Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибирование репродукции вируса лейкоза коров в клеточных культурах генами противовирусных рибозимных РНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ингибирование репродукции вируса лейкоза коров в клеточных культурах генами противовирусных рибозимных РНК"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛШЮХОЗЯЙСТВЕШШ НАУК ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯИСТВЕШЮЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

РГ6 , од

" На правах рукошн.и

у. а № т

ЗЕЛИВЯНСКИЙ Станислав Викторович

ИНГИБИРОВАНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КОРОВ В КШ'ОЧШК КУЛЬТУРАХ ГЕНАМИ ПРОТИВОВИРУСШК РИВОЗШШ ПШ

(ПЗ.ПО.ОЗ - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ни соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

РЯООТ.Ч ВШ10ЛН9КЗ £ ЛЙООрЗТОрШТ ГбКНОЙ ITHK6H9pitK ¡КИРОТИН ? ОТДЕЛИ ГвМЧОЙ КНЖЭНврИЙ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ 0*П0Тс?Х,НпЛОП!И

Н^уч.чий руководит 8ль

доктор оиологических п^ук, проф., '¡.п. —корр. РАО 11 Ткхоненко Т.Н.

Офщ щвлышв оппоненты * доктор о!!ологич9ск1!7 нзук t

проф., ЗйЕриев O.K. какпндат хз^ми'шсккх наук Кэюшш? А. Л. Евду! \ я оргйш?зв}"1Я ~ .Биологический фэкулътбт Московского Гооудирсть'?нного унивйрситйтэ им. М* Е•Ломоносов.*}•

lf 1991 I1.

В '¿20. НЭ ЭSС9Д5Н11П СПбЦНЭЛИЗКрОВЙНКОРО C0B9TS Д*050. "10%ОТ

пj)И FiliHM сельокохозяйствонной о™отэхнолоп?л РАС*СН по йдр9суt ТЧ7550 Г• НГ|Г>КЕ5} ул. ТТ!М1{рЯ39ВСК5Я, Д. "iP. •

О ДИСС^рТЯЦИЭЙ МОЛЕНО О 3 Н ^ К Oi.fli Т1-СЯ

• ii,.">v.%r->nTim^t5i'>trunrt ni*r»TCiТИПЛПРШ» "Pnf^liTT

Т» nit f

0 IVJJIУ OT9K9

г.

г • гj. | м» * ^"ЗИрОЕШПЮГО COB9TS у

ft /i •

С • A •

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ»

Актуальность проблемы. Исследования последних лот показали ъф^ктивность использования рибозимов и антисмыслових РНК (асРНК) дли подавления репродукции различных вирусов. Кроме того, открытие рибозимов дало совершенно новый инструмент для изучения экспрессии различи!« гонов и их регуляции в клетках. С этой точки зрения вти комплексы адресованных рибополинуклеотидов представляют собой потенциально мощный инструмент в медицинской практике и ветеринарии., так как могут быть использованы в генной терапии, а также дают реальную возможность для создали пород трансгешшх животных, устойчивых к одной или доже нескольким ЛИрусНИМ ШфЖЦИЯМ.

Несмотря на отдельные успехи, достигнутые в лечении и профилактики вирусных инфекций, продолжаются поиски новых подходов к борьбе с ними. К числу подобных подходив несомненно относится разработка технологии создания искусственного антивирусного шилу нити та и тератш с помощью ннтисмыок'вих полинуклеошдов, ьоторио представляют сиоой либо «оРНК, кан

нриргдоио» тек и н^щ-и^дато гоноза и ¡чи^тю, нйт^лития^'ий» молекул РНК. И определенной степени рибозим можно рассматривав! как псРНК, с:одорлнщую к-пплптичч'Н'ИЙ центр, способную нч только связываться с: молмкулой РНК мишени, но и енчинфиччеки ра^рушам чо, что дги.т ря«.лчцм»и петонциально олродолчты.» ирчимутчсп-/ пирид асРПК, т.к. при 'Акопрессии в плитках ни чрчлуч'к-и значительного их иобитка.

Особую ценность ¡"ибозимнм как (Ычнциалишм чмржшмиччоким

агентом придает их практически абсолютная специфичность и нетоксичпость. Кроме того возмокно создание рекомбинантных илазмид обладающих аддитивностью и тканеспвцифичностыо. Наличие технологии получения трансгенншс иивотных делает использование плазмидных конструкций с генами рибозишшх РНК в сельском хозяйстве весьма актуальным.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание рибозим-кодирувдих конструкций, способных эффективно ингибировать репликацию вируса лейкоза коров в культуре клеток.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Разработать простую и, надежную систему In vitro для детекции уровня репродукции ВЖ.

2. Создать генно-инженерные конструкции, несущие рибозим-кодирующий ген под контролем различных промоторов.

3. Испытать антивирусное действие полученых конструкций в условиях разработанной модельной системы in vitro.

Научная новизна и практическая значимость.

В настоящей работе впервые показана способность рибозима, направленного против R-области LTR BLV, расщеплять вирусную РНК tri vliro и ингибировать его репликацию в культуре клеток.

Первая часть данной работы посвящена созданию анти-BLV рибозима и изучению условий его оптимальной работы in vitro.

Вторая часть работы связана с разработкой простой и надежной системы тестирования уровня репликации BLV в культуре клеток. Впервые была получена линия клеток FLK-BLV-SEAP, в которой продукция секретируемой щелочной фосфатазы связана с уровнем вирусной репликации. Полученная линия позволяет легко тестировать

влияние различных ингибирущих агентов на репликацию BLV. На заключительном этапе работи Оили сконструированы рекомбинантние нлазмиды несущие ген рибозима. Котрансфекция данных конструкций в клетки CC8I с инфекционной вирусной ДНК и и FI.K-BLV-SKAP сопровождается сштезом рибозимной РНК, обуславливающей эффективное подавление репродукции BLV. Максимальный уровень ингибирования составил ЭО-95% при весовом соотношении вирусного генома и плазмида с рибозимом I/IO при трансфекции клеток CC8I и Г>7 на Зсы чашку при трансфекции клеток FLK-BLV-SEAP для плазмидн pCMVR.

Таким образом впервие показана сносооность рибозима против R-области BLV подавлять его репродукцию In vitro.

Работа представляет не только научный, но и практический интерес, так как плазмиды с генами рибозимов, обладающие ыисокоЛ антивирусной активностью могут быть использовани для получении трансгешшх животных, устойчивых к вирусу Bi.V.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждена на конференциях "Всесоюзное рабочее совещание по молекулярной биологии ДНК-содержащих вирусов, имеицих практическое значение для с/х и медицины" (Киев [991), "Новейшие методы биоинненерии." (Москва 1994).

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в трех печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа из: введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и метиды", "Результаты", "Обсуждение . результатов", "Выводы" и списка литературы, включите го 170 бномю! рафнческих ссыпок. Работа

изложена lia 126 страницах матинопистного текста, включая 15 рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Шшзмидныв вектора. Ttyrn яслсшировании рибогшма и фрагмента генома BLV использовались илазмидные вектора - рС.ЕМ1, рОШ2 (rromega), pSVb (Pharmacia) ¡pRc/CMV (Invitrogen) вектор pMPSVEHE, полученный от Tir. Artelt.; плазмида рВ6490, любезно предоставленная ¡DívSeMkava, шшумвда pI.V12, получешшя от 1)г. Kntólne.

В работе итю'лпнтьжаь следующие клеточные линии: CC8I -кошачьи ^¡ибробласти,, iffp'jиetfoрм ира н ш п ш о вирусом саркомы Раушвра, любезно продостаышш ¡\.И. 'Пш/лиш (Институт канцерогенеза) FLK-BLV - клеточгшл зшншк, иоодчшшая сокультивировагаем овечьих фибробластов с -клетками 'саркоматозного узла больной коровы, полученная от в.н.-с. Шринешсо 'Н.'Г.

Методы. Все генно-4шаюнерные манипуляции проводились но стандартным протоколам, изложенным в Maniatls et al (1989).

Получение РНК-транскриптов In vitro.Синтез Pint проводили на предварительно линеаризированных плазмидах путем обработки их рестриктазами Pvu II или EooR I в объеме 50 мкл в следующих условиях: 40 мМ Трис HCI, pli 7,5, 13 мМ MgCl^, 2 мМ спермидина, 10 мМ Ш)Т, 10 ед РШазного ингабитора, по 800 цМ кавдого NTP, 100 мкКи [а32Р] Ш'Р и 10 ед Врб РНК полимеразы. После 1ч инкубации при 37°С добавляли 50 ед. ДНКазн I и инкубировали 10 мин. После якотрпкции фэнол-хлороформом и осаждения отннолом FHK хранили при

20°С. Процент расщепления субстрата определяли по формуле OOx(PI+P2)/(C+PI+P2), где С, PI и Р2 отражают соответственно оличество субстрата и продуктов, измеренных в расп/мин..

Расщепление субстратной РНК рибозимом. [а-Рой]иТР мэчошше ибозим и субстрат после денатурации в течение 2 мин при 90°С и емедленного охлаждения до 25°С инкубировали в объеме 50)1.1, одержащем БОмМ Тг1в-НС1 рН 7,6 после добавления MgClg Д" онцентрации 10 тМ. РНК-субстрат брали в концентрации 100 пМ, а ибозим 20 riM. Реакцию проводили при 25°С в то четка 8 часов, ачальный температурный интервал брался в пределах от 0° до Б6°С, рН 5,6-9. Оптимальной была определена температура в 25°С и р!1 ,Г>.

Определение активности щелочной фосфатазн. Определент ктивности щелочной фоефатазы проводили по следумцой методике: ликьоты культуральной среды (80ц]) после центрифугирования KTOxg 2 мин и нагревания 6Ь°С б мин (дли инплбирошшнч ктивности зндогенной фоо{отазн) смешинали с ранним количостьчм i реакционного буфера (О,Ь М На^НОО^ рН 9,8/0,5 i/Ji Uiyil./i н шубировали при 37 °С 10 мин в 96 луночной плачже. Затем )бавляни GO р.1 60 мМ р-нит]ч»1йнил1>.»сф'йта (SF.HVA) приготовленного i предвари 1елыю подогретом реакционном буфере. Окончательный 5гем составлял 210 ц!. реакционной смеси измеряли на

Ltertek автоматическом ридере (Plow). Активность щелочноП эсфлтачн п.ннп в миллпединицах (мй) на мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ретровирусы представляют значительный интерес в качестве мишени для действия рибоэимов, так как являются возбудителями ряда заболеваний человека и животных. В частности, вирус лейкоза коров (BLV) способен вызывать у крупного рогатого • скота патологическое состояние, характеризующееся феноменом персистентного лимфоцитоза, а в некоторых случаях и лимфолейкоза. Уровень инфицированное™ скота на территории России очень высок, поэтому проблема ингибирования BLV с помошыо рибозимов имеет не только теоретический, но и практический интерес.

Судя по данным, полученным в экспериментах по ингибированию репродукции вирусов с, помощью асРНК и рибозимов других ретровирусов наиболее удобной мишенью является R область. Во-первых, часть R региона входит в состав всех субгеномных РНК этого вируса. Во-вторых, этот регион играет существенную роль в репликации вируса. Это определяет возможность ингибирования BLV как на уровне репликации и транскрипции, так и на уровне трансляции, что может существенно усилить ингибирующий эфр-жт.

Получение рекомбинантных плазмид для экспрессии рибоэимной РНК и РНК-мишени in vitro.

В позиции 356-358 R-обласги генома BLV находится потенциальный сайт CUC для расщепления рибозимом. В работе показано, что антисмысловая РНК, включающая область 359-559 яф|октивно ингибировала репликацию вируса. Исследование вторичной

структуры, участка LTR BLV с координатами 200-500, .проведенное с использованием программы DNASIS (Hitachi), показало, что выбранный в качестве мишени сайт с указанными выше координатами не принимает участие в образовании шпилечной структуры, следовательно вероятность того, что он будет доступен для атаки рибозимом достаточно высока. К сайту-мишени химически синтезировали два рибозима, структура одного из них показана на рисЛА. Рибозимы содержали идентичные каталитические центры, различилиоь лишь длиной фланкирующих последовательностей, обеспечивающих их взаимодействие с РНК-мишенью. (Данный раздел работы проводился совметсно с н.с. отдела генной инженерии Карповым В.А.)

Каталитический центр рибозима I состоящий из 22 нуклеотидов был фланкирован 7-ю нуклеотидами слева и 10-ю скрапа комплементарными области 351-368 R-области LTH BLV. Рибозим был клонирован по Sma I сайту в вектор pGEM1, полученная конструкции получила название pGRI8. Нуклеотидная последовательность второю рибозима, фланкировашшя сайтами для рестриктаз Sph I и Bainfl I была клонирована в вектор pGEM 3Zt по соответствующим сайтам. Полученная плазмида получила название pGR3l5. Плазмида pULVc' получена на основе плаэмиды pGEM2 путем клонирования в Sma I сайг 88-446 п.н. генома BLV, несущего сайт расщепления (РисЛА). нуклеотидов.

Инкубирование [a32-P]UTP-меченных рибозима и субстрата в присутствии Mg2+ ионов, приводило к специфическому раещъшюыды РНК-субстрата длиной 513 нуклеотидов, содержащем область 4-15 LTR BLV с образованием фрагментов длиной 308 и 205 нуклеотнд-л;

(см PI и Р2 фрагменты на рис.2). Через 8 часов инкубации субстра расщеплялся на 80$.

2. Оптимизация условий расщепления РНК-мишени In vitro.

С целью выявления оптимальных условий расщепления, реакци проводилась при изменении различных параметров. Как видно и рис.4 при изменении рН среда расщепление происходит наиболе эффективно при нейтральных и слабощелочных значениях. При pi! расщепления не наблюдается, но при увеличении концентрации ОН ионов скорость расщепления возрастает более чем в 100 ро достигая своего максимума при рН 7,3-7,6. Дальнейшее увеличени значений рН среды существенно не влияет на скорость реакци расщепления (рис.3).

Для определения оптимальной температуры реакции смесь РН pGR18 или pGR315 и pGLV2 денатурировали 90 сек при 9Б°С, а аате немедленно охлаждали до О, Б, 10, 20, 25, 37, 56 , 65°С

о I

инкубировали В присутствии 10 мМ Mg в течении 3 часог Полученные данные показывают, что при увеличении температур скорость реакции сначала линейно возрастает достигая своег максимума при 25°С (для pGR1S) или 56°С (для pGR315), а зат« снижается (рис.4). Эффективность расщепления при оптимальнс температуре, как видно из рисунка, выше у короткого рибозима. Щ инкубации 100 пМоль субстрата с 20 пМоль рибозимов мы нaблюдaJ расщепление субстрата при оптимальных условияхна 86 и 6? соответственно. На основании полученных данных в дальнейше исследование брался лишь рибозим с короткими фланкируицю

ГО

поолндинншлыюстями, кок работающий болев &ф1ч1пиьно

__pGLV2

Spei-Г

А)

L7R BLV

t'v i II

^.itisi/.Hir; PiTi.^rnt;

5* 3'

X.

/'Cleavage eitc*-.

J50 I 3/0

AGGACÜCGACCUU\)AUCUCfrjGliaUí

CGCUOiA AUAGAtíGtfíA А С A U G A (i С ti G А AU U G С G--tí A G GU

pGR18

3* S*

8рв

рлмн гНюиуше |»i*ljr A

PlKi. I А) CXoMtl конструкций 1Ш13МИД I-lil,VJ, J.iiltlH И II- Mil I"» ; h i;yOi:il'tiT'piK}'.i;*iiM. Отр^лка укпзньает мести р'КфМич м р

синзи

В) Обща и схема штямид, получншшх мри mi жировании рибоэимп под кипро.т, рчм иичшп

нуьнрио'гичвеки* IipOM:jTOpOFi. pjvm - itpfiMOTOpii íiV'H), Hpnv i;>m i'MV 1к; i*lU'гуте - [1')(;лодоьа'|ib )Ч1Л>.'!«11Ч*.Ч>Г^ t-»-ti-a;

poly А -Г СИПШЯ П.'ШШДОЦИ.ЧИрОЖШИН Í5V4II.

В)

1 2 3 4 5 6 7

1ип ?,. Кинетика расщепления РНК-субстрата ь:п> а:) синтетическим рибозимом (И). Р1 и Р2 продукты г „ц-иления. 4 р«ЕМ1 гид{юлизовашшй Нра II; 2 - субстрат и рибозйм инкубация в течении 10ч без добавления М^*; должки 3 -7 - накопление продуктов расщепления через I, 3, 6, 8 и 10ч инкубации соответственно (в присутствии H¿-i)

Процесс непосредственного рибоэим-катализируемого х'идролиза Ц|К протекает достаточно бистро. Гораздо больше времени ьнм [.ачивается на гибридизацию рибозима с субстратом и нос ладу идее его освобождение от продуктов расщепления. Поэтому при проведении несколько циклов денатурации-охлаждения еФ1<лстивность расщепления должна быть выше, вследствии коммулятивного аффекта, чемг полученная при инкубации в

о, '«м

К

тлттпттпттттпгтип

7.00 «¿О «¿0 10 Ьо

Рн

Гис.З Г*сщ»Ш1*ым« иубстркг* Пfя |мттпыит п«н«а» рН «р»дн.

твчи гряд О

|*И4 4 Зйяштиост» |че№1|'Ия||| еу6>'7р«у* Я т»Ш1»р*тури [чмпхоывг.й ср«1Ш

иш МНИ

ЧЧГ»Г.|«|»

100 00

ВО 00

и

в

о &

60.00

40 00

20 Л0

0 00

- *£•

■ тт'Г'?-« г г I'» I » т I 1 г 1 » » » I I I » ■ 1

0.00 4.00 »00

Ирем» (•<)

ii 1111

и 00

I 0 1.10

Рве &. ЗвИНСМЫиСТ*

от условий деиягцнщнц ГНК I»! скорость рыииеплеиия при нооюимиоД <■ |.и -1 .. ,I-ЧДД1> пкороптк р*1ш\*гшеии4 |фм цп«мнчо. я,'1 цк.«|||,|.цн11

оптимнлышл. условиях при постоянной температуре. Для потвераденин итого предположения мы оценили скорость накопления продуктов рипщ-зшюния субстрата при инкубации кошшпсоа субстрат/рибозим при и при повторном нврревании/охлвждешш. Нолучшшие дшпим

(рнс.Г)) показывают, что повторные температурные циклы увеличивают скорость протекания рибозимной реакции. После 6 часов икубации и условиях ширевание/охлазкдение распадается более 80% субстрата, я ра тоже время при постоянной температуре расщепляется около 60$.

.4. Получение рекомбинантшх векторов для экспресси рибозимной РНК в вукариотцческих клетках.

Рибовим-акспрессирупцие конструкции получены на основе слодуидих. векторов pSVf, (Pharmacia), и pMPSVHE, любезно предоставленным доктором II. Нашег (Cell Biology and Genetlca Ruction, . GBF-Gesellsliart fm' BiotchnologlBhe PorBchuiig mbll. .Dratmachvselg) .содержащих SV40 HCMV-IE промоторы и промотор миолопрохифэративного саркома вируса (MPSV). Рибозим из плазмиды pGHIO бил вырезан по сайтам Xba I/Fvu II и Hind III/EcoR I кло1шрован по сайтам ХЪа 1/£с1 136 II в pSVL, и Hind III/EcoR I в pMI'SVHE соответственно. Полученные конструкции получили название JSVR, pMPSVH (рис.2В).

Для получо!шя конструкции, экспрессируицей рибозим Под контролем СМ7 промотора плазмида pRc/CMV была обработана рестриктазпй Bglll и нуклеазой, для удаления одноцопочечных концов. Затем полученную плазмиду обрабатывали рестриктазой Hind III. Полученный фрагмент, содержащий IE GMV промотор, клонировали

в плазмиду pí'iRte по сайтам Мае I Hlrnl Iii. Полученная плазмвда получила название pCMVR.

4. Экспрессия щелочной фссфатаг-ы при транзиентной трянсфекцип плазмида pLBSEAP клеток линий С(Ш и FIK-BTA'.

Используя плазмида pLBSEAP, pBCl2/RSV ¡¡КАР и pBCI2/PL/SEAP мы исследовали работу промотора Г/ГА ВI V различных линиях клеток, Выбор именно этих линий ооусловлен тем, что клетки CC8I способны пбддерживать репродукцию BLV, FIX BI.V является линией, стабильно продуцйрующей BLV в высоком титре. Трансфекция этих плазмид в клетки FLK-BLV особенно интересна так кчк может позволить выявить зависимость работы клонированного нами промотора от наличия трансактиваторннх факторов этого вируса.

Ц начЬле указанные вша конструкции били трап оптированы в клетки линии CC8I. Исследования нрюдемонстрироваки наличие экспрессии щелочной фосфатаэн в культура чыюй среде в точение 72 часов после трвнсфекции клеток (<ош плазмидями pl,RSEAP и pBCI2/RSV/SF,AP и отсутствие ггрирвл10ния активности топочной фосфатазы при трансакции плаямилой рВОГЗ'РГЛЯШ1 1'рио.7). Уровень экспрессии щелочной фоофлт aaw находится в прямой зависимости от количества трано-фекпиро ванной JUÍK плпамидн pLBSBAP (Табл.1).

Клетки линии FIK ВЛК, содержащие интнгрировннный пр..вирусный геном, и яалнициеоя продуцентами Rt.V, били ииюль^ончнн для трансакции плозмидами, pT.RSEAP (несущей регюрторннй гни под контролем вирусного-промотора), рВПГЯ/РГ./SBAP (год» ржаной только

репортерши ген). Првращепие активности щелочной фосфатазы достигло максимального уровня к 60-72 часам. :

Экспрессия щелочной фосфатазы в клетках FLK-BIV свидетельствует о наличии промоторной активности клонированного участка LTR BT,V. При проведении трансфекции плазмид pLBSEAP и pBG12/RSV/SEAP, несущей ген щелочной фосфатазы под контролем промотора вируса саркомы Рауса, уровень экспрессии щелочной фосфатазы под контролем промотора BLV выше чем под контролем RSV промотора в аналогичной плазмиде. Экспрессия щелочной фосфатазы под контролем промотора RSV одинакова в клетках CC8I и FbK-BLV (Рис.7). . .

Вреиа после трансфекции (ч)

Рис. 7. Накопление щелочной фосфатазы в культуралтой жидкости после трансфекции клеток СС81 и FLK-BLV плазиидами pLBSKAP и pBC12/RSV/SB^c

ttiü CCai+pLBSEAP ' FLK-BLV+pLESEAP

».."j1sl'HJC-BLV+pBC12/RSV/SEAP

Ь'ГН В ГУ

.'*> 1910

/ 1>ЛП1 И

аЛ 7

ШЛИ (6'ЛИ

5469

V

\

¡»•■•г

р.<у А ни <Г**'1Г

Рио.Ь. Схьма получении шшимиди |ЛЖШ> - с.»'1Л1).о.»!И|.у»«ц.»П щнлочну« фоофатаэу под контролем промотора, клонирщ.пнн'П'п из ГТИ

ВЬУ.

Возможно, что эффективная экспрессия репортерного гена под контролем собственного промотора BLV в клетках линии FIK-3LV связана с наличием большого количества вирусных трансактиваторных

tOT РОТ

ЙОЛКОО р38""Л ы При отоутотвхя отях оийцнфыцооиих

трансактиваторов в клетках CC8I уровень собственных клеточных

трансактиваторов недостаточен для эффективной работы вирусного

промотора. Этим же можно объяснить тот факт что клетки CC8I не

способны длительное время поддерживать репликацию BLV, а также

устойчивы к прямому заражению данным вирусом.

Таблица I. '

Зависимость экспрессии щелочной фосфатазы от количества трансфецированной ДНК плазмида pLBSEAP.

Количество плазмидной ДНК. мкг на чашку Зсм2 Уровень экспрессии щелочной фосфатазы (mU)

0 0

1 0,05

1.Б . 0.1

2 0,13

Б 0,2

10 0,35

5. Получение клеточной линии, экснрессирукщей щелочную фосфатазу.

На основе плазмида- рЫЗБЕАР получены стабильно • трансфоцировакные линии клеток РЬК-ВЬУ, экспрессирупцие щелочную фосфатазу.

Отбор клонов осуществлялся на основании блот-гибридизации (рис.8). В качестве зонда был использован Рти II фрагмент

плазмиды рЬК5ЕАР (рис.6), включающий фрагменты как промоторной области, так и часть кодирующей области фосфатазы. , Вторым критерием отбора служил уровень экспрессии маркерного гена. На основании полученных данных была отобрана одна линия, получившая название РЬК-ВБУ-БЕАР, обладавшая наиболее высоким уровнем

экспрессии (рис.9)

~------—^

1 I

I ,• •

I

1 2 3 4 5 К

Рис.'8. Анализ ДНК из клеток РЬК-ЬиУ, трансфецированных плазмидой рЬВБЕАР, с геном щелочной фосфатазы под контролем промотора ВЬУ. Треки 1-5 ДНК из клеток,трансфецированных плазмидой рЪВБЕАР,гидролизозанная РуиП; К - РтП фрагмент плазмиды рЬВБЕАР

6. Снижение уровня экспрессии щелочной фосфатазы при трансфекции рибозим-проДуцируюцих конструкций в линию клеток РЬК-ВЬУ-БЕАР.

Для изучения возможности ингибирования репродукции ВЬУ рибозим-экспрессирущими конструкциями мы трансфицировали. плазмиды рЭУШ?, рМРБУН и рКЕХН в количестве Б7 на Зсм чашку

4.00

О.ОЬ

| ( м ■ ) I | ( 40.00

Врем* культивирования (ч)

I I 11 ■ I м I 11 I < | 120.00 160.00

..... У|гщ|п1 щелочаяоМ |п|4щ|1| л 3 1

ММЯУромп пдаочшоЛ (оофосмм в шла* клеток ПК-ШТ-ВКАР

Ряс. 9. Кинетика накоплена* секретируеыой щелочной фосфатази в стабильно трансфецировавных пинии ШС-ВЬУ

клетки РЬК-ВЬУ-ЗЕАР, экспрессируюцие щелочную фосфатазу. Процедура трансфекции и анализ активности щелочной фосфатази проводился по вышеизложенной схеме.Измерение уровня экспрессии щелочной фосфатази в транофецированных клетках показало его снижение в зависимости от трансфецированной конструкции от 17 до 37% _(Рис.10). При- трансфекции контрольных плазмид, содержащих рибозим с измененным каталитическим центром, в таком же соотношении снижение уровня щелочной фосфатази не наблюдалось. Полученные данные свидетельствуют о способности данных конструкций эффективно ингибировать репликацию ВIV (Работа

шполнена совместно с н.с. отдела Воскресенской Е.П.).

'. Подавление синцитийобразования в клетках CC8I при котрансфекции провирусного генома BLV и плазмида pCMVR

Для изучения ингибирующего эффекта экспрессии рибозимной РНК ш репликацию BLV мы котрансфецировали клетки CC8I ДКК BLV ,с отбозим-кодирущей плазмидой рХЕХН, оказавшей наибольший пггибирующий эффект на репликацию вируса, по снижению экспрессии [елочной фосфатазы.

Ранее было показано, что введение в клетки CC8I ДНК BLV • гриводит к образованию синцитиев , т.е. многоядерных образовать | клеточном монослов (рис. 12). Количество образующихся сит^тиев :аходится в прямой зависимости от количества трансфицирумой ярусной ДНК, причем, уровень репродукции вируса коррелирует с :оличеством вводимой инфекционной ДНК.

Котрансфекцию ДНК BLV и pCMVR проводили в весовых оотношениях 1:1 и 1:10. В качестве контрольной бралась таже лазмида, что и в предыдущем эксперименте. Полученные данные Табл.2), показывают, что котрансфекция BLV+pCMVR в эквивалентных оотношениях ингибирует продукцию ВЬ7 на 63%, а' 10. кратный збыток рибозим-нэсущей плазмида - . на 90-93% по инцитийобразованию (Работа выполнена совместно со с.н.с. отдела, орисенко A.C.).

Время после трансфекции (ч)

Рис. 10 Кинетика накопления щелочной фрс4«тазы в куготуральиой сред* при трансфекции клеточкой Ливии ГиС-ВЬУ-ЯКАР рибоакм-продуцирующкми плаамиданп

иш влеточна! пиша РиС-В1Л-ВКАР ХЭйОХ рИРЭТВ

НН) рУУВ

«ЯМ* рСМУЙ

Рис.П. Клеточный монослой СС81 после трансфекции ДНК спермы лосося. Фазовоконтрастная микроскопия после окраски монослоя толуидиновым синим. Увеличение х 400.

Pao. 12. Индукция образования сшщитиэв после трансфекции ДНК прогенома ВЛК. Фазовоконтрастная микроскопия после окраски монослоя толуидиновым синим. Увеличение.х 400. Отчетлгво видно скопление большого числа ядер в цитоплазме.

Таблица 2.

Ингибирование репликации ВЬУ плазмидой рС1Г/П в клетка* (УШ

Тип трансфйцир.

К-во трансф. К:во синц." "

я (1

ДНК (р^/чашку) на чашку ингибир

■б

ДНК

В

ВIV

рСМУН(В1,У рСМУГЬВЬУ р(ЖНЫГ(ВЬУ рОМШИВГ.У рСМУП рСМУН рОНУНЫ рСМУПМ

1:1 1:10 1:1 10:1 1:0 10:1 1:0 10:0

0:1

25-2 10±1

3±1

26-2 27-2

63% 91*

а) первым дано к-во ДНК векторной или нлаэмидц несущей

рибозим;

б) к-во синцитиев определено в двух независимых экспериментах но три повторнооти в каждом; в) процент ингибироввния считали как отношение к-ва синцитиев конр.пл-да»ВГ.У/рСЫVН(ВГ.У; г) контрольная плазмидв.

Н. Снижение ревертаэной активности.

■ Акали;! реьертазиой активности ь культуральной жидкооти КЛа'ЮЧНОЙ линии Р1К ВЬУ-йЕА}', трансфецировышов

рибозимэксщ^ссиру моими илазмидами провопили на 3 сутки. У.ювень иши'ощювания активности КПК -зависимой ДНК полимеразы снижался н преполах от 30 до 49$ (Табл.Я).

Таблица 3.

Ингибирование рибозим-экспрессирующими конструкциями рввертазной

активности

Транслированная плазмида

% ингибирования -плаомида—

FLK- BLV-SEAPtконтрльная FLK-BLV-SEAP vpSVR FLK-BLV-SEAP+pMPSVR FLK-BLV-SEAP+pCHVR

Иеопдайше9ёя

24 238 17 439 16 603 12 361

461

28« 32% A9%

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

■ R-область LTR BLV является одной из наиболее удобных мишеней для расщепления рибозимами, так как все вирусные .РНК включа, г Б' нетранслируемую область, и рибозим направленный против этого региона, будет эффективен против всех субгеномных мРНК независимо их дальнейшей модификации. Удаление же ее' приводит к терминации трансляции рибосомами таких РНК. С точки зрения практического использования еще важно, что R-область ооладает высокой степенью консервативности. В данной работе мы исследовали влияние рибовимной РНК на репродукцию BLV in vitro и In vivo. Первым етапом явилось создание методом химического, синтеза' рибозима к R-области BLV получение конструкций экспрессирующих. рибозимную FHK и РНК-мишень и исследование работы рибозима in vitro при изменении температуры, рН среды и условий денатурации.

В позиции 356-358 генома ВЛК находится потенциальный сайт CUC для расщепления рибозимом. Компьютерной анализ участка ЮТ BIV, показал, что выбранный нами сайт не участвует в образовании

двухцепочных петлевых участков, стабилизирующих вторичную структуру РНК. РкОозим и участок 88-445 п.н. генома BLY, несущий са()т расщешюниябыли клонированы в вектора рСЕМ под контроль промотора для Sp6 полимеразы, что позволило получить РНК транскрипты клонированных фрагментов ДНК и поставить реакцию расщепления in vitro. Через 8 часов инкубации в оптимальных условиях субстрат расщеплялся более чем не 80S, что говорит о эффективной работе рибозима в условиях in vitro.

С целью выявления оптимальных условий расщепления, реакция проводилась при изменении различных параметров. При изменении рН среда расщепление происходит наиболее эфективно при нейтральных и слабощелочных значениях. Оптимальными найдены значения рН среды в пределах 7,3-7,6, а тегаюратура проведения реакции расщепления 25 и Б6°С для рибозима с короткими и длинными фланкирующими

последовательностями , соответственно. Различив в оптимальных

)

условия проведения реакции для рибозимов, различающихся лишь длиной фпашсируквдих последовательностей, объясняется тем, что при увеличении плеч рибозима увеличивается энергия связывания рибозима с субстратом. Для диссоциации рибозим/субстратного комплекса требуется затратить • больше энергии, что приводит о смещению оптимума реакции расщепления в область более высокой температуры реакционной смеси. Однако даже при оптимальной температуре рибозим с данными фланкирующими последовательностями расщепляет субстрат с меньшей эффективностью. Будучи РНК-ферментом рибозим не расходуется в процессе реакции. Свободные молекулы рибозима связываются о новыми молекулами субстрата, что было подтверждено экспериментами по расщеплению

вирусной FHK In vitro в которых каядая молекула рибозима, в среднем, расщепляет 4 молекулы субстрата. Понятно, что клеточная РНКаза гидролизует молекулы рибозима, снижая его концентрацию в клетке и понижая, таким образом, эффективность расщепления РНК-мишени.

Полученные на первом этапе исследования данные о работо рибозима tri vitro показывают, что синтезированный химическим путем рибозим против R-региона LTR BLV способен специфически . расщеплять вирусную РНК.

Вторая часть работы была посвящена изучению антивирусного действия рибозима в культуре клеток CC8I и FLK-BLV.

Изучение ингибирующего эффекта антисмысловых РНК и рибозимов на вирусную репликацию требует наличия удобной и надежной системы для количественной оценки вирусной репродукции. Для тестирования вирусной репликации in el tu мы решили получить лишго клеток, в которой репликация вируса была бы связана о окспрлсси&Л маркерного гена. В качестве маркерного был взят ген секретируемой щелочной фосфатазы.

Активация репорторного гена, находящегося под контролем промотора ITH BLV, сопряжена с вирусной инфекцией и снижение уровня репликации вируса приведет к уменьшению экспрессии репортерного гена, что важно для использования данной модели как тест системы. Как показали результаты трансфекции, полученной конструкции,

в клетки CC8I н PLK-BLV, в обоих типах клеток наблюдалась экспрессия щелочной фосфатазы. Более эффективная экспрессия репорторного гена под контролем собственного промотора BLV по

сравнению с промотором RSV объясняется наличием в линии FLK-BLV специфических вирусных белков-трансактиваторов. Полученные данные свидетельствуют, о связи экспрессии щелочной фосфатазы плазмидой jjLBSKAP с наличием трансактаваторов в клетке, и следовательно с репликацией BLV.

Для исследования влияния экспрессии рибозима на репликацию BLV 'был сконструирован ряд плазмид, содержащих рибозим под контролем промоторов SV40, JÍPSV и CMV, Выбор промоторов определялся их силой и широтой спектра действия в различных типах клеток, особенно в лимфоцитаршх клетках крови, где (n utuo происходит репликация BLV. При трансфекции этих конструкций в линию FLK-BLV-SEAP, наблюдается снижение экспрессии ренортерного гена в зависимости от конструкции от 17 до 37%, аналогичные результаты получены и при анализе ревертазной активности, с.-.доние активности ревертазы в клетках FLK-BLV-SEAP подтверждает связь между снижением експресоии ренортерного гена и ингибированием вирусной репликации. Из трех использованных промоторов наиболее эффективно работала конструкция содержащая рибозимный ген под контролем промотора CMV.

На основании полученных данных по трансфекции клеток FLK-BLV различными рибозим-продуцируицими конструкциями была выбрана плазмида давшая наибольший ингибируюций эффект. На следуодем • этапе работы нас интересовал ответ на вопрос о том, каков будет ингибирующий эффект в транзиентной системе при одновременной трансфекции рибозимной конструкции и инфекционного провируса в клетки CC8I.

При котрансфвкции плазмида pCMVR в клетки CC8I тестируемый

нлгибирующий эффект, в зависимости от соотношения нлазмида/инфекционная ДНК, находился в пределах 63-91*. Это можно объяснить, тем что в при трансфекцйи вирусная и плазмидная ДНК как преимущественно попадают в клетку одновременно и количество петрансфецированных клеток не влияет на результат, так как СС81 но заражаются напрямую ВЬУ. При трансфекции же линии, продуцирующей репорторный ген, эффективность ингибирования в значительной степени зависит от эффективности трансфекции, т.е. . от количества клеток в которые попала плазмида. В условиях наших экспериментов эффективность трансфекции, определявшаяся по . количеству окращенных клеток при трансфекции в них плазмида, содержащей ген р-галактозидазы под контролем СИУ промотора, находилась в пределах 40-46%. Следовательно лишь около 40% клеток РЬК-ВЬ7 получали плазмидные ДНК, несущие риОозим, а эта линия является продуцентом вируса в высоком титре. Последнее обстоятельство является одним из факторов объясняющимим, разницу в ингибировании вирусной репродукции по экспрессии щелочной фосфатаэы и синцитийобразованию.

В представленной работе экспрессия ВЬ7 ингибировалась, но не элиминировалась полностью. Уровень ингибирования не превышавший 40% в клетках РЬК-ВЬУ, в клетках СС81 достигал 90% лишь при десятикратном избытке рибозимной конструкции. Не смотря на это полученные данные можно считать удовлетворительными, так как даже в клетках УЬК-ВЬУ, являющихся продуцентами вируса с высоким титром, уровень ингибирования приближается к 50%. Титр вируса при заражении животного гораздо ниже и коррелирует с развитием персистентного лимфоцитоза, что позволяет надеятся на эффективную

8&щиту клеток от вирусной инфекции при получении трансгенных животных. В тоже время для повышения эффективности ингибирования вируса необходимо использовать рибозимы, направленные против равных участков вирусного генома, либо сочетание рибоэима и асРНК, что явится предметом дальнейшей работы.

Изложенные в работе данные открывают новые пути для поиска новых аффективных ыишений ингибирования вирусной репликации с помощью не только антисмысловых РНК, но и рибозимов.

ВЫВОДЫ

1. Методом олигонуклеотидного синтеза на автоматическом синтезаторе синтезирован рибозим направленной против К-обласла ЬТН вируса лейкоза коров, расщепляющий ьирусную РНК 1п и((го на 8» 5 за 8 часов инкубации при соотношении субстрат/рибозим 5:1.

2. Созданы генно-инженерные конструкции, содержащие рибозим-кодирущие гены под контролем промотора БУ40, ЫРЗУ и ОМУ вирусов.

3. Впервые показана способность полученных реконбинантных шшзмид, содержащих рибозим, ингибировоть уюпродукцию вируса в культуре клеток П^-ВЬУ и СС81. Полученные конструкции ингибировали репликацию ВЬУ от 17 до 37% в культуре клеток

•ПЛ-ВЬУ и от 63 до 91% - в СС81.

4. Сравнительное исследование активности промоторов 8740, ПРЭУ и СМУ в клетках ПК-ВЬУ показало, что наибольшей активностью в данной линии обладает промотор .;му.

Г>. Получена плаэмида, содержащая ген синр^тируемой щелочной

фосфятчзн под контролем собственного 1громотора LTE! BLV.

6. Газаработпна тест-система на основе плазмиды, несущей репортрринП ген иод контролем собственного вирусного промотора и клеточной линии Р1Л -BT.V, позволяющей тестировать снижение уровня репликации вируса лейкоза коров по изменению уровня экспрессии щелочной фосфатазн.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Язливянский C.B., Карпов В.А., Баурин В.В., Мирошниченко О.И., Тихоненко Т.И. Изучение условий расщеплиния РНК вируса лейкоза коров рибозимом, направленным против длинных концевых повторов (n vitro. // Молекулярная ген., микр. и вирусол., 1994 ЖЗ.

2. Зеливянский C.B., Воскресенская Е.П., Тихоненко Т.И., Получение клеточной линии, экспрессирущей секрегируемую щелочную фоофатазу под контролем промотора длинных кольцевых повторов вируса лейкоза коров.// Молекулярная ген., микр. и вирусол., 1994 в печати.

3. Бяурин В.В., Зеливянский С.В.„ Ш.ад^ресонская Е.П. Использование антисмнслошх FHK для инпгбцропшпгл ^репликации вирусов животных в культуре клеток. "Всесоюзное paflpiioe юовощание по молекулярной биологии ДНК-содержащих вируеоп,. ¡имеющих практическое значение для с/х и медицины." Тезисы ¡Киев ÎIMI

й/1'