Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Векторная система на основе генома аденовируса птиц CELO для доставки и экспрессии гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Векторная система на основе генома аденовируса птиц CELO для доставки и экспрессии гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1"

российская академия сельскохозяйственных наук внии сельскохозяйственной биотехнологии

На правах рукописи

ШАШКОВА Елена Викторовна

векторная система на основе генома аденовируса птиц celo для доставки и экспрессии гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1

(специальность 03.00.03. - молекулярная биология)

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии эукариот ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, Доронин К.К.

доктор биологических наук, Карягина-Жулина A.C. доктор ветеринарных наук, Бел оу сова Р.В.

Ведущая организация - Институт канцерогенеза РАМН.

Защита диссертации состоится " "_2002 г. в_часов на

заседании Диссертационного Совета Д.006.02701 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: г, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42.,тел. 211-38-10, факс 977-09-47.

С диссертацией можно ознакомите - в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "__2ОС - ,

Ученый секретарь

Диссертационного Совета.

кандидат биологических наук

^/'Liblcf МелнковаС.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ,

Актуальность проблемы.

Одними из перспективных систем доставки, генетической информации в клетки млекопитающих являются вирусные векторы, которые используют для проникновения в клетку природный механизм вирусной инфекции. Наиболее изученными и эффективными вирусными векторами, обеспечивающими in vivo транзиентную экспрессию доставляемых генов, в настоящее время являются векторы на основе генома аденовируса человека типа 5 (Ад5). Данные векторы способны трансдуцировать различные типы клеток млекопитающих, включая как делящиеся, так и неделящиеся клетки.

В последние годы интенсивно изучается возможность создания векторных систем на основе генома аденовируса пгиц CELO (Mtchou A.i. et. al., 1999, Francois A. et. al., 2001, Glotzer J.B, étal., 2000, Шмаров M. и соавт., 2002). Интерес исследователей к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием свойств, позволяющих предположить возможность разработки эффективной эукариотической векторной системы на основе генома CELO. В организме человека и млекопитающих отсутствует предшествующий применению векторов иммунитет к Ад птиц CELO, что теоретически способно обеспечить продолжительную персистенцию экспрессии генов, доставляемых векторами CELO. Особенностью вируса CELO является способность к репликации в эмбрионах кур (Laver W.G. et. al., 1971). В отличие от трудоемких и относительно низкоэффектнвных методик накопления Ад5 в культуре клеток, наращивание векторов в эмбрионах кур является высокоэффективным процессом. Данная технология является привлекательной при получении векторов в препаративных количествах. Положительными характеристиками Ад CELO являются также большая пакующая емкость и повышенная ¿физическая стабильность -

вирионов по сравнению с вирионами Ад5 (Laver W.G. et. al., 1971; Cotten M. et. al., 1993).

В настоящее время показана возможность конструирования рекомбинантных Ад CELO. Определен регион геномной ДНК вируса CELO, удаление которого не оказывает влияния на способность CELO к репликации в культуре клеток гепатомы петуха леггорна LMH (Michou A.-I. et. al, 1999). Данные векторы на основе генома CELO представляют собой аналог недефектных по репликации векторов на основе Ад5 с делецией ЕЗ области и способны к репродукции в культуре клеток LMH и эмбрионах кур. Описаны также векторы с делецией раннего гена GAM-I. Репликация такого вектора CELO может быть комплементирована in trans экспрессией hsp40. (Glotzer J.B. et, al., 2000). Векторы с делецией гена длинного фибера CELO (Tan Р.К. et. al., 2001) сохраняют способность к репликации в клетках линии LMH и эмбрионах кур, что позволяет предположить возможность модификаций данного гена с целью изменения транедуцирующих свойств векторов на основе генома CELO. На настоящий момент в литературе отсутствуют данные о клеточных линиях, способных комплементировать делении генов CELO, необходимых для репликации вируса. S экспериментах in vitro показана функциональная активность рекомбинантных вирусов CELO, экс прессн рующих репортерные гены, В научной литературе отсутствуют данные по результатам использования векторов CELO для доставки терапевтических генов и определения их функциональной активности как in vivo, так и in vitro.

В нашей работе мы исследовали данную новую эукариотическую векторную систему для доставки и экспрессии терапевтического гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа î (HSV-tk) in vitro, s культурах клеток опухолей, и in vivo, в модели подкожных трансплантатов меланомы В16 мышам C57BL/6.

Полученные результаты позволяют сделать заключение о перспективности развития векторной системы на основе Ад птиц CELO. На основе векторов данного типа возможно получение рекомбинантных вакцин против инфекционных заболеваний человека и животных. Векторы CELO также способны найти широкое применение в генной терапии как альтернативный или дополнительный к Ад5 вектор.

Цели н задачи исследования.

Целью дзкной работы являлось конструирование секторов на основе Ад птиц CELO и Ад5 для доставки и экспрессии in vitro и in vivo терапевтического гена HSV-tk, а также репортеры ого гена EGFP, исследование экспрессии и функциональной активности продуктов экспрессии а культурах клеток млекопитающих, сравнение in vitro эффективности доставки и экспрессии HSV-tk векторами на основе CELO и Ад5, а также изучение функциональной активности полученных рекомбинантных Ад CELO ш vivo, на модели меланомы мышей В16.

Непосредственными задачами данной работы были:

1, Получение рекомбинантных Ад CELO, несущих гены HSV-tk и EGFP в сайте делешш 41731-43684 п.о, генома CELO под контролем промотора HCMV.

2, Исследование функциональной активности рекомбинантного Лд CELO, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, в культурах клеток опухолей.

3. Получение рекомбинантных Ад на основе генома Лд5, несущих гены HSV-tk и EGFP в сайте делецин El области генома Ад5 под контролем промотора HCMV.

4. Сравнение in vitro, в культурах клеток опухолей функциональной активности векторов на основе Ад CELO и Ад5, экспрессирующих ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.

5. Исследование in vivo, на модели подкожных трансплантатов меланомы мышей В16 функциональной активности рекомбинантного Ад CELO, экспрессиругощего ген HSV-lk под контролем промотора HCMV.

Научная новизна и практическая значимость.

В результате проведенной работы впервые получены данные о функциональной активности рекомбинантного Ад птиц CELO, экспрессиругощего терапевтический ген тимидинкшазы вируса простого герпеса человека типа 1 под контролем промотора HCMV, in vitro, в культурах клеток опухолей человека и мышей. Исследована эффективность системы HSV-tk/GCV в экспериментах in vitro с использованием вектора на основе генома CELO.

Впервые проведено in vitro, в культуре клеток аденокарциномы легкого человека HI299 сравнение цитотоксического действия векторных систем на основе геномов Ад птиц CELO и Ад человека типа 5, экспресс ирующих ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.

Впервые показан противоопухолевый эффект рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, in vivo, на модели подкожных трансплантатов меланомы мышей В i 6.

Полученные результаты демонстрируют возможность использования Ад птиц CELO в качестве средства доставки и экспрессии целевых генов в клетках млекопитающих как in vitro, так и in vivo, что подтверждает целесообразность дальнейшего изучения и развития векторной системы на основе генома CELO с целью применения в ветеринарии и сельском хозяйстве в качестве генно-инженерных вакцин, а также в генной терапии для создания рекомбинантных вирусов CELO, которые в перспективе могут быть использованы в терапии "и профилактике различных заболеваний человека, в том числе - онкологических.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на I и II молодежных научных конференциях "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", ВНИИСБ (Москва, 2001г., 2002г.), на 10-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, Россия, 2002). Результаты работы доложены и обсуждены на расширенном заседании лаборатории генной инженерии эукаркот ВНИИ СБ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 165 библиографических ссылок. Работа иллюстрирована 22 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Материалы и методы исследовании.

Плазмндные векторы. Для конструирования челночных плазмидных

векторов были проведены последовательные су б клонирования генов HSV-tk

и EGFP, Ndel-Sall фрагмент pGT60hTRAIL (In vi vogen, США), содержащий

ген HSV-tk, субклонировали в pBluescript II SK (Fermentas, Литва) используя

сайты Smal и EcoRV полилинкера. ВamHI-PstI-фрагмент полученной

плазмиды pBssk/TK, содержащий ген HSV-tk без дополнительных

инициаторных кодонов субклонировали s pBluescript II SK, используя сайты

' EcoRV и Pstl полнлинкера. Экспрессирующий вектор pRc/TK.

конструировали субклонированием Notí-Hincll фрагмента полученной на

предыдущем этапе плазмиды pBs/TK в Ара! н Notl сайты полилинкера

pRc/CMV (Invitrogen, США), Челночный шшимдный вектор pCBEARV/TK

получили субклонированием PvuII-BgHI-фрагмента pRc/TK, содержащим

экс пресс ирующую кассету, в сайт EcoRV в фрагменте генома CELO в

5

челночном векторе pCBEARV (содержащем фрагмент генома вируса CELO 88,8-100 ед.к. с делецией 1954 пар оснований по сайтам EcoRV (95,2-99,7 ед.к.)). PvuII-В gill-фрагмент pRc/TK субклонировали также в Bglll и EcoRV сайты полилинкера pAElsplA, содержащий левый концевой фрагмент генома Ад5 (0-16,1 ед.к.) сделецией El области (1-9,8 ед.к.) с полилинкером в сайте делеции, Таким образом был получен челночный ялазмидашй вектор pRW215.

Ген EGFP получили из pEGFP-1 (Cloníech, США), используя сайты Not! и EcoRV, и субклонировали в pcDNA3.1/Zeo(+) (In vi trogen, США) s аналогичные сайты полилинкера. Экспрессирующую кассету по сайтам BgHI и PvuII из полученного вектора pcEGFP, содержащую ген EGFP под контролем промотора HCMV, субклонировали в pCBE4RV, используя сайт EcoRV, а также в pÄElsplA - в Bglll и EcoR.V сайты полилинкера. Таким образом были получены челночные плазмидные векторы pRW325 и pRWll, соответственно.

Клонирования в плазмидных векторах проводили с использованием стандартных методик (Маниатис Т. и соавт., 1982; Holmes D.S., Quígley М.А., 1981; Hanahan D., 1983). В.работе использовали лабораторный штамм Е. coli DH5a. Плазмвда pCBE&RV была любезно предоставлена к.б.н. Шмаровым М.М. (ВНИИ СБ). Плазмида pAElspl А была любезно предоставлена F. Graham (McMaster University, Канада).

Клеточные лнкнн н трансакции. В работе использовали линии клеток: 293 (клетки эмбриональной почки человека, трансформированные El-областью Ад5), А549 и HI299 (клетки аденокарцином легкого человека), НерЗВ (клетки гепатоклеточной карциномы человека), LMH (клетки гепатомы петуха леггорна), любезно предоставленные М. Cotten (Institute for Molecular Pathology, Австрия) и В16 (клетки меланомы мышей), любезно предоставленные к.б.н. Казанским ДБ. (Институт канцерогенеза, РАМН).

Траисфекции культур клеток проводили методом кальциево-фосфатной преципитации (Graham F.L., Van der Eb A. J., 1973; Chen C„ Okayama H., 1987).

Аденовирусные векторы. В экспериментальной части работы были использованы Ад птиц CELO (штамм Phelps) и Ад вектор CELO-GFP, любезно предоставленный к.б.н. Шмаровым М.М, (ВНИИ СБ). Векторы на основе генома Ад человека типа 5 наращивали в клетках линии 293 (Green M., Wold W.S.M., 1980), Ад CELO - в SPF эмбрионах кур (Laver W.G. et. at., 1971).

Рекомбинантные Ад CELO-TK и CELO-EGFP получили методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH при котрансфекции геномной ДНК аденовируса CELO, обработанной эндонуклеазой рестрикции Swal, и плазмидными векторами pCBEARV/TK или pRW325, соответственно. Полученные векторы несут делецию 1954 и.о. области генома CELO по сайтам EcoRV (41731-43684 п.о.) и вставку экспрессирующих кассет в сайте делеции. Данные вирусные векторы способны к репродукции в культуре клеток LMH, а также - в эмбрионах кур. В культурах клеток млекопитающих вирусы CELO-TK и CELO-EGFP рсиликационко-дефектны.

Работа по получению Ад вектора CELO-EGFP проводилась совместно с Д. Ю. Логуновым (ВНИИ СБ).

Рекомбинантные Ад Ad5-EGFP и Ad5-TK получили по методике, описанной Graham F.L. и Prevec L. (1991) - котрансфекцией культуры клеток 293 плазмидными векторами pRWll или pRW215, соответственно, и шзазмндой pJM17 (любезно предоставленной F. Graham (McMaster University-, Канада), содержащей полный геном делециониого мутанта Ад5 dl309 с концами вирусной ДНК, замкнутыми 0/!00% и вставкой плазмидной ДНК в El области. Полученные вирусные векторы несут делецию El области генома Ад5 (1,0 - 9,8 ед.к.) и вставку экспрессирующей кассеты в сайте делеции. Данные вирусные векторы способны к репродукции в культуре

клеток 293, стабильно экспрессирующей El область Ад5 и комплементирующей функции El белков in trans.

Структуру геномов рекомб и нантных вирусов подтверждали гидролизом сайтспецифическими эндонуклеазами и методом полимеразной цепной реакции. Дезоксиолигонуклеотиды были синтезированы и любезно предоставлены ЗАО «СИНТОЛ», Россия.

Исследование цнтотокснчности. Исследование цитотоксичностн в экспериментах in vitro проводили с использованием МТТ-тесгга (Mossman Т., 1983). Использовали МТТ фирмы "ДиазМ" (Россия) и ганцикловир фирмы "F. Hoffman-La Roche Lid" (Швейцария).

Лабораторные животные и эксперименты in vivo. В работе были использованы иммунокомпетентные мыши линии C57BL/6, самки, 6-ти недельного возраста к началу экспериментов.

Для определения функциональной активности рекомбинантного Ад CELO-TK in vivo мышам подкожно инъецировали клетки сингатой меланомы В16 в количестве 1x10й клеток/инъекцию. Через 7 дней опухоли объемом -100 мм3 были инъецированы внутриопухолево буфером PBS (Sigma) или рекомбинантными вирусами CELO-TK или CELO-GFP (109 БОЕ/инъекцию). CsCl-содержащие препараты вирусов диализовали I час против 1л буфера PBS, содержащего ионы Ca2*" и Mg3+ (Sigma, США) перед проведением инъекций. Было произведено 10 инъекций по схеме: один раз в день с интервалом между инъекциями в 2 дня. Начиная со второго дня после первой инъекции половике мышей вводили внутрибрюшинно GCV в дозе 50 мг/кг/день в течение 30 последующих дней. Размер опухолей измеряли с интервалом в два дня и рассчитывали объем по формуле; длина (мм) х ширина1 (мм2) х 0,5 (Dethlefsen L.A. et. al., 1968). При достижении опухолями объема 2500 мм3 мышей умерщвляли. Все группы состояли из 9 мышей.

Данную работу проводили совместно с Л.В. Череновой (ВНИИСБ) и к.б.н. Д.Б, Казанским (Институт канцерогенеза, РАМН).

Статистический анализ. Для оценки статистической значимости результатов использовали критерий Стьюдента. Значимыми считали Р<0,05.

2. Результаты исследований и нх обсуждение.

2.1, Исследование функциональной активности рекомбинантиого Ад CELO-TK /я vitro, в культурах клеток опухолей человека и мышей.

В данной работе для изучения вируса CELO в качестве вектора для доставки и экспрессии терапевтических генов в клетках млекопитающих мы использовали ген HSV-tk. Продукты фосфорилирования белком HSV-tk нуклеозидных аналогов, таких как ганцикловир (GCV), в результате дальнейшего фосфорилирования клеточными киназами приобретают способность к встраиванию в ДНК, что приводит к ингнбированию ДНК-полимеразы и прекращению синтеза ДНК, в результате чего в клетке активируется механизм программируемой клеточной смерти - апоптоз. Способность HSV-tk вызывать апоптоз в присутствии GCV используется в исследованиях и клинических испытаниях терапии злокачественных опухолей (Anderson L.M. et al., 1999; Minemura К. et al., 2000; Todryk S. et al., 2001). Поскольку мишенями такой системы могут быть только делящиеся клетки, специфичность к опухолевым клеткам по сравнению с клетками нормальных тканей обуславливается их статусом наиболее активно делящихся популяций клеток в организме.

Нами был сконструирован рекомбинантный Ад CELO-TK, экспрессирующий ген HSV-tk под контролем промотора HCMV. Рекомбинантный Ад CELO-EGFP, экспрессирующий репортерный ген EGFP, был получен для использования в качестве контроля и детекции транедукции. Белок EGFP является мутационным вариантом белка GFP, в

Векторы на основе генома аденовируса птиц CELO

Сигнал «CMV.

пели-Д HSV-tk пишет«

CELO-TK о «як* CELO-EGFP

100 WA-K.

95,2 ОЦ.К. EOF I* 89,7 ед.к.

Векторы на оснояе генома аденовируса человека типа 5

Ad5-TK о «М.К. Ad5-EGFP

Сиги« HCMV-

mnwA HSV-tk

•»•«л- EQFP '-'

в,Я вял.

Рис. Схема геномов весторов на основе Ад CELO и Ад5, экспрессирующих гены HSV-tk н EGFP.

отличие от которого обладает улучшенными свойствами, облегчающими детекцию трансдуцированных вектором клеток. Схема геномов рекомбинантных Ад CELO представлена на рис. 1.

Для определения степени цитотоксич кости, проявляемой рекомбинантным Ад CELO-TK в присутствии GCV, мы использовали культуру клеток аденокарциномы легкого человека А549. Вирус CELO-TK способен трансдуцировать клетки данной линии и не способен в них к репликации. Клетки трансдуцировали вирусом CELO-TK с множественностью инфекции 100 БОЕ/клетку. Через сутки после инфекции в культурапьную среду добавляли GCV в различных концентрациях. Результаты эксперимента оценивали на день 7 с использованием M i l - теста (Рис, 2). Рекомбинантный Ад CELO-TK в присутствии GCV вызывал гибель 87-92% опухолевых клеток в зависимости от концентрации GCV. Данные результаты статистически достоверны с Р<0,05.

Рис. 2. Ингнбирование роста клеток линии А549 рекомбииаиткым вирусом CELO-TK при различных концентрациях ганцикловира (множественность инфекции 100 БОЕ/клетку).

Применение гена HSV-tk в исследованиях и клинических испытаниях в области генной терапии опухолей стало возможным благодаря способности системы HSV-tk/GCV проявлять так называемый "bystander" эффект ("эффект свидетеля"). "Bystander" эффект позволяет повысить эффективность противоопухолевой генной терапии, поскольку векторные системы не способны обеспечивать трансдукшио всех клеток опухолей in vivo. Данный эффект заключается в гибели не только клеток, экспрессируюших терапевтический ген, но также соседних с ними нетрансдуцированных

клеток. Система HSV-tk/GCY проявляет такой эффект и объясняется он несколькими процессами: распространением токсичных продуктов фосфор и лнрования GCV в опухолевой массе через щелевые межклеточные контакты, индукцией специфического противоопухолевого иммунитета, а также фагоцитозом апоптотических везикул, содержащих метаболиты GCV (Freeman S.M. et. al., 1993; Barba D. et. al., 1994; Melcher A. el. al., 1998; Rubsam L.Z. et. al., 1999).

Для изучения "bystander" эффекта, проявляемого системой CELO-TK/GCV, мы использовали культуры клеток аденокарцином легкого человека А549 и Н1299, гепатоклеточкой карциномы человека НерЗВ и меланомы мышей В16. Ад CELO не способен к репликации в данных клеточных культурах. Клетки трансдуциров&ти векторами CELO-TK или CELQ-GFP с множественностью инфекции 1000 БОЕ/клетку. Трансдуцированные клетки смешивали с нетрансдуцированными в соотношении 1:1 и рассевали. Через сутки в культуральную среду добавляли GCV (50 мкг/мл среды). Анализ цитотоксичноети проводили через 7 дней после инфекции с использованием МТТ-теста, Результаты эксперимента представлены на рис.3.

Ад CELO-TK в присутствии GCV вызывал гибель 92% клеток А549, 80% клеток HI299, 94% клеток НерЗВ и 64% клеток В16. Контрольные группы аналогичного эффекта не проявляли.

Полученные данные статистически достоверны с Р<0,05 и подтверждают функциональную активность in vitro и наличие "bystander" эффекта системы CELO-TK/GCV в исследованных линиях клеток опухолей.

2.2, Сравнение ш vitro цнтотоксичности системы HSV-tk/GCV мри использовании для доставки гена HSV-tk векторов на основе Ад CELO и Ад5.

Наиболее широко исследуемыми и охарактеризованными Ад векторными системами в настоящее время являются векторы на основе генома Ад5 человека. Использование таких векторов, экспрессируюших ген

12

А549

(аденокарцннома легкого человека)

HI 299

(аденокарцннома легкого человека)

& Л? А? S>

° 0s С«»',./

о*

ii i in

ш Ш 0 ■I—JHp—HL— i i >

с/

НерЗВ

(гепяггоклеточная карцинома человека)

BI6

(меланома мышей)

УУо^///

У

& &

Рис. 3. Ад CELO-TK проявляет "bystander" эффект в культурах клеток опухолей человека и мышей. Множественность инфекции эффекторов 1000 БОЕ/клетку. Соотношение эффектор;мишень = lit.

HSV-tk, показало противоопухолевый эффект в моделях опухолей мозга,

простаты, кишечника, меланомы и других (Vandier D, et, al., 2000; Nasu Y. et.

al., 2000; Wildner O., Morris J.C., 2000; Warten P. et. al, 2002). С целью

сравнения in vitro цитотоксического действия HSV-tk/GCV, проявляемого в

случае доставки гена в клетки опухолей векторной системой на основе Ад

птиц CELO с эффектом, достигаемым при использовании вектора на основе

Ад5 человека мы сконструировали рекомбинантные вирусы Ad5-TK и Ad5-

EGFP, экс премирующие гены HSV-tk и EGFP, соответственно. Схема

геномов данных векторов представлена на рис. 1. Для сравнения

функциональной активности рекомбинантного Ад CELO-TK с

функциональной активностью вектора Ad5-TK мы использовали культуру

клеток аденокарциномы легкого человека HI299. В клетках данной линии

как векторы CELO, так и векторы на основе генома Ад5 решжкационно-

дефектны. Клетки трансдуцировали векторами CELO-TK и Ad5-TK, а также -

используемыми в качестве контрольных - векторами CELO-EGFP и Ad5-

EGFP. Дня векторов на основе Ад5 использовали множественности инфекции

10 и 100 БОЕ/клетку, для векторов на основе CELO - 10, 100 и 1000

БОЕ/клетку. После адсорбции векторов трансдуцированные клетки

отмывали, трипсинизировали, смешивали с нетрансдуцированными клетками

в соотношении 1:1 и рассевали. Через сутки в культу рал ьную среду

добавляли GCV а количестве 50 мкг/мл среды. Анализ цитотоксичности

проводили через 6 дней после инфекции с использованием МТТ-теста

(Рис.4), Увеличение множественности инфекции приводило к увеличению

цитотоксичности как Ad5-TK/GCV, так и CELO-TK/GCV систем. При

множественности инфекции 10 БОЕ в группе Ad5-TK/GCV мы наблюдали

ингибирование роста клеток на 56% и на 38% в группе CELO-TK/GCV, при

множественности инфекции 100 БОЕ — на 77% и на 46%, соответственно.

При множественности инфекции 1000 БОЕ CELO-TK в присутствии GCV

вызывал ингибирование роста клеток на 65%. В контрольных группах как в

14

/ // О^/

сГ

■МОМО ■МОМОО □МОИ ООО ■ОСУ-

Б.

ЛГ а о

■МОИО+ОСУ ■ МОМОО+ССУ □МОМО(КЖЗСУ

■ОСУ+

Рис. 4. Сравнение цитотокснчностн систем СЕЬО-ТК/ССУ н А(15-ТК/ССУ & культуре клеток аден о кар ци ном ы легкого человека Н1299 при различных множественности* инфекции (день б после транедукцни). Соотношение эффектор:мишень = 1:1. (Л. - отсутствие ССУ в среде, Б. — 50 мкг/мл среды).

отсутствие, так и в присутствии GCV значительного ингибирования роста клеток не наблюдалось. Полученные результаты статистически достоверны с Р<0,05 и подтверждают полученные ранее с использованием репортерных генов данные, показавшие менее эффективный при равных множественностях инфекции уровень трансдукщш клеток млекопитающих векторами CELO по сравнен иго с векторами на основе генома Ад5, что предположительно объясняется пониженной по сравнению с Ад5 аффинностью длинного фибера CELO к первичному рецептору CAR (coxsackie adenovirus receptor) клеток млекопитающих (Tan Р.К. et. al., 200); Щмаров M. и соавт., 2002).

2.3. Исследование функциональной активности вируса CELO-TK in vivo, в модели опухоли мела номы мышеи В16.

Для изучения функциональной активности ре комби нантного Ад CELO-TK in vivo мы использовали модель опухоли меланомы В16. Возможность прививания данных опухолей иммунокомпетентным животным позволяет проявить иммунные реакции, индуцируемые системой HSV-tk/GCV, и тем самым наиболее полно оценить функциональную активность исследуемой векторной системы.

С целью определения способности Ад CELO к трансакции клеток опухоли BÍ6 in vivo иммунокомпетентным мышам линии C57BL/6 подкожно инъецировали I04 клеток данной меланомы. Через 14 дней в сформированные опухоли в течение трех дней вводили рекомбинантный вирус CELO-EGFP в дозе 109 БОЕ/инъекцию/день в объеме 100 мкл. В качестве отрицательного контроля использовали инъекции буфера PBS. На 5 день после первой инъекции вектора срезы опухолей исследовали флюоресцентным мнкроскопированием при длине волны УФ-излучения 490 нм. Вектор CELO-EGFP эффективно транедуцирует клетки меланомы мышей В16 in vivo, в области инъекции (Рис. 5).

CELO-EGFP БУФЕР

щшш

ШШ

шШшШШШ

Рис. 5. CELO-EGFP трансдуцирует клетки подкожных трансплантатов меланомы мышей В16.

Основываясь на полученных результатах по наличию цитотокснчности системы CELO-TK/GCV w vitro в культуре клеток В16 и способности вектора CELO , трансдуцировать клетки подкожных трансплантатов меланомы В16 in vivo, мы исследовали способность рекомбинантного Ад CELO-TK проявлять функциональную активность in vivo, в данной модели опухоли. Подкожные трансплантаты опухоли В16 размером -100 мм1 были инъецированы буфером PBS шш рекомбинантными вирусами CELO-TK или CELO-GFP (109 БОЕ/инъекцию). Мы наблюдали замедление роста опухолей в группе CELO-TK+GCV по сравнению с контрольными группами (Рис. 6). Данные статистически достоверны с Р<0,05. Полученные результаты показывают, что внутриопухолевые инъекции рекомбинантного вируса CELO-TK с последующим введением GCV оказывают супрессивное воздействие на рост меланомы В16 in vivo. Кроме этого, вирус CELO-TK в комбинации с GCV продлевал выживаемость мышей в данном эксперименте, тогда как в контрольных группах подобного эффекта не наблюдалось (Рис.7). Данные статистически достоверны с Р<0,05.

змо

Рис. 6, Внутрнопу холе вые инъекции CELO-TK в присутствии ганцнкловнра замедляют рост подкожных трансплантатов мела номы В16 /« vivo (день 9 после начала инъекции).

К настоящему времени в научной литературе отсутствуют данные, показывающие эффект использования векторов CELO, экс ирессирующих целевые гены, как в экспериментах in vitro, так и in vivo. В данной работе для определения способности вектора CELO, экспрессирующего ген HSV-tk, проявлять функциональную активность in vivo мы использовали модель опухолей меланомы мышей В16. Результаты, полученные нами in vitro, в культуре клеток В16, продемонстрировали наличие прямого токсического действия системы CELO-TK/GCV, а также "bystander" эффекта. Известно, что i« vm? HSV-tk/GCV - индуцируемый "bystander" эффект обычно неэффективен в тимэкгомированных мышах и оказывает временное ингибирующее действие, если не более 50% инъецированных опухолевых

Л, - CELO-GFP не оказывает влияния на выживаемость мышей.

Дни после начала проведения инъекций

Б. — CELO-TK в присутствии гаицикловира продлевает выживаемость мышей

Дни после начала проведения инъекций

Рис. 7. Внутрнопухолевые инъекции CELO-TK в присутствии GCV продлевают выживаемость животных в модели сингенных подкожных трансплантатов мела номы В16 мышам линии C57BL/6.

клеток экспрессируют гей HSV-tk (Freeman S.M. et. at, 1993; Colombo B3/t. et. al., 1995). В иммунокомпётентных мышах может наблюдаться полная регрессия опухоли даже в том случае если 10-20% клеток экспрессируют HSV-tk. При этом была продемонстрирована инфильтрация опухолей клетками иммунной системы (макрофагами, цитотоксическими лимфоцитами,Т-хелперами) (Gagandeep S. et. al., 1996). В данной работе мы

использовали им му некомпетентных животных, что обеспечивает возможность проявления системой CELO-TK/GCV иммунологического аспекта "bystander" эффекта. Такие условия позволяют наиболее полно охарактеризовать функциональную активность, проявляемую рекомбинантным Ад CELO-TK in vivo.

В наших экспериментах внутриопухолевьте инъекции вируса CELO-TK в присутствии GCV вызывали замедление роста сингенных подкожных трансплантатов опухоли меланомы В1б в иммунокомпетентных мышах линии C57BL/6. По сравнению с группой, получавшей инъекции буфера, на девятый день после начала инъекций средний объем опухолей в данной группе был снижен в 3,3 раза. В контрольных группах, трансдуцированных вирусом CELO-GFP, как в присутствии, так и в отсутствие GCV подобных эффектов мы не наблюдали. Относительно животных, инъецированных буфером, медиана выживаемости мышей в группе CELO-TK+GCV была увеличена в два раза. Полученные результаты свидетельствуют о проявлении рекомбинантным вирусом CELO-TK функциональной активности in vivo.

Для использованной в данной работе модели опухоли характерна

сложность получения положительных результатов при различных стратегиях

терапии. Одним из параметров, оказывающих влияние на успех

противоопухолевой терапии в модельных системах, является количество

опухолевых клеток, вводимых в организм лабораторного животного. Такое

влияние объясняется ограниченными способностями иммунной системы

осуществлять иммунологический надзор в организме и контролировать

пролиферацию клеток опухолей (Kelly J.M. et al., 2002). Другим важным

аспектом при использовании иммунокомпетентных животных является

имуногенность опухолей. Использованная в данной работе меланома В16

проявляет низкую иммуногенность (Srivastava Р., 2002). При использовании в

качестве . моделей более и мму ноге иных опухолей и использовании

уменьшенных доз опухолевых клеток, предположительно, возможно

20

достижение более выраженного терапевтического эффекта. Дня усиления противоопухолевого эффекта системы HSV-tk/GCV в настоящее время исследуют различные подходы. Было показано, что комбинации определенных генов проявляют синергизм в ингибировании опухолевого роста. Одновременное использование гена HSV-tk и генов цитокинов, таких как IL-2, IL-12, GM-CSF, приводит к индукции усиленного иммунного ответа lía клетки опухоли по сравнению с эффектом использования этих генов самостоятельно. Совместное использование гена HSV-tk с генами коннексинов также более эффективно ингибирует рост опухолей, что объясняется увеличением уровня межклеточных коммуникаций, приводящим к усилению "bystander" эффекта. Также описана комбинация использования системы HSV-tk/GCV с обработкой опухолей такими веществами, как гидроксимочевина и протеазы (Boucher P.D. et, а!., 2002; Kuriyama N. et. al., 2001).

Способность векторов на основе генома CELO проявлять функциональную активность в клетках млекопитающих in vivo указывает на перспективность изучения данной векторной системы. При этом актуальным является вопрос об онкогенности вируса CELO. Известно, что данный вирус способен вызывать образование опухолей у новорожденных хомяков (Sarma P.S. et. al,, 1965). Показано, что продукт ОРС-22 генома CELO связывет белок ретинобластомы pRb, а также белок рЗОО к по аналогии с подобными функциями Е1А Ад млекопитающих предполагается, что данный белок может обладать трансформирующей активностью (Lehrmann Н., М. Cotten. 1999). В организме взрослых млекопитающих индукции образования опухолей в результате инфекции вирусом CELO продемонстрировано не было. На настоящий момент неизвестно, способны ли векторы CELO с делецией 95,2-99,7 ед.к, генома вызывать опухоли у новорожденных хомяков. Исследование вопроса об онкогенности векторов на основе генома

2 Í

CELO не было целью данной работы, но является необходимым условием их практического использования.

На основании полученных в данной работе результатов можно сделать вывод о способности векторной системы на основе Ад птиц CELO в перспективе стать альтернативой существующим векторам на основе Ад млекопитающих. Кроме этого, возможно использование векторов CELO дополнительно к векторам на основе Ад млекопитающих. Последовательное применение таких векторов предположительно способно повысить уровень и продолжительность экспрессии доставляемого гена (Morral N, et. al„ 1999). Наличие двух фиберов различной длины в каждой вершине вириона CELO и возможность удаления гена длинного фибера, не лишающая вирус CELO способности к репликации в культуре клеток и эмбрионах кур (Tan Р.К. et, af,, 2001), предполагает возможность осуществления замены или модификации данного фибера с целью улучшения трансдуцирующих свойств векторов на основе CELO,

Теоретически, на основе вируса CELO возможно получение так называемых "минимальных" векторов, из геномов которых удалены все вирусные гены. "Минимальные" векторы CELO предположительно способны упаковать до 46000 п.о. генетической информации. Высокотехнологичный и недорогой способ получения препаратов векторов CELO в эмбрионах кур (до 1013 физических частиц/эмбрион) представляет собой важное практическое преимущество данной векторной системы по сравнению с вирусными векторами, для наращивания которых используют культуры клеток.

Предположительно, исследуемая нами векторная система на основе генома Ад птиц CELO способна в будущем найти широкое применение в генной терапии заболеваний человека, а также для получения рекомбинантных вакцин против инфекционных заболеваний человека и животных.

ВЫВОДЫ:

1. Получены рекомбинантные Ад CELO, несущие под контролем промотора HCMV гены HSV-tk и EGFP В сайте делении 41731-43684 п.о. области генома CELO, несущественной для репликации вируса CELO в культуре клеток LMH и куриных эмбрионах.

2. Впервые исследована функциональная активность рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV в культурах клеток аденокарцином легкого человека А549 и Hi299, гепагоклеточной карциномы человека НерЗВ и меланомы мышей В1б, Впервые показано наличие "bystander" эффекта системы CELO-TK7GCV в исследованных линиях клеток опухолей.

3. Получены рекомбинантные Ад на основе генома Ад человека типа 5, несущие гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции El области генома Ад5 под контролем промотора HCMV.

4. Впервые исследована in vitro функциональная активность рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, е сравнении с функциональной активностью векторной системы на основе Ад5. Показано, что при высоких множественностях инфекции эффективность использования вектора CELO сравнима с эффективностью вектора на основе Ад5.

5. Исследована in vivo функциональная активность рекомбинантного Ад птиц CELO, экспрессирующего репортерный ген EGFP под контролем промотора HCMV, на модели меланомы мышей В16.

6. In vivo, на модели сингенных подкожных трансплантатов меланомы мышей BI6 впервые исследована функциональная активность рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, Показана противоопухолевая активность Ад вектора CELO-TK, замедление роста опухолей и увеличение периода выживаемости мышей.

Список работ« опубликованных по теме диссертации.

1. Черенова Л.В., М.М. Шмаров, Н.В. Шашкова, Д.Ю. Логунов, Разработка технологии получения, рекомбинантных аденовирусов на основе аденовируса птиц CELO, несущих целевые гены.// Материалы I молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", ВНИИСБ, Москва,27 марта,2001, стр.б-7.

2. Шашкова Е.В. Функциональная активность вектора CELO, экспрессирутощего ген тимилинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1. // Материалы II молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", ВНИИСБ, Москва, 11 апреля, 2002, стр. 9-10.

3. Черенова Л.В., Шашкова Е.В., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М. Генная терапия рака векторами на основе генома аденовируса птиц CELO, ti 10-я Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 2631 мая, 2002, Санкт-Петербург.

4. Шмаров М.М., Л.В, Черенова, Е.В. Шашкова, Д.Ю. Логунов, Л.В. Верховская, A.B. Капитонов, Г.Л, Неугодова, К.К. Доронин, Б.С. Народицкий. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO, несущие гены GFP и IL-2 человека. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2002, №2, стр. 30-35,

5. Логунов Д.Ю., Л.В. Черенова, М.М. Шмаров, Е.В, Шашкова, Л.В. Верховская, К.К. Доронин, Б.С, Цародицкий, In vitro и in vivo доставка гена секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (SEAP) в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO, Н Молекулярная генетика, микробиология и вирусолога я, 2002, №4, стр. 34-39.

гл

Отпечатано с готового оригинал-макета

Объем /> ff Я А_Зак, НЗЬ_Тираж WO

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шашкова, Елена Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Векторные системы на основе геномов аденовирусов.

1.1.1. Строение и экспрессия генома аденовируса человека типа 5.

1.1.2. Векторы на основе геномов аденовирусов человека.

1.1.3. Особенности строения генома аденовируса птиц CELO в сравнении с геномом аденовируса человека типа 5.

1.1.4. Особенности векторных систем на основе генома аденовируса птиц CELO.

1.2. Экспрессия гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1 в составе геномов аденовирусных векторов.

1.2.1. Функциональная активность HSV-tk.

1.2.2. "Bystander" - эффект системы HSV-tk/GCV.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Ферменты и другие реактивы.

2.1.5. Лабораторные животные.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.

2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами.

2.2.4. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.5. Разделение фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция ДНК из геля.

2.2.7. Трансформация клеток Е. coli.

2.2.8. Идентификация рекомбинантных клонов.

2.2.9. Трансфекция культур клеток методом кальциево-фосфатной преципитации.

2.2.10. Котрансфекция клеток линии LMH для получения рекомбинантных аденовирусов CELO.

2.2.11. Котрансфекция клеток линии 293 для получения рекомбинантных аденовирусов на основе генома Ад5.

2.2.12. Накопление вирусов.

2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов CELO.

2.2.14. Выделение вирусной ДНК.

2.2.15. Выделение ДНК из клеток, инфицированных аденовирусами.

2.2.16. Титрование вирусов.

2.2.17. Дезоксиолигонуклеотиды и полимеразная цепная реакция.

2.2.18. Количественное определение цитотоксичности в экспериментах in vitro.

2.2.19. Определение функциональной активности CELO-TK in vivo.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов CELO, экспрессирующих репортерный ген EGFP и терапевтический ген HSV-tk. .56 3.1.1. Конструирование челночного плазмидного вектора, несущего экспрессирующую кассету с геном HSV-tk в фрагменте генома Ад CELO.

3.1.2. Конструирование челночного плазмидного вектора, несущего экспрессирующую кассету с геном EGFP в фрагменте генома Ад CELO.

3.1.3. Изучение экспрессии гена HSV-tk в составе плазмидного вектора pCBEARV/TK при трансфекции культур клеток 293 и LMH.

3.1.4. Получение рекомбинантных Ад CELO, несущих гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции фрагмента генома, несущественного для репликации вируса CELO в культуре клеток LMH.

3.2. Исследование функциональной активности рекомбинантного Ад CELO-ТК в экспериментах in vitro.

3.2.1. Исследование цитотоксичности рекомбинантного вируса CELO-TK в культуре клеток А549.

3.2.2. Исследование способности Ад CELO-TK проявлять "bystander" эффект.

3.2.3. Сравнение in vitro функциональной активности CELO-TK/GCV и Ad5-TK/GCV.

3.2.3.1. Конструирование рекомбинантных вирусов АдЗ-EGFP и Ад5-ТК на основе генома Ад5 человека.

3.2.3.2. Сравнение in vitro цитотоксичности системы HSV-tk/GCV при использовании для доставки гена HSV-tk векторов на основе Ад CELO и Ад5.

3.3. Исследование функциональной активности вируса CELO-TK in vivo, в модели опухоли меланомы мышей В16.

3.3.1. In vivo трансдукция векторной системой на основе генома Ад CELO подкожных опухолей меланомы мышей В16.

3.3.2. Влияние внутриопухолевых инъекций рекомбинантного Ад CELO-TK на рост опухолей меланомы В16.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Векторная система на основе генома аденовируса птиц CELO для доставки и экспрессии гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1"

1. Актуальность проблемы.

Векторные системы на основе геномов аденовирусов (Ад) позволяют эффективно доставлять генетическую информацию в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. Наиболее изучены в настоящее время векторы на основе генома Ад человека типа 5 (Ад5), возможность применения которых в ветеринарии, сельском хозяйстве и генной терапии интенсивно исследуется. Показаны положительные результаты опосредованной Ад векторами доставки целевых генов в клетки с целью терапии и профилактики различных заболеваний человека и животных. Накоплены экспериментальные данные о свойствах векторов на основе генома Ад5, влияющих на эффективность их использования. Наиболее значительным препятствием для практического использования данных векторов является высокая иммуногенность таких векторов в организме млекопитающих, что приводит к элиминации векторных частиц и трансдуцированных клеток. Результатом является снижение продолжительности экспрессии доставляемых генов, что оказывает негативное влияние на проявляемый в результате экспрессии гена исследуемый эффект.

В настоящее время изучается возможность создания новых альтернативных вирусных эукариотических векторных систем. Одним из новых векторов для доставки генов в клетки млекопитающих in vivo является Ад птиц CELO (FAV-1). Интерес к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием свойств, позволяющих предположить возможность разработки эффективной эукариотической векторной системы на его основе. Поскольку Ад CELO является вирусом птиц, в организме млекопитающих отсутствует предшествующий применению вектора иммунитет к данному вирусу, что предположительно может способствовать увеличению продолжительности экспрессии трансгена в организме млекопитающих в случае его доставки с помощью вектора CELO. Последовательное применение векторов на основе Ад5 и CELO также способно увеличить продолжительность экспрессии доставляемого гена вследствие смены векторной системы. Кроме этого, Ад CELO не способен к репликации в клетках млекопитающих, то есть является по отношению к таким клеткам естественно дефектным. Значительным практическим достоинством векторов CELO является способность к репродукции в куриных эмбрионах. Накопление препаративных количеств векторов в эмбрионах кур эффективнее, технологичнее и экономически выгоднее, чем в культурах клеток, которые используют для получения векторов на основе геномов Ад млекопитающих.

Данные литературы показывают возможность получения рекомбинантных вирусов CELO, экспрессирующих встроенные репортерные гены in vitro и in vivo. Изучение структурно-функциональной организации генома Ад CELO продемонстрировало наличие областей, несущественных для репликации вируса в культуре клеток гепатомы петуха леггорна LMH, представляющие собой потенциальные сайты встраивания трансгенов. Интересной особенностью вируса CELO является наличие двух фиберов различной длины в каждой вершине вириона. Было показано, что удаление длинного фибера не лишает вирус CELO способности к репликации в эмбрионах кур, что предполагает возможность осуществления замены или модификации данного фибера с целью дополнительного улучшения характеристик векторов на основе CELO.

Накопленные данные позволяют сделать заключение о перспективности развития векторной системы на основе Ад птиц CELO. На основе таких векторов возможно получение рекомбинантных вакцин против инфекционных заболеваний человека и животных. Векторы CELO также способны найти широкое применение в генной терапии как альтернативный или дополнительный к Ад5 вектор.

2. Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлось конструирование векторов на основе Ад птиц CELO и Ад5 для доставки и экспрессии in vitro и in vivo терапевтического гена HSV-tk, а также репортерного гена EGFP, исследование экспрессии и функциональной активности продуктов экспрессии в культурах клеток млекопитающих, сравнение эффективности доставки и экспрессии HSV-tk векторами на основе CELO и Ад5, а также изучение функциональной активности полученных рекомбинантных Ад CELO in vivo, на модели опухоли меланомы мышей В16.

Непосредственными задачами данной работы были:

1. Получение рекомбинантных Ад CELO, несущих гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции 41731-43684 п.о. генома CELO под контролем промотора HCMV.

2. Исследование функциональной активности рекомбинантного Ад CELO, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, в культурах опухолевых клеток.

3. Получение рекомбинантных Ад на основе генома Ад5, несущих гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции Е1 области генома Ад5 под контролем промотора HCMV.

4. Сравнение in vitro, в культурах клеток опухолей функциональной активности векторов на основе Ад CELO и Ад5, экспрессирующих ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.

5. Исследование in vivo, на модели подкожных трансплантатов меланомы мышей В16 функциональной активности рекомбинантного Ад CELO, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.

3. Научная новизна и практическая значимость.

В результате проведенной работы впервые получены данные о функциональной активности рекомбинантного Ад птиц CELO, экспрессирующего терапевтический ген тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1 под контролем промотора HCMV, in vitro, в культурах клеток опухолей человека и мышей. Исследована эффективность системы HSV-tk/GCV в экспериментах in vitro с использованием вектора CELO.

Впервые проведено in vitro, в культуре клеток аденокарциномы легкого человека HI299 сравнение цитотоксического действия векторных систем на основе геномов Ад птиц CELO и Ад человека типа 5, экспрессирующих ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.

Впервые показан противоопухолевый эффект рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, in vivo, на модели подкожных трансплантатов меланомы мышей В16.

Полученные результаты демонстрируют возможность использования Ад птиц CELO в качестве средства доставки и экспрессии целевых генов в клетках млекопитающих как in vitro, так и in vivo. Это подтверждает целесообразность дальнейшего изучения и развития векторной системы на основе генома CELO с целью применения в ветеринарии и сельском хозяйстве в качестве генно-инженерных вакцин, а также в генной терапии для создания рекомбинантных вирусов CELO, которые в перспективе могут быть использованы в терапии и профилактике различных заболеваний человека, в том числе - онкологических.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шашкова, Елена Викторовна

ВЫВОДЫ:

1. Получены рекомбинантные Ад CELO, несущие под контролем промотора HCMV гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции 41731-43684 п.о. области генома CELO, несущественной для репликации вируса CELO в культуре клеток LMH и куриных эмбрионах.

2. Впервые исследована функциональная активность рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV в культурах клеток аденокарцином легкого человека А549 и HI299, гепатоклеточной карциномы человека НерЗВ и меланомы мышей В16. Впервые показано наличие "bystander" эффекта системы CELO-TK/GCV в исследованных линиях клеток опухолей.

3. Получены рекомбинантные Ад на основе генома Ад человека типа 5, несущие гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции Е1 области генома Ад5 под контролем промотора HCMV.

4. Впервые исследована in vitro функциональная активность рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, в сравнении с функциональной активностью векторной системы на основе Ад5. Показано, что при высоких множественностях инфекции эффективность использования вектора CELO сравнима с эффективностью вектора на основе Ад5.

5. Исследована in vivo функциональная активность рекомбинантного Ад птиц CELO, экспрессирующего репортерный ген EGFP под контролем промотора HCMV, на модели меланомы мышей В16.

6. In vivo, на модели сингенных подкожных трансплантатов меланомы мышей В16 впервые исследована функциональная активность рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV. Показана противоопухолевая активность

Ад вектора CELO-TK, замедление роста опухолей и увеличение периода выживаемости мышей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шашкова, Елена Викторовна, Москва

1. Акопян Т.А., Каверина Е.Н., Народицкий Б.С., Тихоненко Т.И. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента (92-100%) генома аденовируса птиц CELO. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология., 1992, №11-12, стр. 19-23.

2. Грин М. Трансформация и онкогенез, ДНК-содержащие вирусы. // "Вирусология" ред.Филдс, "Мир", 1989.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. // М., "Мир", 1982.

4. Струк. Инфекционные вирусы и канцерогенез. // Киев, "Наукова думка", 1987.

5. Фомина Н.В. Аденовирусная инфекция животных. // М., "Колос", 1995.

6. Хорвиц М.С. Аденовирусы и их репликация. // "Вирусология" ред.Филдс, "Мир", 1989.

7. Akopian Т.А., Kruglyak V.A., Rivkina M.V., Naroditsky B.S., Tikhonenko T.I. Sequence of the avian adenovirus CELO DNA fragment (0-12%). // Nucleic Acid Research., 1990, v.-18: 2825.

8. Akopian T.A., Lazareva S.E., Tikhomirov E.E., Karpov V.A., Naroditsky B.S. Genes for fowl adenovirus CELO penton base and core polypeptides. // Arch. Virol., 1996a, V.-141, pp-357-365.

9. Akopian T.A., Doronin K.K., Karpov V.A., Naroditsky B.S. Sequence of the avian adenovirus FAV 1 (CELO) DNA encoding the hexon-associated protein pVI and hexon. // Arch. Virol., 1996b, V.-141, pp.-1759-1765.

10. Alam J., Cook J.L. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. // Anal. Biochem., 1990, v.-188, pp.-245-254.

11. Alavi J.B., Eck S.L. Gene therapy for high grade gliomas. // Expert. Opin. Biol. Ther., 2001, v.-l, pp.-239-252

12. Anderson L.M., Swaminathan S., Zackon I., Tajuddin A.K., Thimmapaya В., Weitzman S.A. Adenovirus-mediated tissue-targeted expression of the HSVtk gene for the treatment of breast cancer. // Gene Ther., 1999, v.-6, pp.-854-64.

13. Barba D., Hardin J., Sadelain M., and Gage F.H. Development of anti-tumor immunity following thymidine kinase-mediated killing of experimentalbrain tumors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v.-91, pp.-4348-4352.

14. Beltinger C., S. Fulda, T. Kammertoens, W. Uckert and K.M. Debatin Mitochondrial amplification of death signals determines thymidine kinase / ganciclovir-triggered activation of apoptosis. // Cancer Res., 2000, v.-60, pp.-3212-3217.

15. Bennett M.V., Barrio L.C., Bargiello T.A., Spray D.C., Hertzberg E., Saez J.C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. // Neuron., 1991, v.-6, pp.-305-320.

16. Bergelson J.M., Cunningham J.A., Droguett G., Kurt-Jones E.A., Krithivas A., Hong J.S., Horwitz M.S., Crowell R.L., Finberg R.W. Isolation og a common receptor for coxsackie В viruses and adenoviruses 2 and 5. // Science, 1997, v.-286, pp.-1579-1583.

17. Bett A.J., Haddara W., Prevec L., Graham F.L. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, v.-91, pp.-8802-8806.

18. Boucher P.D., Ostruszka L.J., Murphy P.J., Shewach D.S. Hydroxyurea significantly enhances tumor growth delay in vivo with herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy. // Gene Ther., 2002, v.-9, pp.-1023-1030.

19. Bouri K., Feero W.G., Myerburg M.M., Wickham T.J., Kovesdi I., Hoffman E.P., Clemens P.R. Polylysine modification of adenoviral fiber protein enhances muscle cell transduction. // Hum. Gene Ther., 1999, v.-Ю, pp.-1633-1640.

20. Bruder J.T., Jie Т., McVey D.L., Kovesdi I. Expression of gpl9K increases the persistence of transgene expression from an adenovirus vector in the mouse lung and liver. // J. Virol., 1997, v.-71, pp.-7623-7628.

21. Cai F., Weber J. Organization of the avian adenovirus genome and the structure of its endopeptidase. // Virology., 1993, V.-196, pp.-358-362.

22. Chen C., Okayama N. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. // Mol. Cell. Biol., 1987, v.-7, pp.-2745-2752.

23. Chiocca S., Baker A., Cotten M. Identification of a novel antiapoptotic protein, GAM-1, encoded by the CELO adenovirus.// J. Virol., 1997, v.-71, pp.-3168-3177.

24. Chiocca S., Kurtev V., Colombo R., Boggio R., Sciurpi M.T., Brosch G., Seiser C., Draetta G.F., Cotten M. Histone deacetylase 1 inactivation by an adenovirus early gene product. // Curr. Biol., 2002, v.-12, pp.-594-598.

25. Chiocca S., Kurzbauer R., Schaffner G., Baker A., Mautner V., Cotten M. The complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO. //J. Virol., 1996, v.-70(5), pp.-2939-2949.

26. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). // Gene., 1996, V.-173, pp.-33-8.

27. Cotten M., Wagner E., Zatloukal K., Birnstiel M.L. Chicken adenovirus (CELO virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants. // J. Virol., 1993, v.-67, pp.-3777-3785.

28. Cowen В., Calnek B.W., Menendez N.A., Ball R.F. Avian adenoviruses: effect on egg production, shell quality, and feed consumption. // Avian Dis., 1978, v.-22, pp.-459-470.

29. Cruciani V., Kaalhus O., Mikalsen S.O. Phosphatases involved in modulation of gap junctional intercellular communication and dephosphorylation of connexin43 in hamster fibroblasts: 2B or not 2B? // Exp. Cell Res., 1999, v.-252(2), pp.-449-463.

30. Degreve В., E. De Clercq and J. Balzarini Bystander effect of purine nucleoside analogues in HSV-ltk suicide gene therapy is superior to that of pyrimidine nucleoside analogues.// Gene Therapy, 1999, v.-6, pp.-162-170.

31. DeMatteo R.P., Markmann J.F., Kozarsky K.F., Barker C.F., Raper S.E. Prolongation of adenoviral transgene expression in mouse liver by T lymphocyte subset depletion. // Gene Ther., 1996, v.-3(l), pp.-4-12.

32. Dermietzel R., Spray D.C. Gap junctions in the brain: where, what type, how many and why? // Trends Neurosci., 1993, v.-16, pp.-186-192.

33. Dethlefsen L.A., Prewitt J.M. and Mendelsohn M.L. Analysis of tumor growth curves J. Natl. Cancer Inst., 40: 389-405, 1968.

34. Dhillon A.S., Jack O.K. The oncogenic potential of eleven avian adenovirus strains. // Avian Dis., 1997, v.-41, pp.-247-251.

35. Dilber M.S., Abedi M.R., Christensson В., Bjorkstrand В., Kidder G.M., Naus C.C.G., Gahrton G., and Smith C.I. Gap junction promote the bystander effect of herpes simplex virus thymidine kinase in vivo. // Cancer Res., 1997, v.-57, pp.-1523-1528.

36. Doronin K., Kuppuswamy M., Toth K., Tollefson A.E., Krajcsi P., Krougliak V., Wold W.S. Tissue-specific, tumor-selective, replication-competent adenovirus vector for cancer gene therapy. // J. Virol., 2001, v.-75, pp.-3314-3324.

37. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. //Nature., 1998, v.-391(6662), pp.-43-50.

38. Engelhardt J.F., Ye X., Doranz В., Wilson J.M. Ablation of E2A in recombinant adenoviruses improves transgene persistence and decreases inflammatory response in mouse liver. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, v.-91, pp.-6196-6200.

39. Esandi M.C., Van Someren G.D., Vincent A.J.P.E., Van Bekkum D.M., Valerio D., Bout A., and Noteboom J.L. Gene therapy of experimental malignant mesothelioma using adenovirus vectors encoding the HSVtk gene. // Gene Ther., 1997, v.-4, pp.-280-287.

40. Feng M., Jackson W.H. Jr., Goldman C.K., Rancourt C., Wang M., Dusing S.K., Siegal G., Curiel D.T. Stable in vivo gene transduction via a novel adenoviral/retroviral chimeric vector. // Nat. Biotechnol., 1997, v.-15(9), pp.-866-870.

41. Francois A., N. Eterradossi, B. Delmas, V. Payet, P. Langlois. Construction of adenovirus CELO recombinants in cosmids. // J. Virol., 2001, v.-75, pp.-5288-5301.

42. Freeman S.M., Abboud C.N., Whartenby K.A., Packman C.H., Koeplin D.S., Moolten F.L., amd Abraham G.N. The "bystander effect": tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified. // Cancer Res., 1993, v.-53, pp.-5274-5283.

43. Freeman S.M., Ramesh R., and Marrogi A.J. Immune system in suicide-gene therapy. // Lancet., 1997, V.-349, рр.-2-З.

44. Gagandeep S., Brew R., Green В., Christmas S.E., Klatzman D., Poston G.J., and Kinsella A.R. Prodrug-activated gene therapy: involvement of an immunological component in the "bystander effect". // Cancer Gene Ther., 1996, v.-3, pp.-83-88.

45. Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L., Falck-Pedersen E. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes. // J. Virol., 1996, v.-70(4), pp.-2116-2123.

46. Gallucci S., Matzinger P. Danger signals: SOS to the immune system. // Curr. Opin. Immunol., 2001, v.-13, pp.-l 14-119.

47. Ghosh-Ghounhury G., Haj-Ahmad Y., Brikley P., Rudy J., Graham F.L. Human adenovirus cloning vector based on infectious bacterial plasmids. // Gene., 1986, v.-50, pp.-161-171.

48. Glotzer J.B., Saltik M., Chiocca S., Michou A.I., Moseley P., Cotten M. Activation of heat-shock response by an adenovirus is essential for virus replication. //Nature., 2000, V.-407, pp.-207-211.

49. Gorziglia M.I., Lapcevich С., Roy S., Kang Q., Kadan M., Wu V., Pechan P., Kaleko M. Generation of an adenovirus vector lacking El, e2a, E3, and all of E4 except open reading frame 3. // J. Virol., 1999, v.-73, pp.-6048-6055.

50. Graham F.L., and Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol. Biol., 1991, v.-7, pp.-109-127.

51. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. // J. Gen. Virol., 1977, v.-36(l), pp.-59-74.

52. Graham F.L., Van der Eb A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. // Virology., 1973, v.-52, pp.-456-467.

53. Green M., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay. // Methods Enzymology., 1980, v.-58, pp.-425-431.

54. Hamel W., Magnelli L., Chiarugi V.P., and Israel M.A. Herpes simplex vims thimidine kinase/ganciclovir-madiated apoptotic death of bystander cells. // Cancer Res., 1996, v.-56, pp.-2697-2702.

55. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // J. Mol. Biol., 1983, V.-166, pp.-557-580.

56. Harari O.A., Wickham T.J., Stocker C.J., Kovesdi I., Segal D.M., Huehns T.Y., Sarraf C., Haskard D.O. Targeting an adenoviral gene vector to cytokine-activated vascular endothelium via E-selectin. // Gene Ther., 1999, v.-6(5), pp.-801-807.

57. Hawkins L.K., Lemoine N.R., Kirn D. Oncolytic biotherapy: a novel therapeutic platform. // Lancet Oncol., 2002, v.-3(l), pp.-17-26.

58. Hay R.T., Freeman A., Leith I., Monaghan A., and Webster A. Molecular interactions during adenovirus DNA replication. // The molecular repertoire of adenoviruses., 1995, pp.-31-48.

59. Hess M., Cuzange A., Ruigrok R.W., Chroboczek J., Jacrot B. The avian adenovirus penton: two fibres and one base. // J. Mol. Biol., 1995, V.-252, pp.-379-385.

60. Hirschi K.K., Xu C.E., Tsukamoto Т., Sager R. Gap junction genes Cx26 and Cx43 individually suppress the cancer phenotype of human mammary cells and restore differentiation potential. // Cell Growth Differ., 1996, v.-7, pp.-861-870.

61. Kass-Eisler A., Falck-Pedersen E., Elfenbein D.H., Alvira M., Buttrick P.M., Leinwand L.A. The impact of developmental stage, route of administration and the immune system on adenovirus-mediated gene transfer. // Gene Ther., 1994, v.-l, pp.-395-402.

62. Keller P.M., Fyfe J.A., Beauchamp M., and Spector T. Enzymatic phosphorylation of acyclic nucleoside analogs and correlations with antiherpetic activities. // Biochem. Pharmacol., 1981, v.-30, pp.-3071-3077.

63. Kelly J.M., P.K. Darcy, J.L. Markby, D.I. Godfrey, K. Takeda, H. Yagita, and M. Smyth. Induction of tumor-specific T cell memory by NK cell-mediated tumor rejection. Nature Immunol 2002; 3: 83-90.

64. Kochanek S., Schiedner G., Volpers C. High-capacity 'gutless' adenoviral vectors. // Curr. Opin. Mol. Ther., 2001, v.-3, pp.-454-463.

65. Krougliak V., Graham F.L. Development of cell lines capable of complementing El, E4, and protein IX defective adenovirus type 5 mutants. // Hum. Gene Ther.,1995, v.-6(12), pp.-1575-1586.

66. Kumar N.M., and Gilula N.B. The gap junction communication channel. Cell.,1996, v.-84,pp.-381-388.

67. Kuriyama N., Kuriyama H., Julin C.M., Lamborn K.R., Israel M.A. Protease pretreatment increases the efficacy of adenovirus-mediated gene therapy for the treatment of an experimental glioblastoma model. // Cancer Res., 2001, v.-61, pp.-1805-1809.

68. Lance P., Encell, Daniel M., Landis, Lawrence A. Loeb. Improving enzymes for cancer gene therapy. // Nature Biotechnology, 1999, v.-17, pp.-143 147.

69. Laver W.G., H.B. Younghusband, and N.G. Wrigley. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). // Virology., 1971, v.-45, pp.-598-614.

70. Legerski R.J., Robberson D.L. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions. //J. Mol. Biol., 1985, V.-181, pp.-297-312.

71. Lehrmann H., Cotten M. Characterization of CELO virus proteins that modulate the pRb/E2F pathway. // J. Virol., 1999, v.-73, pp.-6517-6525.

72. Leon R.P., Hedlund Т., Meech S.J., Li S., Schaack J., Hunger S.P., Duke R.C., DeGregori J. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, v.-95(22), pp.-13159-13164.

73. Leppard K.N. E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. // J. Gen. Virology., 1997, v.-78, pp.-2131-2138.

74. Li P., Bellett A.J., Parish C.R. A comparison of the terminal protein and hexon polypeptides of avian and human adenoviruses. // J. Gen. Virol., 1983, v.-64, pp.-1375-1379.

75. Li P., Bellett A.J., Parish C.R. DNA-binding proteins of chick embryo lethal orphan virus: lack of complementation between early proteins of avian and humans adenoviruses. // J. Virol., 1984b, v.-65, pp.-1817-1825.

76. Li P., Bellett A.J., Parish C.R. The structural proteins of chick embryo lethal orphan virus (fowl adenovirus type 1). // J. Gen. Virol., 1984a, v.-65, pp.-1803-1815.

77. Lieber A., Steinwaerder D.S., Carlson C.A., Kay M.A. Integrating adenovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of all viral genes. // J. Virol., 1999, v.-73, pp.-9314-9324.

78. Martin J.C., Drovak C.A., Smee D.F., Matthews T.R., and Verheyden J.P. 9-(l,3-Dihydroxy-2-propoxy)-methyl.guanine: a new potent and selective antiherpes agent. // J. Med. Chem., 1983, v.-26,pp.-759-761.

79. Matthews Т., and Boehme R. Antiviral activity and mechanism of action of ganciclovir. // Rev. Infect. Dis., 1988, v.-Ю (Suppl.3), pp.-S490-S494.

80. Medema J.P., Scaffidi C., Kischkel F.C., Shevchenko A.N., Mann M., Krammer P.H., and Peter M.E. FLICE is activated by association with the CD95 death-inducing signaling complex (DISC). // EMBO J., 1997, v.-16, pp.-2794-2804.

81. Melcher A., Todryk S., Hardwick N., Ford M., Jacobson M., and Vile R.G. Tumor immunogenicity is determined by the mechanism of cell death via induction of heat shock protein expression. // Nat. Med., 1998, v.-4, pp.-581-587.

82. Mesnil M., Krutovskikh V., Piccoli C., Elfgang C., Traub O., Willecke K., Yamasaki H. Negative growth control of HeLa cells by connexin gene: connexin species specificity. // Cancer Res., 1995, v.-55, pp.-629-639.

83. Michou A.I., Lehrmann H., Saltik M., Cotten M. Mutational analysis of the avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors. // J. Virol., 1999, v.-73(2), pp.-1399-1410.

84. Mittereder N., March K.L., Trapnell B.C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. // J. Virol., 1996, v.-70, pp.-7498-7509.

85. Mizuguchi H., Hayakawa T. Adenovirus vectors containing chimeric type 5 and type 35 fiber proteins exhibit altered and expanded tropism and increase the size limit of foreign genes. // Gene., 2002, v.-20, pp.-285, pp.-69-77.

86. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J. Immune Methods., 1983, v.-65, pp.-55-63.

87. Motoi F., Sunamura M., Ding L., Duda D.G., Yoshida Y., Zhang W., Matsuno S., Hamada H. Effective gene therapy for pancreatic cancer by cytokines mediated by restricted replication-competent adenovirus. // Hum. Gene Ther., 2000, v.-l 1, pp.-223-235.

88. Nagata S. Apoptosis by death factor. // Cell., 1997, v.-88, pp.-355-365.

89. Nasu Y., Kusaka N., Saika Т., Tsushima Т., Kumon H. Suicide gene therapy for urogenital cancer: current outcome and prospects. // Mol. Urol., 2000, v.-4, pp.-67-7

90. Payet V., Arnauld C., Picault J.P., Jestin A., Langlois P. Transcriptional organization of the avian adenovirus CELO. // J. Virol., 1998, v.-2, pp.-9278-9285.

91. Polyak K., Xia Y., Zweier J.L., Kinzler K.W., Vogelstein B. A model for p53-induced apoptosis. // Nature., 1997, v.-389(6648), pp.-300-305.

92. Ramesh R., Munshi A., Abboud C.N., Marrogi A.J., Freeman S.M. Expression of costimulatory molecules: B7 and ICAM upregulation after treatment with a suicide gene. // Cancer Gene Ther., 1996, v.-3, pp.-373-384.

93. Rasmussen U.B., Benchaibi M., Meyer V., Schlesinger Y., Schughart K. Novel human gene transfer vectors: evaluation of wild-type and recombinant animal adenoviruses in human-derived cells. // Hum. Gene Ther., 1999, v.-10, pp.-2587-2599.

94. Rechtin T.M., Black M.E., Mao F., Lewis M.L., Drake R.R. Purification and photoaffinity labeling of herpes simplex virus type-1 thymidine kinase. // J. Biol. Chem., 1995, v.-270(13), pp.-7055-7060.

95. Romano G., Pacilio C., Giordano A. Gene transfer technology in therapy: current applications and future goals. // Stem Cells., 1999, v.-7, pp.-191-202.

96. Russell W.C. Update on adenovirus and its vectors. // J. Gen. Virology., 2000, v.-81, pp.-2573-2604.

97. Sarma P.S., R.J. Huebner, W.T. Lane. Induction of tumors in hamsters with an avian adenovirus. // Science, 1965, v.-149, pp: 1108.

98. Scaffidi C., Fulda S., Li F., Friesen C., Srinivasan A., Tomaselli K.J., Debatin K-M., Krammer P.H., and Peter M.E. Two CD95 signaling pathways. // EMBO J., 1998, v.-17, pp.-1675-1687.

99. Sharp P.A. Adenovirus transcription. In The Adenoviruses. Ed. by H.S. Ginsberg, 1984.

100. Shayakhmetov D.M., Papayannopoulou Т., Stamatoyannopoulos G., Lieber A. Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector. // J. Virol., 2000, v.-74, pp.-2567-2583.

101. Shenk T. Adenoviridae: the viruses and their replication. // Fundamental virology., 1996, v.-3, pp.-979-1016.

102. Shinagawa M., T. Ishiyama, R.V. Padmanabhan, K. Fujigana, M. Kamada, G. Sato. Comparative sequence analysis of the inverted terminal repetition in the genomes of animal and avian adenoviruses. // Virology., 1983, V.-125, pp.-491-495.

103. Srivastava P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses. // Annu. Rev. Immunol., 2002, v.-20, pp.-395-425.

104. Sussenbuch J.S. The structure of the genome. In The Adenoviruses. Ed. by H.S. Ginsberg, 1984.

105. Tan P.K. Defining CAR as a cellular receptor for the avian adenovirus CELO using a genetic analysis of the two viral fibre proteins. // J. Gen. Virology., 2001, v.-82, pp.-1465-1472.

106. Todryk S., Melcher A., Bottley G., Gough M., Vile R. Cell death associated with genetic prodrug activation therapy of colorectal cancer // Cancer. Lett., 2001, V.-174, рр.-25-ЗЗ.

107. Van der Eb A.J., Mulder C., Graham F.L., Houwelling A. Transformation with specifik fragments of adenovirus DNA. I. Isolation of specific fragments with transforming activity of adenovirus 2 and 5 DNA. // Gene., 1977, v.-2, pp.-115-132.

108. Van der Eb. A.J., van Kesteren J.W., van Bruggen E.F.G. Structural properties of adenovirus DNAs. // Biochem. Biophys. Acta., 1969. v.-182, pp.-530-541.

109. Wallace H., MacLaren K., Al-Shawi R., and Bishop J.O. Ganciclovir-induced ablation of non-proliferation thyrocytes expressing herpes simplex virus thimidine kinase occurs by p53-independent apoptosis. // Oncogene., 1996, v.-13, pp.-55-61.

110. Wang Q., Greenburg G., Bunch D., Farson D., Finer M.H. Persistent transgene expression in mouse liver following in vivo gene transfer with a delta El/delta E4 adenovirus vector. // Gene Ther., 1997, v.-4, pp.-393-400.

111. Wickham T.J., Mathias P., Cheresh D.A., Nemerow G.R. Integrins осуРз and avp5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. // Cell., 1993, v.-73, pp.-309-319.

112. Wickham T.J., Roelvink P.W., Brough D.E., Kovesdi I. Adenovirus targeted to heparan-containing receptors increases its gene delivery efficiency to multiple cell types. // Nat. Biotechnol., 1996, v.-14, pp.-1570-1573.

113. Wildner O., Morris J.C. Therapy of peritoneal carcinomatosis from colon cancer with oncolytic adenoviruses. // J. Gene Med., 2000, v.-2, pp.-353-360.

114. Wold W.S., K. Doronin, K. Toth, M. Kuppuswamy, D. L. Lichtenstein, A. Tollefson. Immune responses to adenoviruses: viral evasion mechanisms and their implication for the clinic. // Current Opin. Immun., 1999, v.-11, pp.-380-386.

115. Worgall S., Wolff G., Falck-Pedersen E., Crystal R.G. Innate immune mechanisms dominate elimination of adenoviral vectors following in vivo administration. // Hum. Gene Ther., 1997, v.-8, pp.-37-44.

116. Xu Z.Z., Hyatt A., Boyle D.B., Both G.W. Construction of ovine adenovirus recombinants by gene insertion or deletion of related terminal region sequences. // Virology., 1997, V.-230, pp.-62-71.

117. Yang Y., Jooss K.U., Su Q., Ertl H.C., Wilson J.M. Immune responses to viral antigens versus transgene product in the elimination of recombinant adenovirus-infected hepatocytes in vivo. // Gene Ther., 1996, v.-3(2), pp.-137-144.

118. Yee D., McGuire S.E., Brynner N., Kozelsky T.W., Allerd D.C., Chen S., and Woo S.L. Adenovirus-mediated gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase in an ascites model of human breast cancer. // Hum. Gene Ther., 1996, v.-7, pp.-1251-1257.

119. Yeh P., Dedieu J.F., Orsini C., Vigne E., Denefle P., Perricaudet M. Efficient dual transcomplementation of adenovirus El and E4 regions from a 293-derived cell line expressing a minimal E4 functional unit. // J. Virol., 1996, v.-70, pp.-559-565.

120. Zabner J., Chillon M., Grunst Т., Moninger Т.О., Davidson B.L., Gregory R., Armentano D. A chimeric type 2 adenovirus vector with a type 17 fiber enhances gene transfer to human airway epithelia. // J. Virol., 1999, v.-73(10), pp.-8689-8695.