Создание новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса птиц

Черентаева, Евгения Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса птиц
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Создание новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса птиц"

На правах рукописи

ЧЕРЕНТАЕВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

СОЗДАНИЕ НОВОЙ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ БЕТА-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОВИРУСА ПТИЦ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003467613

Москва - 2009 г.

003467613

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН (ГУ НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН) и ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО МГУПБ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Народицкий Борис Савельевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ермолаева Светлана Александровна

доктор биологических наук Шилов Илья Александрович

Ведущая организация: Государственное учреждение научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.

Защита состоится « Ж » апреля 2009 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан « д> марта_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в медицинских, микробиологических и молекулярно-биологических исследованиях широко используются рекомбинантные аденовирусы (Ад). При этом Ад применяются в качестве векторов для экспрессии генов in vitro и in vivo, для исследования антигенов микроорганизмов а также служат основой для разработки нового поколения генно-инженерных вакцин. Кроме того, разрабатывается новое направление получения рекомбинантных белков с использованием Ад векторов. При этом подходе ген целевого белка клонируют в рекомбинантный аденовирусный вектор, с помощью которого осуществляется доставка гена в эукариотические клетки для продукции этого белка. Большой интерес при этом вызывает возможность создания векторных систем на основе геномов аденовирусов животных и птиц [Rauw F., 2007].

В последнее время была продемонстрирована возможность создания векторов на основе генома Ад птиц CELO (Chicken Embiyo Lethal Orphan) [Logunov D., 2004]. Интерес к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием свойств, позволяющих предположить возможность разработки эффективной эукариотической векторной системы на его основе для продукции рекомбинантных белков in vitro и in ovo: большая пакующая емкость, более высокая физическая стабильность вирионов и способность трансдуцировать клетки птиц. Последнее свойство данного аденовируса используется для создания эукариотических систем экспрессии целевых белков на основе клеток птиц, в частности в куриных эмбрионах, которые являются хорошо изученным и безопасным объектом биотехнологии, что обеспечивает чистоту получаемых продуктов от примесей различных патогенов. Таким образом, рекомбинантные аденовирусы CELO могут найти широкое применение в качестве вектора для разработки новых эукариотических систем экспрессии рекомбинантных белков, в частности бета-интерферона [Tutykhina I., 2009].

Бета-интерферон (ИФН-/3) относится к семейству интерферонов I типа, и подобно альфа-интерферону индуцирует множество биологических событий, включая ингибирование вирусной репликации, стимуляцию иммунной системы и ингибирование пролиферации клеток. Препараты рекомбинантного ИФН-/3 нашли применение в медицине при широком спектре патологий, например, для лечения рассеянного склероза, различных \ вирусных инфекций (вирусные гепатиты, герпесвирусные заболевания), злокачественной меланомы, рака молочных желез и шейки матки, волосатоклеточной лейкемии и других опасных заболеваний. Однако, несмотря на безусловно доказанную медицинскую значимость этого препарата, биологически активный белок ИФН-/3 производится в недостаточном количестве.

Для производства рекомбинантного белка бета-интерферона человека в настоящее время используются как прокариотические, так и эукариотические системы экспрессии. Однако эти системы имеют определенные недостатки. В

частности, ИФН-/3 человека, синтезированный в Escherichia coli, имеет низкую биологическую активность и может быть загрязнен токсичными веществами или пирогенами. Белок бета-интерферона, полученный с помощью эукариотической системы экспрессии, идентичен природному по своим биохимическим, физическим и функциональным свойствам, но является токсичным для клетки-продуцента, что требует разработки более сложных систем продукции [Runkel L., 1998, Rodriguez J., et al., 2005].

Таким образом, изучение возможности создания новых эукариотических систем экспрессии рекомбинантного белка ИФН-/3 на основе аденовируса CELO, является актуальным направлением исследований.

Цель исследования: разработка новой системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса птиц CELO, изучение экспрессии и биологических свойств рекомбинантного белка.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Исследование устойчивости клеток птиц к цитотоксическому действию бета-интерферона человека.

2. Получение рекомбинантного Ад птиц CELO, несущего ген ИФН-/3 человека, методом гомологичной рекомбинации в Е. coli.

3. Изучение экспрессии гена ИФН-)3 человека, находящегося в составе рекомбинантного аденовируса в линии клеток LMH, и динамики накопления биологически активного рекомбинантного бета-интерферона в культуральной среде.

4. Исследование возможности использования рекомбинантного аденовируса СЕШ-ИФН-/3 для получения биологически активного секретируемого белка бета-интерферона человека in ovo в куриных эмбрионах.

5. Выделение и характеристика секретируемого рекомбинантного белка бета-интерферона человека из культуральной среды клеток LMH, трансдуцированных аденовирусом СЕЬО-ИФН-(3, методом аффинной хроматографии.

6. Исследование возможности использования рекомбинантного аденовируса СЕЬО-ИФН-/3 в генной терапии сформированных опухолей in vivo.

Научная новизна. Впервые были получены рекомбинантные аденовирусы птиц CELO, несущие и экспрессирующие модифицированный и исходный гены бета-интерферона человека, методом гомологичной рекомбинации в Е. coli.

Была показана экспрессия гена ИФН-/3 человека, находящегося в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO, накопление рекомбинантного белка бета-интерферона в культуральной среде трансдуцированных клеток LMH и в аллантоисной жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также определеа его биологическая активность. Белок ИФН-/3 человека при этом был получен в препаративных количествах и отработаны условия его выделения из культуральной среды методом аффинной хроматографии.

Впервые показана возможность использования рекомбинантного аденовируса птиц СЕШ-ИФН-/3 для генной терапии аденокарциномы А431 in vivo.

Полученные результаты демонстрируют возможность создания новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека' на основе клеток птиц с использованием рекомбинантного аденовируса птиц CELO, а также конструирования нового генотерапевтического препарата ИФН-/3 для терапии различных заболеваний человека, в том числе - онкологических.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Была получена новая система экспрессии рекомбинантного бета-интерферона человека in vitro на основе аденовируса птиц CELO. Апробирован способ выделения секретируемого рекомбинантного белка ИФН-/3 из культуральной среды от клеток LMH, инфицированных аденовирусом СЕЬО-ИФН-/3 методом аффинной хроматографии. Была показана возможность получения препарата биологически активного рекомбинантного белка ИФН-/3 in ovo.

Перспективным может быть применение рекомбинантного вектора CELO-ИФН-/? в генной терапии рака in vivo, так как была показана эффективная экспрессия доставляемого с помощью него гена интерферона в клетках опухоли.

Препарат рекомбинантного бета-интерферона человека, экспрессированного в культуре клеток LMH с использованием аденовирусного вектора СЕИ>ИФН-/3, и препарат рекомбинантного аденовируса СЕИЭ-ИФН-/3 подготовлены к предклиническим испытаниям.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патент Российской Федерации RU 2 326 942 С1 (МПК C12N 7/01 (2006.01) от 13 июня 2007 года «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии».

Материалы диссертации используются в лекциях для студентов ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» в рамках курса молекулярной биотехнологии.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006), V международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2006), VI Московском международном конгрессе «Экспо-биохим-технологии» (Москва, 2007), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы" (Москва, 2007), VII международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов интерферонов, генетики и молекулярной биологии бактерий, медицинской микробиологии ГУ НИИ ЭМ им. НФ.Гамалеи РАМН 11 ноября 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 статей в сборниках международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список используемой литературы (158 источников, из которых 4 отечественных и 154 иностранных). Работа содержит 5 таблиц и 18 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы

Работа выполнена в период с 2004 по 2008 год на кафедре биологии, вирусологии и генной инженерии ГОУ ВПО МГУПБ и лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Эксперимент по исследованию способности рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН/З вызывать замедление роста установленных опухолей in vivo, выполнен совместно с лабораторией цитогенетики Российский онкологический научный центр. Определение биологической активности интерферона бета человека проводилось совместно с отделом интерферонов ГУ НИИЭМ им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи, РАМН.

В экспериментальной части работы были использованы: аденовирус птиц CELO штамм FELPS (полученный от д-ра А. Ван Дер Эба, лаборатория физиологической химии Лейденского университета), рекомбинантный аденовирус птиц CELO-EGFP.

В работе использован лабораторный штамм Esherichia coli DH5a и Esherichia coli BJ5183.

В работе использовались следующие клеточные линии: LMH (leghorn male hepatoma) любезно предоставленные M. Cotten (Австрия); 293, клетки эмбриональной почки человека, трансформированные El областью Ad5; А431 и HI 299, карциномы легкого человека; HeLa, клетки рака шейки матки человека; MDCK, клетки почки собаки; СНО, клетки яичника китайского хомячка, любезно предоставленные А.Д. Альтштейном.

Эксперименты проводились на голых мышах линии D2&I, возраст 8 недель; куриных SPF эмбрионах.

Использовались следующие плазмидные векторы: плазмидный вектор pCShuttle; плазмидный вектор pCShuttle-EGFP, плазмидный вектор pORF-hlFNjS (Invivogen, США). Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Сиквенирование проводилось в НПФ «Литех».

Трансфекцию клеточных линий проводили с использованием коммерческого препарата Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методам, изложенным в Maniatis et al. (1982). Все манипуляции, связанные с работой с аденовирусами, проводили согласно Graham & Prevec (1991). Для детекции и количественного определения интерферона бета человека использовали тест-систему на основе сэндвич-варианта ИФА. Физико-химические и антигенные свойства интерферона бета определяли методом электрофореза в ПААГ-ДСН в буферной системе Laemmli (1970) с последующим иммуноблоттингом.

Для определения биологической активности ИФН-/3 была использована стандартная методика биологического титрования интерферона на культуре ДФЧ, в качестве индикаторного тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Microsoft Excel. В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с к.б.н. Логуновым Д.Ю., к.б.н. Шмаровым М.М., к.б.н. Верховской Л.В. -сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН г. Москва, сотрудником, лаборатории цитогенетики Российского онкологического научного центра г. Москва, к.б.н. Агаповой Л.А., сотрудником лаборатории интерферонов ГУ НИИЭМ им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН г. Москва, д.м.н. Мезенцевой М.В., которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

2. Результаты исследований

2.1. Исследование токсичности интерферона бета человека для культуры

клеток птиц

В настоящее время для производства рекомбинантного белка бета-интерферона человека используются как прокариотические (на основе Escherichia coli), так и эукариотические (на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, культуры клеток млекопитающих СНО (клетки яичника китайского хомячка)) системы экспрессии. Однако эти системы имеют определенные недостатки, одним из которых является высокая токсичность бета-интерферона для клетки-продуцента {Е. coli, СНО, дрожжи), что требует разработки более сложных систем продукции. В связи с этим, одной из задач нашей работы была разработка новой эукариотической системы экспрессии ИФН-/3 человека на основе клеток, в отношении которых данный белок не проявлял бы токсичного действия.

Для выявления клеток, устойчивых к токсичному действию ИФН-/3 человека мы использовали несколько клеточных линий млекопитающих: СНО, MDCK; две линии клеток человека: HI 299 и 293 и культуру клеток птиц LMH. Токсичность ИФН-/3 была исследована методом трансфекции данных клеточных линий плазмидным вектором, содержащим ген ИФН-/3, в

качестве отрицательного контроля использовали плазмиду, содержащую ген EGFP. Выживаемость клеточных линий оценивали методом окраски метиленовым синим. Экспрессированный белок ИФН-./З был токсичным для следующих культур клеток: СНО (выживаемость 53%), HI 299 (выживаемость 73%), MDCK (выживаемость 68%) и 293 (выживаемость 49%) (Рис. 1). Устойчивыми к действию бета-интерферон оказались клетки птиц LMH (выживаемость 98±2%). Полученный результат, по-видимому, можно объяснить видоспецифическим действием ИФН-/3 на исследуемые клеточные линии млекопитающих и низкой гомологией рецепторов для интерферона /3 у птиц и млекопитающих [McCormick F., 1984; Page M.J., 1985].

120

СНО MDCK Н1299 293 LMH

Рисунок 1. Исследование токсичного действия интерферона ß человека in

vitro.

Устойчивость клеточной линии птиц LMH к бета-интерферону человека позволила предположить возможность создания новой эукариотической системы экспрессии для продукции рекомбинантного ИФН-/3 человека с использованием в качестве вектора аденовируса птиц CELO.

2.2. Получение рекомбинантных аденовирусов птиц СЕЬО-ИФН-0 и

СЕЬО-ИФН-/31ш

В качестве вектора для продукции рекомбинантного белка ИФН-ß in vitro был использован аденовирус птиц CELO. Наш выбор был обусловлен тем, что CELO является охарактеризованным на генетическом уровне объектом и эффективно трансдуцирует клетки LMH. В настоящий момент достаточно полно определена его геномная и транскрипционная организация [Chiocca S., 1996; Payet V., 1998] и вирус CELO используется для продукции рекомбинантных цитокинов человека и животных in vitro и in ovo [Cherenova L.V., 2004].

2.2.1. Создание челночных плазмидных конструкций, содержащих исходный и модифицированный ген бета-интерферона человека в составе экспрессирующей кассеты под контролем СМУ-промотора

Для получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO-ИФ! l-ß был сконструирован челночный плазмидный вектор pCShuttle-hlFN-ß, несущий терминальные последовательности генома CELO. Для получения этой конструкции использовали плазмиду pCShuttle, которая содержит левый и правый участки генома Ад птиц CELO, при этом правый конец генома CELO несет делецию несущественной для репликации вируса области (от 95,3 до 99,7 ед. карты) [Michou А., 1999]. Ген бета-интерферона человека был субклонирован из коммерческой плазмиды pORF-hlFN-ß (Invivogen, США) в сайт делеции правого фрагмента в кассету с CMV промотором и сигналом полиаденилирования BGH по сайтам эндонуклеаз рестрикции Nhel, Eco 1051 (Рис. 2).

hEF1-HTLV-prom

Eco >051

/1117

hlFNbeta

hlFNbeta-his Nhel BGHpoIyA

Лев. Фраг. CELO

Рис. 2. Схема конструирования челночного плазмидного вектора для

рекомбинации.

Где hEFl-HTLV-prom - гибридный промотор (промоторы фактора элонгации la (EF-Icü) и 5'-нетранслируемой области вируса лейкемии Т-клеток человека (HTLV)); CMV-prom - цитомегаловирусный промотор; 1117 - интрон, необходимый для накопления плазмиды, содержащей ген интерферона бета, в Е. coli-, hlFNbeta - ген интерферона бета человека; hlFNbeta-his - ген интерферона бета с последовательностью б гистидинов перед стоп-кодоном; SV40-polyA - сигнал полиаденилирования (Simian Virus 40); BGHpoIyA -сигнал полиаденилирования; ori - точка начала репликации плазмиды в Е. coli-, Amp - ген устойчивости к ампициллину; Ecol05I, Nhel, Asel, PacI -эндонуклеазы рестрикции.

Для получения рекомбинантного Ад птиц CELO-L№H-ß-his, несущего модифицированный ген бета-интерферона, была сконструирована плазмида pCShuttle-hlFN-ß-his, в которой в рамку считывания гена бета-интерферона

перед стоп-кодоном клонировали последовательность, содержащую 6 гистидинов. Данная модификация гена ИФН-/3 человека была выполнена с целью дальнейшего выделения и очистки рекомбинантного белка методом Ni-аффинной хроматографии. Для клонирования нуклеотидной последовательности, кодирующей 6 гистидинов, в рамку считывания гена ИФН-/3 было синтезировано два олигонуклеотида hIFN-/3his-F и hIFN-/Shis-R. Продукт отжига данных олигонуклеотидов, кодирующий спейсер и 6 гистидинов, был клонирован в плазмиду pCShuttle-hIFN-/3 по сайтам эндонуклеаз рестрикции Есо911 и Nhel. Идентичность полученной кассеты IFN-0-6his была подтверждена сиквенированием. Также, была детектирована биологическая активность белка бета-интерферона, экспрессирующегося с данной кассеты.

2.2.2. Получение плазмиды, несущей геном рекомбинантного аденовируса СЕЬО-ИФН-# методом гомологичной рекомбинации в Е.

coli

Плазмида, содержащая полный геном рекомбинантного Ад CELO-ИФН-/3, была сконструирована методом гомологичной рекомбинации в Е. coli BJ5183 [Не Т.С., 1998] между терминальными последовательностями аденовируса в плазмидном векторе pCShuttle-hIFN-ó и полноразмерным геномом CELO (Рис. 3).

Агар

Pací

Pací'

híFNb

ДНК генома аденовируса CELO О % генома 100 % генома

Левое плечо"

Asel

Правое плечо

i идротез по сайт}'Asel

А тр

Pací

Левое плечо

Pací

)

Рекомбинантная "йлазм идя pCELO-hlFNbeta

hlFNb Л^Правое плечо

Гомологичная ...........рекомбинация

Рис. 3. Схема получения плазмиды, несущей геном аденовируса CELO-ИФН-ß, методом гомологичной рекомбинации в Е. coli.

При этом бактериальные клетки Е. coli BJ5183 ^трансформировали методом электропорации геномной ДНК аденовируса CELO и линеаризованным плазмидным вектором pCShuttle-hIFN-/3. Для идентификации полученной плазмиды pCELO-hIFN-/3 проводили анализ рекомбинантных клонов методом ПЦР на наличие гена бета-интерферона человека, для этого использовали праймеры: hlFN-ß-F и hIFN-/3-R (размер ПЦР-фрагмента 600 п.о.), и участка генома аденовируса CELO: праймеры на участок фибера Fl - CpBstl 107 и FICELO (размер ПЦР-фрагмента 350 п.о.).

Дополнительно, рекомбинантные клоны были проанализированы рестрикционным анализом (рис. 4). Электрофоретический анализ рестриктных фрагментов показал наличие фрагментов ожидаемого молекулярного веса, что подтверждает получение плазмиды pCELO-hIFN-/3, содержащей геном рекомбинантного аденовируса СЕЬО-ИФН-(3.

1 2 3 4 5

а).

■ чт

; Ш'

л» <м> '600

264

> " ■' 5 ' ■■ ■'•'■И

i ■■ ■ ,• ■.,. у:

1 2 3 4 5

б)

Ш ©йМ

,350

Рис. 4. Анализ рекомбинантных клонов:

а) электрофореграмма ПЦР-анализа на наличие гена интерферона бета человека: 1 трек - маркер молекулярного веса (ДНК фага X, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции Pstl); 2 трек - отрицательный контроль; 3 трек -положительный контроль (плазмида pORF-hIFN/3-his); 4-5 треки -рекомбинантные клоны.

б) электрофореграмма ПЦР-анализа рекомбинантных клонов на наличие участка генома аденовируса CELO: 1 трек - маркер молекулярного веса (ДНК фага А,, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции Pstl); 2 трек -отрицательный контроль; 3 трек - положительный контроль (ДНК генома аденовируса CELO); 4-5 треки - рекомбинантные клоны.

в) рестрикционный анализ рекомбинантного аденовируса CELО-ИФН-ß: 1 трек - маркер молекулярного веса (ДНК фага X, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции Pstl); 2 трек - ДНК рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН/З; 3 трек -ДНК аденовируса CELO, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции BamHI; 5, 6 треки - рекомбинантные клоны, гидролизованные эндонуклеазой рестрикции BamHI.

Для наращивания препаративных количеств, плазмидная конструкция pCELO-hIFN-/S, содержащая ген ИФН-/3 человека в составе полноразмерного генома вируса CELO, была трансформирована в компетентные клетки E.coli

DH5oí, в которых не происходит рекомбинации ДНК.

2.2.3. Получение рекомбинантного аденовируса CELO-HOH-ff и CELO-

ИФН-ffhis

Для получения рекомбинантного Ад CELO, несущего ген ИФН-/3 трансфицировали линию клеток птиц LMH плазмидой pCELO-hIFN-/3, гидролизованной по сайтам Pací. Трансфекцию проводили с использованием препарата Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), согласно рекомендациям фирмы-производителя (Рис 5).

Pací

\ Оп__ АтР Рж/

t-, hlFNbeta

pCELO-hIFNbeta |t

45000 п. о. ,0 Геном аденовируса • «

CELO

Гидролиз по сайту Pací +

ДНК генома рекомбинантного аденовируса СЕЮ-ИФН-бета

Pad ( hlFNbet£W

Трансфекция пинии клеток LMH

Рекомбинантный аденовирус CELO-ИФН-бета

Рис. 5. Схема получения рекомбинантного аденовируса СЕЬО-ИФН-р

Полученный вектор CELO-ИФН-/? был проанализирован методом ПЦР на наличие вставки гена бета-интерферона (для этого использовали праймеры: hIFN-/?-F и hIFN-/3-R (размер ПЦР-фрагмента 600 п.о.) и отсутствие примеси дикого типа Ад CELO (Рис. 6). Отсутствие примесей ДНК вирусов дикого типа детектировали с помощью праймеров на область делеции в правом конце аденовируса: СВЕ1 и СВЕЗ (размер ПЦР-фрагмента 250 п.о.).

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

а) . х.' 6)

Рис. 6. Электрофореграмма ПЦР-анализа рекомбинантных аденовирусов CELO-ff0H¡3: а) на наличие гена интерферона бета человека; б) на отсутствие примеси аденовируса CELO «дикого» типа.

1 треки - маркер молекулярного веса (ДНК фага X, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции PstI); 2 треки - отрицательный контроль; 3 треки положительный контроль (плазмида pORF-hIFN)3); 4, 5 треки - ДНК рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН/3.

В результате проведённого ПЦР анализа последовательности ДНК полученного рекомбинантного аденовируса было показано, что геном Ад содержит ген бета-интерферона, а примеси вируса CELO дикого типа отсутствуют. Таким образом, был получен вирус СЕИО-ИФН-/3 несущий делецию 1954 п.о. области генома CELO по сайтам EcoRV (41731-43684 п.о.) и вставку экспрессирующей кассеты в месте делеции. Данный вирус репликационно-компетентен и способен к репродукции в культуре клеток гепатомы петуха леггорна LMH, а также - в куриных эмбрионах.

Аналогичным способом был получен рекомбинантный Ад CELO-ИФН-(Shis. Для ПЦР-анализа рекомбинантных клонов плазмиды pCELO-hIFN-/3his и аденовируса CELO-M®H-/3his на наличие модифицированного гена бета-интерферона человека использовали праймерьг. hIFN-j3his-F и hIFN-|3his-R.

2.3. Продукция рекомбинантного бета-интерферона человека in vitro

2.3.1. Экспрессия гена бета-интерферона входящего в состав генома

аденовирусов СЕЬО-ИФН-0 и CELO-HOH-ghis и накопление рекомбинантного белка бета-интерферона в культуре клеток LMH

Экспрессию гена бета-интерферона человека в культуре клеток LMH подтверждали определением секретируемого рекомбинантного белка ИФН-/3, используя коммерческий набор ELISA-hlFNbeta (R&D Systems, Япония). В эксперименте клетки LMH рассевались на культуральные чашки площадью 20 см2, в количестве 105 клеток/см2. Далее клетки были трансдуцированы вирусами CELO-H®H-(3 и CELO-№H-í3his (100 БОЕ/клетку). В качестве отрицательного контроля был взят вирус CELO-EGFP, несущий маркерный ген EGFP. Через 24 часа после трансдукции определяли концентрацию белка. Количество рекомбинантного бета-интерферона человека составило 2 мкг на 1 мл культуральной среды, при этом наблюдали одинаковый уровень

экспрессии гена интерферона как в случае вируса СЕШ-ИФН-/3, так и в случае вируса СЕШ-ИФН-/йиз.

2.3.2. Изучение динамики накопления и биологической активности рекомбннантного бета-интерферона человека продуцируемого в культуре клеток птиц

Для определения биологической активности рекомбинантного бета-интерферона, синтезированного в клетках ЬМН, инфицированных рекомбинантным аденовирусом птиц СЕЬО-ИФН-/3, культуру клеток птиц ЬМН на 75 см2 матрасах (20 мл среды в каждом) трансдуцировали соответственно рекомбинантным Ад СЕЬО-ИФН-(3 и СЕШ-ИФН'/йш в количестве 100 БОЕ/клетку. Далее с интервалом в 24 часа отбирали пробы по 100 мкл и определяли в них содержание бета-интерферона человека методом сэндвич-ИФА и его биологическую активность стандартным методом биологического титрования интерферона на культуре диплоидных фибробластов человека. В качестве референс-препарата использовали рекомбинантный ИФН-/3 человека - «Ребиф» (Бегопо, Италия) с активностью 12 млн МЕ/мл. Данные по динамике накопления бета-интерферона в культуре клеток птиц ЬМН представлены в таблице 1.

Из таблицы видно, что содержание рекомбинантного белка ИФН-/3 в культуральной среде увеличивалось каждые сутки примерно в два раза. Максимальное количество ИФН-/3 - 4 мкг/мл (2x108 МЕ/мл) наблюдали через 72 часа после трансдукции. Через 96 часов содержание бета-интерферона в культуральной среде уменьшилось до 2 мкг/мл, что, по-видимому, объясняется цитопатическим действием рекомбинантного аденовируса на клетки ЬМН и наличием в среде клеточных протеаз. Динамика накопления интерферона, определяемая по биологической активности имела несколько иной характер. Это связано с тем, что интерферон синтезировался в мономерной форме, а затем димеризовался и его биологическая активнось возрастала. Уровень продукции интерферона при использовании вектора СЕШ-ИФНчЗЫб не отличался от уровня экспрессии интерферона при использовании вектора СЕЬО-ИФН-/3.

Таблица 1 Динамика накопления рекомбинантного белка интерферона /3 человека, в культуре клеток ЬМН.

Активность

Время после инфекции, ч Содержание интерферона бета человека (мкг/мл) рекомбинантного интерферона /3 человека (МЕ/мл)

24 1 8Х103

48 2,5 2*106

72 4 2*10*

96 2 107

Таким образом, нами была продемонстрирована экспрессия гена бета-интерферона человека, находящегося в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO и накопление секретируемого биологически активного белка в культуральной среде клеток птиц.

2.4. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона из

культуральной жидкости методом аффинной хроматографии

2.4.1. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона из культуральной жидкости на Ni-NTA-агарозе

Для выделения рекомбинантного белка ИФН-/3 человека из культуральной среды мы исследовали две разновидности аффинной хроматографии: на голубой сефарозе - наиболее распространенный метод выделения рекомбинантных белков и на Ni-NTA- агарозе - более специфичный метод выделения. Целью данного этапа работы был подбор условий выделения рекомбинантного ИФН-/3 из культуральной среды.

Для Ni-аффинной хроматографии на предыдущих этапах работы ген интерферона был модифицирован присоединением к нему последовательности из 6 гистидинов. С помощью этого гистидинового "хвоста" интерферон при очистке прикрепляется к Ni-хелатному комплексу, чем и обеспечивается его выделение из среды. Таким образом, очистку модифицированного ИФН-|3 проводили на Ni-NTA-агарозе (Qiagen, США), согласно протоколу производителя. Для этого, культуру клеток LMH рассевали на культуральные матрасы площадью 162 см2, в количестве 105 клеток/см2 и трансдуцировали их вирусом CEL04W>H-/3his (100 БОЕ/клетку), контролем служила культура клеток, трансдуцированная аденовирусом CELO-EGFP. Через 72 часа отбирали культуральную жидкость и наносили на колонку с Ni-NTA-агарозой. Связавшийся белок эллюировали буфером, содержащим 500 мМ имидазола (рН 8,0). Выход белка рекомбинантного ИФН-/3 составил 30% (табл. 2).

Таблица 2 Выход белка интерферона бета человека при выделении методом М-аффинной хроматографии. _

№ препарата Биологическая активность интерферона бета человека (МЕ/л) Количество интерферона бета человека (мг/л)

1 1,8x1o10 3,5

2 2х107 0,05

3 6,4^109 1,05

1) культуральная среда от культуры клеток ЕМН, трансдуцированных аденовирусом СЕЕО-ИФН/ЗЫб; 2) культуральная среда после нанесения на колонку; 3) препарат интерферона бета, полученный в результате эллюции.

Биологическая антивирусная активность очищенного рекомбинантного

белка ИФН-/3 бьша протестирована по ингибированию действия вируса энцефаломиокардита мышей на культуру диплоидных фибробластов человека и составила 6,9х Ю6 МЕ/мкг белка.

Таким образом, при данном способе выделения, белок ИФН-/3 сохранил биологическую активность, но выход интерферона составил 30%. Это, возможно, связано с тем, что №-аффинная хроматография стандартизована для выделения белков из бактериальных клеток, а в случае выделения рекомбинантных белков из культуральной среды эффективность данной хроматографии колеблется от 20 до 70%.

2.4.2. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона человека из культуральной жидкости на голубой сефарозе

Метод выделения рекомбинантных белков из культуральной жидкости с помощью №-аффинной хроматографии получил широкое применение в связи с высокой специфичностью и простотой выделения. Однако при выделении бета-интерферона из культуральной жидкости линии клеток ЬМН выход белка составил всего 30%. В связи с этим, для дальнейших исследований мы апробировали выделение рекомбинантного ИФН-/3 из культуральной среды методом хроматографии на колонке с голубой сефарозой (АшегзЬаш, США). Для этого, культуру клеток ЬМН рассевали на культуральные матрасы площадью 162 см2, в количестве 105 клеток/см2 и трансдуцировали их вирусом СЕЬО-ИФН-/? (100 БОЕ/клетку), контролем служила культура клеток, трансдуцированная аденовирусом СЕЬО-ЕСРР. Через 72 часа отбирали культуральную жидкость и выделяли секретируемый интерферон на колонке с голубой сефарозой. Для этого калибровали колонку с голубой сефарозой 1 х5 см 0,02 М натрий - фосфатным буфером, рН 7,2, содержащим 2 М хлорида натрия. В подготовленную культуральную жидкость (500 мл), содержащую бета-интерферон добавляли хлорид натрия до-концентрации 1 М и пропустили через колонку с сефарозой со скоростью 200 мл/час. Далее промыли колонку и эллюировали бета-интерферон буфером, содержащим 50% этилен гликоля (ЭГ), после чего довели концентрацию ЭГ до 37% для стабилизации белка. Содержание интерферона во фракциях до и после хроматографии определяли методом сэндвич-ИФА. Дополнительно определяли биологическую активность интерферона в данных фракциях (табл. 3).

Выход белка ИФН-(8 при выделении на голубой сефарозе был значительно выше по сравнению с М-аффинной хроматографией и составил 70%. Удельная биологическая активность очищенного рекомбинантного белка бета-интерферона составила 1,3х108 МЕ/мкг белка. Таким образом, мы показали, что оптимальным методом выделения рекомбинантного белка из культуральной жидкости от клеток ЬМН является аффинная хроматография на голубой сефарозе.

Таблица 3 Выход белка интерферона бета человека при очистке на

колонке с голубой сефарозой.

1 4,2х1011 4

2 8Х104 0,09

3 3,8*10" 3,06

1) культуральная среда с культуры клеток LMH, трансдуцированных аденовирусом CELO-ИФН/З; 2) культуральная среда после инкубации с сефарозой; 3) препарат интерферона бета, полученный в результате эллюции с сорбента.

2.5. Анализ физико-химических и антигенных свойств бета-интерферона человека, продуцируемого в клетках птиц

Идентификацию и изучение физико-химических и антигенных свойств синтезированного в клетках птиц LMH бета-интерферона человека проводили методом иммуноблоттинга, используя моноклональные антитела, против ИФН-/3 человека (Santa Cruz Inc, США). Для этого опыта использовали препарат хроматографически очищенного белка бета-интерферона. Электрофоретическое разделение проводили в денатурирующих и неденатурирующих условиях обработки препарата, поскольку ИФН-jS человека имеет свойство образовывать полимерные структуры до 160 кДа, а в денатурирующих условиях диссоциирует до мономеров. После проведения электрофоретического разделения белков в 15% ПААГ-ДСН, осуществляли перенос белков на PVDF-мембрану, которую затем обрабатывали моноклональными антителами к ИФН-/3 человека. Специфическое взаимодействие комплекса антиген-антитело выявляли антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом (Goat- anti mouse IgG-HRP, Amersham, США). Далее комплекс антиген-антитело окрашивали с помощью хемилюминесцентной системы детекции (ECL-plus Detection System, Amersham).

1 2

Рис. 7 Анализ рекомбинантного белка интерферона бета человека, методом иммуноблоттинга.

45 kDa-^^ 1 ~ препарат интерферона бета в

" •' '. денатурирующих условиях обработки;

2 - препарат интерферона бега в 22 4kDa 1 неденатурирующих условиях обработки.

По данным иммуноблоттинга (Рис. 7), антитела специфически взаимодействуют с белком, имеющим молекулярную массу 45 кДа в неденатурирующих условиях (трек 2), а в денатурирующих условиях выявляли полипептид с молекулярной массой 22,4 кДа (трек 1). По результатам анализа можно сделать вывод о том, что в клетках птиц LMH, трансдуцированных аденовирусом СЕЬО-ИФН-0, синтезируется белок бета-интерферона человека в димерной форме (трек 2). В денатурирующих условиях рекомбинантный препарат ИФН-/3 частично диссоциирует до мономерного полипептида с молекулярной массой 22,4 кДа (трек 1), что соответствует молекулярной массе природного бета-интерферона человека.

Дополнительно рекомбинантный белок ИФН-0 человека, синтезированный в клетках LMH был исследован на гликозилирование. Бета-интерферон человека является гликопротеином и гликозилирован в N-положении по сайту аспарагина 80. Гликозилирование играет важную роль в антивирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностях данного белка. В настоящее время получают как гликозилированный ИФН-/3 человека (в культуре клеток СНО), так и негликозилированный (в Е. coli). При этом функциональная активность белка, полученного в бактериальных клетках на порядки ниже активности интерферона, полученного в эукариотических клетках, и, следовательно, для достижения терапевтического эффекта необходимо увеличивать количество вводимого препарата. В связи с этим, при разработке новых систем экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, одним из существенных вопросов является вопрос о правильном пострансляционном процессинге.

Для исследования гликозилирования рекомбинантного бета-интерферона человека, полученного в клетках птиц, проводили процедуру дегликозилирования данного белка с помощью N-гликозидазы F (NEB, Англия), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Этот фермент отщепляет гликаны с N-конца гликопротеинов, в результате чего меняется электрофоретическая подвижность белка. Для дегликозилирования использовали препарат ИФН-/3 человека, выделенный на голубой сефарозе. Анализ исходной и дегликозилированной форм интерферона (Рис. 8) проводили методом электрофореза в ПААГ-ДСН (15%) с последующим иммуноблоттингом в реакции с моноклональными антителами (Santa Cruz Ltd., США), для идентификации рекомбинантного бета-интерферона человека.

1 2

3 4

Рис. 8 Анализ хроматографически очищенного рекомбинантного интерферона бета человека методом электрофореза в ПААГ-ДСН (15%) \ с последующим иммуноблоттингом в реакции с моноклональными антителами к интерферону бета человека: А - электрофореграмма препаратов интерферона бета человека; Б - иммунореплика препаратов интерферона бета человека; 1 А, ЗБ - препарат рекомбинантного интерферона бета человека; 2А, 4Б - препарат рекомбинантного интерферона бета человека, обработанный И-гликозидазой Б.

Из результатов электрофоретического анализа (А), подтвержденного данными иммуноблоттинга с моноклональными антителами к ИФН-/3 человека (Б), очевидно, что дегликозилированный белок интерферона изменил свою электрофоретическую подвижность по отношению к исходному препарату, и его молекулярная масса уменьшилась, что свидетельствует об отщеплении от бета-интерферона при обработке 14-гликозидазой Б гликозильного остатка. В связи с этим можно заключить, что синтезируемый в клетках птиц белок ИФН-/3 человека претерпевает правильную посттрансляционную модификацию.

Таким образом, мы впервые показали экспрессию биологически активного белка ИФН-)3 человека в культуре клеток птиц ЬМН, при этом подобрали условия выделения рекомбинантного белка интерферона из культуральной среды и охарактеризовали его физико-химические и антигенные свойства. Полученный уровень продукции ИФН-/3 в культуре клеток птиц был на 3 порядка выше по сравнению с заявленной продукцией ИФН-/3 в существующей эукариотической системе экспрессии, использующей культуру клеток млекопитающих - СНО (клетки яичника китайского хомячка) [МсСогтюк, 1984; PageM.J., 1985].

2.6. Продукция рекомбинантного белка интерферона бета человека /и

На следующем этапе нашей работы мы исследовали накопление рекомбинантного белка интерферона бета человека в куриных эмбрионах,

ОУО

зараженных рекомбинантным аденовирусом СЕЬО-ИФН/3. Заражение эмбрионов производилось в аллантоисную полость вируссодержащей культуральной жидкостью (СЕШ-ИФН/З) в титре 5*107 БОЕ на эмбрион. В качестве контроля использовали аллантоис куриных эмбрионов, зараженных рекомбинантным вирусом СЕШ-ЕОРР и аллантоис незараженных куриных эмбрионов. Экспрессию гена ИФН-/3 человека в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов подтверждали определением секретируемого рекомбинантного белка ИФН-/3, используя коммерческий набор ЕЫБА-ЫРЫЬе1а, параллельно в пробах определяли биологическую активность интерферона (Табл. 4).

При заражении куриных эмбрионов аденовирусом СЕЬО-ИФН/З рекомбинантный ИФН-]8 человека накапливался в аллантоисной жидкости. При этом до 48 часов количество интерферона увеличивалось до 1,4 мкг/мл (5><108 МЕ/мл) аллантоисной жидкости, далее оно почти не изменялось и через 96 часов после заражения количество интерферона снизилось до 1,2 мкг/мл (6x107 МЕ/мл), что объясняется распадом уже синтезированного белка интерферона. Максимальный уровень экспрессии ИФН-/3 человека в курином эмбрионе наблюдали через 72 часа, и он составил 1,7 мкг/мл, или 17 мкг на эмбрион.

Таблица 4. Динамика накопления рекомбинантного белка интерферона

бета человека, в куриных эмбрионах.

Количество Активность

Время после рекомбинантного рекомбинантного

инфекции, ч интерферона бета интерферона бета

человека (мкг/мл) человека (МЕ/мл)

12 0,2 3*104

18 0,5 6x10*

24 0,9 6*104

48 1,4 5><10"

72 1,7 5x10"

96 1,2 6x107

Аллантоисная жидкость куриного эмбриона представляет собой сложную смесь, состоящую из фосфолипидов, жирных кислот и белков [Jenkin Н.М., 1970], что затрудняет выделение и очистку целевых белков. В связи с этим выделение рекомбинантного белка интерферона бета человека из аллантоисной жидкости представляет собой самостоятельную научную задачу, которая не входила в рамки данной диссертации.

2.7. Изучение возможности использования рекомбинантного аденовируса CELQ-ИФН-б для генной терапии in vivo

На этом этапе работы нами была изучена антипролиферативная активность ИФН-/3 человека in vitro, при трансдукции опухолевых линий

клеток рекомбинантным аденовирусом CELO-ИФН-Д Для этого исследования были выбраны опухолевые культуры клеток HeLa и А431, так как по литературным данным рекомбинантный бета-интерферон эффективно ' используется для лечения рака шейки матки и аденокарциномы человека I [Реппа С., 1994; Yamamoto S., 1983; Forti R.L., 1984].

j A431 HeLa

! 120 -, 120

¡:| Г il Г : Г I I

1:1Лж1Л, -lJÍjmÍJL

j 100 10 1 100 10 1 БОВклетку

□ CELO-ИФНбетв ■ CELO-EGFP □ Контроль

Рис. 9. Антипролиферативная активность интерферона бета человека на опухолевых культурах клеток.

Клетки рассевали на 24 луночные планшеты с плотностью 2x105 клеток на лунку. Далее данные линии клеток транедуцировали вектором CELO-I ИФН-/3 в дозе 100, 10 и 1 БОЕ на клетку, через 24 часа, методом окраски i метиленовым синим, оценивали выживаемость клеток. В качестве J отрицательного контроля использовали аденовирус CELO-EGFP (Рис. 9). i Антипролиферативное действие бета-интерферона наблюдали на обеих

I клеточных линиях, выживаемость клеток и в том и в другом случае составила i 30%. Оптимальная доза вируса -100 БОЕ/кл.

Основываясь на полученных результатах по антипролиферативной активности системы CELO-ИФН-З in vitro в культуре клеток А431, мы I исследовали способность рекомбинантного аденовируса СТХО-ИФН-/3 вызывать замедление роста опухолей аденокарциномы человека А431 у голых мышей линии D2&I при многократных внутриопухолевых инъекциях. С этой целью опухолевые клетки А431 прививались 8-недельным самкам мышей i подкожно из расчета 106 клеток на инъекцию. В каждой группе было по 8 I сформированных опухолей. Опухоли объемом приблизительно 100 мкл на 10 день были инъецированы препаратами вирусов в количестве 5х10" физических частиц вируса/инъекцию. Инъекции вирусов проводили через 3 дня. Всего группы получали по 4 инъекции. Контрольным группам инъецировали PBS (Sigma), i аденовирус CELO-EGFP и коммерческий препарат бета-интерферона «Ребиф» I в пересчете дозы с человека на мышь. Объем опухолей измеряли с помощью штангенциркуля, начиная с первого дня инъекций, рассчитывая его как ширинухвысотух1/2 высоты. Средний объем опухолей (на последний день эксперимента) в группе мышей, получавших инъекции СЕЮ-ИФН-/3 был в 2,5 раза меньше по отношению к группе получавшей CELO-EGFP, в 4,5 раза по I отношению к группе получавшей «Ребиф» и в 7 раз меньше по отношению к

группе, получавшей инъекции PBS. Измерения продолжались до достижения размера опухоли в контрольных группах 1,5 мл (Рис. 10).

Данная работа выполнялась совместно с к.б.н. Агаповой Л.А. (лаборатория цитогенетики РОНЦ).

Полученные результаты показывают, что внутриопухолевые инъекции рекомбинантного вируса СЕШ-ИФН-/3 оказывают супрессивное воздействие на рост аденокарциномы А431 in vivo. Терапевтический эффект при использовании рекомбинантного Ад вектора СЕЬО-ИФН-/3 был выше по сравнению с эффектом от коммерческого белкового препарата «Ребиф», что возможно объясняется пролонгированной экспрессией гена ИФН-/3, доставляемого непосредственно в клетки опухоли.

Полученные нами данные свидетельствуют о возможности использования вектора CELO-ИФН-/? для генной терапии рака. Более того, вирусная система при этом позволяет достичь высокого терапевтического эффекта, а отсутствие необходимости многократных инъекций бета-интерферона - избежать побочного действия данного белка на организм-реципиент.

900,00 ---

800,00 --

3 700,00-

S 600,00-

с;

g 500,00 -:-

О 400,00 ---

® 300,00 -----

о 200,00 --

100,00 --

0,00 --,

Дни инъекций

•■♦■•Буфер —В -Ребиф -A- CELO-EGFP —•— CELO-ИФНбета

Рис. 10. Внутриопухолевые инъекции CELO-M0Hß замедляют рост установленных опухолей А431 in vivo (день 3 после начала инъекций).

Таким образом, в нашей работе была продемонстрирована перспективность использования рекомбинантного аденовирусного вектора CELO-ИФН/З в биотехнологии и медицине:

1. для получения биологически активного секретируемого белка интерферона бета человека in vitro - в культуре клеток птиц LMH и in ovo - в куриных эмбрионах.

2. для эффективного переноса гена интерферона бета человека для генной терапии рака in vivo.

выводы

1. Сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO, содержащий ген бета-интерферона человека, который экспрессировался в составе рекомбинантного аденовируса CELO-MOH-/3 в линии клеток LMH, полученный рекомбинантный белок бета-интерферона был биологически активен. Уровень экспрессии гена бета-интерферона составил 10 мкг/106 клеток.

2. Продемонстрирована экспрессия гена ИФН-ß человека в куриных эмбрионах (in ovo), зараженных рекомбинантным аденовирусом CELO-ИФН-ß. Рекомбинантный белок ИФН-/3 накапливается в аллантоисной жидкости в количестве 1,7-2 мкг/мл (5x108 МЕ/мл).

3. Разработан способ выделения биологически активного рекомбинантного белка ИФН-ß человека, из культуральной среды клеток LMH, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом СЕЕО-ИФН-/3 с использованием метода аффинной хроматографии на колонке с голубой сефарозой. Выход белка ИФН-ß составил 70%.

4. Впервые показано, что рекомбинантный бета-интерферон человека, синтезируемый в клетках птиц, представлен гликозилированным полипептидом с молекулярной массой 22,5 кДа, который аутентичен природному бета-интерферону, и обладает высокой удельной биологической активностью 1,2x1o11 МЕ/мг.

5. Продемонстрирована возможность применения рекомбинантного аденовируса птиц CELO-H®H-j3 для терапии опухолей in vivo. При множественных внутриопухолевых инъекциях рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-/? in vivo наблюдали замедление роста (в 7 раз) сформированных подкожных ксенотрансплантатов аденокарциномы А431 (у голых мышей линии D2&I).

6. Показано, что бета-интерферон, синтезированный в клетках опухоли, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом CELO-ИФН-/?, значительно эффективнее (в 4,5 раза) подавляет рост опухоли по сравнению с препаратом ИФН-ß вводимого в виде очищенного белка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шувалова Е.А., Карпов А.П., Зубкова О.В., Щебляков Д.В., Валихов А.Ф. Получение рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, методом

■ рекомбинации в E.coli // Сб. науч. ст. международной юбилейной научено-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, - Курск: КГСА, 2006, - С. 221225.

2. Карпов А.П., Шувалова Е.А., Зубкова О.В. Конструирование модифицированного аденовируса птиц CELO с целью создания генно-инженерной вакцины нового поколения // Живые системы и биологическая -безопасность населения: Сб. науч. ст. V международной научной конференции студентов и молодых учёных, - М.: МГУПБ, 2006. - С. 231 -232.

3. Шувалова Е.А., Народицкий Б.С. Получение рекомбинантных аденовирусов птиц CELO методом гомологичной рекомбинации в Е. coli // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Сб. науч. ст. VI Московского международного конгресса. - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. - С. 317.

4. Шмаров М.М, Логунов Д.Ю., Тутыхина И.Л., Карпов А.П., Щербинин Д.Н., Зубкова О.В., Седова Е.С., Шувалова Е.А., Верховская Л.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Разработка технологии получения векторных систем нового поколения на основе аденовирусов человека и птиц для создания генно-инженерных вакцин против социально-значимых и особо опасных инфекций млекопитающих // Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы: Сб. тезисов. - Институт молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта РАН, 2007.- С. 96-98.

5. Черентаева Е.А., Народицкий Б.С. Получение рекомбинантного аденовируса 5 серотипа, несущего ген интерферона альфа-2 человека //Живые системы и биологическая безопасность населения: Сб. науч. ст. VII международной научной конференции студентов и молодых учёных, - М.: МГУПБ, 2008. - С. 278-279.

6. Logunov D.Y., Zubkova O.V., Karyagina-Zhulina A.S., Shuvalova E.A., Karpov A.P., Shmarov M.M., Tutykhina I.L., Alyapkina Y.S., Grezina N.M., Zinovieva N.A., Ernst L.K., Gintsburg A.L., Naroditsky B.S. Identification of HI-like loop in CELO adenovirus fiber for incorporation of receptor binding motifs // J. Virol. 2007 Sep;81(18):9641-52.

7. Черентаева E.A., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Мезинцева М.В., Шмаров М.М., Ершов Ф.И., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Продукция рекомбинантного белка интерферна-/? человека в культуре клеток птиц // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2008, № 3, С. 37-40.

8. Народицкий Б.С., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л., Верховская Л.В., Тутыхина И.Л., Шувалова Е.А., Карпов А.П., Зубкова О.В., Седова Е.С. Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии. Патент Российской Федерации RU 2 326 942 Cl (МПК C12N 7/01 (2006.01) от 13 июня 2007 года.

Заказ №1039. Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 ■www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черентаева, Евгения Александровна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирусные системы доставки генов в клетки эукариот

1.2. Общая характеристика аденовирусов и их использование в качестве векторов для переноса генетической информации

1.2.1. Общая характеристика и классификация аденовирусов

1.2.2. Аденовирусы как векторы для переноса генетической информации

1.2.2.1. Векторы на основе аденовирусов человека

1.2.2.2. Векторы на основе аденовирусов животных и птиц

1.2.3. Аденовирус птиц CELO, его особенности, использование в качестве вектора

1.3. Общая характеристика бета-интерферона, механизмы действия, свойства и технология получения

1.3.1. Бета-интерферон и его функции

1.3.2. Производство бета-интерферона.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41 2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы

2.1.2. Клеточные линии

2.1.3. Плазмидные векторы

2.1.4. Ферменты и другие реактивы

2.1.5. Лабораторные животные

2.1.6. Лабораторное оборудование 43 2.2. МЕТОДЫ

2.2.1. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК

2.2.2. Выделение препаративных количеств плазмидной

2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами рестрикции

2.2.4. Обработка Фрагментом Кленова

2.2.5. Лигирование фрагментов ДНК

2.2.6. Трансформация клеток Е.соП

2.2.7. Приготовление компетентных клеток

2.2.8. Приготовление электрокомпетентных клеток Е.соН

2.2.9. Гомологичная рекомбинация в Е.соИ

2.2.10. Получение рекомбинантных аденовирусов

2.2.11. Накопление аденовирусов

2.2.12. Очистка и концентрирование аденовирусов

2.2.13. Титрование вирусов

2.2.14. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом

2.2.15. Выделение вирионной ДНК

2.2.16. Окраска клеток метиленовым синим

2.2.17. Определение биологической активности бета-интерферона человека

2.2.18. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН

2.2.19. Иммуноблотинг

2.2.20. Дегликозилирование рекомбинантного белка бета-интерферона человека

2.2.21. Количественное определение продукции белка бета-интерферона человека методом сэндвич-ИФА

2.2.22. Выделение бета-интерферона человека на №-ЫТА-агарозе

2.2.23. Выделение бета-интерферона человека на голубой сефарозе

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Исследование токсичности бета-интерферона человека для культуры клеток птиц

3.2. Получение рекомбинантных аденовирусов птиц СЕЬО-ИФН-Р и СЕШ-ИФН-РЫб

3.2.1. Создание челночных плазмидных конструкций, содержащих исходный и модифицированный ген бета-интерферона человека в составе экспрессирующей кассеты под контролем CMV-промотора

3.2.2. Получение плазмиды, несущей геном рекомбинантного аденовируса СЕЬО-ИФН-ß методом гомологичной рекомбинации в Е. coli

3.2.3. Получение аденовируса СЕЬО-ИФН-ß и CELO-ИФН

3.3. Продукция рекомбинантного бета-интерферона человека in vitro

3.3.1. Экспрессия гена бета-интерферона входящего в состав генома аденовирусов СЕШ-ИФН-ß и СЕЬО-ИФН-ßhis и накопление рекомбинантного белка бета-интерферона в культуре клеток LMH

3.3.2. Изучение динамики накопления и биологической активности рекомбинантного бета-интерферона человека продуцируемого в культуре клеток птиц

3.4. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона из культуральной жидкости методом аффинной хроматографии

3.4.1. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона из культуральной жидкости на Ni-NTA-агарозе

3.4.2. Выделение рекомбинантного белка бета-интерферона из культуральной жидкости на голубой сефарозе

3.5. Анализ физико-химических и антигенных свойств бета-интерферона человека, продуцируемого в клетках птиц

3.6. Продукция рекомбинантного белка бета-интерферона человека in ovo

3.6.1. Продукция и накопление рекомбинантного белка бета-интерферона человека в куриных эмбрионах, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CELO-ИФН-Р

3.6.2. Изучение биологической активности бета-интерферона продуцируемого в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов

3.7. Исследование возможности использования рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-р для генной терапии in vivo

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

Ад — Аденовирус

БОЕ - бляшкообразующая единица

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ед. к. - единица карты т.п.о. — тысяч пар оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РКА — репликативно-компетентный аденовирус

ЦПД — цитопатическое действие

CAR — coxsackie adenovirus receptor - коксакивирусный-аденовирусный рецептор

CELO - Chicken Embryo Lethal Orphan FAV1 (fowl adenovirus type 1) аденовирус птиц типа p — Plasmid - плазмида

PBS - фосфатный солевой буфер

SPF — specific pathogen free - свободный от вирусных и бактериальных контаминаций трис - гидроксиметиламинометан ЭДТА - этилендиаминтетраацетат CMV - цитомегаловирус человека ORF — открытая рамка считывания polyA — сигнал полиаденилирования ИФН-Р - бета-интерферон

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса птиц"

Актуальность проблемы. В настоящее время рекомбинантные аденовирусы (Ад) широко используются в молекулярно-биологических, биомедицинских и микробиологических исследованиях. Аденовирусные векторы являются удобным инструментом для исследования, например, антигенов микроорганизмов in vitro и in vivo, а также служат основой для разработки нового поколения генно-инженерных вакцин. В последние годы разрабатывается новое направление получения рекомбинантных белков с использованием Ад векторов. При этом подходе ген целевого белка клонируют в рекомбинантный аденовирусный вектор, с помощью которого осуществляется доставка гена в эукариотические клетки для продукции белка. Большой интерес при этом вызывает возможность создания векторных систем на основе геномов аденовирусов животных и птиц.

В последнее время была продемонстрирована возможность создания векторов на основе генома Ад птиц CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) [Logunov D. и др.2004]. Интерес к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием свойств, позволяющих предположить возможность разработки эффективной эукариотической векторной системы на его основе для продукции рекомбинантных белков in vitro и in ovo: большая пакующая емкость, более высокая физическая стабильность вирионов и способность трансдуцировать клетки птиц. Последнее свойство данного аденовируса используется для создания эукариотических систем экспрессии целевых белков на основе клеток птиц, в частности в куриных эмбрионах, которые являются хорошо изученным и безопасным объектом биотехнологии, что обеспечивает чистоту получаемых продуктов от примесей различных патогенов. Таким образом, рекомбинантные аденовирусы CELO могут найти широкое применение в качестве вектора для разработки новых эукариотических систем экспрессии рекомбинантных белков, в частности интерферона бета.

Интерферон бета (ИФН-ß) относится к семейству интерферонов I типа, и подобно альфа-интерферону индуцирует множество биологических событий, включая ингибирование вирусной репликации, стимуляцию иммунной системы и ингибирование пролиферации клеток. Препараты рекомбинантного ИФН-ß нашли применение в медицине при широком спектре патологий. Это лечение, в первую очередь, рассеянного склероза, различных вирусных инфекций (вирусные гепатиты, герпесвирусные заболевания), а также злокачественной меланомы, рака молочных желез и шейки матки, волосатоклеточной лейкемии и других не менее опасных заболеваний. Однако, несмотря на безусловно доказанную медицинскую значимость этого препарата, биологически активный белок ИФН-ß производится в недостаточном количестве.

Для производства рекомбинантного белка интерферона бета человека в настоящее время используются как прокариотические, так и эукариотические системы экспрессии. Однако эти системы имеют определенные недостатки. В частности, ИФН-ß человека, синтезированный в Escherichia coli имеет низкую биологическую активность и может быть загрязнен токсичными веществами или пирогенами. Белок интерферона бета, полученный с помощью эукариотической системы экспрессии, идентичен природному по своим биохимическим, физическим и функциональным свойствам, но является токсичным для клетки-продуцента, что требует разработки более сложных систем продукции.

Таким образом, изучение возможности создания новых эукариотических систем экспрессии рекомбинантного белка ИФН-ß на основе аденовируса CELO, является актуальным направлением исследований.

Цель исследования. Целью данной работы являлась разработка новой системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного Ад птиц CELO, изучение экспрессии и биологических свойств рекомбинантного белка.

В связи с этим, в процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Исследование устойчивости клеток птиц к цитотоксическому действию бета-интерферона человека.

2. Получение рекомбинантного Ад птиц CELO, несущего ген ИФН-ß человека методом гомологичной рекомбинации в Е. coli.

3. Изучение экспрессии гена ИФН-ß человека, находящегося в составе рекомбинантного аденовируса в линии клеток LMH, и динамики накопления биологически активного рекомбинантного бета-интерферона в культуральной среде.

4. Исследование возможности использования рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-Р для получения биологически активного секретируемого белка бета-интерферона человека in ovo в куриных эмбрионах.

5. Выделение и характеристика секретируемого рекомбинантного белка бета-интерферона человека из культуральной среды клеток LMH, трансдуцированных аденовирусом СЕЬО-ИФН-ß методом аффинной хроматографии.

6. Исследование возможности использования рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-Р в генной терапии сформированных опухолей in vivo.

Научная новизна. Нами впервые были получены рекомбинантные аденовирусы птиц CELO, несущие и экспрессирующие модифицированный и исходный гены бета-интерферона человека, методом гомологичной рекомбинации в Е. coli.

Была показана экспрессия гена ИФН-ß человека, находящегося в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO, накопление рекомбинантного белка бета-интерферона в культуральной среде трансдуцированных клеток LMH и в аллантоисной жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также определеа его биологическая активность. Белок ИФН-ß человека при этом был получен в препаративных количествах и отработаны условия его выделения из культуральной среды методом аффинной хроматографии.

Впервые показана возможность использования рекомбинантного аденовируса птиц СЕЬО-ИФН-ß для генной терапии аденокарциномы А431 in vivo.

Полученные результаты демонстрируют возможность создания новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе клеток птиц с использованием рекомбинантного аденовируса птиц CELO; и конструирование нового генотерапевтического препарата ИФН-ß для терапии различных заболеваний человека, в том числе — онкологических.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Была получена новая система экспрессии рекомбинантного бета-интерферона человека in vitro на основе аденовируса птиц CELO. Апробирован способ выделения секретируемого рекомбинантного белка ИФН-ß из культуральной среды от клеток LMH, инфицированных аденовирусом СЕЬО-ИФН-ß методом аффинной хроматографии. Была показана возможность получения препарата биологически активного рекомбинантного белка ИФН-ß in ovo.

Перспективным может быть применение рекомбинантного вектора СЕЬО-ИФН-ß в генной терапии рака in vivo, так как была показана эффективная экспрессия доставляемого с помощью него гена интерферона в клетках опухоли.

Препарат рекомбинантного бета-интерферона человека, экспрессированного в культуре клеток LMH с использованием аденовирусного вектора СЕЬО-ИФН-ß, и препарат рекомбинантного аденовируса СЕЬО-ИФН-ß подготовлены к предклиническим испытаниям.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005), международной юбилейной научно-практической конференции, посвящённой 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006), V международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2006), IV Московском международном конгрессе «Экспо-биохим-технологии» (Москва, 2007), VI международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007), совместном заседании отдела генетики и молекулярной биологии бактерий, отдела медицинской микробиологии и отдела интерферонов 11 ноября 2008 г. ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Черентаева, Евгения Александровна

ВЫВОДЫ

1. Сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO, содержащий ген бета-интерферона человека, который экспрессировался в составе рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-Р в линии клеток LMH, полученный рекомбинантный белок бета-интерферона был биологически активен. Уровень экспрессии гена бета-интерферона составил 10 мкг/106 клеток.

2. Продемонстрирована экспрессия гена ИФН-Р человека в куриных эмбрионах (in ovo), зараженных рекомбинантным аденовирусом CELO-ИФН-р. Рекомбинантный белок ИФН-Р накапливается в аллантоисной жидкости в о количестве 1,7-2 мкг/мл (5x10° МЕ/мл).

3. Разработан способ выделения биологически активного рекомбинантного белка ИФН-Р человека, из культуральной среды клеток LMH, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом CELO-ИФН-Р с использованием метода аффинной хроматографии на колонке с голубой сефарозой. Выход белка ИФН-Р составил 70%.

5. Продемонстрирована возможность применения рекомбинантного аденовируса птиц CELO-ИФН-Р для терапии опухолей ш vivo. При множественных внутриопухолевых инъекциях рекомбинантного аденовируса CELO-ИФН-Р in vivo наблюдали замедление роста (в 7 раз) сформированных подкожных ксенотрансплантатов аденокарциномы А431 (у голых мышей линии D2&I).

6. Показано, что бета-интерферон, синтезированный в клетках опухоли, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом CELO-ИФН-р, значительно эффективнее (в 4,5 раза) подавляет рост опухоли по сравнению с препаратом ИФН-(3 вводимого в виде очищенного белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черентаева, Евгения Александровна, Москва

1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с.

2. Грин М. Трансформация и онкогенез, ДНК-содержащие вирусы. // "Вирусология" под ред. Филдс, "Мир", 1989.

3. Попов В.Ф., Попов О. В. // "Лекарственные формы интерферонов" — М.: Триада-Х, 2002, - 230 с.

4. Хорвиц М.С. Аденовирусы и их репликация. // "Вирусология" под ред. Филдс, "Мир", 1989.

5. Barnett B.G., Crews C.J., Douglas J.T. Targeted adenovirus vectors. // Bioch. et Bioph. Acta 2002 V.-1575, pp. 1-14.

6. Babiuk L.A., Tikoo S.K. Adenoviruses as vectors for delivering vaccines to mucosal surfaces. // J Biotechnol 2000 v.-83(l-2), pp. 105-13.

7. Baxi M.K., Robertson J., Babiuk L.A., Tikoo S.K. Mutational analysis of early region 4 of bovine adenovirus type 3. //Virology 2001 v.-290(l), pp.153-63.

8. Baxi M.K., Deregt D., Robertson J., Babiuk L.A., Schlapp Т., Tikoo S.K. Recombinant bovine adenovirus type 3 expressing bovine viral diarrhea virus glycoprotein E2 induces an immune response in cotton rats. // Virology 2000 v. -278(1), pp. 234-243.

9. Bergelson J.M., Krithivas A., Celi L., Droguett G., Horwitz M.S., Wickham Т., Crowell R.L., Finberg R.W. The murine CAR homolog is a receptor for coxsackie В viruses and adenoviruses. // J. Virol. 1998 v. 72(1), pp. 415-419.

10. Berkner K.L. (1988). Development of adenovirus vectors for the expression of geterologous genes. Biotechniques, 6, 616-629. ICTVdB The universal virus database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ICTVdB/

11. Bett A .J., Haddara W., Prevec L., Graham F.L. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, v.-91, pp.-8802-8806.

12. Blomer U., Naldini L., Kafri T., Trono D., Verma I.M., Gage F.H. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. // J Virol 1997 v. 71(9), pp. 6641-9.

13. Buchen-Osmond C., (2003) 00.001. Adenoviridae. In: ICTVdB The Universal Virus Database, version 3. ICTVdB Management, The Earth Institute and Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, New York, NY, USA.

14. Both G.W. Ovine adenovirus: a review of its biology, biosafety profile and application as a gene delivery vector. // Immunol Cell Biol 2004 v. 82(2), pp. 189-95.

15. Bouri K., Feero W.G., Myerburg M.M., Wickham T.J., Kovesdi I., Hoffman E.P., Clemens P.R. Poly lysine modification of adenoviral fiber protein enhances muscle cell transduction. // Hum. Gene Ther., 1999, v. 10, pp. 1633-1640.

16. Buchschacher G.L., Jr, Wong-Staal F. Development of lentiviral vectors for gene therapy for human diseases. // Blood 2000 v. (8), pp. 2499-2504.

17. Buller R.M., Chakrabarti S., Cooper J.A., Twardzik D.R. and Moss B. Deletion of the vaccinia virus growth factor gene reduces virus virulence. // J Virol 1988 v. -62, pp. 866-874.

18. Cao J.X., Krell P.J., Nagy E. Sequence and transcriptional analysis of terminal regions of the fowl adenovirus type 8 genome. // J Gen Virol 1998 v. 79, pp. 2507-16.

19. Chu G., Hayakawa H., Berg P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cell with DNA. // Nucleic Acids Res 1987 v. 15, pp. 1311-1326.

20. Chen C., Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. //Mol. Cell. Biol 1991 v. 7, pp. 2745-2752.

21. Chiocca S., Kurzbauer R., Schaf&ier J., Baker A., Maunter V., Cotten M. The complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO. // J Virol 1996 v. 70, pp. 2939-2949.

22. Chiocca S., Baker A., Cotten M. Identification of a novel antiapoptotic protein, GAM-1, encoded by the CELO adenovirus. // J Virol 1997 v. 71, pp. 3168-3177.

23. Chiocca S., Kurtev V., Colombo R., Boggio R, Sciurpi M.T., Brosch G., Seiser C., Draetta G.F., Cotten M. Hystone Deacetylase 1 inactivation by an adenovirus early gene product. // Curr. Biol 2002 v. 12, pp. 594-98.

24. Child S.J., Palumbo G.J., Buller R.M., Hruby D.E. Insertional inactivation of the large subunit of ribonucleotide reductase encoded by vaccinia virus is associated with reduced virulence in vivo. // Virol 1990 v. -174, pp. 625-29.

25. Chen H.H., Mack L.M., Kelly R., Ontell M., Kochanek S., Clemens P.R. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997 v. 94(5), pp. 1645-1650.

26. Chillon M., Kremer E.J. Trafficking and propagation of canine adenovirus vectors lacking a known integrin-interacting motif. // Hum Gene Ther 2001 v. -12(14), pp. 1815-1823.

27. Clemens P.R., Kochanek S., Sunada Y., Chan S., Chen H.H., Campbell K.P., Caskey CT. In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with an adenoviral vector that lacks all viral genes. // Gene Ther 1996 v. 3(11), pp. 965972.

28. Cowen B., Calnek B.W., Menendez N.A., Ball R.F. Avian adenoviruses: effect on egg production, shell quality, and feed consumption. // Avian Dis 1978 v. -22(3), pp. 459-470.

29. Cotten M., Wagner E., Zatloukal K., Birnstiel M.L. Chicken adenovirus (CELO virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants. // J Virol 1993 v. 67(7), pp. 3777-3785.

30. Damdinsuren B., Nagano H., Sakon M. // Ann. Surg.Oncol 2003 v. 10,pp. 1184-1190.

31. Davison A.J., Benko M., Harrach B. Genetic content and evolution of adenoviruses. // J Gen Virol 2003 v. 84, pp. 2895-908.

32. Dinesh S.B., Suresh K.M. Development of nonhuman adenoviruses as vaccine vectors. // Vaccine 2006 v. 24, pp. 849-862.

33. Douglas J.T., Rogers B.E., Rosenfeld M.E., Michael S.I., Feng M., Curiel D.T. Targeted gene delivery by tropism-modified adenoviral vectors. // Nature Biotechnology 1996 v. 14, pp. 1574-1578.

34. Douglas J.T., Miller C.R., Kim M., Dmitriev I., Mikheeva G., Krasnykh V., Curiel D.T. A system for the propagation of adenoviral vectors with genetically modified receptor specificities. // Nat Biotechnol 1999 v. 17(5), pp. 470-4.

35. Douglas J.T. Adenoviral vector for gene therapy. // Mol Biothechnol 2007 v. -36, pp. 71-80.

36. Engelhardt J.F., Ye X., Doranz B., Wilson J.M. Ablation of E2A in recombinant adenoviruses improves transgene persistence and decreases inflammatory response in mouse liver. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, v. 91, pp. 6196-6200.

37. Evans PS, Benko M, Harrach B, Letchworth GJ. Sequence, transcriptional analysis, and deletion of the bovine adenovirus type 1 E3 region. // Virology 1998 v.-244(l), pp. 173-85.

38. Feigner P.L. Improvements in cationic liposomes for in vivo gene transfer. // Hum Gene Ther 1996 v. 7, pp. 1791-1793.

39. Ferrari F.K., Samulski T., Shenk T., Samulski RJ. Second-strand synthesis is a rate-limiting step for efficient transduction by recombinant adeno-associated virus vectors. // J Virol 1996 v. 70(5), pp. 3227-3234.

40. Flotte T.R., Carter BJ. Adeno-associated virus vectors for gene therapy. // Gene Ther 1995 v. 2, pp. 357-362.

41. Francois A., Eterradossi N., Delmas B., Payet V., Langlois P. Construction of avian adenovirus CELO recombinants in cosmids. // J Virol 2001 v. 75, pp. 5288-5301.

42. Freund C.T., Sutton M.A., Dang T., Contant C.F., Rowley D., Lerner S.P. Adenovirus-mediated combination suicide and cytokine gene therapy for bladder cancer. // Anticancer Res 2000 v. 20(3A), pp. 1359-65.

43. Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L., Falck-Pedersen E. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes. // J Virol 1996 v. 70(4), pp. 2116-2123.

44. Glotzer J.B., Saltik M., Chiocca S., Michou A.I., Moseley P., Cotten M. Activation of heat-shock response by an adenovirus is essential for virus replication. // Nature 2000 v. 407(6801), pp. 207-211.

45. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. // J. Gen. Virol., 1977, v. -36(1), pp. 59-74.

46. Graham F.L. Transformation by and oncogenicity of human adenoviruses. // The Adenoviruses. ed.H.S.Ginsberg, 1984.

47. Hemminki A., Kaverna A., Kremer E.J., Bauerschmitz G.J., Smith B.F., Liu B. A canine conditionally replicating adenovirus for evaluating oncolytic virotherapy in a singeneic animal model. // Mol Ther 2003 v. 7(2), pp. 163-73.

48. Hess M., Cuzange A., Ruigrok R.W.H., Chroboczek J., Jacrot B. The avian adenovirus penton: two fibres and one base. // J Mol Biol 1995 v. 252, pp. 379385.

49. Hillerman M.R., Werner J.H. Recovery of new agents from patientes with acute respiratory illness. //Proc Soc Exp Biol Med 1954 v. 85, pp. 183-188.

50. Hofinann C., Loser P., Cichon G., Arnold W., Both G.W., Strauss M. Ovine adenovirus vectors overcome preexisting humoral immunity against human adenoviruses in vivo. // J Virol 1999 v. 73(8), pp. 6930-6.

51. Horiguchi Y., Larchian W.A., Kaplinsky R., Fair W.R, Heston W. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene terapy in orthotopic murine bladder cancer model. // Gene Ther 2000 v. 7, pp. 844-851.

52. Imler J.L. Adenovirus vector as recombinant viral vaccines. // Vaccine 1995 v. -13, pp. 1143-1151.

53. Jacobs A., Breakefield X.O., Fraefel C. HSV-l-based vectors for gene therapy of neurological diseases and brain tumors: part II. Vector systems and applications. //Neoplasia 1999 v. 1, pp. 402-416.

54. Johnson M.A., Pooley C., Lowenthal J.W. Delivery of avian cytokines by adenovirus vectors. // DevCompImmunol 2000 v. 24(2-3), pp. 343-54.

55. Ju D.W., Wang B.M., Cao X. Adenovirus-mediated combined suicide gene and interleukin-2 gene therapy for the treatment of established tumor and induction of antitumor immunity. // J Cancer Res Clin Oncol 1998 v. 124(12), pp. 683-9.

56. Karlsson S., Van Doren K., Schweiger S.G., Nienhuis A.W., Gluzman Y. Stable gene transfer and tissue-specific expression of a human globin gene using adenoviral vectors. // EMBO J 1986 v. 5(9), pp. 2377-2385.

57. Karpusas M., Whitty L., Runkel L., Hochman P. The structure of human interferon beta implications for activity. // Cell. Mol. Life Sci. 1998 v. — 54, pp. 1203-1216.

58. Kawaguchi T., Nomura K., Hirayama Y., Kitagawa T. Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. // Cancer Res 1987 v. 47(16), pp. 4460-4464.

59. Kaynor C., Xin M., Wakefield J., Barsoum J., Qin X.Q. Direct evidence that IFN-beta functions as a tumor-suppressor protein. // J. Interferon Cytokine Research 2002 v. 22, pp. 1089-1098.

60. Krasnykh V.N., Mikheeva G.V., Douglas J.T., Curiel D.T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. // J Virol 1996 v. 70(10), pp. 6839-6846.

61. Kremer E.J., Boutin S., Chillon M., Danos O. Canine adenovirus vectors: an alternative for adenovirus-mediated gene transfer. // J Virol 2000 v. 74(1), pp. 505-512.

62. Kundig T.M., Kalberer C.P., Hengartner H., Zinkernagel R.M. Vaccination with two different vaccinia recombinant viruses: long-term inhibition of secondary vaccination. // Vaccine 1993 v. -.11, pp. 1154-8.

63. Laver W.G., Younghusband H.B., Wrigley N.G. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). // Virology 1971 v. -45(3), pp. 598-614.

64. Lee R.J., Low P.S. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis. // J Biol Chem 1994 v. 269, pp. 3198-3204.

65. Lehrmarin H. and Cotten M. Characterization of CELO virus proteins that modulate the pRb/E2F pathway. // J Virol 1999 v. 73, pp. 6517-6525.

66. Leon R.P., Hedlund T., Meech S.J., Li S., Schaack J., Hunger S.P., Duke R.C., DeGregori J. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, v. 95(22), pp. 13159-13164.

67. Lewis P.F., Emerman M. Passage through mitosis is required for oncoretroviruses but not for the human immunodeficiency virus. // J Virol 1994 v. -68(1), pp. 510-6.

68. Li P., Bellett A.J.D., Parish C.R. The structural proteins of chick embryo lethal orphan virus (fowl adenovirus type 1). // J Gen Virol 1984 v. 65, pp. 1803-1815.

69. Lichtenberg D. Liposomes: preparation, characterization, and preservation. // Methods Biochem Anal 1988 v. 33, pp. 337-468.

70. Lieber A., He C.Y., Polyak S.J., Gretch D.R., Barr D., Kay M.A. Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human hepatocytes by adenovirus-mediated expression of ribozymes. //J Virol 1996 v. 70(12), pp. 8782-8791.

71. Litzinger D.C., Huang L. Phosphatidylethanolamine liposomes: drug delivery, gene transfer and immunodiagnostic applications. // Biochim Biophys Acta 1992 v. 1113, pp. 201-227.

72. Loser P., Kumin D., Hillgenberg M., Both G.W., Hofmann C. Preparation of ovine adenovirus vectors. // Methods Mol Med 2002 v. 69, pp. 415-26.

73. Loser P., Hofmann C., Both G.W., Uckert W., Hillgenberg M. Construction, resque, and characterization of vectors derived from ovine atadenovirus. // J Virol 2003 v. 77(22), pp. 11941 -51.

74. Mathias P., Wickham T., Moore M., Nemerow G. Multiple adenovirus serotypes use alpha v integrins for infection. // J Virol 1994 v. 68(10), pp. 68116814.

75. Meager A. and Das R.G. // J. Immunol. Methods 2005 v. 306, pp. 1-15.

76. Medin J.A., Fowler D.H. Post-transduction events in retrovirus-mediated gene therapy involving hematopoietic stem cells: beyond efficiency issues. // Cell Biochem Suppl 2002 v. 38, pp. 46-54.

77. Michou A., Lehrmann H., Saltik M., Cotten M. Mutational analysis of the avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors. // J Virol 1999 v. 73, pp. 1399-1410.

78. Misaki R. N-linked glycan structures of mouse interferon-beta produced by Bombyx mori larvae. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003 v. 311(4), pp. 979-986

79. Mittal S.K., Prevec L., Graham F., Babiuk L.A. Development of a bovine adenovirus type 3-based expression vector. // J Gen Virol 1995 v.-76,pp.93-102.

80. Morrison M.D., Onions D.E., Nicolson L. Complete DNA sequence of canine adenovirus type 1. // J Gen Virol 1997 v. 78(4), pp. 873-8.

81. Morrison M.D., Reid D., Onions D., Spibey N., Nicolson L. Generation of E3-deleted canine adenoviruses expressing canine parvovirus capsid by homologous recombination in bacteria. // Virology 2002 v. 293(1), pp. 26-30.

82. Murata M., Nabeshima S., Kikuchi K. // Cytokine 2006 v. 33, pp. 121-128.

83. Naldini L., Blomer U., Gallay P., Ory D., Mulligan R., Gage F.H., Verma I.M., Trono D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. // Science 1996 v. 272(5259), pp. 263-7.

84. Nemerow G.R., Stewart P.L. Role of alpha (v) integrins in adenovirus cell entry and gene delivery. // Microbiol Mol Biol Rev 1999 v.- 63(3), pp.725-734.

85. Nermut M.V. The architecture of adenoviruses. // The Adenoviruses, ed. By H.S. Ginsberg, 1984.

86. Nguyen J.T., Wu P., Clouse M.E., Hlatky L., Terwilliger E.F. Adeno-associated virus-mediated delivery of antiangiogenic factors as an antitumor strategy. // Cancer Res 1998 v. 58, pp. 5673-5677.

87. Okuda Y., Ono M., Yazawa S., Shibata I., Sato S. Experimental infection of specific-pathogen-free chickens with serotype-1 fowl adenovirus isolated from a broiler chicken with gizzard erosions. // Avian Dis 2001 v. 45(1), pp. 19-25.

88. Olsen J.C. Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus. // Gene Ther 1998 v. 5, pp. 1481-1487.

89. Ono M., Okuda Y., Yazawa S., Shibata I., Tanimura N., Kimura K., Haritani M., Mase M., Sato S. Epizootic outbreaks of gizzard erosion associated with adenovirus infection in chickens. // Avian Dis 2001 v. 45(1), pp. 268-275.

90. Paoletti E., Taylor J., Meignier B., Meric C., Tartaglia J. Highly attenuated poxvirus vectors: NYVAC, ALVAC and TROVAC. // Dev Biol Stand 1995 v. -84, pp. 159-63.

91. Payet V., Arnould C., Picault J.P. // J. Virol 1998 v. 72, pp. 9278-9285.

92. Pestka S., Krause CD, Walter MR. //Immunological Reviews 2004 v. 202, pp. 8-32.

93. Pestka S. // J Biol Chem 2007 v. 282(28), pp. 20047-20051.

94. Poeschla E.M., Wong-Staal F., Looney D.J. Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. // Nat Med 1998 v. 4(3), pp. 354-7.

95. Reddy P.S., Idamakanti N., Zakhartchouk A.N., Baxi M.K., Li J.B., Pyne C. Nucleotide sequence, genome organization, and transcription map of bovine adenovirus type 3. // J Virol 1998 v. 72(2), pp. 1394-402.

96. Reddy P.S., Idamakanti N., Zakhartchouk L.N., Babiuk L.A., Mehtali M., Tikoo S.K. Optimization of bovine coronavirus hemagglutinin-estrase glycoprotein expression in E3 deleted bovine adenovirus-3. // Virus Res 2000 v. -70(1-2), pp. 65-73.

97. Reddy P.S., Idamakanti N., Chen Y., Whale T., Babiuk L.A., Mehtali M., Tikoo S.K. Replication-defective bovine adenovirus type 3 as an expression vector. // J Virol 1999 v. 73(11), pp. 9137-9144.

98. Reddy P.S., Idamakanti N., Hyun B.H., Tikoo S.K., Babiuk L.A. Development of porcine adenovirus-3 as an expression vector. // J Gen Virol 1999 v. 80(3), pp. 563-570.

99. Reddy P.S., Idamakanti N., Babiuk L.A., Mehtali M., Tikoo S.K. Porcine adenovirus-3 as a helper-dependent expression vector. // J Gen Virol 1999 v. -80(11), pp. 2909-2916.

100. Rodriguez J., Spearman M., Huzel N., and Butler M. Enhanced Production of Monomelic Interferon Beta by CHO Cells through the Control of Culture conditions // Biotechnol. Prog. 2005 v. 21, pp. 22-30.

101. Romano G., Pacilio C., Giordano A. Gene transfer technology in therapy: current applications and future goals. // Stem Cells 1999 v. 17, pp. 191-202.

102. Rowe W.P., Huebner R .J., Gilmor L.K., Parrott R.H., Ward T.G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoigs spontaneous degeneration in tissue culture. // Proc Soc Exp Biol Med 1953 v. 84, pp. 570-573.

103. Sandhya Rani M.R., Ransohoff R.M. // J. Interferon Cytokine Research 2005 v. 25, pp. 788-798.

104. Shayakhmetov D.M., Papayannopoulou T., Stamatoyannopoulos G., Lieber A. Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector. // J. Virol., 2000, v. 74, pp. 2567-2583.

105. Shenk T. Adenoviridae: the viruses and their replication. // Fields virology. / Eds Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. Fhiladelfhia: 3rd ed. Lippincott-Raven Publishers, 1996, pp. 2111-2148.

106. Sheppard M., Werner W., Tsatas E., McCoy R., Prowse S., Johnson M. Fowl adenovirus recombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induces protective immunity against bursal disease. // Arch Virol. 1998 v. 143(5), pp. 915-930.

107. Shiau A.L., Lin C.Y., Tzai T.S., Wu C.L. Postoperative immuno-gene therapy of murine bladder tumor by in vivo administration of retroviruses expressing mouse interferon-gamma. // Cancer Gene Ther 2001 v. 8(1), pp. 73-81.

108. Smith G.L., Moss B. Infectious poxvirus vectors have capacity for at least 25 000 base pairs of foreign DNA. // Gene 1983 v. 25, pp. 21-28.

109. Straus S.E. Adenovirus infection in humans. // The Adenoviruses, ed. by HS.Ginsberg, 1984.

110. Tan P.K., Michou A., Bergelson J.M., Cotten M. Defining CAR as a cellular receptor for the avian adenovirus CELO using a genetic analysis of the two viral fibre proteins. //J Gen Virol 2001 v. 82, pp. 1465-1472.

111. Tartaglia J., Bonnet M.C., Berinstein N., Barber B., Klein M., Moingeon P. Therapeutic vaccines against melanoma and colorectal cancer. // Vaccine 2001 v. -19, pp. 2571-2575.

112. Tartaglia J., Perkus M.E., Taylor J., Norton E.K., Audonnet J.C., Cox W.I., Davis S.W., van der Hoeven J., Meignier B., Riviere M. NYVAC: a highly attenuated strain of vaccinia virus. // Virology 1992 v. 188, pp. 217-232.

113. Tomko R.P., Xu R., Philipson L. HCAR and MCAR: the human and mouse cellular receptors for subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses. // Proc Natl Acad Sci USA 1997 v. 94(7), pp. 3352-3356.

114. Tuboly T., Nagy E. Sequence analysis and deletion of porcine adenovirus serotype 5 E3 region. // Virus Res 2000 v. 68(2), pp. 109-17.

115. Vile R.G. A marriage of viral vectors. // Nature Biotech 1997 v. 15, pp. 840841.

116. Vile R.G., Russell S.J., Lemoine NR. Cancer gene therapy: hard lesson and new courses. // Gene Ther 2000 v. 7, pp. 2-8.

117. Volpers C., Kochanek S. Adenoviral vectors for gene transfer and therapy. // J Gene Med 2004 v. 6, pp. 164-171.

118. Vrati S., Brookes D.E., Strike P., Khatri A., Boyle D.B., Both G.W. Unique genome arrangement of an ovine adenovirus: identification of new proteins and proteinase cleavage sites. // Virology 1996 v. 220(1), pp. 186-99.

119. Walling H.W., Swarthout J.T., Culver K.W. Bystander-mediated regression of osteosarcoma via retroviral transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase and human interleukin-2 genes. // Cancer Gene Ther 2000 v. 7(2), pp. 187-96.

120. Wang G., Williams G., Xia H., Hickey M., Shao J., Davidson B.L., McCray P.B. Apical barriers to airway epithelial cell gene transfer with amphotropic retroviral vectors. // Gene Ther 2002 v. 9(14), pp. 922-31.

121. Wickham T.J., Mathias P., Cheresh D.A., Nemerow G.R. Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. // Cell 1993 v. 73(2), pp. 309-319.

122. Wickham T.J., Roelvink P.W., Brough D.E., Kovesdi I. Adenovirus targeted to heparan-containing receptors increases its gene delivery efficiency to multiple cell types. //Nat. Biotechnol., 1996, v. 14, pp. 1570-1573.

123. Wilderman M.J., Kim S., Gillespie C.T. // Molecul. Therapy 2005 v. 13(5), pp. 910-7.

124. Wilson D.R. Viral-mediated gene transfer for cancer treatment. // Current Pharm Biotechnol 2002 v. 3, pp. 151-164.

125. Wu S.C., Huang G.Y., Liu J.H. Production of retrovirus and adenovirus vectors for gene therapy: a comparative study using microcarrier and stationary cell culture. // Biotechnol Prog 2002 v. 18(3), pp. 617-22.

126. Yates V.J., Fry D.E. Observations on a chicken embryo lethal orphan (CELO) virus. // Am J Vet Res 1957 v. 18, pp. 657-660.

127. Zhou Y., Tikoo S.K. Analysis of early region 1 of porcine adenovirus type 3. // Virology 2001 v. 291(1), pp. 68-76.

Информация о работе

Черентаева, Евгения Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Создание новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса птиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Создание новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса птиц - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы