Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ ПТИЦ CELO В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ ПТИЦ CELO В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO."

у/, с г у.

На правах рукописи

ШМАРОВ Максим Михайлович

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ ПТИЦ CELO В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO.

(специальность 03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2002 г.

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии эукариот ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РЛСХН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Народицкий Б.С.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

Альтштейн Л.Д. кандидат биологических наук, Забережный А.Д.

Ведущая организация - Институт молекулярной генетики РАН.

Защита диссертации состоится " "_2002г, в_ часов на

заседании Диссертационного Совета Д.006.02701 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, у л .Тимирязевская, д. 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "__2002г.

Ученый секре- ь Диссертационного Со ета, кандидат биологических наук

Мел и ко ва С А,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

IÍ настоящее время аденовпрусы (Ад) хорошо изучены в качестве этиологических агентов различных инфекционных заболеваний человека и животных. Они являются удобной моделью для многочисленных исследований в молекулярной биологии, включая изучение сплайсинга мРНК, репликации ДНК, транскрипции и клеточной трансформации, Ад широко применяются в качестве векторов для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro. Исследуется применение векторов на основе Ад человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии.

Использование векторов на основе генома Ад человека в настоящее время имеет ряд ограничении: прсдсуществуюшнй гуморальный и клеточный иммунный ответ организма человека на данные аденовирусы, ограниченный спектр клеток, в которые Лд человека эффективно проникают, размер вставки чужеродного генетического материала для аденовирусных векторов первого поколения составляет не более 7,5 т.н.п., а также серьезным ограничение является экономический фактор, так как наращивание препаративных количеств Ад человека в культуре клеток является трудоемким и дорогостоящим процессом. В связи с этим возможность создания нозых векторных систем на основе геномов аденовирусов животных, в первую очередь птиц, вызывает большой интерес многих исследователей.

В последние годы были осуществлены попытки создания векторов на основе па базе генома аденовируса гггиц CELO. Преимуществами векторов на основе CELO являются отсутствие первичного иммунного ответа в организме млекопитающих, непермиесивноеть клеток человека и животных для этого вируса, большая пакующая емкость и более высокая физическая стабильность вирионов CELO, чем Ад млекопитающих.

Способность аденовируса птиц CELO размножаться в куриных эмбрионах делает его привлекательным объектом для и;

I

¡пользования о кач&стй^^гоаа, так

Мое.-,, , -л.'. i <I

и,.. И. A, j^ Qq-n i} 1.1..„ ТТ

£

как это значительно повышает технологичность процесса получения препаративных количеств рекомбинантных вирусов CELO,

Результаты исследований, проведенных в ряде лабораторий мира, позволяют предположить что вектор на основе аденовируса CELO может быть многофункциональным и имеет хорошие перспективы использования для создания живых маркированных вакшш дая птицеводства, в качестве генно-инженерных субъеднничных вакцин для применения в ветернарин и медицине, а Также в генной терапии опухолей.

Цели м задачи исследования

Целью настоящей работы являлось разработка технологии конструирован ил векторов ш основе генома аденовирусов птиц CELO для доставки в клетки млекопитающих целевых генов и использование этой технологии для получения рекомбинантных аденовирусов CEI.О, содержащих гены рибозимов, направленных на ингибирование репродукции вируса гриппа А.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Разработать методику конструирования рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса нгиц С К LO, основанную на гомологичной рекомбинации фрагментов вирусного генома и клетках LMH.

2. Исследовать способность аденовирусного вектора CELO обеспечивать доставку и эффективную экспрессию репоргерньгх генов в клеточные культуры различного видового и тканевого происхождения, а также в клетки тканей лабораторных животных in vivo,

Ъ. Получить решмбинантные аденовирусы отиц CELO, несущие гены фуккци опально го и дефектного рибозимов, направленных на расщепление мРНК гена PBI вируса гршша Л, Исследовать экспрессию генов рибозтюв и их биологическую активность в культуре клеток.

Научная новизна и практическая значимость.

Мы впервые применили для получения рекомбинантных аденовирусов CELO метод гомологичной рекомбинации в культуре клеток, используемый для создания рекомбинантных Дд человека.

Впервые нами была показана транедукция рекомбинантцым аденовирусом гггиц CELO-GFP культур клеток человека линии HI299, НерЗВ и культур клеток животных лини» MDBK, MDCK, COSI, RAT2, В16.

При проведении экспериментов ш vivo впервые показано, что при введении рекомбннантного аденовируса CELO-GFP в хвостовую вену мыши экспрессии белка GFP наблюдалась в клетках печени; кроме того впервые показана транедукция клеток опухоли В16 мел а но мы у мыши при в куз р но лу х олевом введении рекомбинантного вируса CBLO-GFP.

Впервые получены рекомбннантные аденовирусы птиц CELO, несущие гены функционального и дефектного рибозимов, направленных на расщепление мРНК гена РВ1 вируса гриппа А, под контролем промотора цитомегаловируса человека. Показана экспрессия рпбозимов в клетках линии Д549, инфицированных полученными рекомбикзнтнымн аденовирусами, и ннгпбирование репродукции вируса гриппа Д в этой линии клеток.

Работа представляет не только научный, но и практический ннтсрес. Рекомбинантные аденовирусы CELO имеют хорошие перспективы использования в качестве живых или субъединичных рскомбннатных вакцин для ветеринарии (в первую очередь для птицеводства) и медицины.

При наращивании рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах одновременно происходит накапливание секретируемых продуктов экс пресс км целевых трансгеное в аллантоисной жидкости. После соответствующей очистки они могут быть использованы для создания диагностику мов, а также для вакцинации.

Весьма перспективно может оказаться применение этого вектора в генной терапии, особенно в генной терапии рака.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 18()

библиографических ссылок. Работа изложена на U5 машинописных страницах, включая 3 таблицы л 24 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. 1. Материалы и методы исследования.

В экспериментальной част» работы использованы вирус гриппа A/WSN/33, любезно предоставленный акад. АМН д.м.н. Кавериным Н.В. (Институт вирусологии, Москва, Россия), рекомбинантный аденовирус CELO-SEAP, любезно предоставленный Логуновым Д.Ю. (ВНИИСБ), аденовирус человека Ad5 - прототип:!ы¡i штамм, аденовирус птиц CELO штамм PELPS .

В работе использован лабораторный штамм Esheticfiia coli DHSa.

D работе использовал vi сь следующие клеточные линии: клетки линии CV-1 (фибробласты почки африканской зеленой мартышки) и линии MDCK (клетки ночки собаки) получении от К.м.н. Гродницкой H.A. (Институт вирусологии, Москва, Россия); клетки линии 293 (клетки эмбриональной почки человека, трансформированные Ad5), линии А549 (карцинома легкого человека) ч линии Н1299 (карцинома легкого человека) получены от к.б.н. Доронина К.К. (ВНИИСБ); клетки линии LMH (leghorn male hepatoma) были любезно предоставлены М. Corten (Австрия). Клетки опухоли В16 иеланомы были любезно предоставлены к.б.и. Казанским Д.Б. (Инстшут канцерогенеза, РАМН).

В работа использовались стандартные плазмндные векторы pGEM2, рОЕМЗ/(Г-) ("Promega"), р Кс/СМ V ("invitrogen"). Плазмиды pJM-I7 и pflCMVspl3 получены от Dr. F. Graham (McMasícr University, Hamilton, Канала). Илазмида pPBl получена от акад. АМН д,м.и. Каверина Н.В. (Институт вирусолог ии, Москва, Россия).

Синто дезокси о л и г ону кл еотидок проведен Кузубовым A.B. (ЗАО «СИНТОЛ»),

Трансфекшпо клеточных линий проводили методом кальций-фосфатной преципитации (Graham & van der Eb, 1973), Все манн пул я ни и, связанные с получением рекомбинаш-ных аде но в ирусов проводили согласно Graham & Prevec (¡991).

Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методикам, изложенным в Maniatis et al. (1982). Выделение РНК из культур клеток проводили но методу Chomczynski (1993), Реакцию обратной транскрипции РНК проводили с использованием AMV рсвертазы ("Promega").

Все манипуляции с вирусами финна А различных штаммов проводили согласно Darrel et al. (1988).

Аденовирусы человека накапливали в культуре клеток линии 293 но методике Green (1980). Аденовирусы птиц CELO накапливали в куриных эмбрионах (Laver et al. Í971). 2. Результаты исследований и их обсуждение,

2.1. Конструирование рскомбннантного аденовируса птиц CELO-GFP.

В настоящей работе мы описываем новую схему получения вектора на основе генома аденовируса птиц CELO (FAV-1), основанную на процессе гомологичной рекомбинации, которая происходит в клетке после одновременного введения в нее фрагмента генома вируса CELO (or 0 до 99,7 ед.к.), полученного в результате гидролиза вирусной ДНК рестриктаэой Swa I, и плазмиды, несущей участок вирусного генома (от S8,8 до 100 ед. к.) со вставкой чужеродного генетического материала. Этот способ получения рекомбинаитных аденовирусов применялся для создания векторов первого поколения на основе генома Ад человека. Преимуществом данного метода является отсутствие необходимости получения плазм на большого размера, несущих полный вирусный геном (более 43000 н.н.), работа с которыми сложна и трудоемка.

В качестве чужеродного материала для отработки технологии создания

рекомбинантных аденовирусов на основе генома вируса CELO исиользоваш

репортерный ген GFP (green fluorescent protein). Для создания плазмидной

конструкции, лесу шей ре портерный ich GFP в составе фрагмента генома

аденовируса CELO, нами была использована плазмида pCBEl, которая получил

ранее сотрудник лаборатории к.б.н. В.А. Кругляк (Кругляк и др., 1988). Она

содержит участок генома аденовируса CELO с 88,8 по 100 ед. карты. Как было

показано (Michou et al„ 1999), фрагмент генома с 95,3 но 99,7 ед. карты является

■'несущественным" для репликации вируса CELO в культуре клеток и куриных

S

эмбрионах, а удаление этого фрагмента увеличивает пакующую ёмкость вирусного вектора. Исходя ш этого, в плазмнде рСВЕ I была проведена деления по сайгам рестрикции EcoR V, и поручена плазмидная конструкция pCBEiRV, несущая правый фрагмент генома аденовируса CELO с делецией участка между 95,3 и 99,7 сд. карты.

В полученную плазм яду pCBEARV была клонирована зкспрессирующая кассета из pGRF.EN-La ("Clontech"), состоящая из CMV-промотора, гена GFP и сигнала полиаденнлирования (polyA) вируса SV-40. Клонирование проведено но сайту дслеции EcoR V фрагмента генома вируса CELO.

Таким образом, получена нлазмидная коиорушня pCBEGFP, несущая рспортерный ген GFP в составе фрагмента генома аденовируса птиц CELO. Для получения рекомбинантного аденовируса CELO, несущего ген GFP проводили котрансфекиию плазмидой pCBEGFP клеток линии LMH совместно с фрагментом генома вируса CELO от 0 до 99.7 ед. карты. Этот фрагмент был получен из ДНК CELO после ее гидролиза рестрикгазой Swa I. Процесс рекомбинации гомологичных участков геномной И илдзмидной ДНК в клетках приводил к генерации рекомбинантного вируса CELO-GFP, содержащего ген C5FP под котролем CMV промотора в области делецин «несущественного)) участка генома. (Рис. 1) При исследовании аденовирусных бляшек во флуоресцентном микроскопе наблюдалось свечение белка GFP в клетках, зараженных рекомбинантным вирусом CELO-GFP, в отличие от бляшек дикого типа вируса CELO, которые также образовывалась вследствие неполного гидролиза иди в»}трнклеточного лигирования геномной ДНК CELO,

Для устранения возможной контаминации препаратов CELO-GFP вирусом CELO дикого тана проведена очистка методом повторного получения индивидуальных аденовирусных бляшек на культуре клеток LMIL Для доказательства отсутствия контаминации очищенных препаратов CELO-GFP проведен анализ при помощи ПЦР с использованием двух пар прайм еров: первая пара (R1) комплиментарна участку гена GFP, вторая пара (D1) - участку делегированного EcoRV фрагмента генома CELO. Электрофореграмма результатов ПЦР прев еден а на рис. 2.

GFP

вьсклегше Аир\члюй

ДНК

i

Шед-К Лтрг

ГИДрОЛК!

Swal

1

Т

Sua!

КЮы.и ■1

pCVOMOl I felítl L>*M

es?

kOOc;i.K.

Рекочн'ишлпцын алииипнрус ш.о-u l>

* ^ )ÍC ^ Л

а№юй*|рус celo

Рис. 1. Схема получения рекомбннактного аденовируса CELO-GFP, нссушсго ре портерный ген GFP.

ЯШ - последовательность ДИК аденовируса птиц CELO; ед.к, - единицы карты аденовируса птиц CELO;

- последовательность гена GFP в составе экс пресс ирую щей кассеты, состоящей из CMV промотора и сигнала пол наделил и ровання;

- - последовательность плазмндного вектора;

Дтрг - ген устойчивости к ампициллину,

1

Г1 рай меры на ДНК Праймеры на ДНК CELO дикого типа (FL1) CELO-GFP (DI)

6 7 8

520 н.п.

¡37S н,л.

Рис. 2. Результаты ПЦР-аналнза препарата рекомбннантного вируса CELO-GFP с использованием праймеров R1 н D1.

Треки: 1,5- К(-) - отрицательный контроль ПЦР. 2,6- ДНК дикого типа вируса CELO. 3, 7 ДНК, выделенная из клеток, зараженных CELO-GFP, 4,8 - ДНК плазмиды pCBEGFP.

М - маркер мол. веса -ДНК фага X, гидролиз Hind Ш+EcoR I, Амплификация фрагмента ДНК размером 1378 н.п. в присутствии праймеров R1 происходит при наличии в пробе ДНК рекомбннантного аденовируса CE1.0-GFP, а фрагмент 520 н.п. синтезируется в присутствии праймеров D1 при наличии в пробе ДНК вируса CELO дикого типа.

2.2. Накопленной не рекомбннантного аденовируса CELO-GFP в куриных эмбриона!.

В результате проведенных исследований мы отработали оптимальные условия для нар рекомбинаптных аденовирусов CELO » куриных эмбрионах:

■ доза заражения - 107 БОЕ/эмбрион;

■ возраст эмбрионов - 10 суток;

■ время инкубирования после заражения - 2 суток.

При таких условиях наращивания рекомбннантного аденовируса CELO-GFP в куриных эмбрионах титр полученного вируса в аллантоисе составил в среднем БОЕ/мл. Количество вируса в концентрированных и очищенных в градиенте плотности CsCl препаратах составила 10п физических частиц в 1 мл. при титре 101' БОЕ/мл. Такое количество вируса удается получить из 50-60 эмбрионов. Себестоимость получения одной дозы препарата рекомбннантного

аденовируса птиц CELO (Ю13 физических частиц с титром 10м БОЕ/мл.) в курином эмбрионе в лабораторных условиях на порядок ниже, чем себестоимость получения такой же дозы рекомбинантного аденовируса человека в культуре клеток.

Использование ре портерного гена GFP для исследования свойств рекомбинангного аденовируса CELO-GFP позволило впервые визуально определить в каких клетках н тканях куриных эмбрионов происходит размножение вируса CFLO. Для этого были исследованы печень, селезенка, легкие, почки, мышцы и др. ткани куриных эмбрионов, зараженных вирусом CELO-GFP, в люминесцентном микроскопе. Па рис. 3 представлены результаты этих исследований, из которых следует, что размножение рекомбинангного аденовируса CELO-GFP происходило в клетках почечных канальцев и хорноал лаптопе ной мембраны, что согласуется с некоторыми данными опубликованными ранее о размножении дикого штамма вируса CELO в куриных эмбрионах. Причем, в ночках эмбрионов, зараженных CELO-GFP, наблюдался

УФ ti*minM:i УФ Фямтмй

Рис. 3. Экспрессия СРР в клетках куриных эмбрионов, зараженных рекомбннантным аденовирусом СЕЕО-СГР.

A. - Микрофотографии почечных канальцев куриных эмбрионов.

B. - Микрофотографии хориоаплантоисной мембраны куриных эмбрионов. К(-) - отрицательный контроль (ткани иезараженного куриного эмбриона); УФ - микрофотография в ультрафиолетовом свете (460нм);

Фазовый контраст - микрофотография в видимом свете.

некроз клеток почечных канальцев, в отличие от эмбрионов, зараженных диким типом вируса CELO. Предположительно, экспрессия белка GFP в больших количествах токсична ятя данных клеток. 2.3 Трансдукцня различных линии клеток млекопитающих рекомбннантным аденовирусом CELO-GFP.

Исследование способности рекомбинантного аденовируса CELO-GFP трансдуцировать клетки млекопитающих проводили на различных культурах клеток человека v. животных. Для сравнения проводили транедукцию рекомбинантным аденовирусом человека At!5-GFP, полученным ранее в лаборатории. На рис. 4 представлены фотографии трап еду цированных клеток 293 линии (клетки эмбриональной почки человека) и клеток Л549 (каршшома легкого человека), на рис. 5 - клеток Ш249 (карцинома легкого человека).

> '!• КОЯГГГраГТ V Ф ФамЫ1 MHirpKt

Рис. 4. Экспрессия СРР в клетках человека, транедуцированных рекомбинантным аденовирусом СЕЬО-СРР и рекомбинантным аденовирусом А<15-СРР,

A. - Мнкрофото1рафии клеток 293 линии.

B. - Микрофотографии клеток линии А549.

К(-) - отрицательный контроль (монослой нетранедуцированных клеток); УФ - микрофотография в ультрафиолетовом свете (460нм); Фазовый контраст - микрофотография в видимом свете,

УФ

Фазовый

KIIIH [>НС i

УФ

Фазовый ; . MMITpacT Д

Рис, 5,, Экспрессия GFP в клетках человека линии Н1299, трансяуцироаанных рекомбинангиым аденовирусом CELO-GFP и рекомбинаитньш аденовирусом Ad5-GFP.

К(-) - отрицательный контроль (монослой нетрансдуцнрован ных клеток); УФ - микрофотография в ультрафиолетовом свете (460нм); Фазовый контраст - микрофотография в видимом свете.

Результаты исследований показывают, что рекомбинатные вирусы CELO трансдуцируют клетки человека линии 293 и Л549 с эффективностью, сравнимой с эффективностью трап еду кии и Ad5-GFP.

Клетки человека линии H1299, а также клетки линий MDBK (почка КРС), MDCK (почка собаки), COSI (почка зеленой мартышки), RAT2 (фнброблаеты крысы), ПерЗВ (гепатома человека), ВЩмеланома мыши) (данные не приводятся) рекомбинантный аденовирус CELO-GFP транедуцирует

И

AtlMíFP AdS-Ci FP Ad5-G F f Л d5-G FP

H»il) F,OI7ii lu» ЬОГЛ.1. III KOFJhl i tor/nv

CELO-GFP CELO-GFP CELO-GFP.

1ГКИ1 БОРУк.1. lin KOF.'W.I. ta EGfJut.

значительно хуже, чем Ad5-GFP. Эффективность транедукции различных клеток рскомбнналткыми вирусами зависит ог наличия на мембране клеток первичных и вторичных рецепторов (CAR и интегринов) (Shayakhmetov, Papayannopoulou et al. 2000). Особенностью структуры капсида вирнона CELO является наличие двух фнберов различной длины, отходящих от одного основания пептона (Hess et al. 1995). Исследования роли каждого из двух фиберов вируса CELO при взаимодействии с клетками показали, что короткий фибер необходим для заражения вирусом CELO пермиссивных клеток птиц (LMH), а длинный фибер взаимодействует с тем же рецептором, что и Лд5 (CAR), при проникновения CELO в непермиссивные клетки млекопитающих (Tan et al., 2001), Следовательно, существует возможность модификации или замены длинного фкбера CELO на фиберы различных серотинов аденовирусов человека и животных, что позволит получать рскомбинантные аденовирусы CELO с повышенной эффекгнвностыо транедукции клеток млекопитающих. 2.4 Транедукции клеток млекопитающих рекомбинантиым аденовирусом CELO-GFP in vive.

Для успешного использования рекомбинантных аденовирусов в качестве эукариотических векторов необходимо исследовать их способность доставлять чежеродные гены в клетки организма in vivo. В нашей работе рекомбннаитные аденовирусы CELO, несущие рзпортерные гены GFP и SEAP, вводились мышам различными путями. Впервые показано, что при введении рекомбииантного аденовируса CELO-GFP в хвостовую вену мыши в дозе 10я БОЕ/мышь происходит транедукция клеток печени (рис. 6А). Для сравнения приводятся данные о транедукции клеток печени мыши при внутривенном введении вируса АдЭ-GFP в той же дозе.

Эш результаты позволяют говортъ о возможности доставки при помощи векторной системы на основе генома аденовируса CELO целевых генов в организм животных. Кроме того, была исследована возможность транедукции рекомбинантиым аденовирусом CELO-GFP клеток опухоли у мышей Fia модели подкожных аллотрансплаетатов опухоли В16 меланомы. Показано, (рис, 68) что

1Î

Рис. 6. Экспрессия GFP в тканях мышей, трансдуцнроеапнык рекомбинантиыми аденовируса ми CELO-GFP и AU5-GFP в дозе 10! БОЕ/мышь.

Л. - Микрофотографии клеток печени, D. - Микрофотографии клеток опухоли В] 6,

К(-) - отрицательный контроль (ткани нетрансдуцированной мыши); УФ - микрофотография в ультрафиолетовом свете (460нм); Фазовый контраст - микрофотография в видимом свете,

при внутриопухолевом введении вектора CELO-GFP (также как и при введении Aj5-GFP) в дозе t О4 БОЕ'опухоль происходила транедукция клеток опухоли.

Исходя из этих данных можно сделать вывод, что рекомбинанткые аденовирусы CELO могут быть использованы для доставки генов, применяемых в генной терапии рака.

Для исследования способности рекпмбинантных аденовирусов CELO транедуцнровать клетки воздухоносных путей, мы использовали вирус CELO-SEAP, несущий ген секретируемой шел очной фофефотазы. После и нтра назального введения рекомбннантного вируса мышам в дозе 10е БОЕ/мышь активность щелочной фосфотаэы была определена в сыворотки

крови и составила в среднем 5 мЕД/мл,, что свидетельствует о принципиальной возможности применения векторов на основе генома вируса CELO, несущих целевые гены для вакцинации человека и животных, и, как частный случай, для защиты организма от вируса гриппа при использовании рекомбилантных аденовирусов CELO с терапевтическими генами рибозимов. 2.5. Получение рекомбннантных аденовирусов, несущих гены рибозимов направленных против вируса гриппа А.

На следующем этапе работы мы исследовали векторную систему на основе генома аденовируса птиц CELO как средство доставки генов рибозимов в клегки человека для ингибированнн репродукции вируса гриппа Л.

В результате предварительной работы, проведенной в (Lazarev V.N., Shtnarov М.М. et al, 1999), были созданы искуственные гены функционального и дефектного рибозимов, направленных на специфическое расщепление мРНК гена РВ1 вируса гриппа А, который кодирует одну из субъединиц вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Этот белок участвует в процессах инициации и элонгации транскрипции генома вируса гриппа.

Ген РВ1 отличается высоким консерватизмом, что позволяет предположить, что сконструированный нами рибозим будет ингибировачь репродукцию широкого спектра штаммов вирусов гриппа А,

После тестирования специфической эндорибонуклеазнон активности функциональною рибозима по отношению к модельному субстрату и отсутствия активности дефектного рибозима in vitro было проведено исследования биологической активности рибозимов в линиях клеток CV-1, стабильно экс пресс иру ющне гены этих рибозимов (Lazarev V.N., Shmarov М.М. et al., 1999).

Одной из важнейших проблем при использовании рибозимов в качестве потеншшьных терапевтических агентов остается способ переноса гена рибозима в клетку для экспресик ím vivo. В качестве вектора для эндогенного перекоса генов рибозимов, направленных на подавление инфекции вируса гриппа А мы впервые предложили использовать новую векторную систему на

pMsh41

CMV pro 5' Rz 3' 5' Rz 3' "мишень" Amp7

88,8 сл.к.

95,3 ед.к.

99,7 ед.к. i 00 ед.к.

pMsh57

CMVjro 5' Rim 3'

poIyA .) ... . С^Я-П-

Amp'

88,S ед.к.

953 ед.к.

99,7 ед.к, 100 ед.к.

Рис. 7. Схемы рекомбинантных плазмнд, несущих гены рибозимов под контролем промотора шггомегаловнруса человека (CMV-pro) в составе фрагментов генома аденовируса человека Ad5.

Rz - ген функционального рибозима; R2iti - ген дефектного рибозима;

ро!у А - сигнал лолиаденилирования;

ШШШ - последовагельность ДНК аденовируса птиц CELO;

ед.к. - единицы карты генома аденовируса птиц CELO;

Ampr - ген устойчивости к ампициллину.

основе генома аденовируса птиц CELO и провели сравнение с векторной системой на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа.

Для получения рекомбинантных вирусов CELO гены функционального и дефектного рибозимов под контролем CMV промотора были клонированы в плазмидный вектор pCBEARV, несущий правый фрагмент генома аденовируса CELO с делецией участка между 95,3 и 99,7 ед. карты (рис, I)- Схемы полученных конструкций pMsh4l и pMsh57, несущих гены функционального и дефектного рибозимов соответственно, представлены на рис, 7. Рекомбннантные аденовирусы CEL04D-N и CEL04Dm, содержащих гены функционального и дефектного рибозимов соответственно, были получены по схеме аналогичной схеме получения аденовируса CELO-GFP, изображенной на рис. I.

Дтя устранения возможной контаминации препаратов CEL04D-N и CEL04Dm вирусом CELO дикого типа проведена очистка методом повторного

получения индивидуальных аденовирусных бляшек на культуре клеток LMH. Для детекции отсутствия контаминации очищенных препаратов рекомбинантных вирусов проведен анализ при помощи ПЦР с использованием праймеров, гомологичных как участков генов рибознмов, так н участку делегированного EcoR V фрагмента генома CELO.

Анализ экспрессии гена рибозима, направленного на специфическое расщепление мРНК гена РВ1 вируса гриппа А, а также гена дефектного рибозимя в составе генома рекомбинантных аденовирусов CEL04D-N и CEL04Dm проводили на клетках линии А$49. Через 24 часа после инфекции рекомбинантпыми аденовирусами при множественности инфекции 10 БОЕ/клетку, тотальная РНК была выделена из клеток и проанализирована методом ПЦР с обратной транскрипцией. При проведении анализа использовали две пары праймеров: первая пара (Mi) комплиментарна участку гена функционального рибозима, вторая пара (MI) - участку гена дефектного рибозима. Эдектрофореграмма продуктов реакции ОТ-ПЦР приведена на рис.8. Амплификация фрагмента ДНК размером ¡67 н.гг. в присутствии праймеров NJ происходит при наличии в пробе РНК функционального рибозима, а фрагмент 117 н.п. синтезируется а присутствии'праймеров М1 при наличии в пробе РНК дефектного рибозима.

Для получение дефектных рекомбинантных аденовирусов на основе

генома аденовируса человека 5-го серотипа с El областью, замещенной генами

рибознмов, сконструированы плаэмидные векторы, содержащие гены

функционального и дефектного рибознмов под контролем CMV промотора в

составе фрагментов генома аденовируса человека 5-го серотипа.

Методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток 293 линии после

котрансфекции этими векторами совместно с pJM17, которая содержит полный

геном делецпонного мутанта Ад5 <31309 с концами вирусной ДНК, замкнутыми

0/100% и вставкой плазмидной ДНК в El области, получены реком б инантн ы с

аденовирусы AÓ5CMV4D-N и Ad5CMV4Dm, несущие гены функционального и

дефектного рибознмов соответственно. (Рис. 9) Длина последовательности

плазм иды pJM 17 превышает пакующую емкость Ad вектора, поэтому при

16

I2345678M

Ш

Рнс. 8. Электрофоретический анализ продуктов реакции ОТ-ПЦР в присутствии пар лраймеров N1 и М1 тотальной РНК, выделенной нз инфицированных клеток линии А549, трансдуциронных рекомбииаитнымн аденовирусами CEL04D-N и CEL04Dm.

Треки:

1,4- кДНК из интанктной линии клеток А549 (отрицательный контроль). 3,6- кДНК из клетокА549, зараженных р екомби нантньщи аденовирусами CEL04D-N и CEL04Dm соответственно.

2, 5 - ДНК плазмид pMsh41 и pMsh57 соответственно (положительный контроль),

7, 8 - кДНК из клеток А549, зараженных вирусом CELO. 9 - маркер молекулярного веса ДНК pUCMix ('Fermentas").

использовании данной плазмиды вместо фрагментов генома при получении рекомбннантных аденовирусов, практически отсутствует фон вируса дикого типа.

Тестирование экспрессии генов рибозимов в составе генома ре комби нантных аденовирусов проводилась в клетках линии CV-1 после заражения в дозе 10 БО&хлетку при помощи Г1ЦР с обратной транскрипцией (Lazarev V.N., Shmarov М.М. et al, 1999).

2.6. Ингибнрованне репродукции вируса гриппа А в линии клеток А549, инфицированной рекомбннантнымн аденовирусами, зкспрессирующимн гены рибозимов,

Ингибирование репродукции вируса гриппа А в липни клеток Л549, инфицированной рекомбинантными аденовирусами, экспрессирующими гены рибозимов, проводили следующим образом. Клетки линии А549 заражали

трансферт я

V ^ О N

К7.

рекомбинации

[

—-

Рекочбннанткые аденовирусы Л<15СМУ40-М Аа5СМ\'4Ргп

1

293

* ** *

Рис. 9. Схема получения рекомбинантных аденовирусов Ай5СМУ40^ и А<15СМУ40т, несущих гены соответственно функционального и дефектного рибошмов.

М - последовательность ДНК аденовируса А<15; ед.к. — единицы карты аденовируса А(15;

ЯШ - последовательность гена рнбозима (Кг) в составе экспресс ирующей кассеты, состоящей из СМ\' промотора и сигнала лолиаденилирования; — ■ I - последовательность плазмидного вектора; Ашр'- ген устойчивости к ампициллину;

рекомбинантными аденовирусами CEL04D-N и CEL04Dm. Множественность инфекции составляла 100 БОЕ/клетку, Через 48 часов клетки су псринф и пировал и вирусом гриппа AAVSN/33 с множественностью инфекции 1 БОЕ/клетку. Через 8 часов после суперинфекции отобранной культуральной жидкостью инфицировали клетки линии MDCK. Уровень ингибирования ре проекции вируса гриппа AAVSN/33 определяли путем подсчета вирусных бляшек. Для сравнения использовали рекомбинантные аденовирусы Ad5CMV4D-N и Ad5CMV4Dm, несущие гены функционального и мутантного рибозимов соответственно. В клетках, инфицированных ре комби нантным аденовирусом CEL04D-N, уровень ингибирования составил 61.5 %, а в клетках, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CEL04Dm, экс премирующим ген дефектного рибознма - 29.3 %. Суммарные результаты эксперимента приведены в таблице Í,

Анализируя результаты определения уровня ингибирования репродукции вируса гриппа в клетках А549, предварительно зараженных рекомбинантными аденовирусами, несущими гены функционального и дефектног о рибозимов, направленные на специфическое расшепление мРШ гена РВ! вируса гриппа А, можно заключить следующее:

• ингибированис репродукции вируса гриппа происходило как в клетках зараженных рекомбнна|ггными аденовирусами на основе генома Ад5 человека, так и рекомбинантными аденовирусами на основе генома CELO;

• уровень иншбироваиня векторами па основе генома Ад5 человека несколько выше, чем при использовании рекомбинантов CELO;

• показан вклад "антисенс-эффекта" фланкирующих последовательностей рибознма при использований рекомбинантных аденовирусных векторов, экс премирующих гены дефектных рибозимов.

Дальнейшая работа по изучению возможности применения аденовирусных векторов на основе генома вируса птиц CELO для ингибирования ¡рнппошой инфехнии предполагается проводить на лабораторных животных - мышах.

Таблица,.!. Исследование ингибнрования репродукции вируса гриппа A/WSN/33 в линиях клеток А549, инфицированных реко мб и на нтны м и аденовирусами э кс пресен рук» щ н м и рнбознмы, направленные против мРНК гена РВ1 методом блишкообразования.

Рекомб и н антм ы е аденовирусы М ножествсн носи, инфекции Ингибированне репродукции вируса гриппа A/WSN/33

A45CMV4D-N 100 БОЕ/кл 82.6 ± 3,4%*

AdSCMV4Dm ЮОБОЕ/кл 44.1 ±2,4%

т Ad5 ЮОБОЕ/кл 1 11.8 ± 0,9%'

CEL04D-N 100 БОЕ/кл 61.5 ±2,7%

CEL04Dm 100 БОЕ/кл 29.3 ± 1,9%

CELO 100 БОЕ/кл 5.7 ±0,7%

' Проценты пне нбирования приведены но отношению к клеткам линии А549, зараженных вирусом гриппа, но не зараженных рскомбтшнтными аденовирусами.

Для увеличения трансдуцнрующей способности рекомбнпантных вирусов CELO возможна модификация длинного фибера, а также замена его на фиберы различных серотипов аденовирусов человека и животных,

В данной работе разработана методика получения первого поколения векторов на основе генома аденовируса тиц CELO. Такие рекомбинаишые аденовирусы CELO, несущие целевые гены, Moiyr быть использованы в качестве вакцин для ветеринарии. Для эффективного использования этих векторов в медицине (для генной терапии, вакцинации и т.д.) необходимо провести

¡0

модификацию аденовирусного генома с целью повышения безопасности при применении рекомбинантных аденовирусов CELO. Для этого рассматривается возможность удаление нескольких ранних генов, которые подобны генам El области аденовирусов человека, таких как антиаптотнческий ген СЛМ-1 и др. Показано, что вирусы CELO с удаленным геном GAM-1 способны размножаться в клетках LMH, если их подвергнуть тепловому шоку через 2 часа после инфекции, и в куриных эмбрионах (Glotzer et al., 2000).

В перспективе предполагается возможность создания минимального аденовирусного вектора CELO с удалением большинства вирусных генов для увеличения длительности экспрессии целевых генов и для увеличения пакующей емкости. Очевидно, что такие векторы потребуют использования специальных клеточных линий или будут выращиваться с вирусами-помощниками.

Приведенные выше результаты демонстрируют, что рекомбинантные аденовирусы птиц CELO способны транедуцировать широкий спектр клеток млекопитающих и птиц, как в культуре клеток, так и в организме лабораторных животных. Применение таких рекомбинантных аденовирусов в качестве профилактических и терапевтических средств (в том числе для терапии гриппа) имеет ряд преимуществ, по сравнению с векторами на основе генома Ад5, которые заключаются в следующем:

• в отсутствии предсущесгвующего иммунитета у человека и животных;

• в высокой технологичности наращивания препаративного количества рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах, которые являются хорошо изученной и безопасной системой для получения биологических препаратов в случае использования SPF эмбрионов;

• наличие двух фиберов позволяет модифицировать или заменить один т них, что позволит получать рекомбинантные аденовирусы CELO с измененной тропностью и повышенной эффективностью транедукции.

Рекомбинантные вирусы CELO, содержащие изолированные гены, кодирующие синтез протективных антигенов различных вирусов и бактерий, могут быть использованы для создания живых маркированных вакцин для

птицеводства, а также могу г быть использованы в качестве рекомбинантных субьединнчных вакцин для применения в ветернарии и медицине.

При наращивании рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах происходит накапливай не секретируемых продуктов экспрессии целевых трансгенов а аллантоисной жидкости. После соответствующей очистки они могут быть использованы для создания диагностику мок.

Векторы на основе генома аденовируса CELO так же имеют хорошие перспективы использования в генной терапии опухолей.

выводы.

1, Разработана методика получения рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса птиц CELO, основанная на гомологичной рекомбинации фрагментов вирусного генома в клетках LMH. Отработаны оптимальные условия получения препаративных количеств рекомбинанткого аденовируса птиц CELO в куриных эмбрионах. Инфекционный титр препаратов вируса после концентрирования и очистки составил 10м БОЕ/мл.

2, Получен набор рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, содержащих репортерный ген GFP, а также гены функционального и дефектного рибозимов, направленных на расщепление .мРНК генаРВ! вируса гриппа Л.

3, Впервые была показана трансакция рекомбинантным аденовирусом птиц CELO-GFP культур клеток человека линий HI299, НерЗВ и культур клеток животных линий MDBK, MDCK, COSI, RAT2, В16,

4, В экспериментах на лабораторных животных показано, что введение в хвостовую вену мыши рекомбинантного аденовируса CELO-GFP приводит к экспрессии гена GFP в клетках печени; впервые показана транедукцня клеток В1б мела: юмы у мышей при внутри опухолевом введении рекомбинантного вируса CELO-GFP.

5, Впервые показано ингибирование репродукции вируса гриппа А штамма A/WSN/3 3 в клетках линии А549, инфицированных реко.мбннаитным аденовирусом птиц CEL04D-N, экспресс ирую щи м ген рибозима, направленного на расщепление мРНК гена РВ1 вируса гриппа А. Уровень подавления репродукции вируса гриппа составил 61,5%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. М.М. Шмаров, Л.В. Черенова, Е.В. Шашкова, Д.Ю. Логунов, Л.В, Верховская, Л.В. Капитонов, Г.Л. I ley голова, К.К. Доронин, Б.С. Народицкий. Эу кар логические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO, несущие гены GFP и 1L-2 человека. И Молекулярная генетика, микробиолог}1Я н вирусология, 2002, v.- 2, pp.- 30-35.

2. V.N. Lazarev, М.М. Shmarov, A.N, Zakhartchouk, G.K.Yurov, O.U. Misurina, Т.Д. Akopian, N.F.Grinenko, N.G, Grodnitskaya, N.V.Kaverin, B.S. Naroditsky. Inhibition of influenza A virus reproduction by a ribozyme targeted against PB1 mRNA, // Antiviral Research, 1999, v.- 42(3), pp.-47-57.

3. V.N. Lazarev, M.M. Schmarov, A.N. Zakhartchouk, G.K. Yurov, O.U. Misyurina, B.S. Naroditsky, N.A. Grodnitskaya, N.V. Kaverin. Expression of ribozyme gene directed against mRNA gene PB1 of influenza virus A integrated in a defective recombinant adenovirus, // 6lh Symposium on Gene Therapy, May 4-6, 1998, Berlin-Bueh.

4. B.A. Лобанов, B.B. Борисов, A.B. Борисов, B.B, Дрыгин, А,А. Гусев, M.M Шмаров, T.A, Акопиан, Б.С. НародинкнП. Анализ последовательности гена гексона аденовируса KR95, вызывающего синдром перикардита у кур. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2000, v.-1, pp.- 30-36.

Отпечатано с готового оригинал-макета Объем J, S п. П._Зак .215_Тираж ¡СО

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 14