Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические и биологические характеристики трансгенных кроликов с генами антисмысловых РНК, направленными против вируса лейкоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические и биологические характеристики трансгенных кроликов с генами антисмысловых РНК, направленными против вируса лейкоза крупного рогатого скота"

од

На правах рукописи

БАУРИН Виталий Васильевич

физико-химические и биологические характеристики трансгенных кроликов с генами антисмысловых рнк, направленными против вируса лейкоза крупного рогатого скота

(Специальность 03.00.03 — Молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор, чл.-кор. РАСХН Т. И. Тихоненко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М. И. Шемякин, доктор биологических наук С. В, Советкин.

Ведущая организация —Биологический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится . . - ...... 1997 г.

в ..... часов на заседании диссертационного совета

Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан ....... 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета —

кандидат биологических наук С. А. Меликова

ОЕЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: В период с 1987 по 1991 года рядом исследователей была сформулирована концепция искусственного информационного иммунитета на основе комплементарю адресовашшх нуклеотидных последовательностей (КАП). Ровдение идеи было вызвано потребность» найти как можно более "прицельный" способ влияния на экспрессию генов в клетке. Цуклеотидная последовательность генов, в частности, имевдих определяпцее значение в возникновении заболеваний: наследственных, онкогенных, «трусной природа, других - является абсолютно индивидуальной. Введя в пораженную клетку последовательность, комплементарную гену - "возбудителю" (т.н. антисмысловую), можно рассчитывать на комплементарное исключение гена из процессов, приводящих к заболеванию. Основанием для появления концепции явились накопленные к этому времени в значительном количестве научные данные, доказыващие явление регуляции по антисмысловому механизму природных и искусственных генов. В частности неоднократно была описана способность КАП подавлять вирусную репликацию в культуре тканей животных.

В тот же период и в настоящее время успешно развивается технология получения пород трансгенных сельскохозяйственных (с/х) гивотшх с полезныш для человека. признаками. Порода таких пшотных сегодня получены п интенсивно изучаются. Сегодня это направление уке мояно рассматривать как альтернативу многовековой селекции с/х кивотных.

Одной из важнейших проблем, стояззх перед селекционерам, всегда являлось выведение пород с/х швотных, устойчивых к заболеваниям. Серьезной проблемой гявотноводства во штагах

странах мира, включая России, продолжает оставаться лейкоз крупного рогатого скота. Возбудителем заболевания является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛК). Заболевание в терминальной стадии характеризуется анемией, потерей веса, снижением продуктивности, другими экономически важными признаками и, как правило, заканчивается гибелью животного. В начале 90-х годов в России этим вирусом было заражено до 70% коров. На фоне экономического кризиса вполне правомочно предполагать, что зараженность животных гораздо выше 70-ти %.

Не говоря уже об экономической целесообразности работ, направленных на получение пород трансгенных с/х животных, устойчивых к заражению ВЛК, хотелось бы обратить внимание на тот факт, что в контакт с этим вирусом вступает и человек. К примеру, в непастеризованном молоке вирус может сохраняться до трех суток. Широко распространен контакт "кровь-кровь" при переработке мяса, вётеринарных операциях, при непромышленном получении молока и т.д. Хотя на сегодняшний день и не показана возможность заражения человека ВЛК, нельзя оставить без внимания доказанную способность ВЛК заражать не только животных, относящихся к одному с коровами семейству, но и животных другого семейства и даже отряда млекопитапшх (кролики, крысы, морские свинки и др.). Вирус способен проникать в экспериментах in vitro в клетки кошек, собак, человека, репродуцироваться "и персистировать в них. Наконец, следует всегда помнить о возможности мутационных изменений в геноме ВЛК, могущих существенно расширить' его инфекционный потенциал в отношении человека. Эти данные в совокупности с данными о сходстве "стратегии" генома ретровирусов человека и животных, а иногда значительной гомологией части их геномов, заставляют задуматься об опасности слишком близкого

"соседства" ВЛК и человека. Таким образом, с нашей точки зрения, может оказаться, что проблема имеет еще и медицинское значение.

Цели и задачи исследования: Настоящая работа является исследовательским этапом программы, направленной на получение пород крупного рогатого скота, устойчивых к заражению ВЛК по антисмысловому механизму.

В связи с большим периодом вынашивания плода и малым количеством животных в помете, получение трансгенных коров является длительным и дорогостоящим мероприятием, требушим, следовательно, серьезной научной обоснованности. Поэтому в качестве модели для первого этапа исследований были выбраны кролики, продолжительность исследований на которое значительно короче, и главное - на которых ранее показана персистениия ВЛК и вызываемые этим вирусом симптомы иммунодефицита, по которым в свою очередь можно было бы наблвдагь влияние КАП на заболевание. Получение линий трансгенных кроликов, устойчивых по антисмысловому механизму к заражению ВЛК, и являлось главной целью настоящей работы.

В задачи исследования таким образом входило: I - методом микроинъекции ввести анти ВЛК асРНК ген в яйцеклетки кроликов и среди родившихся животных отобрать тех, в геном которых произошла интеграция гена, 2 - физически охарактеризовать особенности интеграции грансгена в хромосому каздого животного, 3 - изучить особенности наследования трансгенов у разных животных, 4 -показать наличие экспрессии асРНК в лимфоцитах животных, 5 -тмунолопмзекими и гематологическими методами охарактеризовать особенности ответа организма трансгенных антиВЯК кроликов на заражение ВЛК, б - изучить влияние асРНК гена на особошости

течения заболевания у трансгенных животных.

Научная новизна и практическая значимость: В работе впервые описано получение линий трансгенных с/х животных с антиВЛК асРНК геном. Впервые на уровне организма с/х животного удалось показать ингибирупцее влияние КАП на инфекцию ВПК.

Апробация работы: Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании отдела генной инженерш ВНИИ Сельскохозяйственной Биотехнологии и на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", ВНИИСБ, Москва 1996.

Обьеы □ структура диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, вклгчапзего 159 библиографических ссылок. Работа изложена на 105 машинописных страницах включая 7 таблиц и 13 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I.I. Получение первично-трансгенных кроликов с RU5 анти ВЛК геном.

Ранее опубликованные результаты изучения действия асРНК-генов на репродукцию BLV в культуре клеток CC8I показ'али, что наиболее эффективной оказалась конструкция pAGR с геном против B-U5-FRS участка LTR BLV. Ингибирование достигало 95%. Эта те конструкция использована для получения трансгенных кроликов. Схема конструкции проведена на рис I.A. .

Трансгенных кроликов получали методомм микроинъкции фрагмента ДНК в мужской пронуклеос оплодотворенных яйцеклеток. Работу проводили совместно с сотрудником Биотехцентра РАСХН (Горки Ленинские) Захарченко В.И. Трансгенных животных выявляли методом блотгибридизации, гидролизованной по TaqI ДНК. Анализировали пробы как от живых, так и от погибших к моменту биопсии животных. Из 69 кроликов обнаружена интеграция у 5 живых (лаб. номера 5,9,14,44,58) и йдйого погибшего крольчонка (М 3), что составило 8,6% от числа проанализированного потомства.

1.2. Физическое картирование трансгена у первично-трансгенных кроликов.

Для того, чтобы физически охарактеризовать грансген, мы гпдролизовалп тотальную ДНК из ушек первично-трансгенных кроликов по рестриктазам: Тад1 (три сайта в микроинъецировашюм фрагменте), РбИ и ЕсоИ1 (по одному сайту) и Н1МП1 (ни одного сайта). В связи с гибелью животных К* 3 и 5, такой анализ проводили на животных Ш 9, 14, 44 и 58. Клотгибродизашгонная картина ДНК животных 0 9 и 14 отличалась от ожидаемой и заключала в себе труднообъяснимые противоречия. Поскольку изучение перестроек в интегрированном фрагменете не входило в задачу; работы, кроликов 1)1 9 и 14 в биологических исследованиях не использовали.

TaqI блотгибрэдизацирнный анализ ДНК кролика № 44 (рис. 1.44) выявил наличие 3-х фрагментов, размеры которых согласуются с овдцаемыш. Фрашент ШпсИП, величиной приблизительно 2500 п.о., свидетельствует об одном сайте встраивания генного блока и о количестве копий, не более двух. При гидролизе по ЕсоЕ! выявлен

А

EcoRI Taql (122) (198)

(PvuII) Ш

pAOR

Taql (126)

PetX (219)

Sari (307)

Taql (613)

(PvuII) (1091)

TK HSV I

промотор

RU5 фрагмент 559-359 и.о. генома BJIK

сигнал поян-А rciiaTKHSVI

(266)

pAOR

(448)

44 58

' MW _______rMW — ш/ ш

^241 _ ^ /6241

v3033

'3033 ""**

им /519

в, /3033 .679 •

. -3 V/¡ <

1 '245 f.f- í . i

O

ta

• I

../-257 /519

1 2 3 4 1 2 3

Рнс.1 Фюическая характеристика airru RUS acPIIK трансгсна. А. На схеме мюероииьыироващгого PvuII фрагмента pAOR укапаны положим сайтов узиавшшя рестрикццошшх эндоиуклеаз и проймеров, используемых для сопряжашой обратпотраисхршщиоиной и полныераэпой цепной решения (prl. и prll.). 44, 53 - результаты блотшбрцдападяошюго' ышлгаа ДНК первнчнотрансгашых кролпхов с соответствующими лабораторными номерами. В дорожках 1, 2, 3 и 4 - ДНК, гидролнэовшшая по Taql, MI, EcoRI и HindlII соответственно. Положения маркеров мадекулярпых лесов в п.с показаны справа от каждой фотографии.

фрагмент, соответствующий ожидаемому при мультикопийпом встраивании. Таким образом, наиболее вероятно, что антисмнеловой генный блок встроен в геном животного в одном сайте в двух копиях. Однако при гидролизе по РэИ, против ожидаемого, фрагмента 1091 п.о. выявлен другой, размером около 6000 и.о.. что, как ш предполагаем, можно объяснить модификацией части сайтов Рзи в блоке. Впрочем, если такое предположение неверно, нельзя исключить однокопийности фрагмента.

Анализ ДНК трансгенного кролика № 58 (рисЛ.58) по сайту TaqI показал наличие фрагментов величиной около 415 и 600 п.о., что соответствует ожидаемым при мультикопийпом встраивании генного блока. Два других фрагмента размером более 700 п.о., вероятно, представляют из себя фланкирующие мультикопийный тандем участки генного блока, связанные с хромосомальной ДНК. При Н1п(П11 анализе выявлен один фрагмент величиной более 12000 п.о., следовательно инъецированный фрагмент, в количестве копий не более 12. встроен в одно положение в геном кролика. Наличие РзН п ЕсоЫ фрагментов величиной около 1000 п.о. подтверждает ыультикопийность встроенного антисмыслового генного блока. Второй фрагмент, обнаруженный при гидролизе по РэН, имеет величину приблизительно 3100 п.о. и, вероятно, соответствует той части мультикопийного блока, которая связана с хромосомальной ДНК еивотного. При гидролизе по ЕсоЫ дополнительно к теоретически ОЕвдаемым фраплентам выявлен фраплент величиной около 1300 п.о.. Проводятся исследования, генного блока для выяснения причин появления дополнительного фрагмента. Однако, с нашей точки зрения, нашила ожидаемых фрагментов при гидролизе по Taq I. РэН п ЕсоМ свидетельствует о целостности, по крайней мере, часта копий в мультикопийпом блоке.

В таблице I представлены результаты блотгибридизационного картирования трансгена, дополненные денситометрическим анализом радиоавтографов и анализом наследования трансгенов. Приведенные данные позволяют оценить копийность трансгена, его целостность и количество положений его встраивания у первично-трансгенных животных.

Таблиц? I. Молекулярно-генетическая характеристика трансгенов.

Характеристика трансгена Лаб.номер первичнотрансгенного кролика

9 14 44 58

Кол-во копий по рез-там физ.картирован я I не более 3-х не более 2-х не более 12-ти

Кол-во копий по данным денситометрш 2-3 25 I 6

Кол-во сайтов интеграции по данным физ. картирования I I I I

Кол-во сайтов по анализу наследования н.о. н.о. I I

Гипотетически вероят ные перестройки Делеция 100 п.о . Метилирование или микроделеция в части фратаентов

н.о. - не определяли

1.3. Особенности наследования трансгенов

Блотгибридизационный анализ гидролизованной по Рэ^ ДНК трансгенных Р1, "Е2, РЗ и Р4 потомков от скрешшания , первично-траясгенного самца Я 58 с нетрансгенными самками (линия названа ТШ,58) позволил выявить единственное (из 89-ти исследуемых) хшвотное с изменением в генном блоке. На рисунке 2. А представлены данные сравнительного йлотгпбридазашюнного анализа

ю о

Ol

5

о

сз

а

-О

t.:,

i

fcV.

S

а

TRL58 Дик. тип 740

о-

КЗ А

-U

ГЭа

3 gs

31 Si

a

y

Дик. тип TRI-44

TRL58

гвдролизованной по PstI ДНК из ушек трансгенных PI потомков одного помета (лабораторные №И 740 и 748) от скрещивания первично-трансгенного самца К 58 с нетрансгенной самкой. В дорожке № 3 представлены характерные для потомков первично-трансгенного животного № 58 блотгибридизационные фрагменты. В геноме животного № 740 появился дополнительный фрагмент величиной около 900 п.о. Наиболее вероятной является делеция величиной приблизительно 100 п.о., произошедшая в части копий мультикогойного блока.

Таблица 2. Число трансгенных самок и самцов в четырех поколениях потомков первично-траксгенного самца Jé 58 и нетрансгенных самок. .

п 0 т 0 . м с т в 0 Кол-во кроликов и возраст к моменту анализа (в неделях)

Родившихся в результате скрещиваний 0 Анализированных /% от родившихся 2-4 Трансгенных /% от анализированных 4-6 Половозрелых трансгенных/% от анализированных . 12-16

самцов самок самцов самок самцов самок самцов самок

F1 144 139 113/78? 76/55% 26/23% 4/5% 11/10% 0/0%

F2 99 90 84/85% 67/7435 22/26% 2/3% 11/13% 0/0%

F3 63 60 57/9055 41/68% 14/25% 2/2% 8/14% 0/0%

F4 67 64 61/91% 42/66% 12/20% 1/2% 7/12% 1/2%

Всего 373 353 315/85% 226/64 74/20% 9/4% 37/12% 1/0,4%

Отно-шшие /Пл 1,05 1,39 8,22 37,0

Символами т и 1ш обозначены скдцы и свшш соответственно.

В ДНК потомков первого и второго поколения, полученных от скрецивания первично-трансгенной сажа В 44 с нетрансгешшма

самцами, а также потомков PI от скрещивания первично-трансгенного самца № 58 и первично-трансгенной самки № 44, изменений генных блоков не выявлено. Дополнительный выборочный анализ шести трансгенных потомков TRL 58, и трех TRL 44 , проводимый по рестриктазам Taql, EcoRI и Hindlll, показал неизменность генного блока при наследовании.

При анализе наследования трансгена в линии животных TBL 58 в поколениях от PI до F4 от скрещивания первично-трансгенного самца М 58 с самками дикого типа обнаружено отсутствие половозрелых трансгенных животных женского пола вплоть до поколения F3 (таблица 2). Однако в поколении F4 все же было зарегистрировано появление одной трансгенной самки. Из представленных в таблице 2 данных следует, что трансгенные по антиВЛК асРНК гену самки погибают, не достигнув половой зрелости, гораздо чаше, чем самцы того же генотипа.

1.4. Линии клеток трансгенных лимфоцитов.

Для более 'детального исследования молекулярно-биологических механизмов устойчивости животных к ВЛК из лимфоцитарной фракции периферической крови трансгенных животных с лабораторньаи К№ 64 и 802 (лопуляяцш животных TRL 58 и TRL 44, соответственно) были получены краткосрочные культуры лимфоцитов, а из материала от кролика J5 500 (TRI 44 х 58) была установлены лимфоидаые линии, прошедшие более ста пассией (работа проведена сотрудником лаборатории генной Енаенёрпз ВНИИ СБ Т.И. Пономаревой). В задачи настоящей работы вгодзя анализ стабильности трансгена при пассажах культур. Ш ргззргха 2.Б -видно, что трансген во всех линиях и клоках остается сеазмешшм.

■^T i'i.Mg'ailyi/l......i ■¡p;»iiyin«i||UiMi;n |и,|||ц!1|«....г|р.да.||!.>1!? It!). Iiyjiu ц^уу

183 138

- 45

1 2 3 4 5 б 7 в 9 10 11 12 13

Рис. 3. Экспрессия RU5 ген» в лимфоцитах трансгениых кроликов. Тсугалшую фракцию РНК из лимфоцитов кролнкоа обрабатывали ДНК-зой и анализировали последовательно методом обратной транскрипции в присутствии прямого праймера и после добавления обратного праймера - методом полимсраэиоП ценной реакшш. В дорожках 2, 4 и 12 представлены ОТ-ПЦР РНК линий TRL44, TRLJ8 и TRL44XÍ8 соответственно. В дорожках 1, 3 и 11 - РНК тех-же линий подвергнутая только ПЦР (Koirrpojui 1Ш лрнмесь ДНК). В дорожке 5 представлена ОТ-ПЦГ РНК вегралегашого кролика (отрицатели 1ЫЙ контроль). В дорожках б, 7 а 13 - продукт ОТ-ПЦР РНК лшшй TRL44, TRL58 и TRL44x58, обработанный ресгрнкцнокной эндоиуклеазы Narl (доказательство специфичности ПЦР фрагмента, см. рис. 1). Продукт амплификации плазмиды рЛОЯ (дор. 8) гидролизованныП по Narl (дор. 9) предстаалеиы о качестве положительного контроля. В дор. 10 - маркеры молекулярных весов (mapomaoMimaa AJul плдзмндд pOUM3Z). Величины ОТ-ПЦР (¡¡ропвид п продуктов его гидрат cía но Ntrl обозначены в нарах иуккотидов справа.

1.5. Экспрессия асРНК анти ГО5 генов в лимфоцитах трансгенных кроликов.

Наличие антисмысловой РНК, кодируемой геном RU5 асРНК, в лимфоцитах трансгензых кроликов линий TRL44, TRL58 и TRL44x58 доказывали методом ОТ-ПЦР, как описано в подписи под рисунком 3, на котором показаны результата эксперимента.

При использовании затравок prl и prll для ОТ-ЧХР (положение в трансгене см. рис. I.A) мы ожидали получить амплификацию фрагмента величиной 183 п.о. В соответствии с физической картой RU5 области фрагмент содержит са"т узнавания для рестрикционной эндонуклеазы Narl, гидролизующей продукт амплификации на два фрагмента величиной 45 и 138 п.о. Это обстоятельство мы использовали для доказательства специфичности продукта ОТ-ПЦР. Из рисунка 3 следует, что в лимфоцитах трансгенных кроликов присутствует асРНК, кодируемая грансгеном.

1.6. Гематологический и иммунологический анализ трансгенных кроликов, зараженных ВЛК.

Динамика изменения гематологических параметров (абсолютные количества лейкоцитов периферической крови в I мкл и процентное количество лимфоцитов в лейкоформуле) трансгенных и нетрзнсгенных кроликов после заражения ВЛК представлена на рисунке 4.А. и 4.В. соответственно. Работа выполнена совместно с группой сотрудников ВШИ ветеринарией микробиологии и вирусологии под руководством Гевондяна B.C.

Прежде всего нуяно отметить, что количество лейкоцитов в периферической крови трансгенных лшвотиы виз зависимости от' проводимых на:.м экспериментов всегда оказывалось несколько выше.

в

и 5

80) 75 70 65 60

£ ^ о •& 55 •в- р

£

«ч ё

О 5 Недели

10 15 20 25 после заражения

С

с-

i*

Е 3

а *

I?

25! 20 15 10

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Недели после заражения

4000 3000 2000 1000 0

0 4 8 12 16 20 24

1 кдели после заражения

50 45 40 35

о

2 12 е

а ш

соО X

8

«45

й 40 а

5 35 §,30 = 25

Б 20 5,5 » 10 э- 5

£ о

5 10 15 20 25 Недели после заражения

0 5 10 15 20 Недели после заражения

0 4 8 12 16 20 24

Недели после заражения

Рис. 4. Динамика изменений гематологических и иммунологических параметров транстошых (О) н нетрзнсгскимх (□) кроликов, зараженных ВЛК. На графиках А и В кажаая точка соответствует усредненному параметру для группы из 3-х животных. С. Индекс стимуляции отражает процент тралефоршгровашшх лимфоцитов и опытах по бластгрансфориашш нндуцнрованной фнтогемагтлютшшнои. V). Радиоактивность Н1 , отражая относительное количество делящихся лимфоцитов, характеризует степень пх спонтанной пролиферации. Е. и К. р24 и гр51 - внутренний и поверхностный антигены ВЛК соответственно. Неделя 0 соответствует периоду до згр£**иня.

4

чем у контрольных нетрансгенных кроликов. Например перед заражением у трансгенных животных оно составляло в среднем для группы из трех животных П,2хЮ 3/мкл. а у нетрансгенных - 8,8 х 103/мкл. Незначительно увеличенное количество лейкоцитов у трансгенных животных мы наблюдали в нескольких несвязанных друг с другом опытах. Это обстоятельство, с натай точки зрения, является особенностью линии животных TEL 58. На рис. 4.А. представлены приведенные к точке "О недель" результаты исследс^ания динамики изменения количества лейкоцитов у трансгенных и нетрансгенных животных после заражения их ВЛК.

Анализ динамики изменения коли«е^тва лейкоцитов у животных дикого типа показывает, что через неделю после заражения их число уменьшилось (в среднем в группе) почти в 1,5 раза т.е. до 5,3 х 10 /мкл. (процент лимфоцитов при этом остался ггозктически неизменным). Через 2 недели после заражения наблюдали увеличение количества периферических лейкоцитов и далее, после снижения в период- с 4-ой по 6-ю-неделю, их число, вновь увеличилось, не достигнув, впрочем, начальных значений и впоследствии существенно не менялось в течение 6-ти месяцев наблюдений.

Количество зрелых лимфоцитов у трансгенных и нетрансгенных животных до заражения ВШ было приблизительно одинаковым и составляло 51 - 9%. После заражения в крови нетрансгенных кроликов процент лимфоцитов уменьшился (неделей позже уменьшения количества лейкоцитов) и на второй неделе достиг опасного уровня: 37% против 51% до заражения. Начиная о третьей недели, зафиксирован значительный рост (до 65-70%) количества лимфоцитов в лейкоформуле зараженных животных дикого типа. До конца наблюдения (24 недели) количество- лимфоцитов существенно не • менялось.

Т7

В то же время гематологический анализ трансгешшх кроликов показал отсутствие заметной реакции на заражение ВЖ. Ни в количестве лейкоцитов, ни в проценте зрелых лимфоцитов в период с I по 3 неделю после заражения и позже заметных изменений, по сравнению с теш же, но црединфекционными параметрами, не наблюдали.

Восстановление обычного состава лейкоформулы у нетрансгенных животных на 3й неделв после заражения достаточно обоснованно коррелирует со значительной, почти 50%, стимуляцией спонтанной пролиферации лимфоцитов в этой группе животных, тогда как у трансгенных животных этот индекс даже падает (рис.4.В.). Заметные отличия мевду трансгешшми и нетрансгешшми животными в уровне сг. читанной пролиферации и индуцированной бласттрансформацш лимфоцитов (рис.4.С.)легко могут быть объяснены хорошо известными иитогенными свойствами ВЛК. На лимфоцитах трансгенных кроликов, зараженных ВЛК, показан практически тот же самый уровень спонтанной пролиферации, что и до инфекции. А вот на лимфоцитах нетрансгенных кроликов в период от 1-ой до 3-ей недели после заражения наблвдали почти 50%-е снижение спонтанно пролиферирувдих клеток. Наиболее простым объяснением различий в спонтанной пролиферации лимфоцитов трансгенных и нетрансгенных кроликов, с нашей точки зрения, является подавление репликации ВЛК в трансгенных лимфоцитах. Такая интерпретация подтверждается результатами исследования бластрансформации трансгекных и нетрансгенных лимфоцитов индуцируемой фитогемагглютинином (рис.4.С.). Сходный "идекс стимуляции трансгенных и нетрансгенных лимфоцитов фитогемагглютинином подтверждает способность трансгенных лимфоцитов к трансформации, вызываемой митогеном. Таким образом, сниаешшй уровень спонтанной пролиферации

лимфоцитов зараженных трансгенных животных (рис.4.Б.) с нашей точки зрения, обусловлен тем, что ген R1J5 асРНК подавляет репликацию ЕЛК и, следовательно, его мутагенный потенциал.

Низюте уровни антител к вирусным белкам р24 и gp51 (рис 4) у трансгенных животных, в сравнении с кетрансгекными, обнаружены на протяжении всего периода наблюдений, за исключением первой недели. Титр анти р24 антител (рис. 4.Е.), определяемый в период от I - й недели до 2 - х месцев после зарыкени в крови трансгенных животных, не превышал уровня 400 - 100, а у животных дикого типа оказался приблизительно на порядок выше и составлял 4000 - 1000 (титры антител приведены в разведениях образцов крови). К концу опыта (6-ой месяц) в крови трансгенных животных практически не наблюдали анти р24 антител, тогда как в крови живогяыых дикого типа (при падении титра, начиная с З-^о месяца, все же наблюдали значительный уровень антител против р24 вирусного белка. Сходную картину наблюдали при исследовании титра антител к gp51 у трансгенных и нетрансгенных кроликов (рис.4.Р.). Титры анти gp51 антител у трансгенных животных оказывались ниже, чем у нетрансгенных, как на раннем, так и на позднем этапе после заражения, хотя отмечены индивидуальные различия в пределах групп.' Исходя из анализа уровней антиВЛК антител, можно предположить, что ВЛК способен лишь ограниченно реплицироваться в

лимфоцитах трансгенных кроликов. Иными словами инфекция у ♦

трансгенных животных протекает в абортивной форме.

1.7. Особенности развития иммунодефицита у трансгенных кроликов, зараженных ВЛК.

Хорошо известно, что у инфицированных ЛЯК животных состояние приобретенного иммунодефицита устанавливается на поздних стадах

<73

5 25

и, я ал О

20

15-

10

Лаб.номера кроликов Зараженные Незаражашые

Нетрансгенные 10 а 741 (□) 6 (о)

АнтиВЛК трансгенные 740 (•), 748 (») 742 (.)

Анти Адсио трансгенные 5 (») -

о IV • • ™-- в "~ТГ-

й \ а о т

\ V ' ■

0

20

—I—

40

60 80 100 120 Дни после заражения

Рис. 5. Динамика изменения татра предсущссгвукицнх ытлгапскнрующах итггел у трапсгеш-дх и пстраисгешшх кроликов, наряженных ВЛК. В таблице сверху указаны лабораторные номера опъгшых и контрольных, трансгашых ц нехрансгеиных кроликов. В скобках показаны графические ашволы, которые на графиках обозначают точки кривых получашъя па соответствующих жявотиых.

инфекции. Недавно Гевондян и др. показали, что по снижению титра предсуществующих антител можно доказать ослабление иммушого ответа телят, инфицированных ВЛК на ранних стадиях инфекции. В нашей работе мы использовали это явление, которое фиксировали по реакции связывания комплемента с агглютинирующая! антителами против широко распространенных возбудителей микробных инфекций кроликов (Shigella, Salmonella, Clebsiella).

На рисунке 5 показано, что начиная с первой недели после заражения ВЛК. нетрзнсгенных кроликов J0S 741, 10, титры антител против Salmonella падают и достигают "плато" к 50-му - 60-му дню. У незараженного животного дикого т*да Я 6 гак жэ, как у зараженных трансгенных ()£>« 740, 748), падение титров агглютанируюдих антител к сальмонелле не наблвдзли. Такие же результаты были получены с агглютинирующими антителр'ли против Shigella и Clebsiella. В среднем зафиксировано 3-х - 4-х кратное снижение титра агглютинирующих антител у животных дикого типа, тогда как у трансгенных снижения титра не обнаружено. Представителя линии антиадено трансгенных кроликов № 5 в этом эксперименте использовали в качестве контрольного животного. Динамика изменения титра агглютинирующих антител у этого животного не отличалась от полученной на нетрансгенных животных 741 и 10. Из этого можно сделать вывод, что к изменениям приводит не любой, а именно, антиВЛК трансген.

Таким ' образом, из . анализа ряда гематологических н иммунологических параметров можно сделать вывод о том, что заболевание, вызванное экспериментальным заражением ВЛК, у трансгенных кроликов в отличие от нетрансгенных протекает в слабой форме, этот эффект вызван внутриклеточным информационным • иммунитетом, обусловленным антиВЛК асРНК трансгеном.

Вывода

1.Подучены первично-трансгенные кролики с генами антисмысловых РНК против Ш5 области генома вируса бычьего лейкоза.

2.Выявлены особенности интеграции и амплифиацш трансгенов у первично-трансгенных животных.

3. На основе первично-трансгенных животных получены линии трансгенных кроликов с разной хромосомальной локализацией трансгенов асРНК против Ш5 области (в том числе содержащих два трансгена с разной локализацией в геноме).

4. Показана высокая стабильность наследования анти-Ш15 трансгенов

у кроликов на протяжении, по крайней мере, 4-Х генераций.

)

5. В одной из полученных линий животных TRL58 практически отсутствовали грансгенные самки, погибающие вскоре после рождения.

6. Доказана экспрессия гена антиВЛК антисмысловой РНК в лимфоцитах трансгенных кроликов.

7. Впервые в экспериментальных условиях ln vivo по ряду гематологических и иммунологических тестов продемонстрирована повышенная устойчивость трансгенных кроликов с генами антиВЛК асРНК к заражению вирусом лейкоза коров.

8. Экспериментальная инфекция трансгенных кроликов высокими дозами лимфоцитов лейкозных коров носила выраженный абортивный характер.

Благодарности.

Автор выражает благодарность сотрудникам Биотехцентра РАСХН, Ленинские горки (директор - чл. корр. РАСХН Прокофьев М.И.) за активное сотрудничество при выполнении работы.

Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю - профессору Тихоненко Т.И. за построение лошкн работы и решающую помощи в интерпретации результатов.

Автор выражает также большую благодарность своим коллегам -сотрудникам лаборатории генной инженерии ВНИИ СБ: Пономаревой Т.И., Парфеновой Т.М., Борисе!¡ко A.C., Шгтаметову Д.М. и другим за активную помощь в выполнении работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертаций.

1. Баурнн., В.В.. Мирошниченко О.И., Захарченко В.И., Прокофьев

М.И., Эрнст Л.К., Тихоненко Т.И. "Трансгенные кролики с геном

асРНК против RU5 LTR области генома вируса лейкоза коров", t

Биоинзхенерия сельскохозяйственных животных. / Под ред. Эрнста Л.К. М.: РАСХН, 1995. С. 181-191.

2. Пономарева Т.И., Пврфенова Т.М., Воскресенская. Е.П., Баурин В.В.. Тихоненко Т.И., "Лимфоидная линия RSV-asRI из периферической крови трансгенного кролика, несущего гены антнсмысловой РНК к R.U5 области генома вируса лейкоза коров", Биоинженерия сельскохозяйственных животных. / Под ред. Эрнста Л.К. М.: РАСХН, 1995. С. 181-191.

3. Зеливянсский С.В., Карпов В.А., Баурин В.В.. Мирошниченко О.И., Тихоненко Т.И. "Изучение условий расщепления РНК вируса лейкоза коров in vitro рибозимом, направленным против длинных концевых повторов, / 1994, Молекулярная генетика, т.З., стр.23-26.

4. Kozireva, S., Konicheva, V., Murovska, М., Baiirin. V., Shayakhmetov D., Prokoijev M. and Tikchonenko, T. Investigation of an antisense RNA gene effect on the reproduction of the Bovine Leukaemia Virus in vivo. Transgenics-2:99-109 (1996).

5. Miroshnichenko О. I., Ponomareva Т. I., Borisenko A. S., Baurin V. V.. Voskreseiiiikaya E. V., Tikchonenko T .1. Ingibition of viral reproduction by antisense RNA. // VIII - th International Congress Virology, Berlin, 1990, Abstracts, p. 324.