Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение противовирусного действия антисмысловых РНК, направленных против 3-концевой области генома вируса лейкоза коров

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Терновой, Владимир Васильевич

Принятые сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.,.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Антисмысловые РНК: общая характеристика.

1.1.1. Природные антисмысловые РНК у прокариот.

1.1.2. Природные антисмысловые РНК у эукариот.

1.2. Рекомбинантные антисмысловые гены.

1.2.1. Факторы, определяющие эффективность искусственных антисмысловых генов в эукариотических клетках.

1.2.1.1. Транскрипция антисмыслового гена.

1.2.1.2. Солокализация молекул асРНК и РНК-мишени.

1.3. Ретровирусы.

1.3.1. Жизненный цикл ретровирусов.

1.3.2. Роль белка Tat ВИЧ-1 в регуляции синтеза вирусных РНК.

1.3.3. Регуляция экспрессии ВИЧ-1 на посттранскрипционном уровне.

Регуляторный белок Rev.

1.3.4. Вирион.

1.3.5. Синтез вирусной ДНК.

1.4. Стратегии борьбы с ретровирусной инфекцией при помощи рекомбинантных генов асРНК.

1.4.1. Подавление экспрессии генома ретровируса в инфицированной клетке.

1.4.2. Блокирование интеграции вирусной ДНК с ДНК инфицированной клетки.

1.5. Вирус лейкоза коров.

1.5.1. Геном ВЛК и продукты генов.

1.5.2. Экспрессия ВЛК.

1.5.3. Регуляторные белки ВЛК.

1.5.4. Патогенез энзоотического лейкоза коров.

1.6. Искусственные антисмысловые гены против генов ВЛК и вируса Т-клеточного лейкоза человека.

1.7. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции.

1.8. Регуляторные элементы, обеспечивающие клеточноспецифическую экспрессию трансгена.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение противовирусного действия антисмысловых РНК, направленных против 3-концевой области генома вируса лейкоза коров"

Актуальность проблемы. Вирус лейкоза коров - экзогенный лимфотропный ретровирус, заражающий в естественных условиях крупный рогатый скот. У значительной части инфицированных животных развиваются патологические процессы, снижающие их продуктивность, а так как уровень инфицированности домашнего скота высок (более 10% поголовья стада молочных коров в развитых странах), экономические потери оцениваются десятками миллионов долларов (Schwartz & Levy, 1994).

Гены BJIK, обеспечивающие его репродуктивный успех и дестабилизирующие гомеостаз инфицированной клетки, установлены. Это дает возможность использовать антисмысловые гены для контроля экспрессии вирусного генома. Создание анти-BJIK генов асРНК, ингибирующих репродукцию вируса, позволит получить трансгенных животных с повышенной устойчивостью к развитию патологических процессов, связанных с экспрессией генома BJIK.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение возможности ингибирования репродукции вируса лейкоза коров при помощи генов асРНК против Зл-концевой области вирусного генома.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Создать клеточную тест-систему, позволяющую в короткие сроки надежно детектировать инфицированные вирусом лейкоза коров клетки.

2. Создать на основе фрагментов 3 х-концевого участка провирусной ДНК ВЖ серию рекомбинантных плазмид, несущих антисмысловые гены.

3. Изучить сравнительную противовирусную активность антисмысловых генов в клетках линии СС81 при помощи теста подавления вирусиндуцированного синцитиеобразования.

4. Сконструировать на основе антисмыслового гена, показавшего наиболее высокий уровень противовирусной активности по данным теста ингибирования 7 вирусиндуцированного синцитиеобразования, антисмысловой ген, несущий сигнал упаковки ВЛК. 5. Установить уровень ингибирования репродукции ВЖ геном асРНК против 3"-концевой области вирусного генома.

Научная новизна и практическая значимость.

Создана модельная клеточная тест-система ВЬУОБР, которая дает возможность надежно и быстро детектировать инфицированные ВЛК клетки. При помощи тест-системы ВЬУвРР данные об уровне ингибирования репродукции вируса можно получать уже через 96 часов после начала эксперимента, тогда как при помощи разработанной ранее тест-системы ВЬУ-8УЫЕО это становится возможным не раньше, чем через 2-3 недели. Разработанная тест-система при меньших затратах средств дает возможность более интенсивно проводить исследования по созданию противовирусных средств против ВЛК.

Установлено, что асРНК против 3"-концевой области генома ВЛК надежно контролируют экспрессию генов вируса. Впервые исследована возможность использования сигнала упаковки для повышения уровня ингибирования репродукции ВЛК геном асРНК против 3"-концевой области вирусного генома.

Сконструированные гены асРНК против 3"-концевой области генома ВЛК могут быть использованы для получения трансгенных животных с искусственным противовирусным иммунитетом. 8

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Терновой, Владимир Васильевич

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Изучение противовирусного действия генов асРНК против 3"-концевой области генома вируса лейкоза коров представляет значительный интерес. В случае использования для конструирования антисмыслового гена фрагмента ДНК ВЛК, который включает последовательность, кодирующую полипуриновый тракт и 3" LTR, есть основания предполагать, что гены асРНК будут обладать выраженной противовирусной активностью. Во-первых, РНК, кодируемые таким геном, будут комплементарны 5"- и З'-нетранслируемым последовательностям всех мРНК ВЛК. Известно, что эти последовательности мРНК несут важные для её эффективной экспрессии цис-действующие элементы (Sonenberg, 1994).

Во-вторых, последовательности данной области генома ВЛК кодируют RxRE-элемент. Установлено, что асРНК, комплементарные последовательности, кодирующей RRE элемент вируса ВИЧ-1, эффективно ингибируют репликацию вируса, блокируя накопление в цитоплазме полноразмерных вирусных транскриптов (Kim et al., 1996).

И, наконец, асРНК комплементарны последовательности геномной РНК ВЛК, кодирующей полипуриновый тракт, и, как позволяют предполагать данные, полученные То с соавт., (То et al., 1994), могут блокировать праймерную функцию полипуринового тракта. В результате этого образующаяся в процессе обратной транскрипции двухцепочечная вирусная ДНК имеет одноцепочечные длинные концевые повторы, которые не могут служить в качестве субстрата интегразы и инфекция клетки не завершается внедрением в её геном провирусной ДНК ретровируса.

3.1. Создание клеточной тест-системы для изучения действия генов асРНК на репродукцию ВЛК.

Уровень экспрессии генома ВЛК в культуре клеток, как правило, низкий, что не позволяет при использовании ДНК ВЖ дикого типа получать достоверные данные об уровне ингибирования противовирусными средствами репродукции вируса. Для того, чтобы надежно детектировать экспрессию генома ВЛК в

48 инфицированной клетке, ранее была разработана клеточная тест-система BLV-SVNEO, в которой используется ретровирусный вектор, несущий на 3"-конце генома BJIK маркерный ген neo под контролем промотора вируса SV40 (Derse & Martarano, 1990). Тест-система позволяет оценивать уровень ингибирования репродукции BJIK, сравнивая количество устойчивых к неомицину выросших колоний клеток в варианте с противовирусным средством и контрольном, однако для получения данных требуется 2-3 недели.

Для того, чтобы создать тест-систему, позволяющую получать достоверные данные о действии гена асРНК на репродукцию BJIK в короткие сроки, было решено использовать систему регулируемого, высокоуровневого контроля экспрессии гена (Gossen & Bujard, 1992). Основу такой тест-системы должен составить ретровирусный вектор, несущий экспрессирующую кассету, состоящую из маркерного гена под контролем индуцибельного промотора TRE. В связи с тем, что промотор TRE в присутствии активатора транскрипции tTA обеспечивает повышение уровня экспрессии контролируемого гена на пять порядков, а в его отсутствие практически молчит, это должно позволить надежно и быстро детектировать экспрессию генома BJ1K в клетках, экспрессирующих трансактиватор транскрипции. В качестве маркерного гена было решено использовать ген зеленого флуоресцентного белка (Chalfie et al., 1994).

3.1.1. Конструирование ретровирусного вектора pBLVGFP.

Ретровирусный вектор pBLVGFP (рис. 3) был сконструирован на основе ДНК плазмидной конструкции рВ6490, которая несет молекулярный клон BJIK с одним LTR. Для создания вектора при помощи гидролиза ДНК рВ6490 рестрикционными эндонуклеазами Xbal и Pstl, координаты 6819 п.н. и 1087 п.н., соответственно, и последующей обработкой полученного фрагмента экзонуклеазой BaBl и рестрикционной эндонуклеазой EcoRI получили фрагмент ДНК BJIK с координатами 7925-8650 п.н., несущий LTR. Полученный фрагмент клонировали в EcoRV сайт полилинкера плазмидного вектора рВС SK+. Далее в этот же вектор были последовательно встроены: фрагмент Xhol-EcoRI плазмидной конструкции pTRE (Clontech Inc.), несущий индуцибельный тетрациклиновый промотор TRE,

49 фрагмент Notl-Notl плазмндной конструкции pGreen Lantern-1 (Gibco BRL), несущий ген ЗФБ, и фрагмент рВ6490 с координатами 4117-6691 п.н. Затем фрагмент Hindlll-EcoRl, несущий указанные последовательности, был переклонирован в плазмидный вектор pGEM7zf+ (Promega). В этот же вектор клонирован фрагмент ДНК BJIK EcoRI-Hindlll с координатами 7925-4117 п.н., полученный в результате гидролиза соответствующими рестриктазами рВ6490. Здесь и далее координаты указаны в соответствии с опубликованной последовательностью генома BJIK Сагата с соавт. (Sagata et al., 1985).

Таким образом, в ретровирусном векторе pBLVGFP делетирован фрагмент генома BJIK с координатами 6691-7925 п.н., несущий регуляторные гены tax я rex, и в этот участок вирусного генома встроена экспрессирующая кассета, состоящая из маркерного гена ЗФБ под контролем индуцибельного промотора TRE.

3.1.2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pCMVtax/rex.

В связи с тем, что экспрессия структурных генов BJIK находится в выраженной зависимости от вирусных регуляторных белков Tax и Rex (Derse, 1987; 1988), с целью компенсации функции генов tax и rex была создана плазмидная конструкция pCMVtax/rex (рис. 4).

Для получения фрагмента, несущего старт-кодоны, которые расположены во втором экзоне мРНК Tax/Rex, в реакции обратной транскрипции с препаратом тотальной клеточной РНК клеток линии FLK-BLV была наработана кДНК (Van der Maaten & Miller, 1976). В реакции был использован обратный праймер "77" (нуклеотидная последовательность представлена в разделе "Методы"). В полимеразной цепной реакции с полученной кДНК были использованы праймеры прямой "75" и обратный, и в результате получен фрагмент ДНК размером 350 п.н.

Соответствие нуклеотидной последовательности полученного фрагмента последовательностям генома ВЖ было подтверждено методом секвенирования.

Полученный фрагмент кДНК после расщепления рестрикционными эндонуклеазами Hindlll и Clal был клонирован в плазмидный вектор pGem7zf+.

В этот же вектор были последовательно клонированы фрагменты Clal-ЕсоШ плазмидной конструкции рВ6490 (Itohara & Sekikawa, 1987) и ЕсоШ-Pvull

52 плазмидной конструкции pLT (Шаяхметов, 1995), содержащие участки генома ВПК с координатами 7318-7924 п.н. и 7925-8245 п.н., соответственно. Фрагмент Hindlll-Xbal из плазмидного вектора pGem7zf+ был переклонирован в полилинкер экспрессирующего вектора pRc/CMV.

Таким образом, уровень транскрипции генов tax и rex в плазмидной конструкции pCMVtax/rex контролирует HCMV IE, терминацию - сигнал полиаденилирования гормона роста коровы и синтезирующийся транскрипт должен значительно отличаться от нативного.

Структурная организация ретровирусного вектора pBLVGFP и pCMVtax/rex и кодируемые ими продукты в сравнении с таковыми вируса дикого типа представлены на рисунке 5.

3.1.3. Экспрессия генов BJIK рекомбинантными плазмидами pBLVGFP и pCMVtax/rex в культуре клеток.

Для анализа экспрессии генов BJ1K ретровирусным вектором pBLVGFP и плазмидной конструкцией pCMVtax/rex были использованы индикаторные клетки линии СС81. В связи с тем, что трансфекция клеток этой линии ДНК BJIK индуцирует образование синцитиев (Borisenko et al., 1992), но для индукции синцитиеобразования необходима функция зрелых белков оболочки BJIK gp51 и gp30 (Voneche et al., 1992) и регуляторных белков Tax и Rex (Itohara et al., 1988), появление синцитиев при котрансфекции клеток линии СС81 pBLVGFP с pCMVtax/rex будет свидетельствовать о правильной экспрессии генов рекомбинантными плазмидами.

Клетки линии СС81 котрансфицировали ДНК плазмидных конструкций pBLVGFP и pCMVtax/rex в различных весовых соотношениях. Полученные данные показали (рис. 6), что при использовании в трансфекционной смеси 1 мкг ДНК ретровирусного вектора pBLVGFP и 1 мкг ДНК pCMVtax/rex происходило образование 1000+140 синцитиев. Количество вирусиндуцированных синцитиев возрастало в два раза при увеличении в трансфекционной смеси ДНК pCMVtax/rex до 4 мкг и затем выходило на плато.

54

55

Рис. 7. Индикаторные клетки линии СС81, трансфицированные ДНК ВЪУОРР. Многоядерные клетки - синцитии. Окраска 0,1% толуидиновым синим.

56

3.1.4. Изучение возможности детектировать инфицированные BJ1K клетки при помощи системы регулируемого контроля экспрессии маркерного гена.

Для того, чтобы клеточная тест-система моделировала цикл репликации BJIK и позволяла надежно детектировать вновь инфицированные клетки по экспрессии маркерного белка, использованы две линии клеток. В качестве клеток, которые должны продуцировать вирусные частицы при их трансфекции ДНК pBLVGFP, были использованы клетки линии СС81, а в качестве клеток-мишеней вирусной инфекции - клетки линии HeLa Tet-Off, постоянно экспрессирующие трансактиватор транскрипции tTA индуцибельного промотора TRE. Экспрессия маркерного гена становится возможной в инфицированных клетках линии HeLa Tet-Off после образования в процессе обратной транскрипции двухцепочечной вирусной ДНК. В трансфицированных клетках линии СС81 экспрессия гена ЗФБ 'может происходить лишь на недетектируемом уровне.

Возможность при помощи разрабатываемой клеточной тест-системы детектировать экспрессию генома BJ1K во вновь инфицированных клетках была изучена в эксперименте, который проводили следующим образом (рис. 8А): клетки линии СС81 рассевали на 35 мм чашки (1,7x105 клеток на чашку) и через 24 часа проводили трансфекцию клеток ДНК BLVGFP. BLVGFP - условное название вируса при использовании в трансфекционной смеси 1 мкг pBLVGFP и 1 мкг pCMVtax/rex. Ещё через 24 часа клетки рассевали в соотношении один к двум и на одной из чашек клетки линии СС81 (1,3x105 клеток) сокультивировали с клетками линии HeLa Tet-Off (1,5x105 клеток), а другую чашку оставляли для подсчета синцитиев.

Количество синцитиев и "зеленых клеток" (клетки линии HeLa Tet-Off, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок) подсчитывали при помощи светового микроскопа через 72 часа после сокультивирования клеток. Для подсчета клеток, экспрессирующих ЗФБ (рис. 9), использовали световой микроскоп, оснащенный фильтрами для детекции излучения с длиной волны в диапазоне 450500 нм.

Как видно из данных в таблице (рис. 8Б), через 96 часов после трансфекции клеток линии СС81 ДНК BLVGFP можно было обнаружить 1460 + 150 "зеленых

58 клеток" и 1000+140 синцитиев. Количество синцитиев и "зеленых клеток" значительно увеличивалось при нарастании в трансфекционной смеси количества рСМ\Чах/гех. Неожиданным оказалось появление около 200 "зеленых клеток" при трансфекции клеток линии СС81 трансфекционной смесью, не содержащей рСМУ1ах/гех. Возможные причины этого рассматриваются в главе "Обсуждение результатов".

Полученные данные свидетельствуют о том, что клеточная тест-система (рабочее название - ВЬУвРР) моделирует репликацию ВЛК и позволяет надежно и быстро детектировать экспрессию генома ВЛК во вновь инфицированных клетках.

3.2. Конструирование антисмысловых генов на основе фрагментов 3'-концевого участка провирусной ДНК ВЛК и изучение их противовирусного действия. 3.2.1. Создание плазмидных конструкций и анализ транскрипции антисмысловых генов.

В связи с тем, 3' -концевая последовательность генома ВЛК формирует сложную вторичную структуру (Sagata е! а1., 1984), это может препятствовать образованию гибридного дуплекса между комплементарными последовательностями асРНК и вирусных мРНК. Для того, чтобы экспериментальным путем установить, какой фрагмент 3'-концевого участка провирусного генома ВЛК будет обеспечивать наиболее высокий уровень противовирусной активности асРНК, была создана серия рекомбинантных плазмид, несущих различающиеся по величине фрагменты ДНК ВЛК (рис. 10).

Все рекомбинантные плазмиды получены в результате клонирования в полилинкер экспрессирующего плазмидного вектора рЯс/СМУ фрагментов провирусного генома ВЛК в антисмысловой ориентации, т.е. экспрессия гена асРНК контролируется промотором предранних генов цитомегаловируса человека.

Плазмидные конструкции р470 и р516 образованы переклонированием из плазмидной конструкции рЬТ (Шаяхметов, 1995) в сайт ЯшёIII рЯс/СМУ фрагментов генома ВЛК ЕсоШ-МЬо11 (7924-8396 п.н.) и ЕсоШ-Бас! (7924-8440 п.н.), соответственно.

59

Рис. 9. Детекция инфицированных вирусом лейкоза клеток по экспрессии маркерного гена зеленого флуоресцентного белка.

Клетки линии НеЬа Те1-(Ж, экспрессирующие ген зеленого флуоресцентного белка ("зеленые клетки"). Клетки были инфицированы вирусными частицами, продуцируемыми клетками линии СС81, трансфицированными ВЬУОРР. Вверху: изображение поля зрения сделано при помощи светового микроскопа, оснащенного фильтрами для детекции излучения с длиной волны 450 - 500 нм (через 96 часов после трансфекции). Увеличение 400х.

Внизу: то же поле зрения при обычном освещении.

75 ингибируют репликацию ВИЧ-1 в том случае, если при создании гена использованы протяженные фланкирующие последовательности, кодирующие, в частности, сайт инициации димеризации.

Предполагают, что образование димера служит сигналом для упаковки молекул РНК и именно в такой форме процесс упаковки проходит эффективно (Berkhout, 1996). Последовательности, обеспечивающие димеризацию полноразмерных транскриптов BJ1K, расположены в U5 районе LTR (Katoh et al., 1991; 1993), то есть вне последовательности ДНК BJIK с координатами 551-1147

Кроме того, известно, что элементы сигнала упаковки у ретровирусов являются контексто-зависимыми (Mann & Baltimore, 1985; Кауе et al., 1995) и чужеродные последовательности оказывают негативное влияние на способность РНК к упаковке (McBride et al., 1997). Сигнал упаковки ретровирусов образуется множеством элементов и способность каждого такого элемента обеспечивать упаковку определяется его конформацией, поэтому мутации в самом элементе или окружающих его последовательностях могут снижать эффективность взаимодействия с сигналом упаковки Gag полипротеинов, которые обеспечивают избирательную упаковку вирионной РНК (Luban & Goff, 1994; Berkowitz et al., 1995; 1996; Clever & Parslow, 1997).

Отсутствие в составе фрагмента ДНК BJIK с координатами 551-1147 п.н. (рис. 10) последовательностей, обеспечивающих димеризацию транскриптов и фланкирующих последовательностей, необходимых для формирования правильной конформации сигнала упаковки в чужеродном контексте (Kurg et al., 1995; Mansky & Wisnievski, 1998), должно было негативно повлиять на компетентность сигнала упаковки, кодируемого рекомбинантным ас геном.

Тем не менее, сигнал упаковки, вероятно, сыграл положительную роль в достижении высокого уровня ингибирования репродукции BJIK.

Сравнение уровней подавления синцитиеобразования при котрансфекции клеток линии СС81 ДНК BLVGFP с р760 (рис. 8Б) в одном случае и с р760у в другом (рис. 13) свидетельствует, на первый взгляд, о том, что встраивание

76 дополнительного фрагмента ДНК ВЛК перед ас геном привело к снижению уровня экспрессии ас гена, т.к. уровень ингибирования вирусиндуцированного синцитиеобразования снизился с 99% до 70%. Однако, данные о высоком уровне ингибирования репродукции ВЛК противоречат такому предположению.

Как уже было сказано выше, уровень ингибирования образования синцитиев в данной экспериментальной системе отражает, прежде всего, уровень ингибирования геном асРНК экспрессии гена ет и, вероятнее всего, это происходит в результате ингибирования кодируемой этим геном мРНК. Следовательно, встраивание сигнала упаковки могло привести к снижению уровня ингибирования антисмысловыми РНК экспрессии мРНК Епу, но на ингибирование экспрессии других мРНК ВЛК модификация искусственного ас гена могла повлиять иначе.

Установлено, что сигнал упаковки ретровирусов обеспечивает солокализацию транскриптов, несущих сигнал упаковки, в одном клеточном компартменте (Ра1 е{ а1., 1998). Это позволяет предположить, что сигнал упаковки направлял транспорт асРНК в те же компартменты клеток линии СС81, в которых локализовались полноразмерные мРНК ВЛК. Обратной стороной этого будет уменьшение количества асРНК с сигналом упаковки, ингибирующих экспрессию мРНК Епу.

В целом, полученные данные можно интерпретировать следующим образом. Отсутствие в составе использованного фрагмента ДНК ВЛК с координатами 551-1147 п.н. последовательностей, кодирующих сигнал инициации димеризации и фланкирующих последовательностей, необходимых для формирования правильной конформации сигнала упаковки, существенно снизило его способность обеспечивать образование гомодимеров асРНК:асРНК и гетеродимеров асРНК:полноразмерная РНК ВЛК, которые бы могли конкурировать с гомодимерами полноразмерных РНК ВЛК за факторы транспорта к месту сборки/упаковки вирусных частиц. В связи с этим, асРНК не могли эффективно ингибировать соответствующий этап экспрессии ВЛК (этап 9 на рис. 14В). Однако, формируемая сигнальная последовательность могла обеспечивать солокализацию

77 асРНК с сигналом упаковки с мРНК Gag-Pol. В связи с тем, что именно в ходе экспрессии этой мРНК образуются все компоненты вирусных частиц (за исключением белков оболочки), было достигнуто выраженное ингибирование репродукции BJ1K (предполагаемые этапы экспрессии генома BJ1K, блокируемые асРНК с сигналом упаковки - 6, 7а и 8а на рис 14В).

В целом, анализ данных позволяет предположить, что клонирование сигнала упаковки способствовало увеличению уровня ингибирования экспрессии мРНК Gag-Pol антисмысловыми РНК. Это обеспечило высокий уровень ингибирования репродукции BJIK.

Таким образом, в результате изучения генов асРНК, созданных на основе фрагментов 3'-концевого участка провирусного генома BJIK было установлено, что наиболее высоким уровнем противовирусного действия обладает ген асРНК, созданный на основе ДНК BJ1K с координатами 7925-8650 п.н. Анализ данных, полученных при изучении действия модифицированного антисмыслового гена, кодирующего асРНК с сигналом упаковки, на репродукцию BJ1K свидетельствуют в пользу того, что уровень ингибирования антисмысловым геном экспрессии гена BJIK можно повысить, обеспечив солокализацию асРНК с мРНК, кодируемыми геном-мишенью.

79

1.9. Заключение.

Обзор литературных данных показывает, что эффективность контроля экспрессии гена-мишени искусственным антисмысловым геном увеличивается в тех

38 случаях, когда используются регуляторные элементы генома, контролирующие экспрессию в данном типе клетки. При создании искусственных противовирусных антисмысловых генов, наряду с регуляторными элементами генома, обеспечивающими экспрессию в пермиссивной клетке, дополнительное увеличение "силы" ас гена обеспечивает включение в состав гена фрагментов провирусного генома ретровирусов в смысловой ориентации. Это позволяет адаптировать экспрессию искусственного гена в клетке не только на уровне транскрипции, но и на посттранскрипционном уровне.

39

ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы и питательные среды.

В экспериментальной части работы были использованы лабораторные штаммы E.coli DH1, DH5, JM109, XLl-blue.

Для выращивания бактерий использовали питательные среды: Среда LB (Luria-Bertani), состав (г/л) бакго-триптон 10, дрожжевой экстракт 5, NaCl 10, pH 7,5.

Среда SOB, состав (г/л) бакго-триптон 20, дрожжевой экстракт 5, NaCl 0,5 , pH 6,8 -7,0. Среда SOC идентична среде SOB, но содержит дополнительно 20 мМ глюкозы.

В качестве твердых питательных сред использовались среды LB, SOB с добавкой 1,7% бакто-агара (Difco, США) и среда Мак-Конки (Difco, США). Среды готовились на дистиллированной воде и стерилизовались автоклавированием.

2.1.2. Плазмидные векторы.

При клонировании фрагментов ДНК использовались стандартные клонирующие плазмидные векторы: pGEM7zf+ ("Promega"), рВС СК+ ("Stratogene"), pRc/CMV ("Invitrogene"), pTRE ("Clontech"), pGreen Lantern-1 (Gibco BRL), pB6490 -любезно предоставлена Dr. Sekikava. 4

2.1.3. Ферменты и другие реактивы.

В работе были использованы коммерческие препараты специфических рестрикционных эндодезоксирибонуклеаз фирм "New England Biolabs" (США), "Boehringer Mannheim"(OPr), "Amersham" (Великобритания), "Sigma" (США) и НПО "Фермент" (Вильнюс, Латвия); панкреатической дезоксирибонуклеазы I ("Sigma", США) и ДНК полимеразы I E.coli фирмы "Miles" (Великобритания).

Для удаления 5'-фосфатных групп использовали препараты щелочной фосфатазы фирм "Boehringer Mannheim" (ФРГ) и "Amersham" (Великобритания).

Электрофорез нуклеиновых кислот проводили в гелях, приготовленных из агарозы фирм "Bio-Rad" (США), "Sigma"(CIIIA) и "Serva" (ФРГ). Для приготовления

40 буферных смесей и других реактивов использовали коммерческие препараты фирм "Serva" (ФРГ), "Merck" (ФРГ), "Sigma" (США).

Другие использовавшиеся реактивы: морфолинпропансульфат (MOPS), морфолинэтансульфат (MES), бычий сывороточный альбумин (BSA), трихлорид гексаминокобальта, формамид, 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-(1-галактопиранозид (X-gal), дезоксихолат натрия, изопропилтиогалактозид (IPTG), диметилформамид и диметилсульфат ("Sigma", США); Трис (онкометиламинометан), додецилсульфат натрия, ЭДТА-Ка2, тритон-ХЮО, фреон 113 - фирмы "Serva"(OPr); фиколл 400 (Pharmacia, Швеция); поливинилпирролидон и пиперидин "Merck" (ФРГ).

2.1.4. Клеточные линии.

В работе использовались клеточные линии СС81 - кошачьи фибробласты, трансформированные вирусом саркомы мышей (Ferrer et al., 1981), FLK-BLV -фибробласты овечьего эмбриона, персистентно инфицированные вирусом лейкоза коров (Van der Maaten & Miller, 1976), D17 -первичные клетки остеогенной саркомы собаки, HeLa Tet-Off (Clontech). Клетки линии СС81 и D17 культивировали на ростовой среде ДМЕМ, содержащей 2 мМ глютамина, антибиотики (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл) и 10% фетальной телячьей сыворотки, при 37°С и 5% С02. Клетки линий FLK-BLV, HeLa Tet-Off культивировали на среде MEM, содержащей 2 мМ глютамина, антибиотики (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл) и 5% фетальной телячьей сыворотки при 37°С и 3% С02.

2.2. Методы.

2.2.1. Клонирование ДНК.

Клонирование ДНК проводили по стандартным протоколам (Sambrook et al., 1989). Лигирование смеси фрагментов ДНК после гидролиза специфическими эндонуклеазами проводили в 10-50 мкл буфера, содержащего 66 мМ трис-HCl, pH 7,6; 6,6 мМ MgCl2 , 10 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТФ, 0,1-2 мкг ДНК и 0,5 единицы ДНК-лигазы фага Т4. После инкубирования реакционной смеси при +12°С в течение 6-16 часов реакцию останавливали прогреванием (65°С, 10 мин).

41

Гс :r 3EHH0

1 Id

2.2.2. Приготовление компетентных клеток E.coli и их трансформация препаратами плазмидной ДНК.

Приготовление компетентных клеток E.coli и трансформацию их плазмидной ДНК проводили по методу стандартной трансформации Ханаана (Ханаан, 1988).

В 10 мл среды SOB засевали 1 свежевыращенную на чашке с SOB агаром колонию диаметром 2-3 мм и выращивали в течение 3 часов при 37°С с аэрацией на качалке (190 об/мин) до плотности 4-7x10 клеток/мл. Клеточную суспензию охлаждали в снегу и центрифугировали 5 мин. при 2500 об/мин при температуре Осадок клеток ресуспендировали в 1/3 Объема TFB (100 мМ KCl, 45 мМ МпС12, 10 мМ СаС12, 3 мМ гексаминокобальт-хлорида, 10 мМ K-Mes, pH 6,3). Охлаждали 10-15 мин. в снегу, вновь центрифугировали как описано выше и ресуспендировали в 1/12,5 объема TFB. Добавляли диметилсульфоксид и дитиотреитол до 3,5% (v/v). Инкубировали в снегу 10 мин. Добавляли вторую аликвоту DMSO-DTT до 7% и инкубировали в снегу 10-15 минут. Расфасовывали по 200 мкл в пробирки Eppendorf, добавляли ДНК (в объеме меньше 20 мкл), перемешивали пипетированием. Инкубировали в снегу 20-40 мин. Шокировали при 42°С в течение 90 секунд, немедленно охлаждали в снегу в течение 2 мин., добавляли 800 мкл среды SOC и инкубировали при

37°С 30-60 мин. при умеренном встряхивании. Отбор трансформантов проводили на твердых питательных средах LB или Мак-Конки с добавлением необходимого антибиотика.

2.2.3. Выделение плазмидной ДНК.

ДНК выделяли щелочным методом (Sambrook et al., 1989) с некоторыми модификациями. Клетки выращивали на шейкере в течение ночи при 37°С, 190 оборотах в минуту, собирали центрифугированием при 5000 оборотах в минуту в роторе J10, осадок ресуспендировали в 10 мл раствора: 50 мМ трис HCl, рН8,0, 50 мМ глюкозы, 6 мМ ЭДТА. К клеточной суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 1мг/мл, инкубировали 5 минут и разбавляли двумя объемами охлажденного раствора: 0,2 M NaOH, 0,1% тритон Х-100. Выдерживали в снегу 10 минут, добавляли 5мл 3 M ацетата калия, pH 4,8, осторожно перемешивали, вновь выдерживали в снегу 10 минут и центрифугировали 40 минут при 4°С и скорости

42

14000 оборотов в минуту в роторе 120. Плазмидную ДНК осаждали центрифугированием супернатанта в смеси с 0,6 кратным объемом изопропилового спирта 30 минут при комнатной температуре и 8000 оборотах в минуту, супернатант сливали и осадок после подсушивания (15-20 минут при комнатной температуре) растворяли в 2мл бидистиллированной автоклавированной воды, добавляли 2,2 грамма хлорида цезия и 300 мкл раствора этидия бромида, центрифугировали в ультрацентрифуге ТЬ-100 на скорости 70000 оборотов в минуту 18 часов при 15°С (дважды); отбирали полосу, соответствующую суперскрученной кольцевой ДНК, освобождали от этидия бромида с помощью изоамилового спирта (добавляя 6-8 раз равный объем ) и удаляли хлористый цезий диализом против большого объема ТЕ буфера, преципитировали ацетатом натрия (1:10) и осаждали 96% этанолом (2 объема).

2.2.4. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

Гидролиз плазмидной ДНК (0,1-15 мкг) проводили в течение 1-3 часов при рекомендуемой для данного фермента температуре и буфере 1-5 единицами активности фермента в объеме 20-100 мкл.

2.2.5. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

Разделение фрагментов ДНК проводили в горизонтальных агарозных гелях с концентрацией агарозы 0,8 - 3% (БатЬгоок й а1., 1989). Электрофорез проводили при комнатной температуре в трис-ацетатном буфере (0,04 М трис-ацетат, рН 8.0, 0.002 М ЭДТА) с содержанием 0.5 мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 30-60 мин. Гели фотографировали в ультрафиолетовом свете на пленку "Микрат-300" с использованием оранжевого светофильтра.

2.2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля.

Фрагменты после электрофореза в 0.8 - 3% агарозном геле выделяли методом электроэлюции в диализных трубках (ЗатЬгоок й а1., 1989). Полученный раствор ДНК экстрагировали последовательно фенолом - фенол-хлороформом - хлороформом и

43 переосаждали этанолом. Эффективность элюции проверяли методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.7. .Цитирование фрагментов ДНК.

Для лигирования рестрикционных фрагментов ДНК использовали ДНК-лигазу фага Т4 (Fermentas MBI, Литва). Реакция проводилась в буфере, содержащем трихлорид гексаминокобальта. Состав буфера: 250 мМ трис HCI рН 7.2, 25 мМ KCI, 5 мМ MgCI2,10 мМ ДТТ, 1 мМ трихлорида гексаминокобальта (Rushe, 1985).

2.2.8. Выделение тотальной РНК из клеточных линий.

Тотальная РНК выделялась из клеток методом лизиса в кислом 4 М растворе гуанидин-изотиоцианата с последующей экстракцией водонасыщенным фенолом и хлороформом-изоамилом (25:1) (Ausubel et al., 1991). Концентрации препаратов РНК и их чистоту определяли спектрофотометрически при длине волны 260:280.

2.2.9. Нозерн-блот-гибридизация.

РНК (20 мкг тотальной клеточной РНК на лунку) фракционировали по размеру, проводя электрофорез в 1,2% агарозном геле в МОПС буфере с добавлением формальдегида при напряжении электрического поля 4 в/см. По окончании электрофореза гель отмывали от формальдегида полосканием в 20х SSC в течение 60 мин. (в трех сменах), осуществляли капиллярный перенос на нейлоновую мембрану Hybond N (Amersham) в течение ночи в 20х SSC, фиксировали РНК на мембране прижиганием ультрафиолетом. Предгибридизацию проводили в течение 30 мин. при 70° в Rapid Hyb. буфере (Amersham), гибридизацию в том же буфере с добавлением радиоактивно меченного РНК-зонда в течение 2 часов. После гибридизации производили отмывку мембраны по протоколу производителя гибридизационного буфера, затем заворачивали её в Saran Wrap и экспонировали с рентгеновской пленкой при -70°С в течение 1-7 суток.

2.2.10. Приготовление зонда для гибридизации.

44

Для получения радиоактивно меченных транскриптов с высокой специфической активностью проводили реакцию прерванной (run-off) транскрипции in vitro с использованием набора фирмы "Promega" и 5"[a-32P]UTP по протоколу фирмы-изготовителя реактивов. В качестве матрицы использовали предварительно линеаризованную ДНК плазмидной конструкции, несущей под контролем промотора полимеразы фага ТЗ последовательность U3 области LTR ВЖ.

2.2.11. Ревертазная реакция и последующий ПЦР-анализ.

1 мкг тотальной клеточной РНК, выделенной из клеток FLK-BLV, предварительно обработанной ДНКазой RQ ("Promega", США), отжигали с 10 рмолями праймера "77" (последовательность в геноме 7419-7398) 5"-ggcggtccagttgatacggtg-3" 10 мин при 55° и 10 мин при комнатной температуре. Затем проводили ревертазную реакцию в общем объеме 20 мкл. Состав реакционной смеси: 1 мкг РНК с отожженным праймером, 50 мМ трис-HCl рН 8.3, 50мМ КС1, ЮмМ MgCl2, ЮмМ ДТТ, 1мМ каждого дезоксирибонуклеотида, 0.5мМ спермидина, 1 ед. AMV ревертазы. Реакцию проводили 30 мин при 42°.

Реакцию ПЦР (Saiki et al., 1985) проводили в автоматическом режиме на приборе РНС-2 фирмы "Techne". 100 мкл реакционной смеси содержали: 10 мкл 10х буфера, 16 мкл смеси дНТФ (конечная концентрация 200 мМ), по 20 пикомолей праймеров (второй-праймер "75", соответствует последовательностям генома ВЖ 4701-4721, нуклеотидНая последовательность 5' -cgggcaaaacaagcttcggtg-34), 1 мкл раствора БСА (1,7 мг/мкл), 2,5 ед. фермента Tag! полимеразы производства НПМДЦ "Гентест" (Москва). Состав 10х буфера: 1 мкл 0,67 М трис-HCl (рН 8,8 при температуре 25°С), содержащего 20мМ MgCl2,0,15 М (NH^SCV

Параметры амплификации:

1-й цикл: денатурация 94°-2 мин; отжиг праймеров с матрицей 62° - 1 мин; синтез комплементарных цепей 72° - 15 сек.

2-й цикл: денатурация 94° - 30 сек; отжиг праймеров с матрицей 64° - 30 сек;

45 синтез комплементарных цепей 73° - 15 сек.

2.2.12. Трансфекция клеточных линий препаратами плазмидной ДНК.

Перенос чужеродного генетического материала в клетки млекопитающих осуществляли методом кальций-фосфатной преципитации (Graham & Van der Eb, 1973). За день до постановки эксперимента клетки пересевали при плотности 2x104 /см. На следующий день ростовую среду заменяли свежей средой и через 4 часа добавляли ДНК в составе кальций-фосфатного преципитата, который готовили следующим образом: к 2х HEPES-буферному раствору (1,63% по весу NaCI, 1,19% по весу HEPES, 0,023% по весу Na2HP04, pH 7.12) медленно по каплям добавляли аликвоту раствора, содержащего 0.25М СаС12 , донорную ДНК и ДНК плазмиды, использовавшейся в качестве носителя. После экспозиции в течение 15-30 минут при комнатной температуре квоту раствора преципитата, составляющую 1/10 объема ростовой среды добавляли к клеточному монослою. Через 5 часов инкубации при 37°С и 5% С02 клетки подвергали шоку 25%-ым диметилсульфоксидом при комнатной температуре в течение 3 минут, затем трижды отмывали средой ДМЕМ с 5% содержанием FBS. На следующий день клетки субпассировали из расчета 1А и культивировали при 37°С и 5% С02 на селективной либо аналитической ростовой среде.

2.2.13. Тест вирусиндуцированного синцитиеобразования.

Определение ингибирующего действия асРНК проводили, используя феномен вирусиндуцированного синцитиеобразования в индикаторной клеточной линии СС81 (Borisenko et al., 1992). Синцитии - многоядерные образования с объединенной цитоплазмой, которые являются продуктом слияния трансфицированных клеток, экспрессирующих зрелые белки оболочки ВЖ, с соседними клетками. Через 24 часа после трансфекции плазмидных конструкций клетки из каждой чашки рассевали на две 35 мм чашки и культивировали в ростовой среде, дополнительно содержащей 4 мкг/мл полибрена и 1% ДМСО при 37°С и 5% С02. На 5-е сутки после трансфекции клетки фиксировали, окрашивали 0.1% водным раствором толуидинового синего и проводили подсчет синцитиев. По изменению количества синцитиев в контрольных и

46 опытных вариантах делали вывод о степени ингибирования генами асРНК вирусной репродукции.

47

ГЛАВА 3.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Терновой, Владимир Васильевич, Москва

1. Лоуи Д.Р. «Трансформация и онкогенез: ретровирусы». 1989. В «Вирусология» под ред. Б.Филдса, Д.Найпа. М., «Мир», стр.-436.

2. Спандидос Д. и Уилки Н. Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих. 1987. В «Транскрипция и трансляция». Под ред. Хеймса Б. И Хиггинса С. М., «Мир», стр.-24.

3. Ханаан Д. "Методы трансформации E.coli'". 1988. В "Клонирование ДНК" под ред. Гловера Д. // М., "Мир", стр.- 140-174.

4. Шаяхметов Д.М. Анализ ингибирования репродукции вируса лейкоза коров генами антисмысловых РНК и трансактиватор-связывающим участком ДНК ВЛК. // Автореф.дисс.канд.биол.наук, М., 1995, стр.-57-59.

5. Andersen K.B., and Olsen K.E. Fusion between uninfected cells in retrovirus-induced fusion-from-within. // Virus Res., 1998,v.-58,pp.-53-64.

6. Aronow B.J., Ebert K.A., Valerius M.T.Potter S.S., Wiginton D.A., Witte D.P., Hutton J.J. Dissecting a locus control region: facilitation of enhancer function by extended enhancer-flaking sequences. // Mol.Cell.Biol.,1995,v.-15,pp.-l 123-1135.

7. Austin U., Kenyon C. Marking time with antisense. // Current Biology, 1994,v.-4,pp.-367-369.80

8. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Smith J.A., Struhl K. // Current protocols in molecular biology, N.Y.: John Willey Inc., 1991.

9. Baltimore D. Intracellular immunization. // Nature,1988,V.-335,pp.-395-396.

10. Bassell G.J., Oleynikov Y., Singer R.H. The travels of mRNAs through all cells large and small. // FASEB J, 1999,v.-13,pp.-447-454.

11. Berkhout B. Structure and function of the human immunodeficiency virus leader RNA. // Prog.Nucl.Acid Res.Mol.Biol.,1996,v.-54,pp.-l-34.

12. Berkowitz R.D., Ohagen A., Hoglund S., Goff S.P. Retroviral nucleocapsid domains mediate the specific recognition of genomic viral RNAs by chimeric Gag polyproteins during RNA packaging in vivo. // J.Virol.,1995,v.-69,pp.-6445-6456.

13. Berkowitz R., Fisher J., Goff S.P. RNA packaging. // Curr.Top.Microbiol.Immunol. 1996,v.-214, pp.-177-218.

14. Berthold E., and Maldarelli F. cis-Acting elements in human immunodeficiency virus type 1 RNAs direct viral transcripts to distinct intranuclear locations. // J.Virol.,1996,v.-70,pp.-4667-4682.

15. Borg K., Favaro J., Arrigo S. Involvement of human immunodeficiency virus type 1 splice sites in the cytoplasmic accumulation of viral RNA. // Virology, 1997,v.-236,pp.-95-103.

16. Borg K.T., Favaro J.P., Arrigo S.J., Schmidt M. Activation of a cryptic splice donor in human immunodeficiency virus type-1. // J.Biomed.Sci.,1999,v.-6,pp.-45-52.

17. Borisenko A., Miroschnickhenko O., Tikchonenko T. Inhibition of bovine leukemia virus replication by the antisense RNA in cell line CC81. // Virus Res., 1992,v.-23,pp.-89-97.

18. Boros I.M., Tie F., Giam C-Z. Interaction of bovine leukemia virus transactivator Tax with bZip proteins. // Virology,1995,v.-214,pp.-207-214.

19. Brandeis M., Frank D., Keshet I., Siegfried Z., Mendelson M., Nemes A., Temper V., Razin A., Cedar H. Spl elements protect a CpG island from de novo methylation. // Nature, 1994,v.-371 ,pp.-435-438.

20. Brooks P.A., Nyborg G.K., Cockerell G.L. Identification of an NF-kB binding site in the bovine leukemia virus promoter. // J.Virol., 1995,v.-69,pp.-6005-6009.

21. Brooks P.A., Cockerell G.L., Nyborg J.K. Activation of BLV transcription by NF-kB and Tax. // Virology, 1998,v.-243,pp.-94-98.

22. Burny A., Bruck C., Chanhenne H., Cleuter Y., Dekegel D., Ghysdael J., Kettmann R., Leclercg M., Leunen J., Mammerickx M., Portetelle D. Bovine leukemia virus: molecular biology and epidemiology. Raven Press: New York, N.Y., 1980,pp.-231-278.

23. Cantor G.H., McElwain T.F., Birkebak T.A., Palmer G.H. Ribozyme cleaves rex/tax mRNA and inhibits bovine leukemia virus expression. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1993 ,v.-90,pp.-10932-10936.

24. Cantor G.H., Stone D.M., McElwain T.F., Palmer G.H. Comparison of the antiviral efficacy of ribozymes and antisense RNA directed against bovine leukemia virus rex/tax. // Antisense Nucleic Acid.Drug Dev., 1996,v.-6,pp.301-304.

25. Case C.C., Roels S.M., Jensen P., Lee J., Kleckner N., Simons R.W. The unusual stability of the IS 10 anti-sense RNA is determined by the structure of its stem domain. // EMBO J., 1989, v.-8, pp.-4297-4305.

26. Chang D.D., and Sharp P.A. Regulation by HIV Rev depends upon recognition of splice sites. // Cell.,1989,v.-59,pp.-789-795.

27. Chang L-J., and Stoltzfus C.M. Inhibition of Rause sarcoma virus replication by antisense RNA. // J.Virol., 1987,v.-61,pp.-921-924.

28. Chevallier N., Berthelemy M., Le Rhun D., Laine V., Levy D., Schwartz-Cornil I. Bovine leukemia virus-induced lymphocytosis and increased cell survival mainly involve the CDllb+ B-lymphocyte subset in sheep. // J.Virol.,1998,v.-72,pp.-4413-4420.

29. Chin D.J. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev-Rev-response element complex formation by complementary oligonucleotides. // J.Virol., 1992,v.-66,pp.-600-607.

30. Clever J.L., and Parslow T.G. Mutant human immunodeficiency virus type 1 genomes with defects in RNA dimerization or encapsidation. // J.Virol.,1997,v.-71,pp.-3407-3414.

31. Cochrane A.W., Jones K.S., Beidas S., Dillon P.J., Skalka A.M., Rosen C.A. Identification and characterization of intragenic sequences wich repress human immunodeficiency virus structural gene expression. // J.Virol.,1991,V.-65,pp.-5305-5313.

32. Cockerill P.N. and Garrard W.T. Chromosomal loop anchorage of the k immunoglobulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase II sites. // Cell, 1986,v.-44,pp.-273-282.

33. Cullen B.R. Retroviruses as model systems for the study of nuclear RNA export pathways. // Virology,!998,v.-249,pp.-203-210.83

34. Depelchin A., Letesson J.J., Lostrie-Trussart N., Mammerickx M., Portetelle D., Burny A. Bovine leukemia virus (BLV)-infected B-cells express a marker similar to the CD5 T cell marker. // Immunol Lett., 1989, v.-20, pp.-69-76.

35. Derse D., and Casey J.W. Two elements in the bovine leukemia virus long terminal repeat that regulate gene expression. // Sciense, 1986, v.-231, pp.-1437-1440.

36. Derse D. Bovine leukemia virus trascription is controlled by a virus-encoded transacting factor and by cys-acting response elements. // J.Virol.,1987,v.-61,pp.-2462-2471.

37. Derse D. trans-Acting regulation of bovine leukemia virus mRNA processing. // J.Virol., 1988, v.-62, pp.-l 115-1119.

38. Derse D., and Martarano L. Construction of a recombinant bovine leukemia virus vector for analysis of virus infectivity. // J.Virol., 1990,v.-64,pp.-401-405.

39. Ding S-F., Noronha J., Joshi S. Co-packaging of sense and antisense RNAs: a novel strategy for blocking HIV-1 replication. //Nucl.Acid.Res.,1998,v.-26,pp.-3270-3278.

40. Dorer D.R., and Henicoff S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in drosophila. // Cell, 1994,v.-77,pp.-993-1002.

41. Dorer D.R. and Henikoff S. Transgene repeat arrays interact with distant heterochromatin and cause silencing in cis and trans. // Genetics, 1997,v.-147,pp.-1181-1190.84

42. Duan L., Zhu M., Ozaki I., Zhang H., Wei D.L., Pomerantz R.J. Intracellular inhibition of HIV-1 replication using a dual protein-and RNA-based strategy. // Gene Ther., 1997, v.-4, pp.-533-543.

43. Eguchi Y., Itoh T., Tomizawa J. Antisense RNA. // Annu.Rev.Biochem.,1991,v.-60,pp.-631-652.

44. Emerman M., and Malim M.H. HIV-1 regulatory/accessory genes: keys to unraveling viral and host cell biology. // Science,1998,v.-280,pp.-1880-1884.

45. Feng Y-X., Copeland T.D., Henderson L.E., Gorelic R.J., Bosche W.J., Levin J.G., Rein A. HIV-1 nucleocapsid protein induces "maturation" of dimeric retroviral RNA in vitro. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1996,v.-93,pp.-7577-7581.

46. Ferrer J.F., Cabradilla C., Gupta P. Use of a feline cell line in the syncytia infectivity assay for the detection of bovine leukemia virus infection in cattle. // Am. J. Vet.Res.,198 l,v.-42,pp.-9-14.

47. Forrester W.C., van Genderen C., Jenuwein T., Grosschedl R. Dependence of enhancer-mediated transcription of the immunoglobulin m gene on nuclear matrix attachment regions. // Science,1994,V.-265,pp.-1221-1225.

48. Frankel A.D., and Young J.A.T. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. // Annu.Rev.Biochem., 1998,v.-67,pp.-1 -25.

49. Fu W., Gorelic R.J., Rein A. Characterization of human immunodefitiency virus type 1 dimeric RNA from wild-type and protease-defective virions. // J.Virology, 1994, v.-68, pp.-5013-5018.

50. Garrick D., Fiering S., Martin D.I., Whitelaw E. Repeat-induced gene silencing in mammals. //Nat.Genet.,1998,v.-18,pp.-56-59.

51. Gasser S.M. and Laemmli U.K. Cohabitation of scaffold binding regions with upstream/enhancer elements of three developmentally regulated genes of D.melanogaster. // Cell, 1986,v.-46,pp.-521-530.85

52. Gerdes K., Gultyaev A.P., Franch T., Pedersen K. Mikkelsen N.D. Antisense RNA-regulated programmed cell death. //Annu. Rev. Genet., 1997, v.-31, pp.-1-31.

53. Gheysen D., Jacobs E., deForesta F., Thiriart C., Francotte M., Thines D., De Wilde M. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus infected insect cells. // Cell,1989,v.-59,pp.-103-l 12.

54. Gilboa E., Mitra S.W., Goff S., Baltimore D. A detailed model of reverse transcription and tests of crucial aspects. // Cell, 1979, v.-18, pp.-93-100.

55. Girard P.-M., Bonnet-Mattoniere B., Muriaux D., Paoletti J. Auto complementary sequence in the 5" leader region is responsible for dimerization of MoMuLV genomic DNA. // Biochemistry, 1995,v.-34,pp.-9785-9794.

56. Good P.D., Krikos A.J., Li S.X., Bertrand E., Lee N.S., Giver L., Ellington A., Zaia J.A., Rossi J.J., Engelke D.R. Expression of small, therapeutic RNAs in human cell nuclei. // Gene Ther.,1997,v.-4,pp.-45-54.

57. Gossen M., and Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992,v.-89,pp.-5547-5551.

58. Graham F.L., and Van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. // Virology,1973,v.-52,pp.-456-467.

59. Graham F.L., and Van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. // Virology, 1973, v.-52, pp.-156-167.

60. Grosveld F., Blom van Assendelft G., Greaves D.R., Kollias G. Position-independent, high-level expression of the human b-globin gene in transgenic mice. // Cell,1987,v.-51,pp.-975-985.

61. Ha I., Wightman B., Ruvkun G. A bulged lin-4/lin-14 RNA duplex is sufficient for Caenorhabditis elegans lin-14 temporal gradient formation. // Genes Dev., 1996,v.-10,pp.-3041-3050.86

62. Haas L, Divers T., Casey J.W. Bovine leukemia virus gene expression in vivo. // J.Virol., 1992,v.-66,pp.-6223-6225.

63. Hanna Z, Kay D.G., Cool M., Jothy S., Rebal N., Jolicoeur P. Transgenic mice expressing human immunodeficiency virus type 1 in immune cells develop a severe AIDS-like disease. // J.Virol, 1998,v.-72,pp.-121-132.

64. Haseltine W.A, Kleid D.G, Panet A, Rothenberg E, Baltimore D. Ordered transcription of RNA tumor virus genomes. // J.Mol.Biol,1976,V.-106,pp.-109-131.

65. Hjalt T.A.H. and Wagner E.G.H. Bulged-out nucleotides protect an antisense RNA from Rnase III cleavage. //Nucl. Acids Res, 1995a, v.-23, pp.-571-579.

66. Hjalt T.A.H. and Wagner E.G.H. Bulged-out nucleotides in an antisense RNA are required for rapid target RNA binding in vitro and inhibition in vivo. // Nucl. Acids Res, 1995b, v.-23, pp.-580-587.

67. Itoh T.and Tomizawa J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColEl DNA by ribonuclease H. // Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 1980, v.-77, pp.-2450-2454.

68. Itohara S, and Sekikawa K. Molecular cloning of infectious proviral genomes of bovine leukemia virus. // Virology,1987,V.-159,pp.-158-160.

69. Jackson R.J. Cytoplasmic regulation of the mRNA function: the importanse of the 3' untranslated region. // Cell, 1993,v.-74,pp.-9-14.

70. Jenuwein T., Forrester W.C., Qui R-G., Grosschedl R. The immunoglobulin m enhancer core establishes local factor access in nuclear chromatin independent of transcriptional stimulation. // Genes Dev., 1993,v.-7,pp.-2016-2032.

71. Jenuwein T., Forrester W.C., Fernandez-Herrero L.A., Laible G., Dull M., Grosschedl R. // Nature, 1997,v.-385,pp.-269-272.

72. Johnston D.S. The intracellular localization of messenger RNAs. // Cell,1995,v.-81,pp.-161-170.

73. Jones B.K., Monks B.R., Liebhaber S.A., Cooke N.E. The human growth hormone gene is regulated by a multicomponent locus control region. // Mol.Cel.Biol., 1995,v.-15,pp.-7010-7021.

74. Joshi S., Van Brunschot A., Asad S., Van Der Elst I., Read S.E., Bernstein A. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 multiplication by antisense and sense RNA expression. // J.Virol.,1991,v.-65,pp.-5524-5530.

75. Katoh I., Yoshinaka Y., Sagata N., Ikawa Y. The bovine leukemia virus X region encodes a trans-activator of its long terminal repeat. // Jpn.J.Canc.Res.,1987,v.-78,pp.-93-98.

76. Katoh I., Ikawa Y., Yoshinaka Y. Retroviruses protease characterized as a dimeric aspartic proteinase. // J.Virol., 1989a,v.-63,pp.-2226-2232.

77. Katoh I., Yasunaga T., Yoshinaka Y. Bovine leukemia virus RNA sequences involved in dimerization and specific gag protein binding: close relation to the packaging sites of avian, murine, and human retroviruses. // J.Virol., 1993, v.-61, pp.-1830-1839.

78. Katz R.A. and Skalka A.M. The retroviral enzymes. // Annu. Rev. Biochem., 1994, v.-63, pp.-133-173.

79. Kaye J.F., Richardson J.H., Lever A.M.L. cz's-Acting sequences involved in human immunodeficiency virus type 1 RNA packaging. // J.Virol., 1995,v.-69,pp.-6588-6592.

80. Kerkhofs P., Heremans H., Bumy A., Kettmann R., Willems L. In vitro and in vivo oncogenic potential of bovine leukemia virus G4 protein. // J.Virol.,1998,v.-72,pp.-2554-2559.

81. Kettmann R., Burny A., Callebaut I., Droogmans L., Mammerickx M., Willems L., Portetelle D. (1994). Bovine leukemia virus. In The Retroviride, pp.39-81. New York: Plenum Press.

82. Kim S.K. and Wold B.J. Stable reduction on thymidine kinase activity in cells expressing high levels of anti-sense RNA. // Cell, 1985, v.-42, pp.-129-138.

83. Kim S., Byrn R., Groopman J., Baltimore D. Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection: evidence for differential gene expression. // J.Virol., 1989,V.-63,pp.-3708-3713.

84. Kim J.H., McLinden R.J., Mosca J.D., Vahey M.T., Greene W.C., Redfield R.R. Inhibition of HIV replication by sense and antisense Rev response elements in HIV-based retroviral vectors. // J.AIDS&Hum.Retrov., 1996, v.-12, pp.-343-351.

85. Kingston R.E., Bunker C.A., Imbalzano A.N. Repression and activation by protein multiprotein complexes that alter chromatin structure. // Genes Dev., 1996,v.-10,pp.-905-920.89

86. Kioussis D., and Festenstein R. Locus control region: overcoming heterohromatin-induced gene inactivation in mammals. // Current opinion in genetics and development, 1997,v.-7,pp.-614-619.

87. Kiss-Toth E., Paca-uccaralertkun S., Unk I., Boros I. Member of the CREB/ATF protein family, but not CREBa plays an active role in BLV tax trans activation in vivo. // Nucl. Acid.Res.,1993,v.-21,pp.-3677-3682.

88. Kumar M. and Carmichael G.G. Nuclear antisense RNA induces extensive adenosine modifications and nuclear retention of target transcripts. // Proc.Natl.Acad.Sci.,1997,v.-94,pp.-3542-3547.

89. Kumar M. and Carmichael G.G. Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes. // Microbiol.Mol.Biol.Rev.,1998,v.-62,pp.-1415-1434.

90. Kurg A., Sommer G., Metspalu A. An RNA stem-loop structure involved in the packaging of bovine leukemia virus genomic RNA in vivo. // Virology,1995,v.-211,pp.-434-442.

91. Lagarias D.M., and Radke K. Transcriptional activation of bovine leukemia virus in blood cells experimentally infected, asymtomatic sheep with latent infections. // J,Virol., 1989,v.-63,pp.-2099-2107.

92. Land H., Parada L., Weinberg R. Tumorigenic conversion of primary embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes. // Nature, 1983, V.-304, pp.-596-602.

93. Laughrea M., and Jette L. A 19-nucleotide sequence upstream of the 5' major splise donor is part of the dimerization domain of human immunodeficiency virus 1 genomic RNA. // Biochemistry,1994,v.-33,pp.-13464-13474.

94. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. // Cell, 1993, v.-75, pp.-843-854.

95. Li C.J., Ueda Y., Shi B., Borodyansky L., Huang L., Li Y-Z., Pardee A.B. Tat protein induces self-perpetuating permissivity for productive HIV-1 infection. // Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 1997,v.-94,pp.-8116-8120.90

96. Linial M.L., and Miller A.D. Retroviral RNA packaging: sequence requirements and implications. // Curr.Top.Microbiol.Immunol.,1990,v.-157,pp.-125-152.

97. Lori F., di Marzo Veronese F., De Vico A.L., Lusso P., Reitz M.S.Jr., Gallo R.C. Viral DNA carried by human immunodeficiency virus type 1 virions. // J.Virol., 1992, v.-66, pp.-5067-5074.

98. Luban J., and Goff S.P. Mutational analysis of cw-acting packaging signals in human immunodeficiency virus type 1 RNA. // J.Virol., 1994,v.-68,pp.-3784-3793.

99. Malim M.H., Hauber J., Le S.-Y., Maizel J.V., Cullen B.R. The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral rnRNA. // Nature,1989a,v.-338,pp.-254-257.

100. Malim M.H., and Cullen B.R. HIV-1 structural gene expression requires the binding of multiple Rev monomers to the viral RRE: implications for HIV-1 latency. // Cell, 199l,v.-65,pp.-241-248.

101. Mammerickx M., Palm R., Portetelle D., Burny A. Experimental transmission of leukosis in sheep: latency period of the tumoral disease. // Leukemia, 1988,v.-2,pp.-103-107.

102. Mann R., and Baltimore D. Varying the position of a retrovirus packaging sequence results in the encapsidation of both unspliced and spliced RNAs. // J.Virol., 1985,v.-54,pp.-401 -407.

103. Mansky L.M., and Temin H.M. Lower mutation rate of bovine leukemia virus relative to that of spleen necrosis virus. // J.Virol., 1994,v.-68,pp.-494-499.91

104. Mansky L.M., Krueger A.E., Temin H.M. The bovine leukemia virus encapsidation signal is discontinuous and extends into the 5' end of the gag gene. // J.Virol., 1995, v.-69, pp.-3282-3289.

105. Mansky L.M. and Wisniewski R.M. The bovine leukemia virus encapsidation signal is composed of RNA secondary structures. // J.Virol.,1998,v.-72,pp.-3196-3204.

106. Marquet R., Paillart J.-C., Skripkin E., Ehreshmann C., Ehreshmann B. Dimerization of human immunodeficiency virus type 1 RNA involves sequences located upstream of the splice donor site. // Nucl.Acid.Res.,1994,v.-22,pp.-145-151.

107. Mattaj I.W., and Englmeier L. Nucleocytoplasmic transport: the soluble phase. // Annu.Rev.Biochem.,1998,v.-67,pp.-265-306.

108. McBride M.S., and Panganiban A.T. The human immunodeficiency virus type 1 encapsidation site is multipartite RNA element composed of functional hairpin structures. // J.Virol., 1996,v.-70,pp.-2963-2973.

109. McBride M.S., Schwartz M.D., Panganiban A.T. Efficient encapsidation of the human immunodeficiency virus type 1 vectors and further characterization of cis elements required for encapsidation. //1.Virol., 1997,v.-71,pp.-4544-4554.

110. McKnight R.A., Shamay A., Sancaran L., Wall R.J., Hennighausen L. Matrixattachment regions can impart position-independent regulation of a tissue-specific gene in transgenic mice. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,v.-89,pp.-6943-6947.

111. Mirsky M.L., Da Y., Lewin H.A. Detection of bovine leukemia virus proviral DNA in individual cells. // PCR methods and applications, 1993, v.-2, pp.-333-339.92

112. Mirsky M.L., Olmstead C., Da Y., Lewin H.A. Reduced bovine leukemia virus proviral load in genetically resistant cattle. // Anim. Genet., 1998.V.-29,pp.-245-252.

113. Morgan R.A. Gene therapy for HIV infection. // Clin.Exp.Immunol.,1997,v.-107(Suppl. 1 ),pp.-41 -44.

114. Moser D.R., Ma D., Moser C.D., Campbell J.L. cis-Acting mutations that affect rop protein control of plasmid copy number. // Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1984, v.-81, pp.-4465-4469.

115. Moss E.G., Lee R.C., Ambros V. The cold shock domain protein LIN-28 controls developmental timing in C.elegans and is regulated by the lin-4 RNA. // Cell, 1997,v.-88,pp.-637-646.

116. Mujeeb A., Clever J.L., Billeci T.M., James T.L., Parslow T.G. Structure of the dimer initiation complex of HIV-1 genomic RNA. // Nat.Struct.Biol.,1998,v.-5,pp.-432-436.

117. Nakielny S. and Dreyfuss G. Nuclear export of proteins and RNAs. // Curr.Opin.Cell Biol.,1997a,v.-9,pp.-420-429.

118. Nakielny S., Fischer U., Michael W.M., Dreyfuss G. RNA transport. // Annu.Rev.Neurosci., 1997b,v.-20,pp.-269-301.

119. Natsoulis G., and Boeke J.D. New antiviral strategy using capsid-nuclease fusion proteins.//Nature,1991,v.-352,pp.-632-635.

120. Nellen W. and Sczakiel G. In vitro and in vivo action of antisense RNA. // Mol.Biotech.,1996,v.-6,pp.-7-14.

121. Niermann G., and Buehring G.C. Hormone regulation of bovine leukemia virus. // Virology, 1997, V.-239, pp.-249-258.

122. Onuma M., Watarai S., Sonoda M., Mikami T., Izawa H. Detection of bovine leukemia virus by syncytium assay. // Can J.comp.Med.1980, v.-44,pp.-289-293.

123. Pal B.K., Scherer L., Zelby L., Bertrand E., Rossi J.J. Monitoring retroviral RNA dimerization in vivo via hammerhead ribozyme cleavage. // J.Virol., 1998,v.-72,pp.-8349-8353.

124. Pal-Bhadra M., Bhadra U., Birchler J.A. Cosupression in Drosophila: gene silencing of alcohol dehydrogenase by white-Adh transgenes is Polycomb dependent. // Cell, 1997,v.-90,pp.-479-490.

125. Pettersson S., Arulampalam V., Neurarh M. Temporal control of IgH gene expression in developing B cells by the 3' Locus Control Region. // Immunobiol.,1997,v.-198,pp.-236-248.

126. Pirrotta V. Polycombing the genome: PcG, trxG, and chromatin silensing. // Cell,1998,v.-93,pp.-333-336.

127. Pollard V.W., and Malim M.H. The HIV-1 Rev protein. // Annu.Rev.Microbiol.,1998,v.-52,pp.-491-532.

128. Pomerantz R., Trono D., Feinberg M., Baltimore D. Cells nonproductivly infected with HIV-1 exhibit an aberrant pattern of viral RNA expression: a molecular model for latency. // Cell, 1990,v.-62,pp.-1271-1275.

129. Poon D.T.K., Wu J., Aldovini A. Charged amino acid residues of human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid p7 protein involved in RNA packaging and infectivity. // J.Virol., 1996,v.-70,pp.-6607-6616.

130. Powers M.A., and Radke K. Activation of bovine leukemia virus transcription in lymphocytes from infected sheep: rapid transition through early to late gene expression. // J.Virol., 1992,v.-66,pp.-4769-4777.

131. Ramezani A., Ding S.F., Joshi S. Inhibition of HIV-1 replication by retroviral vectors expressing monomeric and multimeric hammerhead ribozymes. // Gene Therapy, 1997,v.-4,pp.-861-867.

132. Ramsey C.A. and Panganiban A.T. Replication of the retroviral terminal repeat sequence during in vivo reverse transcription. // J.Virol.,1993,v.-67,pp.-4114-4121.

133. Reicin A.S., Paik S„ Berkovitz R.D., Luban J, Lowy I., Goff S.P. Linker insertion mutations in the human immunodeficiency virus type 1 gag gene: effects on virion particle assembly, release, and infectivity. // J.Virol., 1995,v.-69,pp.-642-650.94

134. Rhodes A, and James W. Inhibition of human immunodeficiency virus replication in cell culture by endogenously syntesized antisense RNA. // J.Gen. Virol, 1990,v.-71,pp.-1965-1974.

135. Rice N.R., Simek S.L, Dubois G.S, Showalter S.D, Gilden R.V, Stephens RM. Expression of bovine leukemia virus X region in virus-infected cells. // J. Virol, 1987,v.-61,pp.-1577-1585.

136. Robbins P.B, Yu X-J, Skelton D.M, Pepper K.A, Wasserman R.M, Zhu L, Kohn D.B. Increased probability of expression from modified retroviral vectors in embryonal stem cells and embryonal carcynoma cells. // J.Virol, 1997,v.-71,pp.-9466-9474.

137. Rovnak J, Boyd A.L, Casey J.W, Gonda M.A, Jensen W.A, Cockerell G.L. Pathogenicity of molecularly cloned bovine leukemia virus. // J.Virol, 1993,v.-67,pp.-7096-7105.

138. Rushe J, Howard-Flanders P. Hexamjne cobalt chloride promotes intermolecular ligation of blunt end DNA fragments by T4 DNA ligase. // Nucl. Acids Res, 1985, v.-13, pp.-1997-2008.

139. Sagata N, Yasunaga T, Tsuzuku-Kawamura J, Ohishi K, Ogawa Y, Ikawa Y. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionari relationship to other retroviruses. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,v.-82,pp.-677-681.

140. Saiki R.K, Schrf S, Faloona F, Mullis K.B, Horn G.T, Erlich H.A, Arnheim N. Enzymatic amplification of P-globin genomic sequences and restriction site analysis . for diagnosis of side cell anemia. // Science,1985,v.-230,pp.-1350-1354.

141. Sambrook J, Fritsch E.F, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

142. Schwartz I., and Levy D. Pathobiology of bovine leukemia virus. // Vet.Res.,1994,v.-25,pp.-521-536.

143. Schwartz M.D., Fiore D., Panganiban A.T. Distinct functions and reqirements for the Cys-His boxes of the human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein during RNA encapsidation and replication. //J.Virol.,1997,v.-71,pp.-9295-9305.

144. Schwartz-Cornil L., Chevallier N., Belloc C., Le Rhun D., Laine V., Berthelemy M., Levy D. Bovine leukemia virus-induced lymphocytosis in sheep is associated with reduction of spontaneous B cell apoptosis. // J.Gen.Virol.,1997,v.-78,pp.-153-162.

145. Sczakiel G., and Pawlita M. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in human cells stably expressing antisense RNA. // J.Virol.,1991,v.-65,pp.-468-472.

146. Seguin B., Staffa A., Cochrane A. Control of human immunodeficiency virus type 1 RNA metabolism: role of splice sites and intron sequences in unspliced viral RNA subcellular distribution. // J.Virol.,1998,v.-72,pp.-9503-9513.

147. Shelton D.A., Stegman L., Hardison R., Miller W., Bock J.H., Slightom J.L., Goodman M., Gumucio D.L. Phylogenetic footprinting of hypersensitive site 3 of the b-globin locus control region. // Blood, 1997,v.-89,pp.-3457-3469.

148. Simons R.W. Naturally occurring antisense RNA control a brief review. // Gene, 1988,v.-72,pp.-35-44.

149. Skripkin E., Paillart J-C., Marquet R., Blumenfeld M., Ehresmann B., Ehresmann C. Mechanisms of inhibition of in vitro dimerization of HIV type 1 RNA by sense and antisense oligonucleotides. // J.Biol.Chem.,1996,V.-271,pp.-28812-28817.

150. Slack F. and Ruvkun G. Temporal pattern formation by heterochronic genes. // Annu.Rev.Genet., 1997,v.-31,pp.-611-634.96

151. Sonenberg N. mRNA translation: influence of the 5' and 3' untranslated regions. // Current opinion in genetics and development. 1994, v.-4, pp.-310-315.

152. Spiegelman W.G., Reichardt L.F., Yaniv M., Heinemann S.F., Kaiser A.D., Eisen H. Bidirectional transcription and the regulation of phage a repressor synthesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, v.-69, pp.-3156-3160.

153. Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., Gilboa E. Overexpression of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus replication. // Cell,1990,v,-63,pp.-601-608.

154. Sullenger B.A., and Cech T.R. Tethering ribozymes to a retroviral packaging signal for destruction of viral RNA. // Science,1993,V.-262,pp.-1566-1569.

155. To R.Y.-L., Booth S.C., Neiman P.E. Inhibition of retroviral replication by antisense RNA. // Mol.Cell Biol,1986,v.-6,pp.-4758-4762.

156. To R.Y.-L., Booth S.C., Turk G., Neiman P.E. Completion of avian retroviral DNA replication intermediates inhibited by antisense RNA. // Virology, 1994,v.-200,pp.-336-346.

157. Trono D. Partial reverse transcripts in virions from human immunodeficiency and murine leukemia viruses. // 1992,v.-66,pp.-4893-4900.

158. Unk I., Kiss-Toth E., Boros I. Transcription factor AP-4 participates in activation of bovine leukemia virus long terminal repeat by p34 Tax. // Nucl. Acids Res., 1994, v.-22, pp.-4872-4875.

159. Van der Maaten M.J., and Miller J.M. Replication of bovine leukemia virus in monolayer cell cultures. // Bibl.Haematol.,1976,v.-43,pp.-360-362.97

160. Vanhee-Brossollet C., and Vaquero C. Do natural antisense transcripts make sense in eukaryotes? // Gene,1998,v.-211,pp.-1-9.

161. Wakimoto B.T. Beyond the nucleosome: epigenetic aspects of position-effect variegation in Drosophila. // Cell,1998,v.-93,pp.-321-324.

162. Walters M.C., Magis W., Fiering S., Eidemiller J., Scalzo D., Groudine M., Martin D.I.K. Transcriptional enhancers act in cis to supress position-effect variegation. // Genes Dev.,1996,v.-10,pp.-185-195.

163. Wang S., and Dolnick B.J. Quantitative evaluation of intracellular sense:antisense RNA hybrid duplexes. //Nucl.Acid.Res.,1993,v.-21,pp.-4383-4391.

164. Wickens M., and Takayama K. Deviants or emissaries. // Nature, 1994,v.-367,pp.-17-18.

165. Wightman B.,Ha I., Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C.elegans.// Cell,1993,v.-75,pp.-855-862.

166. Willems L., Gegonne A., Chen G., Kettmann R., Ghysdael. The bovine leukemia virus p34 is a transactivator protein. // EMBO J., 1987, v.-6, pp.-3385-3389.

167. Willems L., Heremans H., Chen G., Portetelle D., Billiau A., Burny A., Kettmann R. Cooperation between bovine leukemia virus transactivator protein and Ha-ras oncogene product in cellular transformation. // EMBO J., 1990, v.-9, pp.-l577-1581.

168. Willems L., Kettmann R., Chen G., Portetelle D., Burny A., Derse D. A cyclic AMP-responsive DNA-binding protein (CREB2) is a cellular transactivator of the bovine leukemia virus long terminal repeat. // J.Virol., 1992a,v.-66,pp.-766-772.

169. Willems L., Kettmann R., Dequiedt F., Portetelle D., Voneche V., Cornil I., Kerkhofs P., Burny A., Mammericks M. In vivo infection of sheep by bovine leukemia virus mutants. // J.Virol., 1993,v.-67,pp.-4078-4085.

170. Willems L., Kerkhofs P., Dequiedt F., Portetelle D., Mammerickx M., Burny A., Kettmann R. Attenuation of bovine leukemia virus by deletion of R3 and G4 open reading frames. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 1994, v.-91, pp.-l 1532-11536.

171. Xiao J. and Buehring G.C. In vivo protein binding and functional analysis of cis-acting elements in the U3 region of the bovine leukemia virus long terminal repeat. // J.Virol.,1998,v.-72,pp.-5994-6003.99

172. Yokoyama K. and Imamoto F. Transcriptional control of the endogenous MYC protooncogene by antisense RNA. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987, v.-84, pp.-7363-7367.

173. Zhang G., Zapp M.L., Yan G., Green M.R. Localization of HIV-1 RNA in mammalian nuclei. // J.Cell Biol.,1996,V.-135,pp.-9-18.

174. Zhang H., Zhang Y„ Spicer T.P., Abbott L.Z., Abbott M., Poiesz B.J. Reverse transcription takes place within extracellular HIV-1 virions: potential biological significance. //AIDS Res.Hum.Retrovir.,1993,v.-9,pp.-1287-1296.

175. Zhang H., Dornadula G., Pomerantz R.J. Endogenous reverse trascription of human immunodeficiency virus type 1 in phisiological microenvironments: an impotant stage for viral infection of nondividing cells. // J.Virol., 1996a,v.-70,pp.-2809-2824.