Модификация отростка пентона аденовируса птиц CELO для получения вектора с измененным тропизмом, способного к эффективной трансдукции клеток млекопитающих

Зубкова, Ольга Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модификация отростка пентона аденовируса птиц CELO для получения вектора с измененным тропизмом, способного к эффективной трансдукции клеток млекопитающих
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Модификация отростка пентона аденовируса птиц CELO для получения вектора с измененным тропизмом, способного к эффективной трансдукции клеток млекопитающих"

На правах рукописи

ЗУБКОВА ОЛЬГА ВАДИМОВНА

МОДИФИКАЦИЯ ОТРОСТКА ПЕНТОНА АДЕНОВИРУСА ПТИЦ CELO ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕКТОРА С ИЗМЕНЕННЫМ ТРОПИЗМОМ, СПОСОБНОГО К ЭФФЕКТИВНОЙ ТРАНСДУКЦИИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03 00 03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2008 г

003168684

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф Гамалеи РАМН (ГУ НИИЭМ им. Н Ф. Гамалеи РАМН) и Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМнБ)

Научные руководители.

Кандидат биологических наук Логунов Денис Юрьевич

Доктор ветеринарных наук, профессор Белоусова Раиса Васильевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук,

Ачьтштейн Анатолий Давидович Забережный Алексей Дмитриевич

Ведущая организация'

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО МГУПБ)

Защита состоится «19» мая 2008 г в 12-00 часов на заседании диссертационного совета Д 001 020 01 в ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (адрес 123098, Москва, ул Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусочогии им Д И Ивановского РАМН

Автореферат разослан «/А> апреля 2008 г

«Д>г

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актлачьность проблемы Аденовирусы (Ад), наряду с другими ДНК-содерлащнми вир) сами, представляют собой широко используемую модель в молекутярно-биочогических биомедицинских и биотехнологических исследованиях В последнее десятилетие интенсивно исследуется возможность использования в качестве векторных систем для доставки чужеродной генетической информации Ад четовека 5-го серотипа (Ад5) Векторы на основе генома Ад5 обладают рядом неоспоримых преимуществ, к которым относятся широкая тропность, способность расти в высоком титре и безопасность В тоже время следует отметить ряд недостатков этой векторной системы, в частности, недостаточная пакующая емкость, высокая себестоимость препаратов рекомбинантных Ад, предсуществующий иммунный ответ в организме человека В связи с этим большой интерес вызывает возможность создания новых векторных систем на основе геномов аденовирусов птиц лишенных лих недостатков

Перспективным вектором для доставки генов в клетки млекопитающих m vivo является аденовирус птиц 1-го серотипа (CELO) Вирус имеет типичную для всех аденовирусов икосаэдрическую форму капсида, который состоит из капсомеров гексона и пептона, диаметр вириона составляет 70-80 нм Геном Ад CELO представлен линейной двухцепочечной молекулой ДНК Преимуществами векторов на основе генома CELO являются большая пакующая емкость и более высокая физическая стабильность вирионов Ад CELO, чем вирионов Ад млекопитающих, непермиссивность клеток человека и животных для данного вируса, отсутствие первичного иммунного ответа в организме млекопитающих, возможность наращивания вируса в куриных эмбрионах, что значительно снижает стоимость получения препаративных количеств Ад CELO по сравнению с Ад человека

Недавние исследования показали, что вирус CELO может быть использован в качестве вектора для доставки генетической информации в генной терапии и вакцинации (Карпов А и соавт, 2007, Logunov D Y et al, 2004, Francois A et al, 2004) Однако практическое применение векторов на основе CELO ограничено вследствие недостаточной эффективности транедукции определенных типов клеток млекопитающих

Для решения проблемы, связанной с ограниченной эффективностью транедуции клеток млекопитающих векторами на основе Ад человека, разработаны подходы, заключающиеся в генетической модификация отростка пептона (фибера) Данные подходы включают конструирование «химерных» фиберов (замена глобулярного домена на соответствующий домен альтернативного серотипа Ад) или введения различных гетерологичных рецептор-связывающих последовательностей на С-конец или в Ш-петлю

глобулярного домена фибера Такие модифицированные векторы способны обеспечивать эффективную доставку генетической информации в клетки млекопитающих, в норме резистентных к Ад инфекции

В отличие от Ад человека, в каждой вершине вириона CELO находится два фибера различной длины Длинный фибер CELO способен к взаимодействию с основным аденовирусным рецептором - CAR (coxsackie and adeno\irus receptor) и, в отличие от короткого фибера, несущественен для сборки и проникновения вируса в пермиссивные клетки (Tan РК et al, 2001) Такая структурно-функциональная организация капсида CELO позволяет предположить возможные направленные модификации длинного фибера, с целью повышения тропности вируса по отношению к определенным типам клеток млекопитающих В связи с этим исследования связанные с созданием фибер-модифицированных векторов CELO, представляет самостоятельный научный интерес

Цель н задачи исследования Целью настоящей работы являлось создание на основе вируса CELO с модифицированным тропизмом векторных систем, способных к эффективному переносу генетической информации в CAR-дефицитные и/или CAR-негативные клетки млекопитающих т \itro и w vivo

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи

1 Идентификация участков в аминокислотной последовательности глобулярного домена длинного фибера вируса CELO пригодных для модификации вирусного тропизма

2 Получение модифицированных вирусных векторов, содержащих в качестве гетерологичного лиганда интегрин-связывающую последовательность RGD внутри идентифицированных петель глобулярного домена длинного фибера CELO, и несущих репортерный ген SLAP или EGFP под контролем CMV-промотора

3 Опредетение эффективности доставки генетической информации модифицированными векторами CELO в экспериментах по трансдукции различных культур клеток

4 Изучение механизма проникновения модифицированных векторов CELO в клетки млекопитающих

5 Исследование влияния последовательности RGD на проникновение модифицированных векторов CELO в клетки млекопитающих

6 Определение эффективности доставки репортерного гена SEAP, встроенного в геном модифицированных векторов CELO в CAR-дефицигные клетки млекопитающих в экспериментах т г ¡vo

7 Изучение возможности экспрессии гена лактоферрина человека модифицированными векторами CELO в молочной железе козы

Научная новизна и практическая значимость В результате проведенной работы впервые идентифицирована HI-петля в аминокислотной последовательности глобулярного домена длинного фибера аденовируса птиц CELO

Впервые получены векгоры на основе аденовируса птиц CELO, содержащие последовательность RGD в структуре длинною фибера, и несущие репортерные гены SEAP или EGFP под контролем CMV промотора (CELOSFAP-HIRGD, CEI OEGFP-HIRGD, CELOSEAP-RGD и CbLOEGFP-RGD) Показано, что введение интегрин-связываюшей последовательности RGD в HI-петлю глобулярного домена длинного фибера не влияет на исходные функции данного белка, не снижает способность CELO к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах и приводит к изменению тропизма вируса

Методом ПЦР в режиме реального времени и по уровню экспрессии репортерных генов показано увеличение эффективности транедукции CAR-дефицитных и CAR-негативных клеточных культур модифицированными векторами CELO (CEI OSE\Р-HIRGD, CELOEGFP-HIRGD)

Впервые показан CAR-независимый механизм транедукции клеток млекопитающих модифицированным вектором CELO-HIRGD Определено увеличение процессов прикрептения и интернализации вектора CELO-HIRGD в клетки млекопитающих

В ходе работы показано увеличение экспрессии трансгена (SEAP), встроенною в геном модифицированного CELO вектора (CELOSEAP-HIRGD) при транедукции CAR-дефицигных клеток млекопитающих в условиях m vno

Впервые показана эффективная доставка и экспрессия тепа лактоферрина человека модифицированным вектором CELOLÍ-HIRGD в молочной железе козы

Работа представляет не только научный интерес, но и в перспективе может иметь практическое применение Модифицированные Ад нтиц CELO могут быть использованы в качестве средств доставки и экспрессии целевых генов с целью применения таких векторов в медицине и ветеринарии в качестве генно-инженерных вакцин, для создания средств профилактики различных заболеваний, а также в генной терапии

Научная новизна проведенных исследований подтверждена патентом положительное решение о выдаче Патента Российской Федерации на изобретение по заявке №2007121785 «Способ создания рекомбинантных аденовирусов птиц для вакцинации и генной терапии»

Апробация работы Результаты работы были представтены на научно-

практической конференции молодых ученых и аспирантов «Современные проблемы биохимии и биофизики в биологи и медицине», ФГУВПО МГАВМиБ им К И Скрябина (Москва, 2005), международной юбилейной на\чно-практическои конференции посвященной 110-летию Курской биофабрики и aiробиологической промышленности России (Курск, 2006) V международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биочогическая безопасность населения», ГОУ ВПО МГУПБ (Москва, 2006) научно-практической конференции посвященной 40-тетию ВБФ и 110-летию С И Афонскою «Вопросы физико-химической биотогии в ветеринарии», ФГУВПО М1АВМиБ им К И Скрябина (Москва, 2006), международной русско-французской конференции «Virus vectors for gene function study, gene therapy, veterinary and biomedical applications)/, ГУНИИЭМ им H Ф Гамалеи (Москва, 2007), межкафедральном научном совещания сотрудников кафедр ветеринарной вирусологии микробиологии, иммунотогии и биотехнологии ФГОУ ВПО «МГАВМиБ» 20 февраля 2008г

Публикации. По материалам диссертации опубчиковано 6 печатных работ в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 4 статьи в сборниках конференций

Структура диссертационной работы Диссертация изчожена на 135 страницах, включает 2 таблицы, 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, списка используемой литерагуры (включающего 229 наименований, в том числе 225 на иностранных языках)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материачы и методы исследований В экспериментальной части работы использованы рекомбинантные аденовирусы CELO-SEAP, любезно предоставленный к б н Логуновым Д Ю (ГУ НИИЭМ), CELO-EGFP, любезно предоставленный мне Черентаевой Е А (ГУ НИИЭМ), Ad5-SEAP и Ad5-EGFP, любезно предоставленный м н с Карповым А П (ГУ НИИЭМ), Ad5-Lf и CELO-Lf, любезно предоставленный мне Тутыхиной И Л (ГУ НИИЭМ)

В работе использованы лабораторные штаммы Е coli DH5a и BJ5183

В работе использовали клетки линий 293 (клетки эмбриональной почки человека, трансформированные El-областью Ад5), НСТ-116 (аденокарцинома точетого кишечника человека), Н1299 (аденокарцинома легкого человека), ACHN (карцинома почки чечовека), Н596 (аденокарцинома бронхов человека), MCF-7 (карцинома молочной железы человека), СНО (эпителий яичника китайского хомячка), клетки линии LMH (клегки гепатомы петуха леггорна) Первичная культура клеток молочной железы кролика любезно предоставчена к б н Грезиной Н М (ВИЖ РАСХН)

В работе были использованы мыши линии BALB/c, кролики породы Шиншилла, козы породы Зааненская

Введение последовательности RGD в структуру глобулярного домена длинного фибера CELO проводили с помощью ГЩР-мутагенеза (Logunov D Y et al, 2007) Модифицированные Ад CELO получили методом гомологичной рекомбинации в Ь coli BJ5183 (Michou A L et al, 1999)

Трансфемшю клеточных линий проводили методом липофекции Все манипуляции, связанные с получением рекомбинантных аденовирусов проводили согласно Graham & Prevec (1991) Векторы на основе генома CELO наращивали в SPF эмбрионах кур (Laver W G et al, 1971)

Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методикам, изложенным в Maniatis et al (1982) Определение активности SEAP (секрелируемой щелочной фосфатазы) проводили по методу Berger (1988) Экспрессию EGFP (зеленый флюоресцирующий белок) определяли с помощью флуоресцентной микроскопии и проточным цитометрическим анализом Экспрессию CAR и интегринов определяли методом ОТ-ПЦР Определение количества геномов аденовирусов проводили методом ПЦР в реальном времени

2 Результаты и их обсуждения

21 Идентификация in sihco участков аминокислотной последовательности глобулярного домена длинного фибера вируса CELO пригодных для модификации вирусного тропизма. Ввиду отсутствия данных о трехмерной структуре длинного фибера CELO на первом этапе нашей работы был проведен биоинформатический анализ этого белка С помощью программ PSI-PRED и JPRED (Cuff J A et al, 1998, Jones D1 1999) были предсказаны вторичные структуры глобулярных доменов длинного фибера аденовируса плиц CELO и Ад5 и проведено их структурное выравнивание

В результате анализа мы определили последовательность в С-концевой части глобулярного домена длинного фибера CELO гомологичную соответствующему участку фибера Ад5 (см рис 1) По данным программы PSI-PRED предсказан ß-тяж в данной области длинного фибера CELO, который соответствует J ß-тяжу фибера Ад5 У Ад5 этот участок экспонирован наружу белковой глобулы и играет важную роль в межсубъединичном взаимодействии Согласно номенклалуре Xia D следующими ß-тяжами располагающимися по направлению к N-концу глобулярного домена длинного фибера CELO, являются I, H и G тяжи (Xia D et al, 1994) Подтверждением правильного предсказания ß-тяжей является присутствие последовательности VTY перед G ß-ляжом

глобулярного домена длинного фибера CELO, соответствующего G Р-тяжу <\д5 Исходя из этого мы предположили, что в структуре длинного фибера CEIО между р-тяжами Н и 1 присутствует выступающая наружу петля HI, соответствующая таковой фибера Ад5

А 710 720 730 740 750 760 770 780 790 G Н X J

ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЬЕЕЕЕ ЕЕ EELEEE

ESNLVTVT"lHrKPTG3CQIQASGELÍVAARI't,PV0TTKYELiyLGFTLi<QIISS'~,TMFFDP4NASSDLSFLTPPIPFrYLG 'YO

510 520 530 540 550 560 570 580

G Н I J

ЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕ EF ЕЕЕЕЕЕЕ

KS-lS''TAKSNIv'SQi/YLNGDKTKPVTLTITLNGTCETGDTIPSAYSCSFSWDW'=Gh1IHEIFAT3bYTFSIIAQr

Рис 1. Аминокислотная последовательность С-концевой области ыобулирного домена длинного фибера CELO (А) и глобулярного домена фибера Ад5 (В) Буквами «Е» обозначены последовательности р - тяжей, предсказанные с помощью программ PRED и JPRED. Буквами G, Н, I и J обозначены р - тяжи согласно номенклатуре Xia D

Полученные в нашей работе данные о расположении HI- петли в длинном фибере CELO впоследствии были подтверждены в исследовании Guardado-Caho Р и соавт, которые определили трехмерную структуру глобулярного домена длинною фибера CELO и показали локализацию экспонированных наружу петель (Guardado-Calvo Р et al, 2007)

Таким образом, по аналогии с Ад5 было выбрано два участка в составе С-концевой последовательности глобулярного домена длинного фибера CELO для введения модификаций в область J Р-тяжа непосредственно перед стоп-кодоном (Gln793) и между аминокислотами Рго744 и Val745 (последовательность, которая примерно соответствует середине HI-петли кпоЬ-домена фибера Ад5)

Работа проводилась совместно с д б н Карягиной-Жучиной А С (ГУ НИИЭМ) 2 2 Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих последовательность RGD в глобулярном домене длинного фибера Основываясь на исследованиях проведенных с Ад векторами, в качестве гетерологичной рецептор-связывающей последовательности для модификации тропизма вируса CELO была выбрана интегрин-связывающая последовательность RGD (Arg-Gly-Asp) (полный сиквенс -CDCRGDCFC) (Wickham Т J et ai, 1996) Введение последовательности RGD на С-конец ичи в HI-петлю фибера Ад5 приводит к увеличению эффективности трансдукции CAR-дефицитных и CAR-негативных клеток в 5-500 раз (W íckham Т J et а!, 1996)

Конструирование модифицированных аденовирусов CELO (CELOSEAP-RGD, CELOSEAP-HIRGD, CELOEGFP-RGD, CELOEGFP-HIRGD), содержащих

последовательность RGD на С-конце или в HI-петле глобулярного домена длинного фибера и несущих репортерный ген SEAP или EGFP, проводили методом гомологичной рекомбинации в E.coli BJ5I83 (см. рис. 2).

Плазмида pSCELO-HIRGD или pSCELO-RGD, содержащая последовательность RGD в HI-петле или на С-конце в составе фрагмента генома CELO от 16254 до 33358 т.п.н., соответственно, была трансформирована вместе с плазмидой pCELOdlRV, содержащей полноразмерный геном CELO с деледией от 41731 до 43685 т.п.н.. в клетки Е. coli штамма BJ5183. В результате рекомбинации между гомологичными участками получили плазмидные конструкции, содержащие полноразмерный геном CELO с модифицированным фибером.

pCELOdlRV

pSCELO-HIRCD pSCEIjO-RGI)

он¡"i*/ W

pCELO-HIRGD iliii pCELO-RCD

ñ,rl pCShCMV-SEAP

n ЕЫ1Ш ШЗ

pCELOSEAP-HIRCD ¡1.111 pCELOSEAP-RC ¡U

Рис. 2. Схема получения плазмидной конструкции, несушей полноразмерный геном аденовируса птиц CELO с последовательностью RGD в глобулярном домене длинного фибера и репортерным геном SEAP.

Полученную плазмндную конструкцию pCEIO-HJRGD или pCELO-RGD, гидролизованную по эндонуклеазе рестрикции Pací совместно с шаттл-вектором pCShCMV-SEAP или pCShCMV-EGFP, несущим экспрессирующую кассету (CMV промотор репортерный ген, сигнал полиаденилирования), гидролизованным по эндонуклеазе рестрикции Asel трансформировали в клетки Е coli штамма BJ5183 В результате гомологичной рекомбинации получили плазмидные конструкции, содержащие полноразмерный геном CELO с модифицированным фибером, и экспрессирующую кассету с репортерным геном После трансфекции этих конструкций в клетки линии LMH была получена серия рекомбинантных вирусов CELOSEAP-RGD, CELOSEAP-HIRGD, CELOEGFP-RGD, CELOEGrP-HIRGD

Анализ ДНК рекомбинантных вирусов и отсутствие примесей дикого типа полученных препаратов модифицированных вирусов определяли методом ПЦР Все исследованные препараты содержали ДНК рекомбинантных вирусов и не содержали примеси ДНК вируса дикого типа

2 3 Анализ экспрессии CAR и интегрииов на клеточной поверхности различных клеток млекопитающих Эффективность Ад инфекции зависит от наличия CAR и интегринов на клеточной поверхности Некоторые типы клеток имеют низкий уровень экспрессии CAR и/или интегринов, и в связи с этим резистентны к Ад инфекции Введение последовательности RGD в глобулярный домен фибера Ад5 приводит к проникновению вируса в клетки посредством взаимодействия не только с CAR, но и с меточными интегринами (Wickharn Т J et al, 1996, Huang S et ai, 1995, Krasnykh VN et al, 1996, Bauerschmitz G J et al, 2002)

Исходя из этих данных, мы предположили что сконструированные фибер-модифицированные векторы CELO должны с более высокой эффективностью транедуцировать CAR-дефицитные и/ичи CAR-негативные клетки млекопитающих

Для подтверждения данного предположения необходимо было отобрать культуры клеток с разным уровнем экспрессии CAR Клеточные линии, включая 293, Н1299, НСТ-116, ACHN Н596, MCF-7 анализировали методами полуколичественной реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени (см рис 3)

Проведенные эксперименты показали высокий уровень экспрессии CAR в 293, НСТ-116 и Н1299 клетках, низкий уровень в ACHN и Н596 клетках, и почти не детектируемый уровень в MCF-7 клетках Уровень экспрессии av интегринов был высоким во всех клеточных линиях Экспрессия ß3 интегринов была снижена только в 293 клетках, а ß5 в HCT-116

По результатам проведенного анализа данные клеточные линии были разделены на 4 группы по уровню экспрессии CAR: 1) пермиссивные клеточные линии, которые обеспечивают репликацию вируса (LMH клетки для CELO вируса и 293 клетки для Ад5 вируса); 2) CAR-позитивные клетки (НСТ-116 и HI299): 3) CAR-дефицитные клетки (ACHN и Н596) и 4) CAR-негативные клетки (MCF- 7). В качестве стандартных CAR-негативных клеток использовали линию клеток СНО.

Рис. 3. Определение экспрессии CAR и интегринов (ov, [i? и р5) в клетках млекопитающих методами полуколичественной реакции обратной транскрипции (А) и ПЦР в реальном времени (Б). * Уровень мРНК CAR в клетках HI299 принят за 100%.

2.4. Трансдукция различных линий клеток млекопитающих модифицированными аденовирусами CELO-RGD и CELO-HIRGD. Для оценки эффективности переноса генетической информации, охарактеризованные по уровню экспрессии CAR и интегринов клеточные линии транедуцировали модифицированными векторами (CELOSEAP-HIRGD. CELOSEAP-RGD) в сравнении с ^модифицированными векторами Ад5 (Ad5-SEAP) и CELO (CELO-SEAP). Множественность инфекции составила 102. 103 или 10 вирусных частиц на клетку (вч/клетку). Эффективность транедукции была оценена по уровню экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP) в культуральной среде инфицированных клеток. Активность SEAP определяли по скорости конверсии субстрата р-нитрофенилфосфата (см. рис. 4).

Рекомбинантные вирусы CELO в 5-раз менее эффективно транедуцировали CAR-позитивные клетки (НСТ-116 и Н1299), в отличие от Ad5-SEAP, вне зависимости от внесенных модификаций. Для всех исследуемых векторов при инфекции CAR-дефицитных клеток (ACHN и Н596) уровень транедукции был значительно снижен в сравнении с CAR-позитивными клетками в результате низкой экспрессии CAR на клеточной поверхности (в 10 раз для Ad5-SEAP и в 4-6 раз для CELO векторов). Несмотря на это вектор CELOSEAP-HIRGD более эффективно транедукцировал CAR-дефицитные клетки, чем векторы CELO-

ЯЕАР и СЕЬОБЕАР-ЯОО, и был лишь в 2 раза менее эффективен, чем Ад5 вектор. Противоположные результаты были получены для САЯ-негативных клеток (МСЕ-7 и СНО). СЕЮВЕАР-ШЯОО в 1,5-3 раза был более эффективен, чем Аё5-8ЕАР и в 4 раза, чем немодифицированный вектор СЕЬО-БЕАР. Вектор СЕЬОЗЕАР-ИОВ, содержащий ЯвР последовательность на С-конце глобулярного домена длинного фибера, не увеличил эффективность трандукции САЯ-негативных клеток в сравнении с ^модифицированным вектором СЕЬО-БЕАР.

100 1000 10000

дота вир', сп. вч/клетку

100 1000 юооо

дота вируса. вч/клетку

100 1000 10000

дота вируса. вч/клег*>

1000 10000

юта вируса, вч/тиигтку

100 1000 10000

дота вируса, вчАслетку

100 1000 10000

дота труса. вч/клетку

Ш Ad5.SEАР ЩСШЛ-БЕАР ЦС£Ш5ЕАР-НЖ.ОО ИсЕЕОБЕАР-ЯОИ

100 1000 10000

дота вируса, ач/клстк>

30 1000 10000

дота вируса, вч/ю'нгтку

Рис. 4. Экспрессия гена вЕАР в трансдуцированных аденовирусными векторами.

культуральнои среде

Для подтверждения полученных данных, эксперименты по трансдукции клеток были повторены с использованием векторов, несущих репортерный ген ЕвРР (СЕШЕОРР-НШ.СО, СЕЕОЕОРР-ЯОП, Ас15-ЕОРР, СЕШ-ЕОР-Р). Экспрессию ЕйРР детектировали методом флуоресцентной микроскопии (см. рис, 5).

Н1299 MCF-7 ACHN

Ad5 EGFP

HiЯ

ill

Рис. 5. Экспрессия гена EGFP в клетках HI 299, MCF-7 и ACHN трансдуцированных рекомбинантными аденовекторами.

Приведенные выше результаты демонстрируют, что вектор на основе генома аденовируса птиц CELO, содержащий последовательность RGD в HI-петле глобулярного домена длинного фибера способен эффективно трансдуцироватъ CAR-дефицитные и CAR-негативные клетки млекопитающих.

Введение последовательности RGD на С-конец глобулярного домена длинного фибера не привело к увеличению эффективности трансдукции всех используемых клеточных линий (CAR-позитивных, CAR-дефицитных и CAR-негативных). Это возможно связано с тем, что С-конец глобулярного домена длинного фибера CELO, согласно его трехмерной структуре, пространственно ориентирован к N-концу молекулы в отличие от Ад5, у которого данная область выступает над поверхностью молекулы (Guardado-Calvo Р. et а!., 2007, Xia D. et al.. 1995). В связи с этим дальнейшее исследование данного вируса не представляло научного и практического интересов.

2.5. Изучение механизма проникновения модифицированного CELO-HIRGD вектора в клетки млекопитающих. Векторы на основе Ад5, содержащие последовательность RGD в HI-петле фибера способны проникать в клетки млекопитающих, используя CAR-независимый путь инфекции (Hidaka С. et al.. 1999. Wickham T.J. et al., 1993, Wickham T.J. et al„ 1999). Данная способность была показана в отношении CAR-негативных клеток и клеток с искусственно заблокированными CAR рецепторами.

В задачу данного эксперимента входило определение эффективности трансдукции модифицированным и ^модифицированными векторами клеток млекопитающих в условиях блокирования CAR рецепторов локализованных на клеточной поверхности CAR-позитивные (HI299) и CAR-Heiативные (MCF-7) клеточные линии трансдуцировали аденовекторами Ad5-SEAP, CELO-SEAP или CELOSEAP-HIRGD в количестве 101 вч/клетку Предварительно (за 30 мин до трансдукции) клетки были обработаны фибероч Ад5 в концентрации 10 мкг/мл для блокирования связывания аденовируса с CAR рецептором (см рис 6)

Трансдукция CAR-позитивных Н1299 клеток для всех рекомбинантных вирусов CELO и Ад5 была блокирована фибером Ад5, в отличие от CAR-негативных MCF-7 клеток Предварительная обработка клеток фибером Ад5 приводила к 3-х разовому снижению экспрессии репортерного гена для Ad5-SEAP и 3,7-ми разовому снижению для CELOSEAP-HIRGD Однако добавление фибера Ад5 вызывало снижение трансдукции вектором CELO-SEAP в 34 раза Полученная разница в эффективности трансдукции между векторами CELO в условиях заблокированных CAR рецепторов может быть объяснена присутствием последовательности RGD в структуре глобулярного домена длинного фибера вируса CELOSEAP-HIRGD, которая позволила ему связываться с интегринами и эффективно интернализоваться в клетку

Таким образом, подобно векторам на основе Ад5, содержащих последовательность RGD в HI-петле, вектор CELOSEAP-HIRGD в отсутствии CAR рецепторов специфически связывается с клеточными интегринами, что приводит к CAR-независимому механизму проникновению вируса в клетки млекопитающих

Н1299 MCF-7

AdB-SEAP CELO-SEAP CELOSEAP-HIRGD AdS-SEAP CELO-SEAP CELOSEAP-HIRGD

0 Ю мкг/мл фибера Ад5 Ц контрольная среда

Рис 6. Экспрессия гена 8ЕАР в культу ральиой среде клеток Н1299 и МСР-7, трансдуциро ванных рекомбинантпыми аденовекторами в условиях блокирования САК-зависимо! о пути инфекции

2 7 Определение эффективности доставки ренортерного гена SEAP модифицированным вектором CELOSEAP-HIRGD в CAR-дефицитные к тетки <« vivo В настоящее время иссчедуется возможность создания генно-инженерных вакцин на основе генома аденовируса птиц CELO для доставки структурных компонентов различных патогенов в организм человека, млекопитающих и птиц (Francois A et а!, 2004, Карпов А и соавт, 2007) Одним из основных способов введения в ор!анизм млекопитающих вакцин или других биотогических препаратов является внутримышечная инъекция Известно, что мышечные клетки экспрессируют низкий уровень CAR (т е являются CAR-дефицитными), и, в связи с этим было интересно оценить эффективность доставки генов модифицированным вирусом CELO в мышечные клетки m vivo

Мышам линии BALB/c внутримышечно вводите рекомбинантные вирусы Ad5-SEAP, CELO-SEAP и CFLOSEAP-HIRGD в количестве 5* 10s инфекционных вирусных частиц на животное Для подтверждения транедукцни использовали внутривенный способ введения, тк в данном случае вирус в основном инфицирует гепатоциты характеризующиеся высоким уровнем экспрессии CAR и интенсивностью протекания метаболических процессов, в связи с этим в крови детектируется высокий уровень SEAP (Логунов Д и соавт, 2002) Экспрессию SFAP, детектировали в образцах крови, начиная со второго дня (см рис 8)

При внутримышечном введении CELO-SEAP показал минимальный уровень экспрессии щелочной фосфатазы (0,66 мЕд/мт) Низкий уровень экспрессии SEAP при внутримышечном способе введения рекомбинантными вирусами обусловчен низкой экспрессией мышечными клетками CAR и согласуется с нашими данными полученными при транедукции CAR-дефицитных клеток in vitro (см рис 4) При данном способе введения CELOSEAP-HIRGD показал схожую эффективность в экспрессии SEAP в сравнении с Ad5-SEAP и был в 3,5 раза более эффективен, чем вектор CELO-SE^P

При внутривенном способе введении максимальное значение активности SEAP в сыворотке было детектировано для Ad5-SEAP Уровень активности составил 248,96 мЕд/мл, что значительно выше по сравнению с CELO-SEAP (3,2 мЕд/мл) и CELOSEAP-HIRGD (4,6 мЕд/мл)

Таким образом, потученные нами данные свидетельствуют о возможности конструирования на основе генома модифицированного вектора CELO-HIRGD генно-инженерных вакцин для создания средств профитактики различных экономически значимых заболеваний млекопитающих

Рис. 8. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в сыворотке крови мышей линии BALB/c после введения рекомбинантных вирусов,

2.8. Определение эффективности доставки ренортерного гена SEAP модифицированным вектором CELOSEAP-HIRGD в клетки молочной железы кролика. В недавних работах было показано, что векторы на основе генома Ад5 могут быть использованы в качестве эффективных средств доставки и экспрессии рекомбинантных белков в молоке животных (Han Z.S. et al., 2007, Sanchez O. et al., 2004, Toledo J.R. et al„ 2006).

Известно, что образцы биопсии молочной железы имеют низкий уровень экспрессии CAR (Liu Y. et al., 2006, Shayakhraetov D.M. et al., 2002). Поскольку CELOSEAP-HIRGD показал эффективную транедукцию CAR-дефицитных клеток, в задачу данного эксперимента входило определение эффективности транедукции модифицированным вирусом CELO клеток молочной железы кролика in vitro и in vivo.

Первичную культуру клеток молочной железы кролика гранедуцировали вирусами Ad5-SEAP, CELOSEAP-HIRGD и CELO-SEAP в количестве 10\ 103 или 104 вч/клетку (см. рис. 9). Активность SEAP определяли через 48 часов после транедукции.

В результате проведенного эксперимента вектор CELOSEAP-HIRGD в 4,5 раза более эффективно транедукцировал клетки молочной железы кролика, чем немодифицированный вектор CELO и был в 5 раз менее эффективен, чем Ад5 вектор.

Полученные результаты подтверждают предположение, что модифицированный вектор CELOSEAP-HIRGD эффективно гранедуцирует эпителиальные клетки молочной железы, чем немодифицированный вектор CELO-SEAP.

0,1

< 0,01

1000 Доза, вч/клетку

10000

□ Ad5-SEAP

□ CELO-SEAP

YA CELOSE ^P-H¡RGD

Рис 9 Экспрессия SEAP в кулы\ральнои среде клеток молочной железы кролика трапедуцированиых рекомбипантиыми аденовирусами.

На следующем этапе работы была произведена оценка эффективности транедукции клеток молочной железы кролика вектором CELOSEAP-HIRGD в экспериментах т м\о

Эксперимент проводился по следующей схеме На первый день естественного лактационного периода в моточную железу кролика вводи рекомбинантцые векгоры Ad5-SEAP, CFLOSEAP-HIRGD и CELO-SEAP в количестве Ю10 вирусных частиц на животное Введение вирусов осуществляли методом многократного обкалывания последней пары молочной железы кролика Уровень экспрессии SEAP определяли в образцах сыворотки молока на третий день лактационного периода (см рис 10)

CELO SEAP CELOSEAP-HIRGD

Рис 10 Экспрессия вЕАР в сыворотке молока кролика после введения рекомбинантных аденовиру сов

Как и ожидалось, модифицированный вектор CELOSEAP-HIRGD был в 4 раза более эффективен, чем ^модифицированный вектор CELO и в 1,8 раза менее эффективен, чем Ад5 вектор

Приведенные выше результаты демонстрируют что вектор на основе генома аденовируса птиц CELO, содержащий последовательность RGD в HI-петле длинного фибера, способен эффективно транедуцировать нормальные эпителиальные CAR-дефицитные клетки молочной железы кролика

Работа проводилась совместно с к б н Грезиной Н М (ВИЖ РАСХН) 2 9 Определение эффективности доставки гена лактоферрнна человека модифицированным вектором CELOLf-HIRGD в клетки молочной железы in vitro и w vivo. На заключительном этапе работы мы исстедовали возможность использования модифицированного вектора CELO для продукции рекомбинантных белков в мотоке животных В качестве рекомбинантного белка был выбран лактоферрин человека (Lf) Данный выбор обусловлен тем, что Lf явтяется компонентом молока млекопитающих и занимает важное место в обширной группе защитных факторов Этот белок способен вмешиваться в процессы клеточной пролиферации и дифференцировки, участвует в регуляции гранулопоэза, активизирует неспецифический иммунный ответ организма (Beljaais L et al, 2004, Sabatucci A et al, 2007, Sharp P et al, 2007)

В задачу эксперимента входило определение возможности доставки целевого гена Lf модифицированным вектором CELOLf-HIRGD в клетки моточной жечезы крочика m vitro и козы in vivo Одновременно, задачей эксперимента было исследование времени экспресс™ гена Lf что позволило бы оценить эффективность полученного вектора для создания систем по продукции рекомбинантных белков в молоке животных

Получение плазмидной конструкции, содержащей полноразмерный геном аденовируса птиц CELO, несущей последовательность RGD в HI-петле глобулярного домена длинного фибера и экспрессирующей ген лактоферрина человека, проводили аналогично получению CELOSEAP-HIRGD (см рис 2) Рекомбинатный вирус CELOLf-HIRGD получали методом трансфекции культуры клеток LMH соответствующей плазмидой Рекомбинантную природу генома CELOLf-HIRGD подтверждали методом ПЦР

Основываясь на полученных результатах по способности вектора CELOSEAP-HIRGD эффективно доставлять репортерный ген SEAP в эпителиальные CAR-дефицитные клетки молочной железы кролика in vitro и т vivo, была транедуцирована первичная культура клеток молочной железы кролика вирусами CELOLf-HIRGD ити CELO-Lf в количестве 104 вч/клетку (см рис 11 А) Концентрацию Lf определяли в ку тьтуральной среде через 48 часов методом ИФА

В результате проведенного эксперимента, концентрация Lf для CELOLf-HIRGD составила 150 нг/мл, что в 1,6 раз больше, чем по сравнению с CELO-LÍ (95 нг/мл) Таким

образом CELOLf-HIRGD способен к эффективной доставки гена Lf человека в эпителиальные CAR-дефшщгные клетки молочной железы кролика in vitro

На следулощем этапе работы для оценки экспрессии Lf в клетках молочной железы m vi\ о в качестве модели были использованы козы породы Зааненская

Эксперимент проводился по следующей схеме В канал молочной железы козы на 1 день естественного лактационного периода вводили рекомбинантные вирусы CELOLf-HIRGD или CELO-Lf в количестве 10ш инфекционных вирусных частиц на животное Концентрацию Lf детектировали в образцах сыворопси молока, начиная со второго дня после введения вируса (см рис 11 Б)

0 180

1 1601 I 140

t 120 т

I §100 -

« 5Ё 80 J

1 401

I I I 20

ОЕЮ-и СЕЮи-НКвй 1 2 3 4 5 6

Время дни

Рис 11. Экспрессия лактоферрпиа в кучьтуральной среде клеток моточной железы кролика (А) н в сыворотке молока козы (Б)

Как и ожидалось, концентрация Lf после введения модифицированного вектора CELOLf-HIRGD было в среднем в 1,7 раз больше, чем после введения, ^модифицированного вектора CELO-Lf Максимальная концентрация Lf в сыворотке молока козы была детектирована на 4 сутки после введения вируса, и составила 5 мкг/мл для CELOLf-HIRGD и 3 мкг/мл для CELO-Lf Время экспрессии Lf в сыворотке молока козы составило 8 дней

Таким образом, мы определили эффективность доставки гена Lf в клетки молочной железы кролика и козы модифицированным вектором CELOLf-HIRGD, а также длительность транзиентной экспрессии гена Lf в молочной железе козы

Полученные данные показывают возможность создания на основе модифицированного вируса CELO векторных систем ли продукции различных белков в молоке млекопитающих

Работа проводилась совместно с к б н Грезиной Н М (ВИЖ РАСХН) и к б н Безбородовой О А (МНИОИ)

выводы

1 Идентифицирована HI-петля в структуре белка глобулярного домена длинного фибера вируса CELO Сконструированы рекомбинантные вирусы CELO, несущие интегрин-связывающую последовательности RGD в HI-петле или на С-конце глобулярного домена длинного фибера Показано, что полученные фибер-модифицированные вирусы CELO способны к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах

2 Получены рекомбинантные аденовирусы CELO, содержащие последовательность RGD в HI-петле (CELO-HIRGD) или на С-конце (CELO-RGD) глобулярного домена длинного фибера, и несущие репортерный ген SEAP или EGFP под контролем CMV-промотора In vitro продемонстрировано двукратное увеличение эффективности трансдукции CAR-дефицитных (ACHN и Н596) и четырехкратное CAR-негативньгх (MCF-7 и СНО) клеточных линий вектором CELO-HIRGD по сравнению с немодифицированным вектором CELO

3 Определено, что модифицированный вектор CELO-HIRGD использует CAR-независимый механизм проникновения в клетки млекопитающих

4 На различных моделях животных показано, что модифицированный вектор CELOSEAP-HIRGD в 4 раза эффективнее трансдуцирует CAR-дефицитные глетки, чем иемодифицированный вектор CELO-SEAP

5 Показано, что рекомбинантный аденовирус CELO-HIRGD, содержащий ген лактоферрина человека, эффективно трансдуцирует клетки молочной железы козы и обеспечивает продукцию белка лактоферрина человека Содержание рекомбинантного белка лактоферрина человека в молоке козы составляет 5 мкг/мл

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TEMF ДИССЕРТАЦИИ

1 Зубкова О В Разработка новой эффективной технологии получения рекомбинантных аденовирусов птиц CELO / Зубкова OB// Вопросы физико-химическон биологии в ветеринарии сборник научных трудов к 40-лстию ВБФ и 110-тетию С И Афонского, - ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им К И Скрябина» Москва, 2006 - С 110-112

2 Зубкова О В Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CFLO с помощью космидиой технологии / Зубкова OB., Белоусова PB Лопнов ДЮ // Материалы 3-й конференции по учебно-методической, воспитательной и научно-практической работе академии, - ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им К И Скрябина» Москва, 2006 С 15-17,-ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им К И Скрябина» Москва, 2006 -С 15-17

3 Шувалова ЕА Получение рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, методом рекомбинации в Ecoli / Шувалова ЕА, Карпов АП, Зубкова OB, Щебляков ДВ, Валихов АФ // Сб науч ст международной юбилейной научено-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, - Курск КГСА, 2006 - С 221-225

4 Карпов А П Конструирование модифицированного аденовируса птиц CELO с целью создания генно-инженерной вакцины нового поколения / Карпов А II, Шувалова ЕА, Зубкова О В //Живые системы и биологическая безопасность населения Сб науч ст V международной научной конференции студентов и молодых ученых, - M МГУПБ, 2006 -С 231-232

5 Logunov D Y Identification of HI-Uke loop m CELO adenovirus fiber for incorporation of receptor binding motifs / Logunov D Y , Zubkova O.V, Karyagina-Zhulina A S , Shmalova E A, Karpov A P Shmarov M M, Tutykhina IL , Alyapkma Y S , Grezma N M, Zino\ leva N A , Ernst L К , Gintsburg A L and Naroditsky В S // J Virol, 2007, v 81, pp 9641-9652

6 Зубкова О В Влияние интегрин-связывающей последовательности (RGD) на прикрепление и интернализацию аденовируса птиц CELO в клетки млекопитающих / Зубкова О В , Логунов Д Ю , Карпов А П , Шмаров M M , Белоусова Р В , Народицкий БС //Мол Ген Микробиот Вирусол -Москва,2008 ~№2 -С 32-36

7 Положительное решение о выдаче Патента Российской Федерации на изобретение по заявке №2007121785 «Способ создания рекомбинантных аденовирусов птиц для вакцинации и генной терапии»

Типография "Медлайн-С" 125315, г Москва, Ленинградский пр-т, д 78, к 5 Тел 152-00-16 Тираж 100 шт

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зубкова, Ольга Вадимовна

1. ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ ВВЕДЕНИЕ

Глава

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика аденовирусов

1.2. Строение пентона аденовируса человека 5-го серотипа

1.3. Проникновение аденовируса в клетки млекопитающих

1.4. Векторы на основе геномов аденовирусов человека

1.5. Методы конструирования аденовирусных векторов с аденовируса альтернативным тропизмом

1.6. Особенности структурно-функциональной организации птиц CELO

1.7. 1 Строение длинного фибера CELO

1.8. Эукариотические векторы на основе аденовируса птиц CELO (FAV-1)

Глава

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Вирусы и бактериальные штаммы

2.3. Клеточные линии

2.4. Плазмидные векторы

2.5. Ферменты и другие реактивы

2.6. Лабораторные животные

2.7. Лабораторное оборудование

2.8. Методы

2.9. Подготовка компетентных клеток E.coli штамма DH5a

2.10. Подготовка компетентных клеток E.coli штамма BJ

2.11. Трансформация компетентных клеток E.coli штамма DH5a

2.12. Трансформация компетентных клеток E.coli штамма BJ

2.13. Гомологичная рекомбинация в клетках E.coli

2.14. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК

2.15. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.16. Рестрикционный анализ ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами

2.17. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле

2.18. Препаративное

Глава фрагментов ДНК и элюция ДНК из геля

3.1. Лигирование фрагментов ДНК

3.2. Идентификация рекомбинантных клонов

3.3. Полимеразная цепная реакция

3.4. ПНР в режиме реального времени

3.5. Выделение тотальной РНК из культуры клеток

3.6. Реакция обратной транскрипции

3.7. Выделение тотальной ДНК

3.8. Трансфекция культур клеток методом липофекции

3.9. Получение рекомбинантных аденовирусов

3.10. Накопление вирусов

3.11. Очистка и концентрирование аденовирусов CELO

3.12. Выделение вирусной ДНК

3.13. Титрование вирусов

3.14. Определение активности секретируемой щелочной фосфатазы

3.15. Иммуноферментный анализ

Глава

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Идентификация in silico участков аминокислотной последовательности глобулярного домена длинного фибера вируса CELO пригодных для модификации вирусного тропизма

4.2. Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих последовательность RGD в глобулярном домене длинного отростка пентона

4.3. Создание плазмидной конструкции, несущей последовательность RGD на С-конце глобулярного домена длинного фибера аденовируса птиц CELO

4.4. Создание плазмидной конструкции, несущей последовательность RGD в Ш-петле глобулярного домена длинного фибера аденовируса птиц CELO

4.5. Создание плазмидных конструкций, содержащих полноразмерный геном аденовируса птиц CELO и несущих последовательность RGD в глобулярном домене длинного фибера

4.6. Создание плазмидных конструкций, несущих полноразмерный геном аденовируса птиц CELO с модифицированным фибером и рекомбинантных аденовирусов птиц CELO с репортерными генами

4.7. Получение модифицированным фибером

4.8. Исследование функциональной активности модифицированных CELO векторов в экспериментах in vitro

4.9. Анализ экспрессии CAR и интегринов на клеточной поверхности различных клеток млекопитающих

4.10. Трансдукция различных линий клеток млекопитающих CELO-RGD и модифицированными CELO-HIRGD in vitro рекомбинантными аденовирусами

4.11. Изучение механизма проникновения модифицированного CELOHIRGD вектора в клетки млекопитающих

4.12. Исследование влияния последовательности вектора CELO RGD в на проникновение млекопитающих модифицированного клетки

4.13. Исследование эффективности доставки генов, встроенных в геном модифицированного CELO-HIRGD вектора в экспериментах in vivo

4.14. Определение эффективности доставки секретируемой щелочной фосфатазы модифицированным вектором CELOSEAP-HIRGD в CAR86 дефицитные мышечные клетки

4.15. Определение эффективности доставки репортерного гена SEAP модифицированным железы кролика вектором CELOSEAP-HIRGD в клетки молочной

4.16. Определение эффективности доставки гена лактоферрина человека модифицированным вектором CELOLf-HIRGD в клетки молочной железы in vitro и in vivo

Глава

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модификация отростка пентона аденовируса птиц CELO для получения вектора с измененным тропизмом, способного к эффективной трансдукции клеток млекопитающих"

1. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Аденовирусы (Ад), наряду с другими, ДНК-содержащими вирусами, представляют собой широко используемую модель в, молекулярно- биологических, биомедицинских и биотехнологических исследованиях. В последнее десятилетие интенсивно; исследуется возможность .использования в качестве векторных систем: для? доставки чужеродной; генетической информации Адчеловека 5-го серотипа (Ад5): Вёкторына основе генома<Ад5 обладают рядом неоспоримых преимуществ, к которым относятся широкая тропность, способность расти в высоком титре и* безопасность. В тоже время следует отметить ряд недостатков, этой векторной системы, в- частности, недостаточная пакующая емкость, высокая; себестоимость .препаратов; рекомбинантных Ад, пред существующий; иммунный; ответ в\ организме человека: Bv связи с этим большой» интерес вызывает возможность, создания новых векторных систем: на; основе геномов аденовирусов,птиц лишенных этих недостатков; Перспективным вектором для доставки генов в клетки- млекопитающих in vivo является аденовирус птиц 1-го серотипа (CELO); Вирус имеет типичную для всех аденовирусов икосаэдрическую форму капсида, который состоит из капсомеров гексона и пентона, диаметр вириона составляет 70-80 нм; Реном Ад GELO представлен? линейной двухцепочечной молекулой ДНК. Интерес к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием; у него ряда преимуществ по; сравнению с векторами на основе генома Ад человека. Вирус CELO способен давать высокие титры; прикультивировании в курином эмбрионе (до 10 физических; частиц вируса с одного эмбриона), что делает процесс получения препаративных количеств вектора технологичным и экономически привлекательным. Иммунная система млекопитающих несенсибилизирована к GELO, что позволяет 8» предположить эффективное применение векторов на основе этого вируса для увеличения периода экспрессии целевых генов в их организме. Капсид аденовируса CELO обладает большей пакующей емкость и физической стабильностью по сравнению с капсидами аденовирусов человека. Кроме этого, Ад CELO не способен к репликации в клетках млекопитающих, то есть является по отношению к таким клеткам репликативно-дефектным. Недавние исследования показали, что вирус CELO может быть использован в качестве вектора для доставки генетической информации в генной терапии и вакцинации. Однако в этих же исследованиях было показано, что практическое применение векторов на основе CELO является ограниченным для определенных типов клеток млекопитающих, вследствие недостаточной эффективности их трансдукции. Традиционно для решения проблем, связанных с низкой эффективностью трансдукции клеток млекопитающих векторами на основе Ад человека, используются подходы, связанные с генетической модификацией отростка пентона (фибера). Данные подходы реализуются посредством конструирования «химерных» фиберов (замена глобулярного домена на соответствующий домен альтернативного серотипа Ад) или введения различных гетерологичных рецептор-связывающих последовательностей на С-конец или в Ш-петлю глобулярного домена фибера. Векторы с модифицированными фиберами способны обеспечивать эффективную доставку генетической информации в определенные клетки млекопитающих, в норме резистентные к Ад инфекции. В отличие от Ад5, в каждой вершине вириона CELO находится два фибера различной длины. Длинный фибер CELO способен к взаимодействию с основным аденовирусным рецептором CAR (coxsackie and adenovirus receptor)» и, в отличие, от короткого фибера несущественен для сборки и проникновения вируса в пермиссивные клетки. Такая структурно-функциональная организация капсида CELO позволяет предположить возможные направленные модификации длинного фибера, с целью повышения тропности вируса по отношению к определенным типам клеток млекопитающих. В связи с этим исследования, связанные с созданием фибер-модифицированных векторов CELO, способных к эффективной доставке генетической информации в клетки млекопитающих, представляют самостоятельный научный интерес. 2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящей работы являлось создание на основе вируса GELO с модифицированным тропизмом, векторных систем, способных к эффективному переносу генетической информации в CAR-дефицитные и/или CAR-негативные клетки млекопитающих in vitro и in vivo. В задачи: 1. Идентификация участков в аминокислотной последовательности процессе выполнения работы предстояло решить следующие глобулярного домена длинного фибера вируса CELO, пригодных для модификации вирусного тропизма. 2. Получение модифицированных вирусных качестве гетерологичного лиганда векторов, содержащих в интегрин-связывающую последовательность RGD внутри идентифицированных петель глобулярного домена длинного фибера CELO, и несущих репортерный ген SEAP или EGFP под контролем CMV-промотора. 3. Определение эффективности доставки генетической информации модифицированными векторами CELO в экспериментах по трансдукции различных культур клеток. 4. Изучение механизма проникновения модифицированных векторов CELO в клетки млекопитающих. 5. Исследование влияния последовательности RGD на проникновение 10 модифицированных векторов ОЕЬО в клетки; млекопитающих. 6. Определение в эффективности геном доставки репортерного векторов гена в SEAP, CAR- встроенного модифицированных CELO дефицитные клетки млекопитающих в экспериментах in vivo. 7. Изучение возможности экспрессии гена лактоферрина человека модифицированными векторами CELO в молочной.железе козы; 3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В результате проведенной работы впервые идентифицирована>Н1-петлш в аминокислотной последовательности фибера аденовируса птиц CELO. Впервые получены векторы» на= основе аденовируса птиц CELO, содержащие- последовательность RGD в* структуре длинного фибера, и несущие репортерные гены SEAP или-EGFE под контролем GMV промотора (GELOSEAPHIRGD, CELOEGFP-HIRGD; GELOSEAP-RGD ш CEEOEGFPRGD); Показано, что введение интегрин-связывающей последовательности RGD в Ш-петлю глобулярного домена длинного фибера не влияет на исходные функции данного белка, не снижает способность ОЕЕО к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах и приводит к глобулярного домена длинного изменению тропизма вируса. Методом ПНР в режиме реального времени и по уровню экспрессии репортерных генов показано увеличение эффективности трансдукции СARдефицитных и CAR-негативных клеточных культур модифицированными векторами CELO (CELOSEAP-HIRGDCELOEGFPHIRGD). Впервые показан CAR-независимый механизм трансдукции клеток млекопитающих модифицированным вектором CELO-HIRGD: Определено увеличение процессов прикрепления и интернализации вектора CELOHIRGD в клетки млекопитающих. 11 В ходе работы показано увеличение экспрессии трансгена (SEAP), встроенного в геном модифицированного CELO вектора HIRGD) при трансдукции CAR-дефицитных условиях in vivo. Впервые показана эффективная доставка и экспрессия гена (CELOSEAPв клеток млекопитающих лактоферрина человека модифицированным вектором CELOLf-HIRGD в молочной железе козы. Работа представляет не только научный интерес, но и в перспективе может иметь практическое применение. Модифицированные Ад птиц CELO могут быть использованы в качестве средств доставки и экспрессии целевых генов, с целью применения таких векторов в медицине и ветеринарии в качестве генно-инженерных вакцин, для создания средств профилактики различных заболеваний, а также в генной терапии. 12

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зубкова, Ольга Вадимовна

выводы

1. Идентифицирована Ш-петля в структуре белка глобулярного домена длинного фибера вируса CELO. Сконструированы рекомбинантные вирусы CELO, несущие интегрин-связывающую последовательности RGD в Ш-петле или на С-конце глобулярного домена длинного фибера. Показано, что полученные фибер-модифицированные вирусы CELO способны к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах.

2. Получены рекомбинантные аденовирусы CELO, содержащие последовательность RGD в Ш-петле (CELO-HIRGD) или на С-конце (CELO-RGD) глобулярного домена длинного фибера, и несущие репортерный ген SEAP или EGFP под контролем CMV-промотора. In vitro продемонстрировано двукратное увеличение эффективности трансдукции CAR-дефицитных (ACHN и Н596) и четырехкратное CAR-негативных (MCF-7 и СНО) клеточных линий вектором CELO-HIRGD по сравнению с немодифицированным вектором CELO.

3. Определено, что модифицированный вектор CELO-HIRGD использует CAR-независимый механизм проникновения в клетки млекопитающих.

4. На различных моделях животных показано, что модифицированный вектор CELOSEAP-HIRGD в 4 раза эффективнее трансдуцирует CAR-дефицитные клетки, чем немодифицированный вектор CELO-SEAP.

5. Показано, что рекомбинантный аденовирус CELO-HIRGD, содержащий ген лактоферрина человека, эффективно трансдуцирует клетки молочной железы козы и обеспечивает продукцию белка лактоферрина человека. Содержание рекомбинантного белка лактоферрина человека в молоке козы составляет 5 мкг/мл.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зубкова, Ольга Вадимовна, Москва

1. Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.// Москва, "Мир", 1982

2. Akopian T. A., Lazareva S. E., Tikhomirov E. E., Karpov V. A., Naroditsky B. S. Genes for fowl adenovirus CELO penton base and core polypeptides. // Arch. Virol, 1996a, V.-141, pp-357-365 ,

3. Alam J., Cook J. L. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. //Anal* Biochem, 1990; V.-188, pp:-245-254

4. Amalfitano A, Mauser M. A, I-Iu H, Serra D, Begy C. R, Chamberlain J. S. Production and characterization of improved adenovirus vectors with the El, E2b, and E3 genes deleted. // J. Virol, 1998, v.-72, pp.- 926-933

5. Bai M., Harfe B. and Freimuth P. Mutations that alter an Arg-Gly-Asp (RGD) sequence in the adenovirus type 2 penton base protein abolish its cell-rounding-activity and delay virus reproduction in flat cells. // J. Virol., 1993, v.-67,pp.-5198-5205

6. Bailey A. and Mautner V. Phylogenetic. relationships among adenovirus serotypes.//Virology, 1994, V.-205, pp.-438-452

7. Ballester M;, Sánchez A, Santaló J, Folch JM, Ibáñez E.Expression of recombinant human follicle-stimulating hormone in the mammary gland of transgenic mice. // Mol Biotechnol., 2006, v.-34(l), pp.-37-44

8. Barnett B: G., Grews G. J. and Douglas J. T. Targeted adenovirus vectors. // Bioch. et Bioph. Acta, 2002, V.-1575, pp.-l~14

9. Bartha A. Proposal^for subgrouping of bovine adenoviruses.// Acta Vet. Acad; Sci. Hung., 1969, v.-19, pp.-319-321

10. Bauerschmitz G. J., Barker S. D. and Hemminki A. Adenoviral gene therapy for cancer: from vectors to target and replication competent agent. // Int. J. Oncol., 2002, v.-21, pp.-l 161-1174 http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical

11. Benihoud K., Yeh P. and Perricaudet M. Adenovirus vectors for gene delivery. // Curr Opin Biotechnol, 1999, v.-10(5), pp.-440-447

12. Benko M. and B. Harrach. A proposal for a new (third) genus within the Adenoviridae family. // Arch. Virol., 1998, V.-143, pp.-829-835

13. Benko M., Elo P., Ursu K., Ahne W., LaPatra S. E., Thomson D., Harrach B. First molecular evidence for the existence of distinct fish and snake adenoviruses. // J. Virol., 2002, v.-76, pp.-10056-10059

14. Bergelson J. M., Krithivas A., Celi L., Droguett G., Horwitz M. S., Wickham T., Crowell R. L., Finberg R. W*. The murine CAR homolog is a receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses. // Journal of Virology, 1998, v.-72, pp.- 415-419

15. Bett A. J., Haddara W., Prevec L., Graham F. L. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, v.-91, pp.-8802-8806

16. Bewley M. C., Springer K., Zhang Y. B., Freimuth P., Flanagan J. M. Structural analysis of the mechanism of adenovirus binding to its human cellular receptor, CAR. // Science, 1999, V.-286, pp.-1579-1583

17. Boers J. E., Ambergen A. W. and Thunnissen F. B. Number and proliferation of basal and parabasal cells in normal human airway epithelium. //Am. J. Resp. Crit. Care Med., 1998, V.-157, pp.-2000-2006

18. Boros G., Graf Z., Benko M. and Bartha A. Isolation of a bovine adenovirus from fallow deer (Dama dama). // Acta Vet. Hung., 1985, v.-33, pp.-l 19-123

19. Both G. W. Atadenovirus. Adenoviridae. // The Springer index of viruses, 2002, pp.-2-8

20. Bouri K., Feero W. G., Myerburg M. M., Wickham T. J., Kovesdi I., Hoffman E. P., Clemens P. R. Polylysine modification of adenoviral fiber protein enhances muscle cell transduction. // Hum. Gene Ther., 1999, v.-10, pp.-1633-1640

21. Brough D. E., Lee G. M., Lizonova A. and Kovesdi I. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. // J. Virol., 1997, v.-71, pp.-8221-8229

22. Burmeister W. P., Guilligay D., Cusack S., Wadell G., Arnberg N. Crystal structure of species D adenovirus fiber knobs and their sialic acid binding sites. // J Virol, 2004, v.-78, pp.-7727-7736

23. Butler S. P., O'Sickey T. K., Lord S. T., Lubon H., Gwazdauskas F. C., Velander W. H. Secretion of recombinant human fibrinogen by the murine mammary gland. // Transgenic Res., 2004, v.-13(5), pp.-437^450

24. Cai F. and Weber J. Organization of the avian adenovirus genome and the structure of its endopeptidase. //Virology, 1993, V.-196, pp.-358-362

25. Chen H. H., Mack L. M., Kelly R., Ontell M., Kochanek S., Clemens P.R. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v.-94(5), pp.-l645-1650

26. Chiocca S., Baker A. and Cotten M. Identification of a novel antiapoptotic protein, GAM-1, encoded by the CELO adenovirus. // J. Virol., 1997, v.-71, pp.-3168-3177

27. Chiocca S., Kurtev V., Colombo R., Boggio R., Sciurpi M. T., Brosch G., Seiser C., Draetta G. F., Cotten M. Histone deacetylase 1 inactivation by an adenovirus early gene product. // Curr. Biol., 2002, v.-12, pp.-594-598

28. Chiocca S., Kurzbauer R., Schaffner G., Baker A., Mautner V., Cotten M. The complete DNA sequence and genomic organization of the avian adenovirus CELO. // J. Virol., 1996, v.-70(5), pp.-2939-2949

29. Chiu C. Y., Mathias P., Nemerow G. R and Stewart P. L. Structure of adenovirus complexed with its internalization receptor, avb5 integrin. // Journal of Virology, 1999, v.-73(8), pp.-6759-6768

30. Clemens P. R., Kochanek S., Sunada Y., Chan S., Chen H. H., Campbell K. P., Caskey C. T. In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with an adenoviral vector that lacks all viral genes. // Gene Ther, 1996, v.-3(ll), pp.-965-972

31. Cohen C. J., Shieh J. T., Pickles R. J., Okegawa T., Hsieh J. T., Bergelson J. M. The coxsackievirus and adenovirus receptor is a transmembrane component of the tight junction. // Proc Natl Acad Sci USA, 2001, v.-98, pp.-15191—15196

32. Cormack B.P., Valdivia R. H. and Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). // Gene, 1996, v.-173, pp.-33-38

33. Cotten M., Wagner E., Zatloukal K., Birnstiel' M. L. Chicken adenovirus (CELO virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to. mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants. // J Virol, 1993, v.-67(7), pp.-3777-3785

34. Coyne B. C. and Bergelson J. M. CAR: a virus receptor within the tight junction // Adv Drug Delivery Reviews, 2005, v.-57, pp.-869-882

35. Crawford-Miksza L. and Schnurr D. P. Analysis of 15 adenovirus hexon proteins reveals the location and structure of seven hypervariable regions containing serotype-specific residues. // J. Virol., 1996, v.-70, pp.-1836-1844

36. Crompton J., Toogood C. I., Wallis N. and Hay R. T. Expression of a foreign epitope on the surface of the adenovirus hexon. // J. Gen. Virol., 1994, v.-75, pp.-133-139

37. Cuff J. A*., Clamp M. E., Siddiqui A. S., Finlay M. and Barton G. J. Jpred: a consensus secondary structure prediction server. // Bioinformatics, 1998, v.-14, pp.-892-893

38. Cusack S. Adenovirus complex structures. // Current Opinion in Structural Biology, 2005, v.-15, pp.-237-243

39. Dan A., Ruzsics Z., Russell W. C., Benko M. and Harrach B. Analysis ofjthe hexon gene sequence of bovine adenovirus type 4 provides further support for a new adenovirus genus (Atadenovirus). // J. Gen. Virol., 1998, v.-79, pp.-1453-1460

40. Davison A. J., Wright K. M. and Harrach B. DNA sequence of frog adenovirus. //J. Gen. Virol., 2000,v.-81, pp.-2431-2439

41. Dechecchi M. C., Tamanini A., Bonizzato A. and Cabrini G. Heparan sulfate glycosaminoglycans are involved in adenovirus type 5 and 2-host cell interactions. //Virology, 2000, V.-268, pp.-382-390

42. Devaux C.3 Adrian-M., Berthet C. C., Cusack S. and Jacrot B. Structure of adenovirus fibre. I. Analysis of crystals of fibre*from«adenovirus serotypes 2 and 5 by electron microscopy and X-ray crystallography. // J. Mol. Biol., 1990, V.-215, pp.-567-588

43. Devaux C., Caillet-Boudin M. L., Jacrot B., Boulanger P. Crystallization, enzymatic cleavage, and the polarity of the adenovirus type 2 fiber.// Virology, 1987, v.-161(l), pp.-121—128s

44. Falgout B., and Ketner, G. Characterization of adenovirus particles made by deletion mutants lacking the fiber gene. // J. Virol., 1988, .v.-62, pp.-622-655

45. Fauquet C. M., Mayo M. A., Maniloff J., Desselberger U. and Ball L. A. Virus taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Eight Report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses. // Elsevier Academic Press, 2005.

46. Fechner H., Haack A., Wang H., Wang X., Eizema K., Pauschinger M., Schoemaker R:, Veghel R., Houtsmuller A., Schultheiss H. P., Lamers J. and

47. K., Siegal G., Curiel D.T. Stable in vivo transduction via a novel adenoviral/retroviral chimeric vector. // Nat Biotechnol, 1997, v.-15, pp.866-870

48. Francois A., Eterradossi N., Delmas B., Payet V., Langlois P. Construction of avian adenovirus CELO recombinants in cosmids. // J Virol, 2001, V.-75, pp.-5288-5301

49. Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L., Falck-Pedersen E. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism withoutaffecting primary immune neutralization epitopes. // J. Virol., 1996, v.-70(4), pp.-2116-2123

50. Ginsburg A., Pinkofsky H. B., Reardon I., Heinrikson R. L. Lysyl residue 47 is near the subunit ATP-binding site of glutamine synthetase from Escherichia coli. // J Biol Chem, 1984, v.-259(15), pp.-9616-9622

51. Graham F. L., Smiley J., Russell W. C., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. // J Gen Virol, 1977, v.-36(l), pp.-59-74

52. Greber U. F., Willetts M., Webster P., Helenius A. Stepwise dismantling of adenovirus 2 during entry into cells. // Cell, 1993, V.-75, pp.-477-486

53. Green N. M., Wringley N. G., Russell W. C., Martin S. R. and MacLachlan A. D. Evidence of a repeating cross-J sheet structure in the adenovirus fibre. //EMBO, 1983, v.-2, pp.-1357-1365

54. Ewing's sarcoma, and benign neurogenic tumors among musculoskeletal tumors. // Clin Cancer Res., 2004, v.-lO, pp.-3831- 3838

55. Guardado-Calvo P., Llamas-Saiz A. L., Fox G. C., Langlois P., van Raaij M. J. Structure of the C-terminal head domain of the fowl adenovirus type 1 long fiber. // J Gen Virol., 2007, v.-88(9), pp.-2407-2416

56. Guardado-Calvo P., Llamas-Saiz A. L., Langlois P. and van Raaij M. J. Crystallization of the C-terminal head domain of' the avian adenovirus CELO long fibre. // Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2006, v.-62, pp.-449-452

57. Guy M., Bernard C., Mireille D. Phylogenetic analysis of fowl adenoviruses. // Avian Pathol, 2004, v.-33, pp.-164-170

58. HanahanD. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // J. Mol. Biol., 1983, v.-166, pp.-557-580

59. Harrach B., Meehan B. M., Benko M., Adair B. M. and Todd:D. Close phylogenetic relationship between egg drop syndrome virus, bovine adenovirus serotype 7, and ovine adenovirus strain 287. // Virology, 1997, V.-229, pp.-302—308

60. Hess M, Blocker H. and Brandt P. The complete nucleotide sequence of the egg; drop syndrome virus: an intermediate between mastadenoviruses and aviadenoviruses.//Virology, 1997, V.-238, pp;-145-156

61. Hess M, Cuzange A, Ruigrok R. W. H, Chroboczek J, Jacrot B. The avian? adenovirus penton: two fibres and; one base. // J Mol Biol- ,1995, v.— 252, pp.-379-385

62. Hicks W, Hall L, Sigurdson L, Stewart C, Hard R, Winston J, and Lwebuga-Mukasa J. Isolation and characterization of basal cells from human upper respiratory epithelium. //Exp. CellRes, 1997, V.-237, pp.-357-363

63. Holmes D. S., Quigley M. A. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. // Anal; Biochem, 1981, v.-l 14, pp. -193

64. Hong J. S. and Engler, J. A. Domains required'for assembly of adenovirus type 2 fiber trimers. // J. Virol., 1996, V.-70, pp.-7071-7078

65. Hong S. S., Karayan L., Tournier J., Curiel D. T. and Boulanger P. A. (). Adenovirus type 5 fiber knob binds to MHC class I a2 domain at the surface of human epithelial and B lymphoblastoid cells. // EMBO, 1997, v.-16, pp.-2294-2306

66. Hongju W., Han T., Belousova N., Krasnykh V., Kashentseva E., Dmitriev I., Kataram M., Mahasreshti P. J. and Curiel D. T. Identification of sites»in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. // J. Virol., 2005, v.-19, pp.-3382-3390

67. Horwitz A. F. Integrins and health. // Sci. Am., 1997, V.-276, pp.-68-75

68. Huang S., Endo R. I. and Nemerow G. R. Upregulation of integrins avb3 and avb5 on human monocytes and T, lymphocytes facilitates adenovi rus-mediated gene delivery. // J. Virol., 1995, v.-69, pp.-2257—2263

69. Huang S., Reddy V., Dasgupta N. and Nemerow. G. R. A single amino acid in the adenovirus type 37 fiber confers binding to human conjunctival cells. // J. Virol., 1999, v.-73, pp.-2798-2802

70. Humphries M. J. and P. Newham. The structure of cell-adhesion molecules. // Trends Cell Biol., 1998, v.-8, pp.-78-83

71. Hynes R. O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. // Cell; 1992, v.-69, pp.-11-25

72. Hyvonen P., Suojala L., Haaranen J., von Wright A., Pyorala S. Human and bovine lactoferrins in the milk of recombinant humanlactoferrin-transgenic dairy cows during lactation. // Biotechnol J., 2006, v.-l(4),pp.-410-412

73. Jarecki-Khan K., Tzipori S. R., Unicomb L.E. Enteric adenovirus infection among infants with diarrhea in rural Bangladesh. // J Clin Microbiol, 1993, v.-31(3), pp.-484-489

74. Jones D. T. Protein secondary structure prediction based on positionspecific scoring matrices. // J. Mol. Biol., 1999, V.-292, pp.-195-202

75. Kawaguchi T., Nomura K., Hirayama Y., Kitagawa T. Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. // Cancer Res, 1987, v.-47(16), pp.-4460^1464

76. Keyaerts T. E., Lindberg M., Van Ranst M. Characterization of a cDNA encoding the bovine coxsackie and adenovirus receptor. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, V.-288, pp.-805-808

77. Kovesdi I., Brough D. E, Bruder J. T., Wickham T. J. Adenoviral vectors for gene transfer. // Curr Opin Biotechnol, 1997, v.-8(5),fpp.-583-589

78. Kozarsky K. F. and Wilson J. M. Gene therapy: adenovirus vectors. // Curr Opin in Genetics and Development, 1999, v.-3, pp.-599-603

79. Krasnykh V., N., Mikheeva G. V., Douglas J. T. and Curiel D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. // J. Virol., 1996, v.-70, pp.-6839-6846

80. Krasnykh V., Dmitriev I., Mikheeva G., Miller C. R., Belousova N., and Curiel D. T. Characterization of an adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the HI loop of the fiber knob. // J. Virol., 1998, v.-72, pp.-1844-1852

81. Laver W. G., Younghusband H. B. and Wrigley N.G. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). // Virology., 1971, v.-45, pp.-598-614

82. Leblois H., Roche C., Di- Falco N., Orsini C., Yeh P., Perricaudet M. ' Stable transduction of actively dividing cells via a novel adenoviral/episomal vector. // Mol Ther, 2000, v.-l, pp.-314-322

83. Legerski R. J. and Robberson D. L. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions. // J. Mol. Biol., 1985, V.-181, pp.-297-312

84. Legrand V., Spehner D., Schlesinger Y., Settelen N., Pavirani A. and Mehtali M. Fiberless recombinant adenoviruses: Virus maturation and infectivity in the absence of fiber. // J. Virol., 1999, v.-73, pp.-907-919

85. Lehmkuhl H. D. and Cutlip R. C. A new goat adenovirus isolate proposed as the prototype strain for goat adenovirus serotype 1. // Arch. Virol, 1999, v.-144,pp.-1611-1618

86. Lehmkuhl H. D, Hobbs L. A. and Woods L. W. Characterization of a new adenovirus isolated from black-tailed deer in California. // Arch. Virol, 2001, v.-146,pp.-l 187-1196

87. Lehrmann H. and Cotten M. Characterization of CELO virus.proteins that modulate the pRb/E2F pathway. // J. Virol, 1999, v.-73, pp.-6517-6525

88. Leon R. P, Hedlund T, Meech S. Ji, Li S, Schaack J, Hunger S. P, Duke R. C, DeGregori J. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, v.-95(22), pp.-13159-13164

89. Li E, Stupack D, Bokoch G. M. and Nemerow G. R. Adenovirus endocytosis requires actin cytoskeleton reorganization mediated by Rho family GTPases. //J. Virol, 1998, v.-72, pp.-8806-8812

90. Li E, Stupack D, Klemke R, Cheresh D. A. and Nemerow G. R. Adenovirus endocytosis via alpha(v) integrins requires phosphoinositide-3-OH kinase. // J. Virol, 1998, v.-72, pp.-2055-2061 v

91. Li P, Bellett A. J. Parish C. R. DNA-biridïng proteins of chick embryo lethal orphan virus: lack of complementation between early proteins of avian and humans adenoviruses. // J. Virol, 1984b, v.-65, pp.-1817-1821

92. Li P, Bellett A. J, Parish C. R. The structural proteins of chick embryo lethal orphan virus (fowl adenovirus type 1). // J. Gen. Virol, 1984a, V.-65, pp.-1803-1815

93. Lieber A., He C. Y., Polyak S. L, Gretch D. R., Barr D., Kay M. A. Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human hepatocytes by adenovirus-mediated expression of ribozymes. //J Virol, 1996, v.-70(12), pp.-8782-8791

94. Lieber A., Steinwaerder D. S., Carlson C. A., Kay M. A. Integrating adenovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of all viral' genes. // J Virol, 1999 v.- 73(11), pp.-9314-9324

95. Lonnerdal B. Human milk proteins: key components for the biological activity of human milk. // Adv Exp Med Biol., 2004, V.-554, pp.-l 1-25

96. Loser P., Huser A., Hillgenberg M., Kumin D., Both G. W., Hofmann C. Advances in the development of non-human viral DNA-vectors for gene delivery. // Curr Gene Ther., 2002, v.-2(2), pp.-161-171

97. Matthews D. A. and Russell W. C. Adenovirus protein-protein interactions : molecular parameters governing the binding of protein VI to hexon and the activation of the adenovirus 23K protease. // Journal of General Virology, 1995, v.-76, pp.-1959-1969

98. McDonald G. A., Zhu G., Li Y., Kovesdi I., Wickham T. J. and Sukhatme V. P. Efficient adenoviral gene transfer to kidney cortical vasculature using a fiber modified vector. // J. Gene Med., 1999, v.-l, pp.-103-110

99. McFerran J. B. Saif Y. M., Barnes H. J., Gilsson J. R. .Group I adenovirus infections. In: Disease of poultry. Iowa State University Press, Ames, 2003, pp.-214-227

100. Medina-Kauwe L. K. Endocytosis of adenovirus and adenovirus capsid proteins. // Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, v.-55, pp.-1485-1496/

101. Mette S. A., Pilewski J., Buck C. A. and Albelda S. M. Distribution of integrin cell adhesion receptors on normal bronchial epithelial cells and lung cancer cells in vitro and in vivo. // Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol., 1993, v.-8, pp.-562—572

102. Michael S. I., Hong, J. S., Curiel, D. T. and Engler, J. A. Addition of a short peptide ligand to the adenovirus fiber protein. // Gene Ther., 1995, v.-2, pp.-660-668

103. Michou A. L., Lehrmann H., Saltik M., Cotten M. Mutational analysis of the avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors. // J Virol, 1999, v.-73, pp.-1399^10

104. Mitani K. and Kubo S. Adenovirus as an integrating vector. // Curr Gene Ther, 2002, v.-2, pp.-1-10

105. Miyamoto S., Akiyama S. K., Yamada K. M. Synergistic roles for receptor occupancy and aggregation in integrin transmembrane function. // Science, 1995, V.-267, pp.-883-885

106. Moore M., Horikoshi N., Shenk T. Oncogenic potential of the adenovirus E4orf6 protein. // Proc Natl Acad Sci USA, 1996, v.-93(21), pp.-11295-11301

107. Moorhead J. W., Clayton G. H., Smith R. L., Schaack J. A replication-incompetent adenovirus vector with the preterminal protein gene deleted efficiently transduces mouse ears. // J Virol, 1999, v.-73(2), pp.-1046-1053

108. Niavarani A., Dehghanizadeh S., Zeinali S., Karimi M., Magliano M., Rassoulzadegan M. Development of transgenic mice expressing calcitonin as a beta-lactoglobulin fusion protein in mammary gland. // Transgenic Res., 2005, v.-14(5), pp.-719-727

109. Novelli A. and Boulanger P. A. Deletion analysis of functional domains in baculovirus-expressed adenovirus type 2 fiber. // Virology, 1991, v.-5, pp.-365-376

110. Patterson S. and Russell W. C. Ultrastructural and immunofluorescence studies of early events in adenovirus-HeLa cell interactions. // J. Gen. Virol., 1983, v.-64, pp.-1091-1099

111. Payet V., Arnauld C., Picault J. P., Jestin A., Langlois P. Transcriptional organization of the avian adenovirus CELO. // J. Virol., 1998, v.-2, pp.-9278-9285

112. Petrella J., Cohen C. J., Gaetz J., Bergelson J. M. A zebrafish coxsackievirus and adenovirus receptor homologue interacts with coxsackie B virus and adenovirus. //J. Virol., 2002, v.-76, pp.-l 0503-10506

113. Pilewski J. M., Latoche J. D., Arcasoy S. M. and Albelda S. M. Expression of integrin cell adhesion receptors during human airway epithelial repair in vivo. // Am. J. Physiol, 1997, V.-273, pp.-256-263

114. Roberts M. L., Athanasopoulos T., Pohlschmidt M., Duisit G., Cosset F. L., Dickson G. Post-mitotic, differentiated myotubes efficiently produce retroviral vector from hybrid adeno-retrovirus templates. // Gene Ther, 2001, v.-8, pp.-1580-1586

115. Roberts M. M., White J. L., Grutter M. G. and R. M. Burnett. Three-dimensional structure of the adenovirus major coat protein hexon. // Science, 1986, v.-232,pp.-l 148-1151

116. Roelvink P. W., Mi Lee G., Einfeld D. A., Kovesdi I. and Wickham T. J. Identification of a conserved receptor-binding site on the fiber proteins of CAR-recognizing adenoviridae. // Science, 1999, V.-286, pp.-1568T-1571168. RohnK., 1997

117. Roos J. and Kelly R. B. Is dynamin really a 'pinchase'. // Trends Cell Biol., 1997, v.-7, pp.-257-259

118. Russell W.C. Update on adenovirus and its vectors. // J. Gen. Virology, 2000, v.-81, pp.-2573-2604

119. Rux J. J. and R. M. Burnett. Type-specific epitope locations revealed by X-ray crystallographic study of adenovirus type 5 hexon. // Mol. Ther. 2000, v.-1, pp.-18-30

120. Rux J. J, Kuser P. R and Burnett R. M. Structural and phylogenetic analysis of adenovirus hexons by use of high-resolution X-ray crystallographic, molecular modeling, and sequence-based methods. // J. Virol, 2003, v.-77, pp.-9553-9566

121. Sabatucci A, Vachette P, Vasilyev V. B, Beltramini M, Sokolov A, Pulina M, Salvato B, Angelucci C. B, Maccarrone M, Cozzani I, Dainese

122. E. Structural characterization of the ceruloplasmin: lactoferrin complex in solution. // J Mol Biol, 2007, v.-371(4), pp.-103 8-1046

123. Sanchez O, Toledo J. R, Rodriguez M. P, Castro F. O. Adenoviral vector mediates high expression levels of human growth hormone in the milk of mice and goats. // J. Biotechnol, 2004, v.-l 14, pp.-89-97

124. Sandalon Z, Gnatenko D. V, Bahou W. F, Hearing P. Adeno-associated virus (AAV) Rep protein enhances the generation of a recombinant mini-adenovirus (Ad) utilizing an Ad/AAV hybrid virus. // J Virol, 2000, v.-74, pp.-10381-10389

125. Seiradake E. and Cusack S. Crystal structure of enteric adenovirus serotype 41 short fiber head. // J Virol, 2005, v.-79, pp.-14088-14094

126. Sharp P, Srai S. K. Molecular mechanisms involved in intestinal iron absorption. // World J Gastroenterol, 2007, v.-13(35), pp.-4716-4724

127. Shashkova EV, Cherenova LV, Kazansky DB, Doronin K. Avian adenovirus vector CELO-TK displays anticancer activity in human cancer cells and suppresses established murine melanoma tumors. // Cancer Gene Ther, 2005, v.-12(7), pp.-617-626

128. Shayakhmetov D. M, Li Z. Y, Ni S. and Lieber A. Targeting of adenovirus vectors to tumor cells does not enable efficient transduction of breast cancer metastases. // Cancer Res, 2002, v.-62, pp.-1063-1068

129. Shayakhmetov D. M, Papayannopoulou T, Stamatoyannopoulos G, Lieber A. Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector. // J. Virol, 2000, v.-74, pp.-2567-2583

130. Shenk T, Fields B.N, Knipe D.M, Howley P.M. Adenoviridae: the viruses and their replication. // Fields virology, 1996, pp.- 2111-2148

131. Shinagawa M, Ishiyama T, Padmanabhan R. V, Fujigana K, Kamada M, Sato G. Comparative sequence analysis of the inverted terminal repetition in the genomes of animal and avian adenoviruses. // Virology, 1983, V.-125, pp.-491—495

132. Soifer H, Higo C, Kazazian H. H, Jr. Moran J. V, Mitani K, Kasahara N. Stable integration of transgenes delivered by a retrotransposon-adenovirus hybrid vector. // Hum Gene Ther, 2001, v.-12, pp.1417-1428

133. Soifer H, Higo C, Logg C. R, Ja-Lu Jih L, Shichinohe T, Harboe-Schmidt E, Mitani K, Kasahara N. A novel, helper-dependent, adenovirus-retrovirus hybrid vector: stable transduction by a two-stage mechanism. // Mol Ther, 2002, v.-5, pp.-599-608

134. Stehle T. and T. S. Dermody. Structural evidence for common functions and ancestry of the reovirus and adenovirus attachment proteins. // Rev. Med. Virol, 2003, v.-13, pp.-123-132

135. Stevenson S. C, Rollence M, Marshall-Neff J, McClelland A. Selective targeting of human cells by a chimeric adenovirus vector containing a modified fiber protein. // J Virol, 1997, v.-71(6), pp.-4782-4790

136. Stevenson S. C., Rollence M., White B., Weaver L. and McClelland A. Human adenovirus serotypes 3 and 5 bind to two different cellular receptors via the fiber head domain. // J. Virol., 1995, v.-69, pp.-2850-2857

137. Stewart P. L. and Burnett R. M. Adenovirus structure by X-ray crystallography and electron microscopy. // Curr. Top. Microbiol Immunol., 1995, V.-199, pp.-25-38

138. Stratford-Perricaudet L. D., Makeh I., Perricaudet M., Briand P. Widespread long-term gene transfer to mouse skeletal muscles and heart. // J Clin Invest, 1992, v.-90(2), pp.-626-630

139. Tan B. T., Wu L., Berk A. J. An adenovirus-Epstein Barr virus hibrid vector that stably transforms cultured cells with high efficiency. // J Virol, 1999, v.-6, pp.-7582-7589

140. Tan P. K., Michou A. I., Bergelson J. M. and Cotten M. Defining CAR as a cellular receptor for the avian adenovirus CELO using a genetic analysis of the two viral fibre proteins. // J Gen Virol, 2001, v.-82, pp.-1465-1472

141. Thoelen I., Keyaerts E., Lindberg M., Van Ranst M. Characterization of a cDNA encoding the bovine coxsackie and adenovirus receptor. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, V.-288, pp.-805- 808

142. Thomson D., Meers J. and Harrach B. Molecular confirmation of an adenovirus in brushtail possums (Trichosurus vulpecula). // Virus Res., 2002, v.-83, pp.-189-195

143. Tidona C. A., Darai N. Y., Davison A. J: and Harrach B. Siadenovirus. Adenoviridae. // The Springer index of viruses, 2002, pp.-29-33

144. Toledo J. R., Sanchez O., Segui R. M., Garcia G., Montanez M., Zamora P. A., Rodriguez M. P., Cremata J. A. High expression level of recombinant human erythropoietin in the milk of non-transgenic goats. // J. Biotechnol., 2006, V.-123, pp.-225-235

145. Tomko R. P., Xu R., Philipson L. HCAR and MCAR: the human and mouse cellular receptors for subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses. // Proc Natl Acad Sci USA, 1997, v.-94, p.-3352-3356

146. Van't Holf W., Crystal R. G. Fatty acid modification of the coxsackievirus and adenovirus receptor. // J. Virol., 2002, v.-76, pp.-6382— 6386

147. Wang A., Yokosaki Y., Ferrando R., Balmes J. and Sheppard D. Differential regulation of airway epithelial integrins by growth factors. // Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol., 1996, v.-15, pp.-664-672

148. Wang X. and Bergelson J. M. Coxsackievirus and adenovirus receptor cytoplasmic and transmembrane domains are not essential for coxsackievirus and adenovirus infection. // Journal of Virology, 1999, v.-73, pp.-2559-2562

149. Wickham T. J. Targeting adenovirus. // Gene Ther, 2000, v.-7(2), pp.-110-114

150. Wickham T. J., Carrion M. E. and Kovesdi I. Targeting of adenovirus penton base to new receptors through replacement of its RGD motif with other receptor-specific peptide motifs. // Gene Ther., 1995, v.-2, pp.-750-756

151. Wickham T. J, Haskard D., Segal D. and Kovesdi I. Targeting endothelium for gene therapy via receptors up-regulated during angiogenesis and inflammation. // Cancer Immunol. Immunother, 1997, v.-45, pp.-149-151

152. Wickham T. J, Mathias P, Cheresh D. A, Nemerow G. R. Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. // Cell, 1993, v.-73(2), pp.-309-319

153. Wickham T. J, Roelvink P. W, Brough D. E. and Kovesdi I. Adenovirus targeted to heparan-containing receptors increases its gene delivery efficiency to multiple cell types. // Nat. Biotechnol., 1996, v.-14, pp.-1570-1573

154. Wickham T. J, Segal D. M, Roelvink P. W, Carrion M. E, Lizonova A, Lee G. M. and Kovesdi I. Targeted adenovirus gene transfer to endothelial and smooth muscle cells by using bispecific antibodies. // J. Virol, 1996, v.-70, pp.-6831-6838

155. Wickham T. J, Tzeng E. L, Shears L. N, Roelvink P. W, Li Y, Lee G. M, Brough D. E, Lizonova A, and Kovesdi I. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. //J. Virol, 1997, v.-71, pp.-8221-8229

156. Xia D, Henry L. J, Gerard R. D. and Deisenhofer J. Crystal structure of the receptor-binding domain of adenovirus type 5 fiber protein at 1.7 A resolution. // Structure, 1994, v.-2, pp.-1259-1270

157. Xia D, Henry L, Gerard R. D. and Deisenhofer J. Structure of the receptor-binding domain of adenovirus type 5 fiber protein. // Curr. Top. Microbiol. Immunol, 1995, v.-199, pp.-39-46

158. Yang Y, Nunes F. A, Berencsi K, Furth E. E, Gonczol E. and Wilson J. M. Cellular Immunity to Viral Antigens Limits El-Deleted Adenoviruses for Gene Therapy. // PNAS, v.-91, pp.-4407-4411

159. Yoshida Y, Sadata A, Zhang W, Saito K, Shinoura N. and Hamada H. Generation of fiber-mutant recombinant adenoviruses for gene therapy of malignant glioma. // Hum. Gene Ther, 1998, v.-9, pp.-2503-2515

160. Yu Z, Meng Q, Yu H, Fan B, Yu S, Fei J, Wang L, Dai Y, Li N. Expression and bioactivity of recombinant human lysozyme in the milk of transgenic mice. // J Dairy Sci, 2006, v.-89(8),.- pp2911-2918

161. Zabner J, Chillon M, Grunst T, Moninger T. O, Davidson B. L, Gregory R, Armentano D. A chimeric type 2 adenovirus vector with a type 17 fiber enhances gene transfer to human airway epithelia. // J. Virol, 1999, v.-73(10), pp.-8689-8695

162. Zhang F, Andreassen P, Fender P, Geissler E, Hernandez J. F. and Chroboczek J. A transfecting peptide derived from adenovirus fiber protein. // Gene Therapy, 1999, v.-6, pp.-171-181

163. Zhang L, Sankar U, Lampe D. J, Robertson H. M, Graham F. L. The Himarl mariner transposase cloned in a recombinant adenovirus vector is functional in mammalian cells. // Nucleic Acids Res, 1998, v.-26, pp.-3687-3693

164. Zhao C, Liu Z, Fan B, Dai Y, Wang L, Zheng M, Wang M, Niu H, Xi F, Li N, Zhang D. Differential glycosylation of rhLf expressed in the mammary gland of transgenic mice. // Anim Biotechnol, 2006, v.-17(1), pp.-13-20

165. Zubieta C, Schoehn G, Chroboczek J. and Cusack, S. The structure of the human adenovirus 2 penton. // Mol Cell, 2005, v.-17, pp.-121—135

Информация о работе

Зубкова, Ольга Вадимовна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Модификация отростка пентона аденовируса птиц CELO для получения вектора с измененным тропизмом, способного к эффективной трансдукции клеток млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы