Совершенствование биотехнологических и молекулярно-генетических методов при изучении генов, определяющих устойчивость к заболеваниям и молочную продуктивность

Белов, Денис Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование биотехнологических и молекулярно-генетических методов при изучении генов, определяющих устойчивость к заболеваниям и молочную продуктивность
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование биотехнологических и молекулярно-генетических методов при изучении генов, определяющих устойчивость к заболеваниям и молочную продуктивность"

На правах рукописи

БЕЛОВ Денис Евгеньевич

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРИ ИЗУЧЕНИИ ГЕНОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАБОЛЕВАНИЯМ И МОЛОЧНУЮ ПРОДУКТИВНОСТЬ

03.00.23.- биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь 2006

Работа выполнена в лаборатории иммуногенетики, биохимии и общей химии отдела биотехнологии Ставропольского научно-исследовательского института

животноводства и кормопроизводства

Научный руководитель:

доктор сельскохозяйственных наук Чижова Людмила Николаевна

Официальные оппоненты: доктор с.-х. наук, академик РАСХН

Петрова Людмила Николаевна

доктор биол. наук, профессор Майский Виктор Григорьевич

Ведущая организация:

ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.В АВИЛОВА, г. Москва

Защита диссертации состоится 29 ноября 2006 года в 14 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина д. 1, корпус 2, аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина д. 1, корпус 1.

Автореферат разослан 27 октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биол. наук

Т.И. Джандарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований

В структуре инфекционной заболеваемости КРС лейкоз занимает лидирующее место. Это заболевание, этиологическим агентом которого является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), наносит значительный экономический ущерб животноводству.

На сегодняшний день возможность инфицирования человека этим вирусом не доказана, однако имеются данные о том, что ВЛКРС (BLV — bovine leukemia virus) имеет эволюционное родство с Т- лимфотропными вирусами человека I и II типов (HTLV I, HTLV II) и некоторую степень гомологии с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Необходимо отметить, что все вышеперечисленные вирусы относятся к одному семейству — ретровирусы (retroviridae).

В последние годы установлены случаи, когда вирусы, ранее от животных не передававшиеся человеку, приобретали такую способность. Например, возбудителем тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС - атипичная пневмония) - Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), является мутантный штамм коронавируса, выделенный от азиатских виверр. Показательной также в этой связи является ситуация с вирусом гриппа птиц (influenza virus). Из множества штаммов этого вируса один — H5N1 — передается человеку, причем зачастую с летальным исходом.

ВЛКРС зафиксирован во всех районах Ставропольского края. По данным диагностики с использованием реакции иммунодиффузии (РИД), на сегодняшний день инфицированность составляет: в Арзгирском, Нефтекумском, Предгорном районах - до 10%; в Апанасенковском, Ипатовском, Курском, Степнов-ском, Советском, Туркменском районах - до 20%; в Андроповском, Александровском и Новоселицком районах - до 30%; в Благодарненском, Буденновском, Георгиевском, Грачевском, Изобильненском, Кочубеевском, Красногвардейском, Кировском, Левокумском, Минераловодском, Новоалександровском, Петровском, Труновском, Шпаковском районах — более 30% от общего поголовья КРС.

В настоящее время диагностика лейкоза КРС проводится с использованием реакции иммунодиффузии (РИД) и гематологическим методом (ГЕМ). Однако они не позволяют выявить заболевание на ранних стадиях. Поэтому представляло интерес изучить возможность использования метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в данном направлении.

Нет полной ясности в формировании иммунного ответа на ВЛКРС. В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают исследования с использованием биотехнологических и молекулярно-генетических методов, направленные на изучение механизма генетической устойчивости, предрасположенности к лейкозу КРС. Для использования методов ПЦР и полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), в наших исследованиях потребовалась их модификация с последующей отработкой технологических параметров.

Работа выполнена в соответствии с планами научных исследований Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства по теме, зарегистрированной под № 01. 200.110987 гос. регистрации. Цель и задачи исследований

Цель диссертационной работы — установить оптимальные технологические параметры биотехнологических и молекулярно-генетических методов с целью диагностики ВЛКРС и изучения полиморфизма генов ВоЬА-ОЯВ3.2 и каппа-казеина.

В связи с этим программа исследований включала решение следующих

задач:

- опытным путем установить концентрации компонентов, входящих в состав ПЦР, и температурно-временные режимы ПЦР для обеспечения максимального выхода и специфичности ПЦР-продукта;

- определить сравнительную эффективность диагностики лейкоза КРС методами ПЦР, РИД, ГЕМ;

- усовершенствовать анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов при изучении ДНК-полиморфизма второго экзона гена ЭИВЗ главного комплекса

гистосовместимости; выявить животных, чувствительных и устойчивых к инфекции, вызываемой ВЛКРС;

- установить взаимосвязь полиморфизма генов ВоЬА-ОЯВ3.2 и каппа-казеина с молочной продуктивностью КРС;

- установить экономическую рентабельность от внедрения в практику методов молекулярной биологии.

Научная новизна исследования ^

Усовершенствован метод ПДРФ при определении ДНК-полиморфизма гена ВоЬА-ОЛВ3.2, с использованием дополнительной рестриктазы ВвИШ. Обоснована эффективность использования усовершенствованного ПДРФ-метода при изучении механизма клеточного иммунитета на ВЛКРС.

Предложен модифицированный метод выявления ДНК-провируса ВЛКРС на основе ПЦР. Показана целесообразность использования данного метода в диагностике ВЬУ. Установлены оптимальные температурно-временные режимы и концентрации компонентов, входящих в состав реакции при амплификации участков исследуемых генов.

Проведен анализ влияния аллельных вариантов гена ВоЬА-ЭКВ3.2 и каппа-казеина на уровень молочной продуктивности животных. Установлена статистически достоверная взаимосвязь между генотипами по ВоЬА-БКВ3.2 и уровнем молочной продуктивности. Доказано, что уровень экспрессии гена каппа-казеина статистически достоверного влияния на молочную продуктивность не оказывает.

Практическая значимость и реализация результатов исследований Доказано, что усовершенствованный метод рестриктного анализа обладает высокой разрешающей способностью при исследовании полиморфизма гена ВоЬА-011В3.2. Данное усовершенствование позволяет с высокой точностью выявлять животных, чувствительных к гематологической стадии лейкоза.

Доказана возможность выявления инфицированных животных на ранних стадиях заболевания методом ПЦР, до образования у них антител к ВЛКРС. Результаты исследований внедрены в племенных хозяйствах Ставропольского

края (акт б/н от 14.10.2005 г.) и в лабораторной практике ГНУ СНИИЖК (акт б/н от 10.09.2005 г., акт б/н от 24.03.2006 г.). Внедрение в хозяйствах позволило сократить прямые потери, связанные с выбраковкой животных по причине лейкоза. В лабораторной практике произошло снижение затрат на проведение исследований и повышение точности интерпретируемых результатов.

Авторами разработаны, изданы и внедрены «Методические рекомендации по применению методов ДНК-диагностики в селекции КРС» в племенных хозяйствах Ставропольского края (акт б/н от 06.05.2006 г.). Рекомендации рассмотрены и утверждены на ученом совете ГНУ СНИИЖК 26.12.2005 г., протокол №5.

На защиту выносятся следующие положения

1. Действие ВЛКРС на организм зависит от генетических особенностей животного.

2. Предлагаемые технологические параметры ПЦР позволяют применять данный метод для диагностики ВЛКРС на ранних стадиях инфицирования животных.

3. Усовершенствованный метод рестриктного анализа увеличивает степень точности выявления животных, чувствительных к лейкозу.

Л: Внедрение в практику животноводства биотехнологических и молекуляр-но-генетических методов позволяет повышать рентабельность производства.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на региональной конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики» (Ставрополь, 2005 г.), на международной научно-практической конференции «Животноводство -продовольственная безопасность страны» (Ставрополь, 2006 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Здоровые города: роль межсекторального сотрудничества в сохранении и укреплении здоровья населения» (Ставрополь, 2006г.). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. . ,

Структура и объём работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, предложений производству, списка использованных источников, включающего 167 работ, в том числе 80 зарубежных авторов, и приложений. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 11 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в 2003-2006 гг. в хозяйствах Краснодарского, Ставропольского краев и Ростовской области. Для исследования были отобраны 185 голов КРС. Группу I составила голштинская порода КРС п=117. Группа II п=48 представлена следующими породами: красной степной, голштинской черно-пестрой, голштинской красно-пестрой, с различной долей кровности. В группу III вошли племенные быки, использующиеся при искусственном осеменении в племенных хозяйствах Ставропольского края.

Для постановки РИД использовали «Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота» (ТУ 10-19-442-87), согласно рекомендациям, прилагаемым к набору. Учет и оценку результатов реакции проводили, опираясь на «Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота» № 13-7-2/2130 от 23.08.2000 г.

Гематологический анализ проводили согласно «лейкозному ключу» ГОСТ 25382 - 82.

Выделенную тотальную ДНК исследовали методом ПЦР на присутствие ДНК-провируса лейкоза. При выборе праймеров нами были использованы литературные данные об олигонуклеотидах к генам Gag (Y. Yoshinaka, I. Katon, T. D. Copeland, 1986) и Env (J. Kuzmak, J. Grundboeck, B. Kozachinska, 1993).

Изучение полиморфизма второго экзона гена BoLA-DRB3 осуществляли методом ПЦР-ПДРФ по методике, описанной в 1992 г. авторами M. J. Т. Van Eijk, J. A. Stewart-Haynes, H. A. Lewin, дополненной в 1995 г. группой ученых: А. Gelhaus, L. Schnittger, D. Mehlitz, R. D. Horstmann, C. G. Meyer, и в 1999 г.

J. С. Maillard, С. Renard, P. Chardon, I. Chantai, A. Bensaid. В нашей работе методика, указанная выше, была модифицирована с целью повышения точности интерпретируемых результатов.

Для определения аллельных вариантов гена каппа-казеина использовался метод, предложенный D. Zadworny, U. Kuhnlein (1990), с собственными модификациями параметров ПЦР.

Оптимальные концентрации компонентов и температурно-временные режи-' мы ПЦР подбирались экспериментальным путем.

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ Разработка схемы исследований

Перед началом исследований были определены основные этапы работы, к которым авторы относят:

- исследование ингибирующих свойств антикоагулянтов на ход ПЦР;

- подбор оптимальных температурно-временных режимов ПЦР для синтеза участков исследуемых генов;

- определение оптимальной концентрации реагентов ПЦР для синтеза участков исследуемых генов; -

- совершенствование ПДРФ анализа при установлении генотипов по BoLA-DRB3.2;

- сравнение методов диагностики лейкоза и оценка эффективности ПЦР;

- анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3.2

- анализ полиморфизма гена каппа-казеина

- изучение влияния полиморфизма гена BoLA-DRB3.2 на переход стадии виру-соносительства в гематологическую стадию лейкоза;

- изучение влияния полиморфизма гена BoLA-DRB3.2 на уровень молочной продуктивности;

- изучение влияния полиморфизма гена каппа-казеина на уровень молочной продуктивности;

Исходя из основных этапов была разработана схема исследований (рис. 1).

Рисунок 1 - Схема исследований

Исследование ингибирующих свойств антикоагулянтов на ход ПЦР

Для консервации проб крови в хозяйствах традиционно используются такие антикоагулянты, как гепарин, цитрат натрия и динаггриевая соль этилен-диамин-Ы, N. М, Ы'-тетрауксусной кислоты (ЭДТА). Однако данные вещества по-разному влияют на ход ПЦР, в связи с чем были изучены ингибирующие свойства этих веществ. Результаты эксперимента представлены на рисунке 2.

100-1

Рисунок 2. Влияние антикоагулянтов на выход амплификата

Примечания: колонки 1,2,3,4, 5 соответствуют концентрации: гепарина — 0,05 u/ml, 0,lu/ml, 0,15 u/ml, 0,2 u/ml, 0,25 u/ml, ЭДТА - 0,25 mM, 0,5 тМ, 0,75 тМ, 1 тМ, 1,5 тМ, цитрата Na - 0,25 шМ, 0,5 шМ, 0,75 mM, 1 тМ, 1,5 тМ.

Установлено, что при содержании гепарина в реакционной смеси от 0,2 u/ml ПЦР не идет. ЭДТА начинает ингибировать ПЦР при концентрации 0,5 шМ и достигает максимума при 1,5 тМ. Цитрат Na показал себя слабым ингибитором: в концентрации 1,5 шМ он ингибировал ПЦР лишь на 10%, что является статистически недостоверным.

На основании полученных результатов, рекомендовано при исследовании образцов крови методом ПЦР в качестве антикоагулянта использовать цитрат Na.

Подбор оптимальных температурно-временных режимов ПЦР

Для увеличения точности и специфичности ПЦР необходимо было определить оптимальные значения температурно-временных параметров следующих стадий: денатурации (Тд), гибридизации прайм еров с денатурированной ДНК-матрицей (Тг) и элонгации (Тэ). Оптимальные температурно-временные

параметры ПЦР, установленные экспериментальным, путем представлены в таблице 1.

При определении Тг установлено, что высокие температуры увеличивают специфичность реакции. Однако при Тг выше определенной критической отметки (величина индивидуальная для каждой пары праймеров) выход ампли-фикатов резко уменьшался. Напротив, при снижении Тг происходило увеличение выхода ПЦР продукта, но вместе с тем наблюдалась неспецифическая амплификация. В ходе исследования влияния Тэ на ход реакции, экспериментально было установлено, что при амплификации участка вируса лейкоза с праймерами ENVI и ENV2 оптимальная Тэ = 74 ± 0,2 °С. При регламентированной температуре в 72 ± 0,2 °С выход амплификата уменьшался. Временные параметры стадии элонгации находились в пределах от 20 до 180 сек. Они зависели от этапа ПЦР, длины синтезируемого фрагмента и соотношения пурино-вых и перемидиновых оснований. В отличие от традиционной методики ПЦР, проводили 5 циклов преобразования одноцепочных молекул ДНК в двухцепочные.

Таким образом, с использованием предложенных температурно-временных параметров удалось добиться максимального выхода специфичного ПЦР продукта.

Определение оптимальной концентрации реагентов

Для обеспечения максимального выхода и специфичности амплифици-руемого продукта подбирали концентрации ДНК, ионов Mg2+, дезоксинуклео-зидтрифосфатов, праймеров и полимеразы в инкубационной смеси с таким расчетом, чтобы получить максимальный выход специфичного ПЦР-продукта. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Вариации диапазонов подбираемых концентраций составляли: каждого праймера от 10 до 40 пМ, Трис-HCl от 50 до 70 мМ, сульфат аммония от 15 до 17 мМ, Tween 20 от 0,1 до 0,5 %, MgC12 от 1 до 5 мМ.

Таблица 1 - Оптимальные параметры амплификации для различных участков исследуемых генов

Область гена Праймер5'- 3' Условия реакции / \ "С сек \ V

Название стадий реакции

Название Последовательн I ц II ц III ц IV ц V ц

ость д д Г Э д Г Э Г э э

ВЛКРС ENV EN VI aat gag cct tgc tgt ttc ctg с 95 1 95 60 62 40 74 3 95 58 74 40 58 74 5 74 1

367 п.н. ENV2 ccc gtc aaa ccc gat tac ate a 180 40 20 20 40 20 40 60

ВЛКРС GAG GAG1 ata tet gaa ggg aat cgc aac с 95 1 95 64 72 40 95 62 72 40 62 72 50 72 1

364 п.н. GAG2 egg agt cct aag gaa ccc att a 180 60 40 3 30 30 40 40 5 60

BoLA-DRB3.2 HL030 ate ctc tet ctg cag cac att tcc 95 180 1 95 60 66 72- 5 95 64 72 27 64 72 5 72 1

284 п.н. HL032 teg ccg ctg cac agt gaa act ctc 40 30 30 30 30 30 30 60

Каппа-казеин Bocas А atgtgctga caggta tcctagttatgg 95_ 1 95 64 7? 95 62 17 34 62 V, 72 1

883 п.н. Bocas В cca aaa gta gag tgc aac aac act gg 180 60 30 40: 5 30 30 40 30 50 5 180

Примечания: температурные режимы могут варьировать в диапазоне ± 0,2 °С; I, II, III, IV, V - этапы ПЦР; Ц - количество циклов; Д - денатурация ДНК; Г - гибридизация праймеров с денатурированной ДНК-матрицей; Э - элонгация амплифицируемого фрагмента под действием Tag-полимеразы; п.н. - пары нуклеотидов

Таблица 2 - Оптимальные концентрации компонентов входящих в реакционную смесь

Область гена Концентрации веществ

Смесь прай-меров, (пМ) Трис- НС1, (мМ) (NH4)2S04, (мМ) Tween 20, (%) MgC12, (мМ) Смесь dNTP, (мМ) Tagpol., (ад.)

ВЛКРС ЕЫУ 40±0,1 65±0,1 15,4±0,1 0,2±0,01 2,3±0,1 0,2±0,01 2±0,1

ВЛКРС вАв 40±0,1 67±0,1 15,9±0,1 0,2±0,01 2,1±0,1 0,2±0,01 2±0,1

ВоЬА-ОЯВЗ.г 40±0,1 67±0,1 17,0±0,1 0,3±0,01 2,5±0,1 0,2±0,01 2±0,1

Каппа-казеин 40±0,1 60±0,1 16,4±0,1 0,4±0,01 2,3±0,1 0,4±0,01 4±0,1

Данные концентрации компонентов полимеразной цепной реакции, уста-

новленные экспериментальным путем, позволяют получить максимальный выход специфичного ПЦР-продукта.

Совершенствование метода ПДРФ при установлении генотипов по ВоЬА-ОНВ3.2 Авторами установлено, что повышение точности определения генотипа КРС можно достичь путём дифференциации аллелей ВоЬА-ОЯВ3.2*7, ВоЬА-Б11В3.2*8 и ВоЬА-011В3.2*9. При этом амплифицируется экзон 2 гена ВоЬА-

Анализ рестриктного полиморфизма проводится с помощью эндонуклеазы И^а I. Если при этом выявляются фрагменты 141, 54 - 51, 39 п.н., амплификат необходимо обработать рестриктазой Вб^ 2и I (таблица 3) с целью повышения точности при дифференцировке аллелей ВоЬА-БЯВ 3.2 *7*8*9. Таблица 3 - Сравнение фрагментов, образовавшихся в результате рестрикции эндонуклеазами Ява I и 2111

Аллель BOLA-DRB3.2 Контроль* Величина фрагментов после рестрикции эндонуклеазой Ява I, п.н. Предлагаемый способ Величина фрагментов после рестрикции эндонуклеазой Bst 2UI., п.н.

BoLA-DRB3.2*7 141,51,50,39 111,89,57,24

BoLA-DRB3.2*8 141,54,50,39 180,80,24

BoLA-DRB3.2*9 141,54,50,39 • 203, 57, 24

Примечание - *В качестве контроля использовался способ по прототипу

Как свидетельствуют полученные данные, усовершенствованный метод ПДРФ анализа второго экзона гена ВоЬА-ОЯВ3.2 позволяет с высокой степе-

нью точности выявлять животных, предрасположенных к лейкозу за счет дифференциации аллелей ВоЬА-ОКВ3.2 *7*8 и *9.

Сравнительная оценка эффективности ПЦР для диагностики лейкоза При проведении диагностики среди исследуемых животных инфицирован-ность ВЛКРС выявлена в группе II (п=48). На основании диагностики было сделано сравнение методов ГЕМ, РИД и ПЦР. Критерием оценки была чувствительность и специфичность методов.

Как видно из таблицы 4, метод ПЦР позволял выявлять больше инфицированных животных, чем ГЕМ и РИД. В случае «ПЦР+, РИД+, ГЕМ-» видна стадийность заболевания, то есть вирус лейкоза встроился в ДНК клетки мишени (В-лимфоцит) в виде провируса. На этой стадии ПЦР уже дает положительный результат.

Таблица 4 - Сравнение диагностики ВЬУ различными методами

Кол-во животных Результаты анализов, +/-

ПЦР+ ПЦР+ ПЦР+ ПЦР- ПЦР-

РИД+ РИД+ РИД- РИД+ РИД-

ГЕМ+ ГЕМ- ГЕМ- ГЕМ- ГЕМ-

Голов 7 14 15 4 8

В процентах от общей выборки 14,6 29,2 31,2 8,3 16,7

Затем со встроенной ДНК начинает считываться вирусная РНК копия, а также РНК, которые транслируются в вирусные белки. Далее происходит сборка новых вирионов, которые отпочковываются от клеточной мембраны. Процесс многократно повторяется, что приводит к повышению концентрации в крови животного вирусных белков. Соответственно, повышается и концентрация антител, связывающих данные белки. На этом этапе лейкозного процесса РИД начинает давать положительные результаты, результаты «ПЦР+, РИД+, ГЕМ-» получены у 14 животных, что составляет 29,2% от общей выборки. Та-: кие животные интересны еще и тем, что заболевание еще не перешло у них в гематологическую стадию. Это возможно по двум причинам, первая временная, то есть не прошло достаточно времени для её развития, и вторая - включение генетически обусловленных механизмов.

В 31,2% случаев анализы давали результат «ПЦР+, РИД-, ГЕМ-». Это можно объяснить высокой чувствительностью метода ПЦР по сравнению с другими используемыми методами. Во всех случаях использования ПЦР результаты анализов по генам proBLV Gag и proBLV Env совпали. Так как ген Gag кодирует белки сердцевины BJIKPC, а ген Env - белки оболочки вируса, можно судить о некоторой целостности ВЛКРС.

Вызывают интерес результаты «ПЦР-, РИД+, ГЕМ-» так как ПЦР должна давать положительные результаты раньше, чем РИД.

Количество таких животных в исследуемой нами выборке составило 4 головы. Эти животные были изолированы от общего стада и по истечении б мес. у них были взяты образцы крови для повторного исследования. По итогам диагностики животные определенны в группу здоровых, так как ВЛКРС не был обнаружен ни одним из используемых методов.

В литературе имеются данные, подтверждающие возникновение ложно-положительных результатов при диагностике ВЛКРС с использованием РИД. Например, ложноположительные результаты могут возникать при повышении уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови при артритах, перитонитах и др.; ошибки также возможны при исследовании методом РИД вакцинированных животных. На диаграмме (рис. 3) приведены результаты исследования ВЛКРС различными методами.

ГЕМ

тш 36

рид (нидимииииинм'да отдч 21

ПЦР

-1-1 -I I-1 ■• ■ ■ I ■ I" I

О 5 10 15 20 25 30 35 40

Рисунок 3 — Количество животных с положительным диагнозом, выявленных различными методами Как видно из диаграммы, метод ПЦР обладает наибольшей чувствительностью и позволяет определять инфицированных животных в 75% случаев заболеваний: ' - . \ .. ... .

Это доказывает, что наиболее эффективным методом прижизненной диагностики В JIKPC является полимеразная цепная реакция.

Влияние полиморфизма гена BoLA-DRB3.2 на иммунитет к лейкозу После определения аллельных вариантов гена BoLA-DRB3.2, мы сопоставили данные диагностики лейкоза КРС с результатами генотипирования на устойчивость животных к персистентному лимфоцитозу в группе II. Полученные данные представлены в таблице 5. Для удобства интерпретации результатов генотипы животных обозначали буквами Н, Ч и У, которые соответствуют нейтральным, чувствительным и устойчивым аллелям по отношению к персистентному лимфоцитозу. Так как каждое животное в своем генотипе несет по 2 аллели гена BoLA-DRB3.2, то название генотипов приобретало следующий вид: Н/Н, Н/У, Н/Ч, У/У, Ч/У, Ч/Ч. ." .

Гематологическая стадия лейкоза была выявлена у семи особей исследуемой выборки, причем в трех случаях генотип животного был гетерозиготным Ч/Н, четыре коровы имели гомозиготный генотип Ч/Ч. Таблица 5 - Влияние аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3.2 на развитие персистентного лимфоцитоза

Результаты комплексной диагностики лейкоза КРС

Показатели ПЦР+ , ПЦР+ ПЦР+ ПЦР-

РИД+ РИД+ РИД- РИД-

ГЕМ+ ГЕМ- ГЕМ- ГЕМ-

Генотипы по BOLA-DRB3.2 Н/Н ■ - 2 4 3

Н/У - 3 3 2

Н/Ч 3 4 7 3

У/У - 1 - 1

Ч/У 3 - 1

Ч/Ч 4 1 1 2

Персистентный лимфоцитоз не регистрировался у животных, несущих в своем генотипе хотя бы одну аллель, которая обуславливает устойчивость к гематологической стадии лейкоза. Возможно, это связано с доминантным характером наследования устойчивости к лейкозу.

Вирусоносителями являлись все, без исключения, группы животных, независимо от генотипа по ВоЬА-011В3.2. Обращает на себя внимание тот факт, что

среди животных не было зафиксировано развитие персистентного лимфоцитоза в группе с генотипом Н/Н. Возможно, дальнейшие исследования позволят выявить дополнительные аллели, обуславливающие устойчивость к лейкозу.

Влияние генотипа по локусу BoLA-DRB3.2 на уровень молочной продуктивности В научных публикациях отмечается, что с увеличением продуктивности повышается вероятность заболевания лейкозом. Авторами проведено сравнение удоев с различными генотипами КРС по BoLA-DRB3.2. Установлено, что средний удой в подгруппе с генотипом Ч/У по BoLA-DRB3.2 был выше, чем в других подгруппах, и достоверно отличался от них, при Р=0,95, в группах I (п=117) и II (п=48). Самая низкая продуктивность выявлена у животных с устойчивым гомозиготным генотипом У/У (группа I - 6183 ± 199,0 кг, группа II - 4547 ± 209,0 кг).

Приведенные данные свидетельствуют, о том, что чувствительные животные не являются высокопродуктивными. Самая высокая продуктивность наблюдалась в подгруппе Ч/У. Животные с генотипом Ч/У являются устойчивыми к лейкозу, так как устойчивость имеет доминантный характер наследования.

Связь аллельных вариантов гена каппа-казеина с молочной продуктивностью Для изучения связи аллельных вариантов гена каппа-казеина с молочной продуктивностью были отобраны здоровые животные (п=96). В этом эксперименте вирусоносители и больные участия не принимали.

Для исключения влияния на продуктивность гена BoLA-DRB3.2, группы животных были сформированы определенным образом. При этом достоверность разницы рассматривалась между группами, имеющими различные ал-лельные варианты гена каппа-казеина, но в пределах групп по BoLA-DRB3.2. Группы H/H-AB и У/У-АВ в расчет не принимались, так как показатель точности определения средней (Cs) в этих группах превышал 5%.

Максимальный средний удой зафиксирован в группе Ч/У-АА (зё—8031), минимальный - Ч/Ч-ВВ (* =5668). Следует также отметить, что продуктивность

животных с ВВ генотипом во всех группах была заметно ниже, хотя достоверно отличались лишь группы Н/У-АА от Н/У-ВВ и Ч/Ч-АВ от Ч/Ч-ВВ. Таким образом, установлена тенденция к снижению продуктивности животных генотипом ВВ. - .

Экономическое обоснование Экономические расчеты проводились на 100 голов КРС. При традиционной диагностике ВЛКРС методом РИД прибыль молочного скотоводства из расчета на 100 голов составила 1683,9 тыс. руб., рентабельность 16,1%. При диагностике ВЛКРС методом ПЦР и РИД прибыль молочного скотоводства из расчета на 100 голов составила 2976,7 тыс. руб., рентабельность 23,3%. Внедрение данного метода позволяет сэкономить 1292,8 тыс. руб.

В результате использования генетического маркера устойчивости к пер-систентному лимфоцитозу прибыль составила 2258,2 тыс. руб., что на 728,4 тыс. руб. выше, чем во второй группе. Внедрение данного метода позволяет увеличить рентабельность на 4,1 %. -

Доказано, что используя молоко, полученное от коров с генотипом ВВ каппа-казеина можно существенно повышать экономическую эффективность производства сыра. Учитывая данные за 4 лактации, при средней продуктивности 6000 кг за лактацию, на основании расчетов, установлено, что уровень рентабельности производства сыра в группе с генотипом ВВ на 11,4 % выше, чем в группе с генотипами АВ и АА по локусу каппа-казеина.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что метод ПЦР позволяет выявлять животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, на ранних стадиях внедрения вируса в организм, до образования антител. Методом ПЦР на выборке п=48 идентифицировано 36 инфицированных коров, что составило 75%. Используя РИД на том же поголовье, удалось выявить 21 корову вирусоносителя, что составило 43,8 %. Гематологическая стадия лейкоза зафиксирована у 7 особей исследуемой выборки, что составило 14,58%.

2. Подтвержден доминантный характер наследования устойчивости к инфекции, вызываемой BJ1KPC. Установлено, что у животных, несущих в геноме одну из аллелей *11 *23 *28 гена BoLA-DRB3.2, персистентный лимфоцитоз не развивается, даже в сочетании с аллелями *8 *16 *22 *24, которые обуславливают чувствительность к лейкозу. Из семи голов, у которых лейкоз диагностировался в гематологической стадии, генотип коров по BoLA-DRB3.2 был представлен в четырех случаях двумя чувствительными аллелями, в трех случаях одной чувствительной и одной нейтральной аллелью.

3. Выявлен механизм взаимодействия ВЛКРС с организмом животных. Сущность механизма заключается в узнавании Т-лимфоцитами белков ВЛКРС, связанных с гликопротеином класса II главного комплекса гистосовместимо-сти на поверхности антиген представляющих клеток. Аллели *11 *23 *28 гена BoLA-DRB3.2 определяют сайт узнавания для Т-киллеров и Т-хелперов, аллели *8 *16 *22 *24 - сайт узнавания для Т-супрессоров. Нейтральные аллели кодируют сайты, не вступающие в ассоциации с белками ВЛКРС, либо сайты, которые Т-лимфоцитами не узнаются.

4. Во всех группах исследуемых животных выявлена низкая частота встречаемости генотипа ВВ каппа-казеина, который обеспечивает высокий выход сыра. Экономически обоснованно ведение селекции по каппа-казеиновому маркеру продуктивности. ,

5. Подобран антикоагулянт (цитрат Na), который не оказывает ингибирующего действия на ПЦР. Определены оптимальные технологические параметры, концентрации компонентов, входящих в состав реакции, позволяющие ам-плифицировать in vitro участки следующих генов: pro BLV Gag, pro BLV Env, BoLA-DRB3.2 и каппа-казеина. С целью получения максимального выхода специфичного ПЦР-продукта осуществляли 3-5 циклов амплификации при повышенной температуре отжига праймеров. Данная модификация позволяла увеличить специфичность ПЦР. Затем амплификацию проводили при более мягких условиях отжига праймеров, тем самым увеличивая выход ПЦР-продукта. Далее следовало 5 циклов амплификации без денатурации, с

целью преобразования одноцепочных молекул ДНК в двухцепочные. Заключительным этапом ПЦР была длительная элонгация (при t =72-74 °С) в течение 1-3 мин., во время которой происходила достройка синтезированных участков ДНК.

6. Доказано, что усовершенствованный метод полиморфизма длин рестрикт-ных фрагментов с использованием дополнительной эндонуклеазы Bst 2U I обеспечивает высокую точность при дифференцировке аллелей BoLA-DRB3.2 *7 *8 *9. Это усовершенствование имеет большое практическое значение, так как BoLA-DRB3.2 *8 обуславливает чувствительность к гематологической стадии лейкоза, а DRB3.2 *7 и *9 относятся к нейтральным аллелям.

7. Проведен анализ влияния аллельных вариантов гена BoLA-DRB3.2 и каппа-казеина на уровень молочной продуктивности животных. Установлена статистически достоверная взаимосвязь между генотипами по BoLA-DRB3.2 и уровнем молочной продуктивности. Самая низкая продуктивность выявлена у животных с устойчивым гомозиготным генотипом У/У (в группе I — 6183 ± 199,0 кг, группе II — 4547 ± 209,0 кг); самая высокая — с генотипом Ч/У (в группе I - 7926 ± 232,4 кг, в группе II - 6248 ± 146,3 кг).

8. Доказано, что использование биотехнологических и молекулярно-генетических методов позволяет, повышать рентабельность производства молочной продукции, улучшать её качество.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чижова, JI. Н. Использование полимеразной цепной реакции в диагностике лейкоза КРС / JI.H. Чижова, Д.Е. Белов // Сб. науч. тр. / Ставроп. СНИИЖК. -2004. - Вып. 2, т. 2. - С. 65-68.

2. Чижова, Л. Н. К вопросу диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР / Л. Н. Чижова, Д. Е. Белов // Актуальные вопросы зоотехнической и ветеринарной науки и практики в АПК: матер, научно-практ. конф. -Ставрополь, 2005. - С. 198-200.

3. Белов, Д. Е. Изучение аллельного полиморфизма гена ВоЬА-ОЛВЗ в стадах крупного рогатого скота различных пород / Д. Е. Белов // УУС Триумф аркада. - 2005. - № 5. - С. 62-64.

4. Чижова, Л. Н. Методические рекомендации по применению методов ДНК-диагностики в селекции крупного рогатого скота / Л. Н. Чижова, М. И. Се-лионова, В. В. Абонеев, М. В. Егоров, Г. П. Ковалева, О. В. Семенюк, Д. Е. Белов // Ставрополь, 2005. - с. 45.

5. Чижова, Л.Н. Влияние лейкоза на молочную продуктивность коров / Л. Н. Чижова, Д. Е. Белов // Животноводство - продовольственная безопасность страны: материалы Международной науч.-практ. конф. - Ставрополь, 2006. -Т. 2.-С. 152-156.

6. Белов, Д. Е. Установка генетического аспекта заболевания сельхозживотных-залог оздоровления поголовья / Д. Е. Белов // Здоровые города: роль межсекторального сотрудничества в сохранении и укреплении здоровья населения: матер. Всероссийской научно-практ. конф. - Ставрополь, 2006. - С. 88.

7. Белов, Д. Е. Усовершенствование ПЦР как метода диагностики лейкозов / Д. Е. Белов // Здоровые города: роль межсекторального сотрудничества в сохранении и укреплении здоровья населения: матер. Всероссийской научно-практ. конф. - Ставрополь, 2006. - С. 89.

8. Белов, Д. Е. Здоровье сельскохозяйственных животных — гарантия продовольственной безопасности продукции / Д. Е. Белов // Здоровые города: роль межсекторального сотрудничества в сохранении и укреплении здоровья населения: матер. Всероссийской научно-практ. конф. - Ставрополь, 2006. — С. 90-91

9. Белов, Д. Е. Оптимизация молекулярно-биологических методов с целью изучения полиморфизма нуклеиновых кислот и в диагностике лейкоза КРС / Д. Е. Белов / Ставрополь, 2006. - 14 с. - Деп. в ВИНИТИ, № 958-В2006.

Ю.Белов, Д. Е. Изучение генетических факторов устойчивости к лейкозу крупного рогатого скота / Д. Е. Белов // Молочное и мясное скотоводство. -2006.-№6.-С. 38-39.

Автор выражает благодарность заведующей лабораторией биотехнологии Северо-Кавказского НИИ животноводства, к.б.н. Ковалюк Наталье Викторовне за предоставленную возможность в проведении исследований, за помощь и поддержку.

На правах рукописи

БЕЛОВ Денис Евгеньевич

Подл, в печать 06.10. 2006. Бумага офсетная. Формат60/84 1/16 Зак.128. Усл. печ. лист. 1,0 Тираж 100 экз.

Отдел оперативной полиграфии СНИИЖК г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 15.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белов, Денис Евгеньевич

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Биологическая характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота

1.2 Изучение методов диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота

1.3 Биотехнологические закономерности устойчивости и восприимчивости к персистентному лимфоцитозу

1.4 Главный комплекс гистосовместимости-МНС

Major Histocompatibility Complex)

1.4.1 История изучения МНС

1.4.2 Генетика МНС

1.4.3 Функция МНС

1.4.4 Биотехнология устойчивости и восприимчивости к лейкозу в зависимости от полиморфизма гена BoLA-DRB3.

1.5 История и биотехнология методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ)

1.6 Влияние полиморфизма гена каппа-казеина на технологические свойста молока

2. Материалы и методы исследований

3. Исследование биотехнологических аспектов молекулярно-генетических методов

3.1 Разработка схемы исследований

3.2 Исследование ингибирующих свойств антикоагулянтов на ход ПЦР

3.3 Подбор оптимальных температурно-временных режимов ПЦР

3.4 Определение оптимальной концентрации реагентов

3.5 Модификация диагностики лейкоза методом ПЦР

3.6 Совершенствование метода ПДРФ при установлении генотипов по BoLA-DRB3.

3.7 Сравнительная оценка эффективности ПЦР при диагностике лейкоза 73 4. Изучение влияния гена BoLA-DRB3 на иммунитет к лейкозу и гена капа-казеина на молочную продуктивность

4.1 Результаты типирования животных по гену BoLA-DRB3.

4.2 Влияние полиморфизма гена BoLA-DRB3.2 на иммунитет к лейкозу

4.3 Влияние генотипа по локусу BoLA-DRB3.2 на уровень молочной продуктивности

4.4 Сравнительная характеристика продуктивности здоровых, инфицированных и больных животных

4.5 Определение аллельных вариантов гена каппа-казеина

4.6 Связь.аллельных вариантов гена каппа-казеина с молочной продуктивностью

4.7 Экономическое обоснование исследований

4.7.1 Экономическая эффективность диагностики ВЛКРС методом ПЦР

4.7.2 Экономический эффект от внедрения маркера устойчивости к лейкозу

4.7.3 Экономический эффект от внедрения маркера каппа-казеина 96 5. Заключение 99 ВЫВОДЫ 106 ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 109 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 11 о

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование биотехнологических и молекулярно-генетических методов при изучении генов, определяющих устойчивость к заболеваниям и молочную продуктивность"

Актуальность исследований

В структуре инфекционной заболеваемости КРС лейкоз занимает лидирующее место. Это заболевание, этиологическим агентом которого является вирус лейкоза крупного рогатого скота (BJ1KPC), наносит значительный экономический ущерб животноводству.

На сегодняшний день возможность инфицирования человека этим вирусом не доказана, однако имеются данные о том, что BJ1KPC (BLV -bovine leukemia virus) имеет эволюционное родство с Т- лимфотропными вирусами человека I и II типов (HTLV I, HTLV II) и некоторую степень гомологии с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Необходимо отметить, что все вышеперечисленные вирусы относятся к одному семейству

- ретровирусы (retroviridae).

- атипичная пневмония) - Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), является мутантный штамм коронавируса, выделенный от азиатских виверр. Показательной также в этой связи является ситуация с вирусом гриппа птиц (influenza virus). Из множества штаммов этого вируса один - H5N1 -передается человеку, причем зачастую с летальным исходом.

ВЖРС зафиксирован во всех районах Ставропольского края. По данным диагностики с использованием реакции иммунодиффузии (РИД), на сегодняшний день инфицированность составляет: в Арзгирском, Нефтекумском, Предгорном районах - до 10%; в Апанасенковском, Ипатовском, Курском, Степновском, Советском, Туркменском районах - до 20%; в Андроповском, Александровском и Новоселицком районах - до 30%; в Благодарненском, Буденновском, Георгиевском, Грачевском, Изобильненском, Кочубеевском, Красногвардейском, Кировском,

Левокумском, Минераловодском, Новоалександровском, Петровском, Труновском, Шпаковском районах - более 30% от общего поголовья КРС.

Нет полной ясности в формировании иммунного ответа на BJ1KPC. В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают исследования с использованием биотехнологических и молекулярно-генетических методов, направленные на изучение механизма генетической устойчивости, предрасположенности к лейкозу КРС. Для использования методов ПЦР и полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), в наших исследованиях потребовалась их модификация с последующей отработкой технологических параметров.

Цель диссертационной работы - установить оптимальные технологические параметры биотехнологических и молекулярно-генетических методов с целью диагностики BJ1KPC и изучения полиморфизма генов BoLA-DRB3.2 и каппа-казеина.

В связи с этим программа исследований включала решение следующих задач:

- определить сравнительную эффективность диагностики лейкоза КРС методами ПЦР, РИД, ГЕМ;

- усовершенствовать анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов при изучении ДНК-полиморфизма второго экзона гена DRB3 главного комплекса гистосовместимости; выявить животных, чувствительных и устойчивых к инфекции, вызываемой BJ1KPC;

- установить взаимосвязь полиморфизма генов BoLA-DRB3.2 и каппа-казеина с молочной продуктивностью КРС;

- установить экономическую рентабельность от внедрения в практику методов молекулярной биологии.

Научная новизна исследования

Усовершенствован метод ПДРФ при определении ДНК-полиморфизма гена BoLA-DRB3.2, с использованием дополнительной рестриктазы Bst2UI. Обоснована эффективность использования усовершенствованного ПДРФ-метода при изучении механизма клеточного иммунитета на BJ1KPC.

Предложен модифицированный метод выявления ДНК-провируса BJIKPC на основе ПЦР. Показана целесообразность использования данного метода в диагностике BLV. Установлены оптимальные температурно-временные режимы и концентрации компонентов, входящих в состав реакции при амплификации участков исследуемых генов.

Проведен анализ влияния аллельных вариантов гена BoLA-DRB3.2 и каппа-казеина на уровень молочной продуктивности животных. Установлена статистически достоверная взаимосвязь между генотипами по BoLA-DRB3.2 и уровнем молочной продуктивности. Доказано, что уровень экспрессии гена каппа-казеина статистически достоверного влияния на молочную продуктивность не оказывает.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Доказано, что усовершенствованный метод рестриктного анализа обладает высокой разрешающей способностью при исследовании полиморфизма гена BoLA-DRB3.2. Данное усовершенствование позволяет с высокой точностью выявлять животных, чувствительных к гематологической стадии лейкоза.

Доказана возможность выявления инфицированных животных на ранних стадиях заболевания методом ПЦР, до образования у них антител к ВЖРС. Результаты исследований внедрены в племенных хозяйствах Ставропольского края (акт б/н от 14.10.2005 г.) и в лабораторной практике ГНУ СНИИЖК (акт б/н от 10.09.2005 г., акт б/н от 24.03.2006 г.). Внедрение в хозяйствах позволило сократить прямые потери, связанные с выбраковкой животных по причине лейкоза. В лабораторной практике произошло снижение затрат на проведение исследований и повышение точности интерпретируемых результатов.

1. Действие ВЖРС на организм зависит от генетических особенностей животного.

2. Предлагаемые технологические параметры ПЦР позволяют применять данный метод для диагностики ВЖРС на ранних стадиях инфицирования животных.

4. Внедрение в практику животноводства биотехнологических и молекулярно-генетических методов позволяет повышать рентабельность производства.

Апробация работы

Животноводство - продовольственная безопасность страны» (Ставрополь, 2006 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Здоровые города: роль межсекторального сотрудничества в сохранении и укреплении здоровья населения» (Ставрополь, 2006 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Структура и объём работы

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Белов, Денис Евгеньевич

выводы

2. Подтвержден доминантный характер наследования устойчивости к инфекции, вызываемой BJIKPC. Установлено, что у животных, несущих в геноме одну из аллелей *11 *23 *28 гена BoLA-DRB3.2, персистентный лимфоцитоз не развивается, даже в сочетании с аллелями *8 *16 *22 *24, которые обуславливают чувствительность к лейкозу. Из семи голов, у которых лейкоз диагностировался в гематологической стадии, генотип коров по BoLA-DRB3.2 был представлен в четырех случаях двумя чувствительными аллелями, в трех случаях одной чувствительной и одной нейтральной аллелью.

3. Выявлен механизм взаимодействия BJIKPC с организмом животных. Сущность механизма заключается в узнавании Т-лимфоцитами белков ВЛКРС, связанных с гликопротеином класса II главного комплекса гистосовместимости на поверхности антиген представляющих клеток. Аллели *11 *23 *28 гена BoLA-DRB3.2 определяют сайт узнавания для Т-киллеров и Т-хелперов, аллели *8 *16 *22 *24 - сайт узнавания для Т-супрессоров. Нейтральные аллели кодируют сайты, не вступающие в ассоциации с белками ВЛКРС, либо сайты, которые Т-лимфоцитами не узнаются.

5. Подобран антикоагулянт (цитрат Na), который не оказывает ингибирующего действия на ПЦР. Определены оптимальные технологические параметры, концентрации компонентов, входящих в состав реакции, позволяющие амплифицировать in vitro участки следующих генов: pro BLV Gag, pro BLV Env, BoLA-DRB3.2 и каппа-казеина. С целью получения максимального выхода специфичного ПЦР-продукта осуществляли 3-5 циклов амплификации при повышенной температуре отжига праймеров. Данная модификация позволяла увеличить специфичность ПЦР. Затем амплификацию проводили при более мягких условиях отжига праймеров, тем самым увеличивая выход ПЦР-продукта. Далее следовало 5 циклов амплификации без денатурации, с целью преобразования одноцепочных молекул ДНК в двухцепочные. Заключительным этапом ПЦР была длительная элонгация (при t. =72-74 °С) в течение 1-3 мин., во время которой происходила достройка синтезированных участков ДНК.

6. Доказано, что усовершенствованный метод полиморфизма длин рестриктных фрагментов с использованием дополнительной эндонуклеазы Bst 2U I обеспечивает высокую точность при дифференцировке аллелей BoLA-DRB3.2 *7 *8 *9. Это усовершенствование имеет большое практическое значение, так как BoLA-DRB3.2 *8 обуславливает чувствительность к гематологической стадии лейкоза, a DRB3.2 *7 и *9 относятся к нейтральным аллелям.

7. Проведен анализ влияния аллельных вариантов гена BoLA-DRB3.2 и каппа-казеина на уровень молочной продуктивности животных. Установлена статистически достоверная взаимосвязь между генотипами по BoLA-DRB3.2 и уровнем молочной продуктивности. Самая низкая продуктивность выявлена у животных с устойчивым гомозиготным генотипом У/У (в группе I - 6183 ± 199,0 кг, группе II - 4547 ± 209,0 кг); самая высокая - с генотипом Ч/У (в группе I - 7926 ± 232,4 кг, в группе II - 6248 ± 146,3 кг).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. В план мероприятий по профилактике и борьбе с лейкозом включить диагностику с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Осуществлять генетический контроль импортируемого биологического материала.

3. Использовать при подборе родительских пар данные генотипирования на присутствие в геноме желательных для селекции маркеров продуктивности, устойчивости к заболеваниям, на отсутствие генетических аномалий.

4. При производстве сыра использовать животных с аллельным вариантом ВВ гена каппа-казеина.

5. Использовать рестриктазу Bst 2U I при дифференциации аллелей BoLA-DRB3.2 *7 *8 *9.

5. Заключение

В процессе проведенных исследований нами была модифицирована методика взятия крови: при использовании одноразовых шприцов животные не травмируются, во время забора крови ведут себя спокойно. Взятие крови таким способом не подвергает животных стрессу, что благоприятно сказывается на среднесуточных удоях.

Установлено, что эффективность ПЦР при амплификации второго экзона гена BoLA-DRB3, проводимой в два раунда с праймерами HLO 30 и HLO 31 в первом раунде и HLO 30 и HLO 32 - во втором раунде (М. J. Т. Van Eijk, J. A. Stewart-Haynes, Н. A. Levin,1992), была незначительно выше, чем однораундовой с использованием праймеров HLO 30 и HLO 32. Обоснованно использование однораундовой ПЦР экономически и в целях повышения точности результатов, за счет уменьшения риска перекрестной контаминации.

Модифицированный метод ПДРФ, ДНК-полиморфизма второго экзона гена BoLA-DRB3, повышал точность при дифференциации аллелей BoLA-DRB3.2 *7*8 и *9, однако вместе с тем повышалась стоимость исследования. Уменьшить затраты можно в случаях, когда из общей выборки необходимо отобрать устойчивых к персистентному лимфоцитозу животных. Добиться этого удавалось при проведении на предварительном этапе сайт-специфичной ПЦР в два раунда: в первом с праймерами HLO 30 и HLO 32, на втором с HLO 32 и HLO 62. Такой способ позволял выделять животных несущих аллели устойчивости к персистентному лимфоцитозу. На следующем этапе применялся ПДРФ анализ, который давал возможность идентифицировать гомо- и гетерозиготы.

Проведен эксперимент, доказывающий высокую чувствительность полимеразной цепной реакции при диагностике BJIKPC. Предложен модифицированный метод диагностики лейкоза методом ПЦР. В практическом применении такой метод позволяет диагностировать BJIKPC с наименьшими затратами ресурсов и времени. По нашему мнению, наиболее целесообразным будет смешивание ДНК от 5 животных.

Преимущества данного метода сводятся, прежде всего, к тому, что в случае отрицательного диагноза себестоимость при проведении диагностических мероприятий методом ПЦР снижается в 5 раз. Причем в этом случае ПЦР подходит для массового использования.

Однако есть у такого метода и свой недостаток в случае положительного диагноза себестоимость ПЦР анализа в расчете на одну голову возрастает на 20%, так как будет необходимо протестировать каждое животное индивидуально.

На основании выше изложенного, имеет смысл рекомендовать данный усовершенствованный метод в качестве скринингового для массовой диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах, где инфицированность BLV по результатам РИД диагностики составляет не более 5%.

При диагностике лейкоза установлено, что метод полимеразной цепной реакции позволяет выявлять инфицированных животных с более высокой точностью, чем реакция иммунодиффузии. Также установлено, что РИД имеет ряд существенных недостатков, которые делают практически невозможным оздоровление стад крупного рогатого скота от лейкоза. К таким недостаткам можно, прежде всего, отнести заражение животных вирусом лейкоза при взятии крови, неточность в постановке как положительного, так и отрицательного диагноза, низкая чувствительность и специфичность. Следует отметить, что при заборе крови для диагностики РИД, в связи с использованием игл большого диаметра, животные травмируются, подвергаются стрессу, что влечет за собой снижение продуктивности. Вышеизложенное свидетельствует о том, что только с использованием метода ПЦР возможно оздоровление стад от лейкоза КРС, так как РИД на фоне растущей инфицированности крупного рогатого скота вирусом лейкоза все более показывает свою несостоятельность.

На основании расчетов при 5%-ном уровне достоверности, доказано, что содержание в стаде инфицированных животных влечет за собой значительные экономические потери. В группе II, по причине лейкоза, от 48 дойных коров недополучено 25382 литра молока за лактацию, экономические потери составили 373828 руб. (при цене реализации одного литра молока 6,5руб.), что привело к снижению уровня рентабельности на 24,8%. В нашем случае, потери молока, наблюдаемые среди инфицированных животных, были на 3-5% выше описанных в литературе (А.И. Кузин, Е.Н. Закрепина, 1997; Ю.П. Смирнов, 1999).

Уровень инфицированности коров по мастям отличался не значительно и составлял для красной, черно - пестрой и красно - пестрой - 71, 76 и 75% соответственно. Связи между процентом инфицированных животных (по данным ПЦР) и аллельным полиморфизмом гена BoLA-DRB3 отмечено не было.

Опираясь на данные типирования животных по гену BoLA-DRB3, в первой и второй группах можно исключить эндогенный путь заражения вирусом лейкоза крупного рогатого скота; можно предположить, что в организме животных, несущих аллели предопределяющие чувствительность к персистентному лимфоцитозу (BoLA-DRB3.2*8* 16*22*24), присутствуют механизмы, которые при экзогенном заражении ВЛКРС способствуют развитию персистентного лимфоцитоза. Скорее всего, это происходит из-за ассоциативного узнавания Т-супрессорами белков ВЛКРС с собственным гликопротеидом МНС класса II, и, как следствие, происходит подавление иммунных реакций организма. Напротив, у особей, несущих в своем геноме аллели устойчивости к гематологической стадии лейкоза, происходит ассоциативное узнавание Т- хелперами и цитотоксическими Т-лимфоцитами; в результате инфицированная клетка разрушается -репликация и «сборка» вируса прекращаются. Нейтральные аллели в ассоциации с Т- лимфоцитами не вступают. Теоретически у таких животных может развиваться персистентный лимфоцитоз, однако в наших исследованиях гематологическая стадия среди животных с генотипом Н/Н не выявлена.

Предположительный механизм взаимодействия организма животного с ВЛКРС в зависимости от строения гликопротеина класса II главного комплекса гистосовместимости, предложенного нами, представлен на рисунке 11.

Косвенным доказательством этого предположения могут служить недавние исследования ученых, которые показали, что персистентный лимфоцитоз развивается у всех без исключения животных, если, помимо BLV (bovine leukemia virus), они заражены Т- лимфотропным BIV (bovine immunodeficiency virus) - вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота. Как следствие, в этом случае поражаются механизмы клеточного иммунного ответа, животные, несущие аллели гена BoLA-DRB3, предопределяющие устойчивость к персистентному лимфоцитозу, не могут противостоять данному заболеванию (К.Р. Flaming, D.E. Frank, S. Carpenter, J.A. Roth, 1997; J.A. Isaacson, K.P. Flaming, J.A. Roth, 1998; D. Wu, K. Murakami, A Morooka, H. Jin, Y. Inoshima, H. Sentsui, 2003).

Полученные нами результаты хорошо согласуются с данными ряда ученых, исследовавших гематологические показатели и проводивших патоморфологические исследования, определивших голштинскую породу как одну из наиболее восприимчивых к персистентному лимфоцитозу и развитию опухолевой стадии лейкоза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белов, Денис Евгеньевич, Ставрополь

1. Авилов, В. М. Проблемы оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза / В. М. Авилов, В. М. Нахмансон // Ветеринария. 1995. -№11.-С. 3-6.

2. Альберте, Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альберте, Д. Брей, Дж. Льюис. -М.: Мир, 1987. 1050 с.

3. Бороздин, Э. К. Содержание радиоактивных элементов в органах и тканях животных, больных лейкозом / Э. К. Бороздин, В. С. Высодский // Аграр. Россия. 2000. - № 5. - С. 27-33.

4. Бурба, JI. Г. Валихов А.Ф., Горбатов В.А. Лейкозы и злокачественные опухоли животных / Л. Г. Бурба, А. Ф. Вахилов, В. А. Горбатов. М. : Агропромиздат, 1988. - 399 с.

5. Бусол, В. А. ПЦР диагностика ВЛКРС / В. А. Бусол, О. Ю. Лиманская, А. П. Лиманский // Ветеринарная медицина. - 1998. - Вып. 74. -С. 35-44.

6. Волкова, Р. А. Молекулярно генетическая диагностика гепатита «В» / Р. А. Волкова // Генодиагностика в современной медицине: Тез. докл. III Всероссийской научн.-практ. конф.: - М., 2000. - С. 45^7.

7. Галеев, Р. Ф. Вирус лейкоза КРС (культуральные, инфекционные и иммунологические свойства) / Р. Ф. Галлеев. Уфа: Ветеринарная медицина, 1999. - 147 с.

8. Галеев, Р. Ф. Диагностика и профилактика лейкоза КРС / Р. Ф. Галеев, А. А. Руденко, Ф. Р. Валиев // Практик. № 5-6. - 2003. - С. 44-48.

9. Глазко, В. И. ДНК-технологии животных / В. И. Глазко. Киев: Нора-принт, 1997.-173 с.

10. Глазко, В. И. Полиморфизм молекулярно генетических маркеров у домашней лошади и лошади Пржевальского / В. И. Глазко .// Биотехнология в животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II международной научн. конф.: - М., 2000. - С. 151-152.

11. Глазко, В. И. Современные направления использования ДНК-технологий / В. И. Глазко, Н. Н. Доманский, А. А. Созинов //Цитология и генетика. 1998. - Т. 32. - №5. - С. 80-93.

12. Глазко, В. И. Введение в ДНК-технологии / В. И. Глазко, И. М. Дунин, Г. В. Глазко, Л. А. Калашникова. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001.-436 с.

13. Глазко, В. И. Идентификация генотипов по каппа-казеину и BLAD-мутации с использованием полимеразной цепной реакции у крупного рогатого скота / В. И. Глазко, С. Д. Кириленко // Цитология и генетика. -1995.- №6.- С. 60-63.

14. Глазко, В. И. Межлокусные ассоциации некоторых генетико-биохимических систем у крупного рогатого скота / В. И. Глазко, С. Д.

15. Кириленко, А. А. Созинов // Генетика. 1997. - Т. 33. - № 4. -С. 512-517.

16. Гулюкин. М. И. Дифференциальная диагностика гемабластозов крупного рогатого скота / М. И. Гулюкин // Бюл. ВИЭВ. М.: 1996. -Вып. 77.-С. 46-47.

17. Гулюкин, М. И. Разработка эффективных мероприятий против лейкоза крупного рогатого скота / М. И. Гулюкин // Ветеринария. 2002. -№12.-С. 3-8.

18. Гулюкин, М. И. Основные тенденции в организации и проведении противолейкозных мероприятий / М. И. Гулюкин, Н. В. Замараева, В. А. Седов // Труды ВИЭВ. М. - 1999. - Т. 72. - С. 16-22.

19. Жебровский, J1. С. Селекционно-генетические основы белкового состава молока коров / Л. С. Жебровский. М.: Колос, 1973 - 248 с.

20. Замараева, Н. В. Экспериментальные исследования по выявлению возможности передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота через молоко лабораторным животным / Н. В. Замараева, М. И. Гулюкин, М. Н. Снежков // Бюлл. ВИЭВ. 1996. - № 77. - С. 66.

21. Иванова, JI. А. Опыт применения иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза на заключительном этапе оздоровления / Л. А. Иванова // Бюл. ВИЭВ. -1999. Т. 72. С. 202-209.

22. Калашникова, Jl. А. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных / Л. А. Калашникова, И. М. Дунин, В. И. Глазко, Н. В. Рыжова. -М., 1999.-148 с.

23. Ковалюк Н. В. Возможные пути снижения заболеваемости крупного рогатого скота лейкозом в Краснодарском крае / Н. В. Ковалюк // Ветеринария Кубани. 2004. - № 4. - С. 7-8.

24. Ковалюк, Н. Изучение полиморфизма некоторых генов у быков-производителей / Н. Ковалюк, А. Ковалюк, Е. Чурилова, М. Масленников // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2005. - № 1. - С. 64-65.

25. Коромыслов, Г. Ф. Основы профилактики и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота / Г. Ф. Коромыслов, Шишков В. П. // Ветеринария. 1993.- №4. -С. 15-18.

26. Коромыслов, Г. Ф. Основные итоги и перспективы научных исследований по проблеме лейкозов сельскохозяйственных животных / Г. Ф. Коромыслов, М. И. Гулюкин, Г. А. Симонян // Сб. научн. тр. / Тр. ВИЭВ. -1999. Т. 72. - С.3-11.

27. Костенко, Т. С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии / Т. С. Костенко. М.: Агропромиздат, 1989. - 272 с.

28. Крикун, В. А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность / В. А. Крикун // Ветеринария. 2002. - № 6. - С. 7-9.

29. Крикун, В. А. Слизистая носа наиболее вероятный путь заражения животных вирусом лейкоза КРС / В. А. Крикун // Лейкозы крупного рогатого скота. - М. - 1985. - С. 5-6.

30. Кугенев, П. В. Практикум по молочному делу / П. В. Кугенев, Н. В. Барабанщиков. М.: Колос, 1978. - 240 с.

31. Кудрявцева, Т. П. Лейкоз животных / Т. П. Кудрявцева. -М.: Россельхозиздат, 1980. 158 с.

32. Кузин, А. И. Влияние лейкоза на продуктивность коров и качество молока / А. И. Кузин, Е. Н. Закрепина // Ветеринария. 1997. - № 2. -С. 19-21.

33. Кузин, А. И. К вопросу оздоровления хозяйств Вологодской области от лейкоза крупного рогатого скота / А. И. Кузин, М. В. Печерская // Сб. научн. тр. / Тр. ВАСХНИЛ. 1974. - С. 228.

34. Кузнецова, Н. В. Использование полимеразной цепной реакции для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота / Н. В. Кузнецова // Ветеринария. 1997. - С. 12-13.

35. Кукайн, Р. А. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / Р. А. Кукайн. -Рига: Зинатне, 1982. 174 с.

36. Лакин, Т. Ф. Биометрия / Т. Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1980. -293 с.

37. Лактионов, А. М. Селекционно-генетические аспекты лейкозов крупного рогатого скота / А. М. Лактионов // Ветеринария. 1972. - № 6. -С. 66-69.

38. Лемеш, В. М. Лейкоз крупного рогатого скота / В. М. Лемеш. Минск: «Ураджай», 1987.-220 с.

39. Лиманский, А. П. Молекулярно-генетические методы основа программ по искоренению лейкоза крупного рогатого скота / А. П. Лиманский, О. Ю. Лиманская // Биотехнология. - 2001. - № 3. - С. 40-50.

40. Лиманский, А. П. Типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота, циркулирующего в Украине / А. П. Лиманский, L. Geue, О. Ю. Лиманская, D. Beier // Вопр.вирусологии. 2004. - Т. 49. - № 1. -С.39-44.

41. Мазин, А. В. Методы молекулярной генетики и генной инженерии /

42. A. В. Мазин, К. Д. Кузнеделов, А. С. Краев. Новосибирск: Наука, 1990.-248 с.

43. Мазин, А.В. Анализ генома. Методы / А. В. Мазин, А. С. Краев,

44. B. А. Потапов. -М.: Мир, 1990. 176 с.

45. Меркурьева, Е. К. Биометрия в селекции и генетике сельскохозяйственных животных / Е. К. Меркурьева. М.: Колос, 1979.-423 с.

46. Мурватуллоев, С. А. Носовые истечения больных лейкозом коров, как фактор передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота / С. А. Мурватуллоев / Сб. науч. тр. // Тр. ВИЭВ. -1999. Т. 72. - С. 128-129.

47. Муровска, М. Ингибирование репликации вируса лейкоза крупного рогатого скота у трансгенных кроликов под влиянием антисмысловых РНК / М. Муровска, С. Козырева, В. Томсоне // Экспериментальная онкология. 2001. - № 1. - С. 15-20.

48. Нахмансон, В. М. Лейкоз крупного рогатого скота / В. М. Нахмансон. -М.: Россельхозиздат, 1986. 221с.

49. Нахмансон, В. М. Эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота и меры борьбы с ним / В. М. Нахмансон, Е. А. Дун // Сб. науч. тр. // Итоги науки и техники. 1986. - С. 146-149.

50. Ным, Э. М. Распространение лейкоза крупного рогатого скота в Эстонской ССР / Э. М. Ным // Сб. науч. тр. // Труды АН Латвийской ССР. Рига: Зинатне, 1970. - 145 с.

51. Облап, Р. В. Вирус бычьего лейкоза и диагностика инфицированных животных / Р. В. Облап, В. И. Глазко, А. А. Созинов // Аграр. Наука. -1998.-№4.-С. 43-44.

52. Орлянкин, Б. Г. Классификация ретровирусов и характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота / Б. Г. Орлянкин, М. И. Гулюкин, Н. В. Замараева, К. Ю. Кунаков // Ветеринария. 2000. - № 5. -С. 17-19.

53. Орлянкин, Б. Г. Классификация и номенклатура РНК содержащих вирусов позвоночных / Б. Г. Орлянкин // Сельскохозяйственная биология. - 1996. - № 2. - С. 3-24.

54. Петров, Р. В. Иммунология / Р.В. Петров. М.: Медицина, 1982. - 368 с.

55. Плохинский, Н. А. Биометрия / Н. А. Плохинский. М.: Изд - во Моск. ун-та, 1970.-367 с.

56. Плохинский, Н. А. Руководство по биометрии для зоотехников / Н. А. Плохинский. М.: Колос, 1969. - 256 с.

57. Прохватилова, JI. Б. Диагностика лейкоза КРС методом ПЦР / J1. Б. Прохватилова //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 1998. - № 5 . - С. 65-68.

58. Прохватилова, JI. Б. Применение ПЦР для раннего обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота у экспериментально инфицированных животных / JI. Б. Прохватилова // Ветеринария. -2001. -№ 8. С. 17-21.

59. Рис, Э. Введение в молекулярную биологию / Э. Рис, М. Стернберг. -М.: Мир, 2002. 142 с.

60. Свириденко, Г. М. Лейкоз скота и безопасность молочных продуктов / Г. М. Свириденко, Е. Г. Семова // Молоч. пром-сть. 2003. - № 7. -С. 8-10.

61. Слепченко, А. Р. Главный комплекс гистосовместимости сельскохозяйственных животных: иммуногенетические и популяционные аспекты / А. Р. Слепченко // Успехи современной генетики. 1994. -№ 19. - С. 178-205.

62. Смирнов, Ю. П. Влияние лейкоза на молочную продуктивность коров / Ю. П. Смирнов // Молочное и мясное скотоводство. 1999. - № 4. -С. 25-28.

63. Смирнов, Ю. П. Развитие лейкозного процесса у инфицированных ВЛКРС коров в зависимости от их возраста / Ю. П. Смирнов // Ветеринария.-1999.-№ 12.-С. 15-17.

64. Смирнова, В. Н. К вопросу о токсичности молока коров, больных лейкозом / В. Н. Смирнова // Сб. науч. тр. / Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с лейкозами сельскохозяйственных животных и птиц. Екатеринбург, 2000(6). -С.240-242.

65. Снежков, Н. И. Молоко лейкозных животных фактор эпизоотического процесса / Н. И. Снежков // Ученые-аграрники - с.-х. пр-ву. -Кострома. - 1995. - Т. 1. - С. 35.

66. Сулимова, Г. Е. Генотипирование локуса каппа-казеина у крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции / Г. Е. Сулимова, Г. О. Шайхаев, Э. М. Берберов // Генетика. 1991. -Т. 27.-С. 2053-2062.

67. Сулимова, Г. Е. ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу / Г. Е. Сулимова, И. Г. Удина, Г. О. Шайхаев, И. А. Захаров // Генетика. -1995.-№9.- С. 1294-1299.

68. Сюрин, В. Н. Ветеринарная вирусология / В. Н. Сюрин, Р. В. Белоусова, Н. В. Фомина.-М.: Агропромиздат, 1991.-431с.

69. Удина, И. Г. Использование ДНК-технологий для оценки наследственной устойчивости к заболеванию лейкозом / И. Г. Удина // Биотехнология в животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II международной научн. конф.: М., 2000. - С. 219-220.

70. Удина, И. Г. Гены главного комплекса гистосовместимости человека и животных / Удина, И. Г. // Успехи современной генетики. 1994. -№ 19.-С. 133-177.

71. Херингтон, С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / С. Херингтон. М.: Мир, 1999. - 558 с.

72. Эрнст, Л. К. Особенности распространения антигенов BoLA-A и аллелей гена BoLA -DRB3 у черно-пестрого скота в связи с ассоциацией с лейкозом / Л. К. Эрнст, Г. Е. Сулимова, А. Р. Орлова // Генетика. -1997.-Т.ЗЗ.-№ 1.-С. 87-95.

73. Уильяме Б. Методы практической биохимии / Б. Уильяме, К. Уилсон -М.: Мир, 1978.-272 с.

74. Xu, A., Van Eijk V. J. Т., Park Ch. Polymorphism in BoLA-DRB3 Exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus / A. Xu, V. J. T. Van Eijk, Ch. Park // Immunology. 1993. -V. 151.-№12.-P. 6977-6985.

75. Aida, Y. Further phenotypic characterization of target cells for bovine leukemia virus experimental infection in sheep / Y. Aida, M. Miyasaka, K. Okada // Vet. Res. 1989. - № 50. - P. 1946-1951.

76. Ammer, H. Exonic polymorphism versus intronic simple repeat hypervariability in MHC-DRB genes / H. Ammer, F-W. Schwaiger, C. Kammerbauer // Immunogenetics. 1991 - № 35. - P. 332-340.

77. Amorena, B. Serologically defined (SD) locus in cattle / B. Amorena & W. H. Stone // Science. 1978. - № 201. - P. 159-160.

78. Andersson, Genomic hybridization of bovine class II major histocompatibility genes. 1 extensive polymorphism of DQ-alpha and DQ-beta genes L / Andersson, J. Bohme, A. Peterson, L. Rask // Animal Genetics. 1986.17.-P. 95-112.

79. Andersson, L. Linkage relationships in the bovine MHC region high recombination frequency between class II subregions / L. Andersson, A. Lunden, S. Sigurdardottir, CJ. Davies, L. Rask // Immunogenetics. - 1988. -№27.-P. 273-280.

80. Barroso, A. Technical Note: Detection of Bovine Kappa-Casein Variants A, В, C, and E by Means of Polymerase Chain Reaction-Single StrandConformation Polymorphism (PCR-SSCP) / A. Barroso, S. Dunner // J. Anim. Sci. -1998.-№76.-P. 1535-1538.

81. Beier, D. Possibilities and limitations for use of the polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) infection in cattle /

82. D. Beier, P. Blankenstein, H. Fechner//Zentralbl. Veterinarmed. B. 1992. -V. 39.-№ l.-P. 69-77.

83. Biozzi, G. Selection of mice with high and low antibody response to complex immunogens / G. Biozzi, C. Stiffel, D. Mouton, & Y. Bouthilier // Immunogenetics and Immunodeficiency. 1974. - №5. - P. 180-225.

84. Biozzi, G. Genetic regulation of immunoresponsiveness in relation to resistance against infectious diseases / G. Biozzi // Genet. Appl. Liv. Prod. Proc.: 2 World Congr. / Madrid. 1982. - P. 150-163.

85. Bjorkman, P. J. The foreign antigen binding site and T ceil recognition regions of class I histocompatibility antigen / P. J. Bjorkman, M. A. Saper,

86. B. Sarnraoui, W. S. Bemett, J. L. Strominger & D. C. Wiley //Nature. -1987. -№ 329.-P. 512-518.

87. Burke, M. G. Nucleotide-sequence and northern analysis of a bovine major histocompatibility class II DR- beta-like cDNA / M. G. Burke, R. T. Stone, N.

88. E. Muggli-Cockett // Animal Genetics. 1991. - № 22. - P. 343-352.

89. Burny, A. Bovine leukemia virus: a new mode of leukemogenesis / A. Burny,

90. C. Bruck, Y. Cleuter // Advances in viral oncology. 1985. - P. 35-55.

91. Carli, К. T. Detection of IgG antibody to bovine leukemia virus in urine and serum by two enzyme immunoassays / К. T. Carli, A. Sen, H. Batmaz, E. Kennerman // Lett. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 28. - № 6. -P. 416^18.1. Company, Austin. (1997)

92. Creighton, P. Mapping of bovine markers CYP21, PRL, and BoLA DRBP1 by genetic linkage analysis in reference pedigrees / P. Creighton, A. Eggen, R. Fries, SA. Jordan, J. Hetzel, EP. Cunningham, P. Humphries // Genomics. 1992. -№ 14. -P. 526-528.

93. Da, Y. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus-infected dairy cattle with persistent lymphocytosis / Y. Da, R. D. Shanks, J. A. Stewart, H. A. Lewin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. -№ 94. - P. 6538-6541.

94. Davies, C.J. Polymorphism of bovine MHC class I genes Joint report of the Fifth International Bovine Lymphocyte Antigen (BoLA) / C. J. Davies // European Journal of Immunogenetics. - 1994. - № 21. - P. 239-258.

95. Debacq, C. Reduced Cell Turnover in Bovine Leukemia Virus-Infected, Persistently Lymphocytotic Cattle / C. Debacq, B. Asquith, M. Reichert, A. Burny, R. Kettmann, L. Willems // J. Virol. 2003. -№ 77. -P. 13073-13083.

96. Fries, R. The bovine gene map / R. Fries, I.S. Beckmann, M. Georgies // Animal Genetics. 1989. - V. 20. - P. 3-29.

97. Goulian, M. Enzymatic Synthesis of DNA, XXIII. Synthesis of Circular Replicative Form of Phage XI74 DNA / M. Goulian, A. Kornberg // Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1967. -№58.-P. 1723-1730.

98. Groenen, M. A. M. The nucleotide sequence of bovine MHC class II DQB and DRB genes / M. A. M. Groenen // Immunogenetics. 1990. - № 31. -P. 37.

99. Gruen, I. R. Evolving views of the major histocompatibility complex / I. R. Gruen & S. M. Weissman // Blood. 1990. - № 48 - P. 4252^265.

100. Harding, C.V. МНС molecules and antigen presentation / C.V. Harding // Animal. Genetics. 1997. - V. 27. - P. 91-96.

101. Hawken, R. J. Resolving the genetics of resistance to infectious diseases / R. J. Hawken, C. W. Beattie & L. B. Schook // Revue Scientifique et Technique.- 1998.-№ 17.-P. 17-25.

102. Hill, A. V. S. The immunogenetics of human infectious diseases / A. V. S. Hill // Annual Review of Immunology. 1998. - № 16. -P. 593-617.

103. Hoj, S. Growth hormone gene polymorphism associated with selection for milk fat production in lines of cattle / S. Hoj // Animal. Genetics. 1993. -V. 24.-P. 91-96.

104. Kornberg, A. Metaphosphate synthesis by an enzyme from Escherichia coli /

105. A. Kornberg, S. R. Kornberg, E. S. Simms // Biochimica et Biophysica Acta. 1956. - № 20. - P. 215-227.

106. Kuzmak, J. Wykywanie prowirusowego DNA wirusa bialaczki bydla metoda polymerase chain reaction (PCR) / J. Kuzmak, J. Grundboeck,

107. B. Kozachinska // Medycyna Wet. 1993. - V 49. -№ 7. - P. 312-315.

108. Lagziel, A. An Msp I polymorphism at the bovine growth hormone gene is linked to a locus affecting milk protein percentage / A. Lagziel // Animal. Genetics. 1999. -V. 30. - P. 296-299.

109. Lagziel, A. Association between SSCP haplotypes as the bovine growth hormone gene and milk protein percentage / A. Lagziel, A. Lipkin, M. Soller // Genetics. 1996. - V. 142. - P. 945-951.

110. Lechler, R. The roies of class 1 and class II molecules of the major histocompatibility complex in T cell immunity / R. Lechler // HLA and disease. 1994. - № 5 - P. 49-72

111. Levin, H. A. Association between BoLA and subclinical in bovine leukemia virus infection in a herd of Holstein Friesian cows / H. A. Levin, M. C. Wu, J. A. Steward // Immunogenetics. - 1988. - № 27. - P. 338-344.

112. Maillard, J.C., Renard, C., Chardon, P., Chantal, I., Bensaid, A. Characterisation of 18 new BoLA-DRB3 alleles. / J.C. Maillard, C. Renard, P. Chardon, I. Chantal, A. Bensaid // Animal Genetics. 1999. - № 30. -P. 200-203.

113. Maltseva, N. A. Use of diagnostic DNA probes for detection of the provirus of bovine leukemia virus in infected cows / N. A. Maltseva, A. S. Kaledin, E. I. Oliynik, A. A. Zhivotov, V. I. Baranov // Problems of Virology. -2002.-№ 6.-P. 25-33.

114. McDevitt H.O. & Benacerraf B. Genetic control of specific immune responses / H.O. McDevitt & B. Benacerraf // Advances in I mmunology. 1968. - № 11. - P. 31-74.

115. McDevitt H.O., Deak В .D ., Shreffler D .С., Klein I., Stimpfling J.H & Snell G.D. Genetic control of the immune response. Mapping of the Ir-1 locus. // Journal of Experimental Medicine (1972) 135, 1259-1278 .

116. McDevitt, H.O. Mapping of the Ir-1 locus / H.O. McDevitt, B. D. Deak, D. C. Shreffler, I. Klein, J. H. Stimpfling & G. D. Snell // Journal of Erperimental Medicine . 1972. -№ 135. - P. 1259-1278.

117. Meirom, R. Levels and role of cytokines in bovine leukemia virus (BLV) infection / R. Meirom, S. Moss, J. Brenner, D. Heller and Z. Trainin // Leukemia. 1997. -№ 11. - P. 219-220.

118. Miretti, M. M. Restriction fragment length polymorphism (RLFP) in exon 2 of the BoLA-DRB3 gene in South American cattle / M. M. Miretti, J. A. Ferro // Biochem Genet. 2001. - № 39. - P. 311-324.

119. Muggli-Cockett, NE. Identification of genetic-variation in the bovine major histocompatibility complex DR- beta like genes using sequenced bovine genomic probes / NE. Muggli-Cockett, RT. Stone // Animal Genetics. -1988.-№ 19.-P. 213-225.

120. Muggli-Cockett, NE. Partial nucleotide-sequence of a bovine major histocompatibility class II DR beta-like gene / NE. Muggli-Cockett, RT. Stone // Animal Genetics. 1989. -№ 20. - P. 361-369.

121. Mullis, K. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction / K. Mullis, F. Faloona // Meth. Enzymol. 1987. - V. 155. -P. 335-350.

122. Park, C. Genetic-mapping of F13A to BTA23 by sperm typing difference in recombination rate between bulls in the DYA-PRL interval / C. Park, I. Russ, Y. Da, HA. Lewin // Genomics. - 1995. - № 27. - P. 113-118.

123. Paul, W. E. Genetic control of the immune response to hapten-poly-L-lysine conjugates / W. E. Paul, I. Green & B. Benacerraf // Journal of the Reticuloendothelial Society. 1968. - № 5. - P. 282- 293.

124. Puel, A. Mapping of genes controlling quantitative antibody production in Biozzi mice / A. Puel, P. C. Groot, M. G. Lathrop, P. Demant & D. Mouton // Journal of Immunology. 1995. -№ 154. - P. - 5799-5805.

125. Puel, A. Genes responsible for quantitative regulation of antibody production / A. Puel & D. Mouton // Critical Reviews in Immunolog. 1996. - № 16. -P. 223-250.

126. Rando, A. Identification of bovine k-casein genotypes at the DNA level / A. Rando // Anim. Genet. 1988. - V. 19. - P. 51-54.

127. Rumyantsev, S. N. Observations on constitutional resistance to infection / Rumyantsev S. N. // Immunology Today. 1992. - № 13. - P. 184-187.

128. Shanks, R. D. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus infected Holstein cattle with persistent lymphocytosis / R. D. Shanks, J. A. Steward, H. A. Levin // Agricultural Sciences. - 1993. - V. 90. - № 6. -P. 6538-6541.

129. Sharif, S. Characterization of naturally processed and presented peptides associated with bovine major histocompatibility complex (BoLA) class II DR molecules / S. Sharif// Eur. J. Immunogenet. 2002. - № 29. - P. 223-227.

130. Sharif, S. Presence of glutamine at position 74 of pocket 4 in the BoLA DR antigen binding groove with occurrence of clinical mastitis caused by Staphylococcus species / S. Sharif, B. A. Mallard // Immunogenetics. -2000.-№51.-P. 733-742.

131. So, A. Genetics, polymorphism and regulation of expression of HLA region genes / A. So // HLA and diseme. 1994. - № 4. - P. 1-34.

132. Stear, M. J. Genetic resistance to parasitic infection / M. J. Stear & D. Wakelin // Revue Scientzpque er Technique. 1998. - №17. - P. 143-153.

133. Stone, RT. BoLA-DIB species distribution, linkage with DOB, and northern analysis / RT. Stone, NE. Muggli-Cockett // Animal Genetics. - 1993. -№ 24. - P. 41—45.

134. Vaiman, M. Evidence for a histocompatibility system in swine (SL-A) / M. Vaiman, C. Renard, P. LaFage, J. Ameteau & P. Nizza // Transplantarion. 1970. - № 10. - P. 155-164.

135. Vaiman, M. Porcine major histocompatibility complex / M. Vaiman, P. Chardon & M. F. Rothschild // Revue Scientifique et Technique. 1998. -№ 17.-P. 95-107.

136. Van der Poel, JJ. The Nucleotide sequence of the bovine MHC class II alpha genes DRA, DQA, and DYA / JJ. van der Poel, MAM. Groenen, RJM. Dijkhof, D. Ruyter, MJ. Giphart // Immunogenetics. - 1990. - № 31. -P. 29-36.

137. Van Eijk, M. J. T. Development of persistent lymphocytosis in cattle is closely associated with DRB2 / M. J. T. Van Eijk, J. A. Stewart-Haynes, J. E. Beever, R. L. Fernando & H. A. Lewin // Immunogenetics. 1992. -№37.-P. 64-68.

138. Van Eijk, M. J. T. Extensive polymorphism of the BoLA DRB3 gene distinguished PCR-RFLP / M. J. T. Van Eijk, J. A. Stewart-Haynes, H. A. Lewin // Anim. Genet. 1992. V.- № 23. - P. 483^96.

139. Van Eijk, MJT. Genetic mapping of BoLA-A, CYP21, DRB3, DYA, and PRL on BTA23 / MJT. Van Eijk, JE. Beever, Y. Da, JA. Stewart, GE. Nicholaides, С A. Green, HA. Lewin // Mammalian Genome. 1995. -№6.-P. 151-152.

140. Van Eijk, MJT. Order of Bovine DRB3, DYA, and PRL determined by sperm typing / MJT. Van Eijk, I. Russ, HA. Lewin // Mammalian Genome. -1993;-№4.-P. 113-118.

141. Watson, J.D. Molecular structure of nucleic acids / J.D. Watson, F.H.C. Crick //Nature.- 1953.-V. 171.- P. 737-741.

142. Wu, D. In vivo transcription of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency-like virus / D. Wu, K. Murakami, A. Morooka, H. Jin, Y. Inoshima, H. Sentsui // Virus Research. 2003. - № 97. - P. 81-87.

143. Xu, A. Sequencing and genetic analysis of a bovine DQB cDNA clone / A. Xu, TJ. Clark, MR. Teutsch, LB. Schook, HA. Lewin // Animal Genetics. 1991. - № 22. - 381-398.

144. Xu, A.L. Sequencing and genetic analysis of a bovine DQA cDNA clone / A.L. Xu, K. Mckenna, H.A. Lewin // Immunogenetics. 1993. - № 37. -P. 231-234.

145. Yoshinaka, Y. Bovine leukemia virus protease: purification, chemical analysis and in vitro processing of gag procersor polyprotein / Y. Yoshinaka, I. Katon, T. D. Copeland // J. Virol. 1986. - V 57. - № 3. - P. 826-832.

146. Zadworny, D. The identification of the kappa-casein genotype in Holstein dairy cattle using polymerase chain reaction / D. Zadworny, U. Kuhlein // Theor. and Appl. Genetics. 1990. - V. 80. - P. 631.

147. Zanotti, M. Association of BoLA class II haplotypes with subclinical progression of bovine leukaemia virus infection in Holstein Friesian cattle / M. Zanotti // Anim. Genet. - 1996. - № 27. - P. 337-341.

148. Zinkernagel, R. M. Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity m lymphocytic chonomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system / R. M. Zinkernagel & P. C. Doherty // Nature. 1974. - № 248. - P. 701-702.

Информация о работе

Белов, Денис Евгеньевич
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Совершенствование биотехнологических и молекулярно-генетических методов при изучении генов, определяющих устойчивость к заболеваниям и молочную продуктивность - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы