). Множественность инфекции составляла 1 БОЕ/кл для штамма A/Singapore/1/57 и 1 - 10 БОЕ/кл для штамма A/WSN/33. Электрофореграмма белков, выделенных из

инфицированных клеток показана на рис.5 (Приведены данные только для линий CV-1, CV-Dm и CV-D, инфицированных вирусом гриппа A/Singapore/1/57). На электрофореграмме видно, что после инфекции, синтез клеточных белков резко снижается. Для сценки урозня ингибирования синтеза вирусных белков в полученных нами линиях клеток, стабильно экспрессирующих гены рибозимов мы выбрали структурный белок NP - нуклеопротеин, мажорный структурный протеин, который образует рибонуклеопрстеиновый комплекс с сегментами вирусной РНК и неструктурный белок NS1, который участвует в процессах транспорта клеточной РНК, сплайсинга и трансляции вирусного генома Для процентного определения уровня ингибирования синтеза вирусных белков, проводили денситсметрию полос радиоавтографа, соответствующих по электрофоретическсй подвижности вирусным белкам NP и NS1. Процентное отношение вычисляли исходя из разницы в ингибировании синтеза белков NP и NS1 между исходной линией CV-1 и линиями, стабильно экспрессирующими гены рибозимов. Как аиднс из таб.1, при заражении клеток этих

линий вирусом гриппа A/Singapore/1/57 максимальный уровень ингибирования синтеза белка NP и NS1 - 90.5% и 88.7% соответственно, наблюдался в линии CV-VA, а минимальный (11.8% и 3.6% соответственно для белков NP и NS1) - з линии, экспрессирующей ген дефектного рибозима. Причем,

Рис. • 5. Фракционирование З53-меченых вирусных белков, выделенных из линий клеток инфицированных вирусом гриппа А (штамм А/Singapore/1/57 ) в 15% лолиакриламидном геле. Множественность инфекции- составляла 1 БОЕ/кл.

1 - маркер молекулярного веса (Rainbow,M (l1C) methylated protein).

2, 5, 8 - белки, выделенные из неинфицированных линий клеток CV-1, CV-Dm, CV-D соответственно.

3, 4 - белки выделенные из инфицированной линии клеток CV-1 через 8 и 16 часов после инфекции.

6, 7 - белки выделенные из инфицированной линии клеток CV-Dm через 8 и 16 часов после инфекции.

9, 10 - белки выделенные из инфицированной линии клеток CV-D через 8 и 16 часов после инфекции.

для всех линий, инфицированных вирусом гриппа A/Singapore/1/57, через 16 часов после инфекции уровень ингибирования синтеза белков NP и NS1 снижался по сравнению с уровнем ингибирования через 8 часов после инфекции. При заражении линий клеток вирусом гриппа

A/WSN/33 максимальный уровень ингибирования синтеза белка NP наблюдался также в линии CV-VA (89.6%), а минимальный (4.5%) - в линии, экспрессирующей дефектный рибозим. Примечательно, что через 16 часов после инфекции с множественностью 1 БОЕ/кл уровень ингибирования синтеза белка NS1 возрастает во всех линиях, за исключением линии, экспрессирующей дефектный рибозим, а максимальный уровень (72.1%) наблюдается в линии CV-N. Суммарные результаты по ингибирозанию синтеза вирусных белков приведены в таб.1.

Линии клеток, экспрессирующие как функциональный, так и дефектный рибозим, были инфицированы штаммами вируса гриппа A/Singapore/1/57 и A/WSN/33 с целью определения уровня ингибирования репродукции вируса методом бляшкообразования. При заражении этих линий вирусом гриппа A/Singapore/1/57 (множественность инфекции составляла 1 БОЕ/кл) максимальный уровень ингибирования вирусной репродукции наблюдался в линиях CV-N и CV-VA ( 92.3 ± 4.0% и 90.4 ± 5.1% соответственно) (таб.2) . В линии же, экспрессирующей ген дефектного рибозима он составил 4 4.5 ± 4.9%. При заражении этих линий вирусом гриппа A/WSN/33 максимальный уровень ингибирования вирусной репродукции наблюдался в линии CV-VA (93.5% при множественности инфекции 1 БОЕ/кл). Следует отметить, что ингибирование репродукции вируса в линии, экспрессирующей дефектный рибозим при множественности инфекции 1 БОЕ/кл составляло 63.0 ± 1.4% и снижалось в 3 раза (22.2 ± 6.3 %) при множественности инфекции 10 БОЕ/кл.

Суммарные данные по ингибированию репродукции вируса гриппа двух штаммов приведены в таб.2.

Увеличение уровня ингибирования репродукции вируса гриппа А двух штаммов в линиях клеток CV-VA и CV-N по

Таблица.2 Ингибирование синтеза белков вируса гриппа (штаммы A/Singapore/1/57 и A/WSN/33) в линия клеток, стабильно экспрессируюших рибозимы, направленный против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А п данным денситометрии радиоавтографа электрофореграммы белков, меченных "s- метионином и выделенных и инфицированных линий.

Вирус A/Singapore/1/57 A/WSN/33

Время после инфекции 8 часов 16 часов 8 часов 16 часов

Множественность инфекции 1 БОЕ/кл 1 БОЕ/кл 1 БОЕ/кл 10 БОЕ/кл 1 БОЕ/кл 10 БОЕ/кл

——^^Протенн Липни клето1Г~— NP NS1 NP NSI NP NS1 NP NS1 NP NS1 NP NSI

CV-Dm 38.4%* 32.0% 11.8% 3.6% 42.4% 46.3% 11.4% 16.8% 26.8% 46.0% 4.5% 3.3%

CV-D 72.2% 84.3% 68.9% 39.4% 72.7% 47.8% 60.6% 39.5% 62.4% 58.8% 35.5% 34.7%

CV-N 81.8% 85.9% 75.8% 58.2% 79.4% 64.2% 67.5% 72.1% 84.7% 76.4% 48.2% 51.0%

CV-VA 90.5% 88.7% 81.2% 67.0% 86.2% 69.0% 85.9% 67.1% 89.6% 87.1% 83.4% 41.0%

* Проценты ингибирования приведены по отношению к исходной нетрансфицированной линии CV-1.

сравнению с линией CV-D можно объяснить тем, что в линии CV-VA экспрессируется дополнительно еще один рибозим под контролем промотора гена VA РНК CELO, тем самым увеличивается "доза гена", а в линии CV-N благодаря отсутствию поли(А)-сигнала на конце транскрипта, происходит преимущественное накопление его в ядре клетки, что является немаловажным, поскольку процессы транскрипции и репликации генома вируса гриппа А происходят в ядре.

Таб.2. Исследование ингибирования репродукции вируса гриппа А (штамм A/Singapore/1/57 и A/WSN/33) в линиях клеток, экспрессирующих рибозим, направленный против мРНК гена РВ1 методом бляшкообразования.

Вируашй штамм A/Singapore/1/57 A/WSN/33

Хфгожестаеяяостъ кпфвхцяя 1 БОЕ/кл 1 БОЕ/кл 10 БОЕ/кл

Ляяжя клвток\

CV-Dm 44.5 ± 4.9%" 63.0 ± 1.4% 22.2 ± 6.3%

CV-D 81.6 ± 1.5% 81.4 ±2.7% 71.9 ±4.1%

CV-N 92.3 ± 4.0% 87.5 ± 3.7% 82.8 ±5.4%

CV-VA 90.4 ±5.1% 93.5 ± 1.8% 75.2 ± 8.7%

Проценты ингибирования приведены по отношению к исходной нетрансфицированной линии СУ-1.

2.3. Экспрессия генов рибоэимов в составе геномов рекомйинантных аденовирусов.

Одной из важнейших проблем при использовании рибозимов в качестве потенциальных терапевтических агентов

остается способ переноса гена рибозима в клетку для экспресии ¿л vivo.

3 качестве вектора для эндогенного переноса генов рибозимов, направленных на подавление инфекции вируса гриппа А мы впервые предложили использовать дефектный рекомбинантный аденовирус на основе аденовируса человека типа 5.

Для получения дефектных рекомбинантных аденовирусов с El областью, замещенной генами рибозимов фрагмент ДНК, содержащий димер гена рибозима под контролем CMV-промотора и последовательности кДНК-мишени, получений в результате гидролиза ДНК плазмиды pRc4D-N специфическими эндодезоксирибонуклеазами Stul и BglII был клонирован по сайтам EcoRV - BglII плазмиды pspl3AHCMV, которая содержит последовательности генома Ad5 (0-16% генома)с делетированной El областью (1.3-9.3% генома). Данная рекомбинантная плазмида получила название pCMV4D-N (Рис.6).

Фрагмент ДНК, содержащий ген дефектного рибозима под контролем CMV-промотора, был получен в результате гидролиза ДНК плазмиды pRc4Dm специфическими эндодезоксирибонуклеазами Xbal и BglII. Этот фрагмент был клонирован по этим же сайтам плазмиды pspl3AHCMV. Данная рекомбинантная плазмида получила название pCMV4Dm (Рис.6).

Котрансфекцией плазмид pCMV4D-N, pRc4Dm с плазмидой pJM17 клеток линии 2 93 получили бляшки рекомбинантных аденовирусов Ad5CMV4D-N и Ad5CMV4Dm. Рекомбинантная природа аденовирусов Ad5CMV4D-N и Ad5CMV4Dm подтверждена рестрикционным анализом. Плазмида pJM17 содержит полный геном делеционного мутанта Ad5 dl309 с концевыми фрагментами вирусной ДНК, замкнутыми 0/100% и вставкой плазмидной ДНК в El области. Процесс рекомбинации ln vivo

приводил к генерации рекомбинантных вирусов с делетированной Е1 областью и несущих вставку с последовательностями генов рибозимов.

Необходимо заметить, что длина последовательности плазмиды pJM 17 превышает пакующую емкость Ad вектора, поэтому при использовании данной плазмиды вместо фрагментов генома при получении рекомбинантных аденовирусов, практически отсутствует фон вируса дикого типа.

Тестирование экспрессии генов функционального и дефектного рибозимов в составе генома рекомбинантных аденовирусов проводили з клетках линии CV-1. Через 12 часов после инфекции рексмбинантными аденовирусами Ad5CMV4D-N и Ad5CMV4Dm при множественности инфекции ЮБОЕ/клетку, тотальная РНК была выделена из клеток и проанализирована методом ПЦР с обратной транскрипцией.

Специфическими праймерами для анализа экспрессии гена рибозима в составе генома рекомбинантного аденовируса Ad5CMV4D-N служили олигодезоксирибонуклеотиды

комплементарные последовательностям промоторов фагов Т7 и SP6 и одной из цепей последовательности М13 origin плазмиды pRc/CMV.

Проведенный анализ выявил наличие специфического продукта амплификации кДНК рибозима длиной 167 н. (при инфекции рекомбинантным вирусом Ad5CMV4D-N) и 117 н. (при инфекции рекомбинантнкм вирусом Ad5CMV4Dm). Электрофореграмма продуктов реакции ОТ-ПЦР призедена на рис.7.

гидролиз Bglll-Stul

гидролиз Bgill-Xbai /

полилинкер, сигналы сплайсинга и полиаленилирояания

»ятрош« HCMVEE

сжгшлпаыЛ R2 mut

9.3

AdSCMV40-N

1.3 9.3

Ad5CMV4Dm

Рис.6. Схема получения рекомбинантных аденовирусов Ad5CMV4D-N и Ad5CMV4Dm.

Незаполненные области - последовательности генома Ad5; заштрихованные области - плазмидные последовательности. Rz-Rz-димер гена рибозима, Rzinut - ген дефектного рибозима, "target" фрагменты последовательности кДНК мишени, цифры соответствуют единицам физической карты генома Ad5.

Для определения уровня ингибирования репродукции вируса гриппа А в линии клеток СУ-1, инфицированной рекомбинантными аденовирусами, экспрессирующими гены рибозимов, клетки этой линии заражали рекомбинантными аденовирусами Ас15СМУЕ!т и Ас15С^4П-и. Множественность инфекции составляла 1 и 10 БОЕ/клетку. Через 12 часов клетки суперинфицировали вирусом гриппа А/ЮЭМ/ЗЗ с множественностью инфекции 1 БОЕ/клетку. Через 8 часов после суперинфекции отобранной культуральной жидкостью инфицировали клетки линии МБСК.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.7. Анализ экспрессии РНК рибозимов в составе рекомбинантных аденовирусов при инфекции клеток линии СУ-1. Электрофореграмма продуктов реакции ОТ-ПЦР тотальной РНК, выделенной из инфицированной линии клеток.

2 - неинфицированная линия клеток СУ-1 (отрицательный контроль).

3.6 - РНК из клеток СУ-1, зараженных рекомбинантными аденовирусами Ас35СМУ40та и Ас15СМУ40-Ы соответственно.

4.7 - 1 пкг плазмид рСМУ4!Эт и рСМУ40-Ы соответственно (положительный контроль).

5 - РНК из клеток СУ-1, зараженных рекомбинантным

аденовирусом Ас15пео.

1.8 - маркер молекулярного веса ДНК риС19/Мзр1.

Уровень ингибирования репродукции вируса гриппа А/ИЗЫ/ЗЗ определяли путем подсчета вирусных бляшек. В качестве контроля использовали рекомбинантный аденовирус Ас15пео и аденовирус человека типа 5.

Максимальный уровень ингиСирования репродукции вируса гриппа А/ЯЗИ/ЗЗ (91.4%) наблюдался при инфекции клеток линии С\/-1 рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ген функционального рибозима. В клетках, инфицированных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ген дефектного рибозима уровень ингибирования составил 43.7%.

Ингибирующий эффект зависел от дозы рекомбинантного вируса, экспрессирующего рибозим. В основе этого эффекта, на наш взгляд, лежит факт прямой зависимости эффективности ингибирования экспрессии генов рибозимом от молярного избытка рибозима над РНК-суОстратом. Следует также отметить, что степень ингибирования экспрессии гена рибозимами может сильно варьировать в зависимости от балланса уровень транскрипции/уровень распада матричной РНК гена-мишени.

Однако, мы наблюдали и ингибирование (10-15%) репродукции вируса гриппа А при предзаражении клеток рекомбинантным аденовирусом Ас15пео и аденовирусом дикого типа. Вероятно, это связано с процессами индукции активности интерферона в инфицированных клетках. Суммарные результаты эксперимента приведены в таблице.3.

Одной из перспективных задач конструирования аденовирусных векторов, на наш взгляд, является повышение уровня экспрессии встроенных в геном Ад генов либо за счет применения более сильных промоторов, либо за счет повышения копийности экспрессируемых генов.

Другим актуальным направлением является дальнейшая аттенуация рекомбинантных аденовирусов, что позволило бы расширить возможности применения данной векторной системы.

Таблица 3. Исследование ингибирования репродукции вируса гриппа А/ИБМ/ЗЗ) в линиях клеток СУ-1, инфицированных рекомбинантными аденовирусами экспрессирующих рибозим, направленный против мРНК гена РВ1 методом бляшкообразования.

Рекомбинактные аденовирусы Множественность инфекции Ингибирование репродукции вируса гриппа АЛКЗЫ/ЗЗ

А05СМУ4П-Ы 1 БОЕ/кл 67.6 ± 2.9%*

10 БОЕ/кл 91.4 ± 3.6%

Ас15СМУ4£1т 1 БОЕ/кл 21.5± 1.7%

10 БОЕ/кл 43.7± 5.3%

Ас15пео 1 БОЕ/кл 15.3± 1.9%

А 05 1 БОЕ/кл 10.7± 0.7%

Проценты ингибирования приведены по отношению к клеткам линии инфицированных вирусом гриппа А/ИБМ/ЗЗ, но не зараженных рекомбинантными аденовирусами.

Таким образом, результатом работы является создание рибозима, который активно расщепляет мРНК гена РВ1 вируса гриппа А в бесклеточной системе и в культуре клеток. Эти данные позволяют предположить возможность использования рибозимов как новых средств противовирусной терапии и получения трансгенных сельскохозяйственных животных, устойчивых к вирусным инфекциям.

ВЫВОДЫ.

1. Сконструированы функциональный и дефектный рибозимы, направленные на расщепление мРНК гена РВ1 субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А. Показана специфическая эндорибонуклеазная активность функционального рибозима по отношению к модельному субстрату в бесклеточной системе.

2. Получены клоны линии клеток CV-1 (CV-D, CV-N, CV-VA и CV-Dm), стабильно экспрессирующие гены функционального и дефектного рибозимов под контролем раннего промотора цитомегаловируса человека и промотора VA РНК аденовируса птиц CELO.

3. Впервые показано, что рибозим, специфически расщепляющий мРНК гена РВ1 субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А, ингибирует синтез различных вирусных белков в клетках, стабильно экспрессирующих ген этого рибозима. Максимальный уровень ингибирования синтеза вирусного белка NP (нуклеопротеин) составил 90.5%, а белка NS1 (неструктурный протеин) - 88.7%.

4. Впервые показано ингибирование репродукции вируса гриппа А штаммов A/WSN/33 (на 93.5%) и A/Singapore/1/57 (на 92.3%) в линиях клеток, стабильно экспрессирующих ген функционального рибозима.

5. Получены дефектные рекомбинантные аденовирусы оригинальной конструкции на основе Ad5 человека (Ad5CMVD-N и Ad5CMVDm), несущие гены функционального и дефектного рибозимов, направленных против мРНК гена РВ1 вируса гриппа А. Показана экспрессия рибозимов в клетках линии CV-1, инфицированных полученными рекомбинантными аденовирусами.

6. Впервые показано ингибирование репродукции вируса гриппа А штамма А/ЯЭЫ/ЗЗ в клетках линии СУ-1, предварительно инфицированных рекомбинантным

аденовирусом Ас15СМ71)-М. Уровень подавления репродукции вируса гриппа составил 91.3%.

Список работ, опубликованных по тема диссертации.

1. Лазарев В.Н., Захарчук А.Н., Каверин Н.В., Народицкий B.C. Рибозим, расщепляющий мРНК вируса гриппа А. //Международная конференция " Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Тезисы. Москва, 30-31 октября 1996, стр.46.

2. Захарчук А.Н., Доронин К.К., Лазарев В.Н., Бабурина Т.М., Народицкий B.C. Экспрессия генов, кодирующих рибозимы в составе аденовирусного вектора. // Международная конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Тезисы. Москва, 30-31 октября 1996, стр.29.

3. Захарчук А.Н., Лазарев В.Н., Народицкий B.C., Каверин Н.в. Рибозим, расщепляющий мРНК гена полимеразы вируса гриппа А. // Мол. Биология (1996) т.30, вып. 6, стр. 14201425.

4. Захарчук А.Н., Доронин К.К., Бабурина Т.М., Лазарев В.Н., Народицкий B.C. // Экспрессия гена рибозима в составе генома рекомбинантного аденовируса. // Мол. Биология (1997) т. 31, вып.1, стр. 83-87.

5. Иванова М.М., Лазарев В.Н. Современные методы ДНК -диагностики. // Лекция для студентов и аспирантов, слушателей факультетов повышения квалификации i специалистов диагностических лабораторий. // МГАВМиБ им К.И.Скрябина, Москва, 1997, 19 с.

6. V.N. Lazarev, М.М. Schmarov, G.K. Yurov, 0.0. Misyurina. B.S. Naroditsky, N.A. Grodnitskaya, N.V. Kaverin Expression of ribozyme gene directed against mRNA gene PB' of influenza virus A integrated in a defective recombinant adenovirus.// 6th Symposium on Gene Therapy, May 4-6, 1998 Berlin-Buch.