Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и изучение новых векторных систем для эффективной экспрессии генов рибозимов в культуре клеток

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание и изучение новых векторных систем для эффективной экспрессии генов рибозимов в культуре клеток"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

~"Тд--

«' ' 15 [0(<к На нравах рукопж .1

ЗАХАРЧУК Александр Николаевич

СОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ ВЕКТОРНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РИБОЗИМОВ В КУЛЬТУРЕ

КЛЕТОК.

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на оонскаиив ученой степени кандидата биологических наук.

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генной ннженерии ШШИ сельскохозяйственной биотехнологии РЛСХЛ.

Научный руководитель - доктор биологических наук, Нпродицкий Б.С.

, Официальные оппоненты- доктор биологических наук, Смирнов В.Д. доктор медицинских наук, Лльтштейн Л.Д.

Ведущая организация- Институт молекулярной генетики РЛН.

Защита диссертации состоится " " г.

в чисои на заседании Специализированного Совета Д.020.10.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимнряпенскля, д. 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "_1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Сонета, кандидат биологических наук

Медикоиа С.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проб леммы. Обнаружение каталитических свойств

у полирибонуклеотидов принадлежит к числу наиоолее значительных событий в молекулярной биологии последнего десятилетия. Это открытие привело к пересмотру роли РНК в клетке и положило начало исследованиям каталитически активных РНК, получивших название рибозимов.

Помимо важного научного, эти исследования в перспективе имеют и практическое значение. Использование рибозимов в качестве эффективных и специфических ингибиторов экспрессии геноп клеточного и вирусного происхождения открывает путь к созданию новых средств терапии вирусных инфекций, опухолевых и наследственных заболеваний. В сельском хозяйстве возможно получение вирус-устойчивых растений и животных, а также растений ' и животных, у которых о помощью рибозимов блокируется фенотнпическое выражение нежелательных для человека генетических признаков.

По своему действию рнбозимы близки к антисмысловым РНК. Однако, они способны не только образовывать комплекс о РНК-мишенью, но и расщеплять в ней определенную фоефодиэфирную связь. Сами каталитически активные молекулы не расходуются в процессе расщепления.

Дальнейшее широкое применение рибозимов для решения практических задач будет зависите от эффективности и стабильности экспрессии эндогенного РНК-катализатора, который должен быть

нетоксичен для клетки, от его способности функционировать в сложной внутриклеточной среде и доступности РНК-мишени.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка и изучение новых векторных систем для переноса и эффективной экспрессии в культуре оукариотических клеток генов рибознмов, направленных против мРНК клеточных и вирусных генов.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Создать искусственные гены рибозимов типа "головка молотка", направленные против мРНК клеточных и вирусных генов: сскретир/емой плацентарной щелочной фосфатазы (SKAP) и РВ1 субъсдиницы РПК-полимеразы вируса гриппа Л.

2. Создать генно-инженерные конструкции, содержащие гон рибозима против мРНК SEAP в составе гена VA РНК аденовируса птиц CULO. Исследовать биолэгичсскую активность рибозима против мРНК SEAP в составе гена VA PHIC аденовируса птиц CELO в бссклеточпой системе и в культуре клеток.

3. Получить дефектный рекомбинантный аденовирус на основе А(1б человека, несущий ген рибозима против мРНК SEAP в составе CELO VA РНК в районе дслетированной El области генома. Исследовать экспрессию гена рибозима и его биологическую активность при инфекции рекомбннантным вирусом культуры клеток.

Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенной работы получена рскомбинантная плазмида, несущая ген рибозима в составе гена VA РНК аденовируса птиц CELO. Показано,

что последовательности VA РНК CELO не оказывают негативного влияния на активность рибозима в бесклеточной системе, а вставка последовательности гена рибозима между промоторными бог ;ами гена VA РНК CELO не влияет на эффективность транскрипции гена VA РНК CELO в культуре клеток линии 293. Таким образом, впервые показана возможность использования гена VA РНК CELO для экспрессии рибозима в культуре клеток.

Впервые получен дефектный рекомбинантный аденовирус на основе Ad5, несущий ген рибозима против мРНК SEAP в составе CELO VA РНК в районе делетированной El области генома. Показана экспрессия функциональио-активного рибозима в клетках линии Не1л, инфицированных рекомбинантным аденовирусом, ингибирование транзиентной и стабильной экспрессии гена SEAP в клеточных культурах.

Впервые сконструирован искусственный ген рибозима против мРНК РВ1 субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А. Рибозим был активен по отношению к модельному субстрату в бесклеточной системе.

Работа представляет не только научный, но и в перспективе может иметь и практический интерес, так как полученный функционально-активный в бесклеточной системе рибозим против мРНК PBI субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А может быть использован в дальнейшем для ингибирования репродукции вирусов гриппа сельскохозяйственных животных и птиц. Новые векторные

системы для переноса и экпрессии генов рибознмои могут быть применены для разработки средств противовирусной терапии и получения трансгенных сельскохозяйственных животных, устойчивых к вирусным инфекциям.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на семинарах лаборатории молекулярной диагностики и генной иия: .перин микроорганизмов ВНИИСВ, отдела генной инженерии В1Ш11СБ, на международной конференции CHI "Technological Advances for in vivo Gone Therapy" (Вашингтон, ноябрь 1S94 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

машинописного текста ц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего i47 источников, из них 142 иностранных. Иллюстративный материал представлен 22 рисунками и одной таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1..Материалы н.методы исследования.

В исследованиях использовали рскомбинантные аденовирусы

Ad6 человека • Ad&neo, полученный от Dr. Gluzman (Cold Spring

Harbor 1лЬ.) и Ad5VK2SSEAP, любезно предоставленный н.с. ВНИИСВ

Дорониным 1С.К.

;. Диссертация изложена на 108 стр.

j

Очистку и концентрирование аденовирусов проводили путем центрифугирования в градиенте плотности CsCl по модифицированному методу Грина (Green & Wold, 1980).

В работе использовались клеточные линия: 293; HeLa; FLK-BLV-SEAP, любезно предоставленные с.н.с. ВНИИСБ к.б.н. Зеливянским С. В. Трансфекцию клеточных линий проводили методом кальций-фосфатной преципитации (Graham & van dor Eb, 1973). Все манипуляции, связанные с получением рекомбинангных аденозирусоп проводили согласно Graham & Prevec (1991). Эта работа проводилась совместно с сотрудниками ВНИИСБ Дорониным К.К. и к.б.н. Бабуриной Т.М.

Определение ферментативной активности секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы в культуральпой жидкости проводили по модифицированному методу Berber et el (1988). Активность щелочной фосфатазы представлена в инллиедшшцах (мЕд) на мл культуральной жидкости.

В работе был использован лабораторный штамм E.coll DH6<х и плазмидные векторы: pGEM3zf(-) ("Promega"); pUC1813; pBcl 2/RSV/SEAP, любезно предоставленный Dr. В. Cullen (Howard Hughnes Medical Institute); pJM-17 и pXCJL-1 полученные от Dr. F. Graham (McMaster University); pCKX, любезно предоставлена к.б.н. Кругляком В.А. и кДНК гена РВ1 вируса гриппа А;/Киев/50/78, клониоованная в плазмиде рРВ1, полученная от чл. корр. АМН, доктора мед. наук Каверина Н.В.

I I

Плазмидную ДНК из бактериальных клеток выделяли по модифицированному методу Холмса (Holmes, 1981) и подвергали очистке в градиенте плотности CeCl (Maniatis et al 1989).

Все генно-инженерные манипуляции с ДНК проводили как рекомендовано в руководстве Макиатиса (Maniatis et al 1989) н инструкциями фирм-про «зводителей реагентов. Трансформацию клеток E.coll плазмидной ДНК проводили по стандартной методике (Hanahan 1933).

Первичную структуру ДНК определяли по методу Сэнгера (Sanger 1977). Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировал на автоматическом синтезаторе u.c. ВНИИСБ Карпов В.Л.

Получение [а-82Р]УТФ меченных транскрнптов проводил»! по модифицированному методу Melton (1984). Тестирование специфической эндорибопуклеазной активности in vitro проводили в присутствии 10 mM Tris-HC! pll=7.5, MgCl2 в концентрациях б, 10, 50 гпМ. Транскрибированная РНК смешивалась, денатурировалось нагреванием 95°С - 1 мин. с последующим охлаждением па льду. Реакция проводилась при постоянных температурах инкубации 37 и 66°С, а также с их циклической сменой в интервале от 37 до 80°С. Продолжительность одного полного температурного цикла - 4 мин.

Выделение РНК из культур клеток проводили по методу Chornozynaki (1993). Primer extension анализ РНК проводили согласно руководства Maniatis (1989). Меченный праймер отжигали с тотальной РНК при температуре 85°С.

Обратную транскрипцию РНК проводили с использованием AMV ревертазы ("Promesa") при 42°С - 30 мин.

2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.1 Исследование специфической эндорибонуклеазной активности рибозимов в бесклеточной системе.

Сайт CUC мРНК гена SE АР (координата - 170 н.) и сайт GUC мРНК гена РВ1 (координата - 1558 н.) были выбраны для расщепления рибозимом. При выборе этих сайтов руководствовались данными компьютерного анализа вторичной структуры мРНК программой PC FOLD. К выбранным сайтам химически синтезировали олигодезоксирибонуклеотиды генов рибозимов, включающие в себя последовательности, кодирующие каталитический домен (24 л.) и фланкирующие последовательности, комплементарные мРНК-мншени: по 11 н. с каждой стороны от каталитического домена,

В качестве вектора для эффективной экспрессии рибозима в клетках эукариот мы использовали ген VA РНК аденовируса птиц CELO. Фрагмент генома вируса CELO, содержащий VA РНК, был субклонирован из плазмиды рСКХ по сайтам CfrI, Mael в Smal сайт вектора pUC1813 с предварительным переводом выступающих концов в тупые. Затем, фрагмент генома был переклонирован из этого вектора в сайт BamHI плазмиды pGEM-2 в направлении транскрипции CELO VA РНК о промотора фага SP6. Эта плазмкда получила название pCVA (рис. 1А). Она содержит единственный клонирующий сайт BspMII,

расположенный внутри гена CELO VA РНК между промоториыми боксами гена. Этот сайт и был использован для клонирования гена рибозима против мРНК SEAP. А

pCVA ВатШ ВамШ

pcvAriba или pCVAriW

SP6

И

А бокс ВзрМ II В бокс

■Vial

А бокс ЕМ 11 бокс

РИБОЗИМ

Рис. 1 А. Схемы рекомбимантных плазм ид. Белые прямоугольники -промотор гсиа СК1Х) УЛ РНК. Черный прямоугольник - ген рибозима против мРПК йЕЛР. 8Р6 ■ промотор РИК-полимеразы фага Ы'б. НапЛ II, ХЬа1, Вир МИ - сайты специфических эндодезоксирибонуклеаз. В. Схема вторичной структуры молекулы СКШ \'А РНК с интегрированным в ео состпч рибозимом.

о-с ^ (P^Wccíb aaacugooüadu С-0 U-A

соса со о-с

A-U U-A C-Q TJ-A D С

З'-в"* AQ-5-

Рскомбинантная плазмида получила название pCVArib3 (рис. 1А). ;>та илалмида может служить для синтеза рибозима, интегрированного в

состав молекулы CELO VA РНК (рис. 1Б), как в бссклеточной системе

(транскрипция о промотора БРв), так и в эукариотических клетках (транскрипция о промотора VA РНК CELO). Однако, транскрипт о бесклеточной системе несколько превышает по длине траьакрипт в клетках ш-зл транскрипции участков плазмидных полилинкеров и вирусных последовательностей после терминатора гена VA РНК.

Для получения радиоактивно-меченных транекриптов в бесклеточной системе был сконструирован ряд рекомбинантных плазмид на основе стандартных векторов серии pGEM, несущих в своем составе фрагменты генов мРШС-субстратоа, содержащие выбранные ран fea сайты расщепления, а также плазмиды с генами рибозимов против мРНК БЕАР и РВ1 без последовательностей CELO VA РНК.

Используя РНК-полимеразу фага SP6 и ДНК рекомбпиалтных плазмид, были получены [а-33Р]УТФ-кгчвяпыо трапскрипты, которые использовались для. иоследоваиая специфической оадорнбоиуклеазной активнооти рибозимов в бескдеточпой системе. Инкубироаапие рибозима против нРНК БВАР с фрагментом мРНК-суСстрата в прнсутевип поной M¡f3+ приводямо к споцифтесхому расщеплению субстрата длиной 240 я. с образованием фрагментов РНК длиной 170 и. и 70 н. (см. Р1 и Р2 фрагменты на рно. 2). Рибоаим проявлял

4 3 2 1

- . -Р1

•Р2

*

Рис. 2. Радиоавтограф электрофореза продуктов расщепления субстрата рпбозимом против мРНК SKAP в составе последовательностей CELO VA PHFC(ii) и без них (А) 1> бесклеточной системе. S- субстрат; К- рибозим; Р1 и Р2- продукты решении. Реакция проводилось при бв°С в присутствии 10 niM М(ГС12.

(А) Алнквоты отбирались через временные интервалы: 1- 0 .мин.; 2- Ю .мин.; 3- 20 мин.; 4- -10 мин.; 5- 50 мин.; в- 60 мин.; 7- маркер мол. веса.

(1») Аликвоты отбирались через временные интервалы; 3- 15 мин.; 430 мин.; 5- 60 мин. Рибозим в этих треках не метился. 1- меченный рибозим; 2- меченный субстрат без рибозима; маркер мол. веса.

специфическую активность как без последовательностей CIOLO VA РНК рис. 2 А.), тик и в состапс последовательностей CKLO VA РНК (рис. 2 1J.). Сравнение ферментативной активности рибозима против модельного субстрата в составе последовательностей СЕШ VA РНК и без них не выявило достоверного различия (Р-0,95), что позволяет сделать вывод: последовательности CELO VA РНК не оказывают негативного влияния на активность рибозима в бссклеточной системе.

Исследование ферментативной активности рибозима против мРНК

SEAP проводилось при различных температурах инкубаци. Рибозим проявлял активность при физиологических температурах инкубации, однако, более высокая активность наблюдалась при повышенной температуре (56°С). При циклическ ii смепе инкубационных температур активность значительно повышалась (до 80% расщепления субстрата за час инкубации). Это согласуется о ранее опубликованными данными других авторов.

Исследование специфической эндернбонуклеазной активности димера рибозима "голова-к-хвосту" против фрагмента мРНК гена РВ1 также показало его активность в бесклеточной системе (рис. 3). Субстрат длиной 340 н. расщеплялся с образованием продуктов реакции: Р1- 276 н. и Р2- 64 и. Происходило накопление продуктов с течением времени и уменьшение количества субстрата. Молярное соотношение рибозима к субстрату составляло примерно 1:1. Рибозим был активен и при физиологической температуре инкубации.

Однако, необходимо отметить, что данные по ферментативной активности рибозимов в бесклеточной системе в полной мере не отражают характеристики работы рибозима в клетке. Так как условия проведения реакции In. ultra лишь только приближены к условиям в клетке. Сами молекулы субстрата и рибозима имеют в клетке другую длину и, следовательно, другую вторичную и третичную структуру. Влияние на ферментативную активность рибозима могут оказывать белки. Важное значение имеет в каком клеточном

/

1 г я 4 s (> "/ а и

. .4

©-11»

1*2

Рис. 3. Радиоавтограф электрофореза продуктов расщепления субстратарибозимом против мРНК гена PBX субъединицы РНК-полимерааы вируса гриппа А в бесклеточной системе. S- субстрат; R-рибозим; Р1 и Р2- продукты реакции. Реакция Проводилась при 37°С (2-4) и при 5б°С (5-7). Время инкубации: 1- 0 мин.; 2 и 5- 30 мин.; 3 и 6- 60 мин.; 4 и 7- S0 мин.; 8- маркер мол. весов.

компартменте преимущественно находятся молекулы субстрата и рибозима. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на изучение активности рибозима и его экспрессии в клеточных культурах. Особенный интерес вызывал рибозим в составе CELO VA РНК, так как промотор гена CELO VA РНК должен обеспечить высокий уровень транскрипции в клетках различных типов тканей, а сама молекула CELO VA РНК повысить стабильность интегрированного в ее состав рибозима.

2.2 Исследование биологической активности рибозима против мРНК SEAP при транзиентной трансфекции клеток линии 293.

На первом этапе оценивалась работа промотора гена VA РНК CELO после вставки в него гена рибозима. Для этого проводился primer extension анализ тотальной РНК, выделенной из клеток, трансфицированных плаэмидой pCVArib3. Праймером служил [у-Р32]-меченный олигодезоксирибонуклеотид одной из цепей гена рибозима.

Наблюдалось появление специфического продукта удлинения

/

праймера - 100 н., соответствующего 5-области транскрибируемой в клетках 293 линии VA РНК CELO (рис. 4А).

Л

ÍÍOO- 1 2 3 4 IS

151- ш — а.

118100- о "О* о Ь.

82- i 1 .о ' «as» С.

66- ' <TrN «SS» (J.

48-

Рио. 4. Исследование транскрипции рибозима с промотора гена VA РНК CELO при гранзиентной трансакции ДНК.плазмиды pCVArib3 клеток линии 293.

(А) 2- primer-extension анализ РНК, выделенной на клеток, трансфицированиых pCVArib3. Стрелка указывает на продукт удлинения праймера; 4- primer-extension анализ РНК, выделенной из клеток, трансфицированиых pCVA; 1 и 3- маркер молекулярного веса. (Б) Слот-блот гибридизация РНК выделенной из клеток, трансфицированных pCVA (с) или pCVArlb3 (d). Положительный контроль - транскрибированная in vitro CELO VA- РНК (a), отрицательны контроль - РНК из ветрансфицированных клеток (Ь). Зондом служила ДНК плазмиды pCVA.

Для того, чтобы сравнительно оценить уровень транскрипции, тотальная РНК из клеток, трансфицированных плазмидой pCVArib3 или pCVA исследовалась методом слот-блот гибридизации. В качестве зонда использовалась меченная ДНК плазмиды pCVA, содержащая ген CELO VA РНК. Снижения уровня транскрипции гена VA РНК CELO со вставкой гена рибозима по сравнению с нативным геном не выявлялось (рис. 4Б). Из этого молено сделать важный вывод, что вставка в ген CELO VA РНК 60-тичленного олигонуклеотида гена рибозима между промоторными боксами не привела к снижению эффективности работы промотора в клетках 293 линии.

Для выявления биологической активности рибозима против мРНК SEAP, интегрированного в CELO VA РНК, клетки линии 293 трансфицировали ДНК рекомбинантных плозмид: pBcl2/RSV/SEAP, продуцирующей секретируемую щелочную фосфатазу; pCVArib3, экспрессирующей рибозим против мРНК гена SEAP в составе VA РНК CELO; pCVArib2, экспрессирующей рибозим в составе VA РНК CELO со случайным набором нуклеотидов во фланкирующих последовательностях (контроль). Эффективность трансфекции в наших опытах составляла около 50% клеточного монослоя. Молярное соотношение ДНК плазмиды, продуцирующей фосфатазу и экспрессирующей ген рибозима составляло 1:10. Ферментативная активность SEAP в культуралыюй жидкости клеток, трансфицированных pCVArlb3 уменьшилась на 60% по сравнению с отрицательным контролем (pCVArlb2), что подтверждает

биологическую активность рибозима в составе VA РНК CELO выбранной нами модельной системе (Табл 1) .

Табл. 1. Транзиснтния экспрессия гена SEAP в клетках

ПЛАЗМИДЫ pBcJ2/KSV/SEAi'

Активность SEAP, мЕд/мл

pCVArib.l 0,2в ± 0,07

pCVArib2 0,52 1 0,05

2.3 Исследование биологической активности рибозима против мРНК SEAP в составе рекомбинантного аденовируса.

Одной из важнейших проблем при использовании рибозимов для решения практических задач является доставка гена рибозима в клетку для экспрессии его ln vivo. Для решения этой проблемы мы впервые использовали дефектный аденовирус.

Для получения дефектного рекомбнпантного аденовируса, несущего ген рибозима против мРИК SEAP в составе CELO VA РНК, проводилась котрансфекция клеток 293 линии ДНК плазмид pCVAIi3 и pJM17 (рис. 5А). Шазмидп pCVAR3 была получена путем клонирования гена рибозима в составе гена CELO VA РНК в BamlII сайт плалмиды pXC,JL-l, содержащей фрагмент генома Ad5 (0--17%) с дслетиропанной El областью (1-9,6%). Вследстпие гомологичной рекомбинации вирусных последовательностей плазмид, в трансфицнро иных клетках иозннкал дефектный рскомбипантный аденовирус со вставкой гена рибозима в месте делетированной El

pCVArib3

100.0

rutiu

котрансфскцкя клеток лишш 293

£r

Ad5C VAR 3 Г Bal

«i 9.3

100

1 2 3 4 s

Рис. б. Схема получения рекомбинаитного аденовируса, несущего геи рибозима против мРНК SEAP в составе гена CELO VA РНК и анализ экспрессии гена рибозиыа в ' клетках линии HeLa, инфицированных рекомбинантным аденовирусом.

(А) Белые прямоугольники - геном аденовируса человека 6 типа, цифры обозначают % вирусного генома. Rz - ген рибозима против мРНК SEAJP в составе последовательностей CELO VA РНК, В- сайт BamHI; серые кольца- последовательности

плазмидных векторов.

j

------—* (В) Электрофоре грамма продуктов ПЦР

тотальной РНК, выделевной кэ инфицированных клеток. 1- проба без РНК (отрицательный контроль); 2- РНК из клеток, инфицированных 100 БОЕ/кл. А<15СУАКЗ, обработанная ревертазой; 8- РНК из клеток, инфицированных АДбСУДОЗ, необработанная ревертазой; 4- РНК из клеток, инфицированных 100 БОЕ/кл А<15пео; 5- 1 тег ДНК плаамиды рСУАпЬЗ (положительный контроль).

области генома (рис. 5Л). Такой рекомбинант способен к репликации только в клетках 293 линии, комплемснтирующих делению Е1.

Для тестирования экспрессии гена рибозима в рекомбинантном аденовирусе, тотальная РНК из инфицированных клеток линии НеЬа подвергалась анализу методом полимсразной цепной реакции (ПЦР). Специфическими праймерами служили олигодезок'.нрибонуклеотид одной из цепей гена рибозима и олигодезоксирибонуклеотид, коллипеарный 5'-концу гена СЕ!/) УА РНК. Поведенный анализ выявил наличие специфического продукта амплификации кДНК рибозима в составе последовательностей СЕ1>0 УА РНК длиной 100 н., что подтверждает наличие трикскриита гена рибозима в клетках, инфицированных полученным рекомбинантным аденовирусом (рис. бГ.).

Для исследования биологической активности рибозима против мРНК гена НКЛР в составе рекомбинантного аденовируса, проводилось заражение этим вирусом линии клеток стабильно продуцирующих фосфатазу (ГЬК-ВЬУ-БЕЛР) 100 ВОЕ/кл. Через 72 часа после заражения ишибировыние активности 8ЕАР в культуральной жидкости достигало 29% по сравнению с отрицательным контролем, в качество которого использовали заражение клгток дефектным аденовирусом А(!5пео с той же множественностью (рис. 6А).

Нп следующем этапе работы для экспрессии гена БЕАР в линии клеток НеЬа •-"пользовался дефектный рекомбинантный аденовирус

I 1 неикфицированные клетки КЬК-ВЬУ-БЕАР

инфекция АабСУАИЗ, 100 БОЕ/кл ШШ инфекция А<15пео , 100 БОЕ/кл

Б

—О— 10* БОЕ/кл Ай5С\/АРЗ —в—105 БОЕ/кл Аабпео —л— предзаражение 103 БОЕ/кл АйбСУАРЗ —А— предзаражение 103БОЕ/кл Айбпео

время после заражения Ас15УК288ЕАР, 10® БОЕ/кл (ч)

Рис. б. Исследование ферментативной активности БЕАР в культуральной жидкости клеток линий ВТК-ВиУ-БЕАР (А) и НеЬа (Б) при инфекции

рекомбинантными дефектными аденовирусами.

Ас15УК288ЕЛР. Клетки заражали совместно А(15СУЛНЗ и Л<ШУК288ЕЛР со множественностью 1000 БОЕ/кл. В отрицательном контроле использовали заражение Л(15пео и Л(15УК.2 К ЛР с той же множественностью. Также применяли и предзаражение вирусом, экспрессирующим ген рибозима, за 10 часов, до заражения вирусом, продуцирующим БЕЛР. Отбор проб культуральной жидкости для исследования ферментативной активности проводили в течение 72 часов с интервалом 24 чиса.

Результаты оксперим« на представлены на рис. б Б . С течением времени наблюдается вопри тонне ферментативной активности п зараженных клетках и, наряду с этим, возрастает и ингибирующий эффект но сравнению с отрицательным контролем (заражение А(15пео). При предзиражении А<15СУАКЗ за 10 часов до заражения АйбУК28йЕЛР, шпибирующнй эффект выражается более значительно, чем при одновременной инфекции двумя вирусами. Максимальное ингибирование к 72 часам после инфекции А<15УК288ЕАР составило 52% (при предзаражении) и 38% (при одновременной инфекции). Это можно объяснить повышением молярного избытка рибозима над субстратом при более раннем начале транскрипции гена рибозима. Полученные данные свидетельствуют о наличии биологической активности рибозима, экспрессирукицегося н рскомбинантном аденовирусе. Однако, биологическое действие рибозима представляет собой сумму действий рибозима как фермента, и как антисмысловой молекулы, за счет комплементарного связывания фланкирующих

последовательностей с субстратом. Для того, чтобы доказать наличие специфического расщепления мРНК субстрата в клетках, инфицированных аденовирусом, экспрессирухнцим ген рибозима, был проделан следующий эксперимент. Клетки линии НеЬа, нредзараженные за 10 часов Л(15СУАНЗ 103 БОЕ/кл, заралсали 102 БОЕ/кл АдбУК285ЕАР. В контроле • заражение А<1Ьпеа и А<Ш\ТС28БЕАР с той же множественностью. Через 48 часов после инфекции клеток А<15\ГК2&5ЕАР, из них была выделена тотальная

3

РИБОЗИМ

мРНК

Расщеплепаая мРНК

Нерасщсплеппая мРНК Ревертаза и ПЦР

А '

К ДНК А

В

В

Рис. 7. Тестирование специфического расщепления субсрата рибозимом в культуре клеток. А, В, С - специфические праймеры

РНК и подвергнута обработке ревертазой с последующим ПЦР-аналиаом. Для анализа использовались три специфических праймера: один- после предполагаемого сайта расщепления мРНК БЕАР, два - до него (рис. 7). Полноразмерная мРНК должна обусловливать синтез с кДНК двух специфических продуктов амплификации: длинного (300 я.) и короткого (170 н.). В случае расщепления синтезироваться должен только короткий продукт.

Рис. 8. Радиоавтограф продуктов амплификации РНК, выделенной из клеток линии НеЬа, инфицированных АсШСУАЛЗ, А(]бУК283ЕАР (1) и А(15пео, Ас15УК285ЕАР (2, контроль).

Результаты проведенного исследования (рис. 8) свидетельствуют, что при анализе РНК из клеток, инфицированных А<15СУА113 и А(15УК288ЕАР, содержание длинного продукта уменьшается по сравнению с .летками, инфицированным!' АсШпео и Ас15УК283ЕАР. Это является подтверждением наличия специфической

1 2

И.

эндорибонуклеазной активности у рибозима, экспресснрующегося в культуре клеток в составе разработанной нами новой векторной системы.

ВЫВОДЫ.

1. Создан новый ллазмидный вектор для экспрессии генов рибозимов в составе VA РНК аденовируса птиц CELO в эукариотических клетках.

2. Впервые показано, что последовательности VA РНК CELO не оказывают негативного влияния на ферментативную активность рибозима в бесклеточной системе, а вставка гена рибозима между промоторными боксами гена VA РНК CELO не влияет на эффективность транскрипции гена VA РНК CELO в культуре клеток линии 293.

3. Показана экспрессия и биологическая активность рибозима, против мРНК гена секретируемой щелочной фосфатааы (SEAP), транскрибируемого в составе VA РНК СЕЮ, при транзиентной трансфекции клеток линии 293 плазмидиым вектором.

4. Впервые получен дефектный рекомбинантный аденовирус на основе Ad5 человека, несущий ген рибозима против мРНК SEAP в составе CELO VA РНК в районе делегированной El области генома.

б. Показана экспрессия и биологическая активность рибозима против mPIIK SEAP в клетках линий HeLa и FLK-BLV-SEAP, инфицированных полученным рекомбииантом.

б. Впервые получен рибозим против mPIIK гена РВ1 суб-ьединицы РШС-полимеразы вируса гриппа А. Показана специфическая эндорибонугслеазная активность этого рибозима по отношению к модельному субстрату в бесклеточной системе.

Сшсмцшаатцых Р1\б0ццикма^шс£е1шшаи •

1. Захарчук А.Н., Доронин IC.IC., Кирпов В.А., Кругляк В.А., Нпродицкнй B.C. Исследование активности рибозима к мРНК гена секретируемой щелочной фосфатазы in vitro и in vivo. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1991, №6, е.- 8-12.

2. B.S. Nnroditsky, A.N. Zaklmrehuk, К.К. Doronin, V.A. Krougliak, N.F. Grinenko and Ilnburina T.M. Construction of human defective adenovirus vectors expressing1 ribozyme under the control of different promoters. // CHI conference "Technological Advances for in vivo Gene Therapy", Washington, November 1994, p.- 52.

3. A.N. Zakhnrchuk, K.K. Doronin, V.A. Karpov, V.A. Krongliok and B.S. Nnroditsky. The Towl adenovirus typel (CELO) virus-associated RNA-encoding gene: a new ribozyme-expresaion vector. // Gene, 1995, n печати.