Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3, влияющего на устойчивость к лейкозу, и генов молочной продуктивности у быков-производителей

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3, влияющего на устойчивость к лейкозу, и генов молочной продуктивности у быков-производителей"

На правах рукописи

Смазнова Ирина Александровна

ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ВоЬА-ОЛВЗ, ВЛИЯЮЩЕГО НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЛЕЙКОЗУ, И ГЕНОВ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ ' У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

Специальность 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005548975

_ п _ 2 2 ПАЙ 2014

г. Санкт-Петербург 2014

005548975

Работа выполнена в Инновационном научно-образовательном центре биотехнологии и экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Брянский государственный университет имени академика И.Г. Петровского»

Научный руководитель: доктор биологических наук, директор инновационного

научно-образовательного центра биотехнологии и экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Брянский государственный университет имени академика И.Г. Петровского», Нам Ирина Ян Гуковна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, заведующая

лаборатории ДНК-технологий Всероссийского научно-исследовательского института племенного животноводства Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, Калашникова Любовь Александровна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных» Российской академии сельскохозяйственных наук, Дементьева Наталья Викторовна

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства (ГНУ Северо-Кавказский НИИЖ)

Защита диссертации состоится «27» июня 2014 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 006.012.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и селекции сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии: 196601, Санкт-Петербург - Пушкин, Московское шоссе, 55 а ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии.

Факс: 8-(812)-465-99-89, e-mail: spbvniigen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции сельскохозяйственных животных.

Автореферат разослан "6." .2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Г.Н. Сердюк

Актуальность проблемы. В последние два десятилетия в развитых странах Евросоюза, США, Канаде бурно развивается геномная селекция крупного рогатого скота, основанная на применении ДНК-технологий. Разработка ДНК-маркеров хозяйственно - ценных признаков позволила проводить экспресс-оценку поголовья на устойчивость к инфекционным заболеваниям и стрессорным факторам внешней среды, выявлять племенных животных с высоким генетическим потенциалом молочной и мясной продуктивности, высоким качеством продукции. Молекулярно-генетическая оценка племенного поголовья коров и быков является важнейшим этапом селекционной работы при разведении скота.

В России также проводились работы по применению метода ДНК-маркеров для генотипирования коров по генам хозяйственно-ценных признаков. Так, изучалась генетическая устойчивость к вирусу лейкоза КРС коров из разных регионов страны (Сулимова, 1993; Удина и др., 2009; Эрнст, 2003), был щучен аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB, связанного с генетической устойчивостью животных к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, у разных пород КРС (Шарифуллина, 2006; Быков,2009; Рузина, 2012; Козлов и др., 2012). В проведенных ранее исследованиях аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 в некоторых племенных хозяйствах Брянской области было выявлено 6-15% коров, несущих аллели устойчивости в гомозиготном состоянии, и до 32% генетически устойчивых к вирусу лейкоза коров, имеющих генотипы У/Н и У/Ч (Кожевина и др., 2009; Смазнова и др., 2010; Козлов и др., 2011), что объясняет сравнительное благополучие этих хозяйств относительно распространенности лейкоза.

Особое значение для разведения крупного рогатого скота имеет генетическая оценка быков-производителей, используемых для производства семени на государственных племенных предприятиях (станциях). В настоящее время в литературе имеется незначительное число работ по применению ДНК-маркеров для генетического анализа быков-производителей по устойчивости к лейкозу и генам молочной продуктивности.

Исследования по аллельному полиморфизму гена BoLA-DRB3 быков-производителей разных пород из государственных племенных станций Краснодарского края, Московской, Ленинградской и Ростовской областей, Карелии, Финляндии, Норвегии были проведены в работах Ковалюк (2008), Сацука (2009), Мачульской (2009). В этих работах было показано существенное преобладание у племенных быков — производителей аллелей чувствительности к ВЛКРС, практически полное отсутствие быков, несущих аллели устойчивости в гомозиготном состоянии, и незначительное количество быков с аллелями У в гетерозиготном состоянии -1114%.

Большое значение для повышения продуктивности молочного стада имеет генетический анализ быков по мажорным генам, влияющим на лактацию и качество продукции. Рядом авторов исследовался полиморфизм генов, определяющих молочную продуктивность: соматотропина, ß - лактоглобулина, пролактина (Сулимова, 2008; Гладырь, 2006; Дроздов, 2013), а также качество молока по гену каппа-казеина (Дроздов, 2013).

Целью настоящей работы является исследование быков-производителей разных пород Брянской области, быков черно-пестрой породы племенной станции ОАО «Невское» и быков голштинской породы из «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ HAH Беларуси по животноводству, по устойчивости к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), а также изучение генетического полиморфизма быков-производителей разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности.

Задачи исследования:

1. Провести анализ генетической устойчивости к ВЛКРС по аллелям гена BoLA-DRB3 у быков-производителей разных пород из ОАО «Брянское» - Брянская госплемстанция; у быков-производителей черно-пестрой породы из ОАО «Невское» - госплемстанция Ленинградской области; у быков - производителей голштинской породы из «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ HAH Беларуси по животноводству;

2. Провести генотипирование быков - производителей разных пород Брянской области по генам, связанным с молочной продуктивностью и качеством молока:

- ген гормона роста,

- ген бета-лактоглобулина,

- ген пролактина,

- ген каппа-казеина.

Научная новизна.

Впервые исследован аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3, ответственного за устойчивость к вирусу лейкоза КРС, и генов, связанных с молочной продуктивностью у быков черно-пестрой, симментальской, швицкой, красно-пестрой и абердин-агусской пород.

Установлено, что у быков черно-пестрой породы преобладают аллели чувствительности и их частота увеличивается с ростом степени голштинизации, а доля аллелей устойчивости падает. При этом с увеличением уровня голштинизации наблюдается сужение аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3.

У быков производителей других пород выявлено преобладание нейтральных аллелей и снижение доли аллелей чувствительности.

Оценен потенциал быков - производителей из разных племпредприятий как доноров генетической устойчивости к ВЛКРС.

Впервые изучен аллельный полиморфизм быков-производителей разных пород государственной племенной станции Брянской области по генам соматотропина, бета-лактоглобулина, пролактина, каппа-казеина. Выявлены все парные аллели для каждого изучаемого гена.

Практическая значимость работы. Результаты анализа аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 у быков-производителей Брянской области являются основой для планирования племенной работы по обогащению поголовья КРС Брянской области аллелями устойчивости к ВЛКРС и повышению генетической устойчивости стад КРС к вирусу лейкоза. Оценка потенциала быков - производителей из разных племпредприятий как доноров генетической устойчивости к ВЛКРС позволяет направленно использовать быков при разведении скота, устойчивого к лейкозу.

Оценка генетического потенциала молочной продуктивности быков-производителей Брянской области по генам соматотропина, бета-лактоглобулина, пролактина, каппа-казеина позволяет планировать использование выявленных высокоценных особей в разведении скота, что приведет к повышению продуктивности молочного производства региона в целом.

Положения, выносимые на защиту.

1. Результаты анализа генетической структуры поголовья быков-производителей разных пород крупного рогатого скота ОАО «Брянское» - государственной племенной станции Брянской области по аллелям гена BoLA-DRB3.

2. Сравнение генетической структуры поголовья быков-производителей разных пород крупного рогатого скота ОАО «Брянское» - государственной племенной станции Брянской области по аллелям генов молочной продуктивности.

3. Сравнительная характеристика аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 поголовья быков-производителей черно-пестрой и голштинской породы крупного рогатого скота ОАО «Брянское», ОАО «Невское» - государственной племенной станции Ленинградской области и «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ HAH Беларуси по животноводству.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на следующих конференциях:

Всероссийская выставка «Золотая осень», 2012 год - бронзовая медаль, 2013 год — серебряная медаль; Международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 2010; Научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал молодежи на службу России», Брянск, 2011; «Международная научно-практическая конференция «Трансфер инновационных биотехнологий в растениеводстве, животноводстве, медицине, экологии», Брянск, 2012; 111 и IV региональная научно-практическая конференция молодых исследователей и специалистов «Приоритетные направления современной науки: фундаментальные проблемы.

инновационные проекты», Брянск, 2012, 2013; Международная конференция ученых «Трансфер инноващганных биотехнологий а селекции растений, экологии, растениеводстве, животноводстве». Республика Беларусь, г. Брест, 2012; II Среднерусский экономический форум. Выставка-презентация инновационных проектов молодых ученых и специалистов Центрального федерального округа и диалога с экспертами «Молодежь в инновационном пространстве. Идеи молодых в оценке компетентных профессионалов» Курск, 2013;VIII Международная научная конференция "Факторы экспериментальной эволюции организмов", Украина, Алушта, 2013; Международная научно-практическая конференция «Научное обеспечение инновационного развития животноводства», Жодино, Беларусь, 2013; - на конкурсе УМНИК Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере; -на Всероссийской выставке-форуме РосБиоТех-2012.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах, состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, материал и методика проведения исследований, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Работа содержит 9 таблиц, 35 рисунков и 6 приложений. Список цитируемой литературы содержит 196 источников, из них 152 на английском языке.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК.

Работа поддержана грантами: 1. Минобрнауки АВЦП 2.1.1./224 (2009-2011) «Развитие фундаментальных исследований по биотехнологии растений, животных, нанобиотехиологии»

2. ФЦП 1.1. № 02.740.11.0285 (2009 — 2011) «Проведение фундаментальных и прикладных исследований по биотехнологии растений и животных и нанобиотехиологии и развитие малого бизнеса на основе инновационных разработок»

3. Администрация Брянской области. ХД № 125, (2008-2009) «Разработка биотехнологических подходов для повышения рентабельности животноводства в Брянской области (КРС) за счет формирования молочного стада с гснстической устойчивостью к лейкозу, высоким потенциалом молочной продуктивности и высоким качеством молока».

Материалы и методы исследования.

Исследования проводились в Инновационном научно-образовательном центре биотехнологии и экологии Брянского государственного университета в период с 2011 по 2013 гг.

В работе были исследованы образцы спермы быков разных пород ОАО «Брянское» (52 быка), быков черно-пестрой и голштинской пород ОАО «Невское» Ленинградской области (29 быков) и «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ HAH Беларуси по животноводству (12 быков).

Общая схема проводимых исследований представлена на рис. 1:

Выделение ДНК из спермы проводили с помощью набора реактивов «ExtraGene™ DNA Prep 100».

Полимеразную цепную реакцию и синтез праймеров проводили согласно методике Сулимовой Г.Е. (1999):

HLO-30 (Forward) 5'-ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3';

HLO-32 (Reverse) 5'-TCGCCGCTGCACAGTGAAACTCTC-3'. Для рестрикции использовали три фермента: Rsa I (37 °С), Нае Ш (37 °С) и Bst Х21 (60°С).

Анализ аллельного полиморфизма генов соматотропина, бета-лактоглобулина, пролактина и каппа-казеина проводили по описанным ранее методам.

Рисунок 1. Общая схема исследований

Частоту встречаемости аллелей определяли по формуле:

р=(2^+Ы2)/2п,

где N1 - число гомозигот по исследуемому аллелю, Ыг-число гетерозигот, п - объем выборки.

Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по формуле:

Нс = Ь(р2+Ч2Х

где Не — ожидаемая гетерозиготность, р - частота аллеля А, ц - частота аллеля В. Для оценки избытка гетерозигот в изучаемых выборках животных использовали коэффициент Селендера:

П = (Но-ШУНо-

где Но - наблюдаемая гетерозиготность, Нс - ожидаемая гетерозиготность Для оценки достоверности отклонения распределения выявленных частот аллелей от теоретически ожидаемого использовали критерий хи-квадрат.

Результаты и обсуждение

1. Генетический полиморфизм крупного рогатого скота по гену ВоЛА-ОЯВЗ.

1,1, Анализ аллельного полиморфизма гена ВоЬА-ВЯВЗ методом ПЦР-ПДРФ.

Изучение генетической устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза КРС методом ПЦР-ПДРФ основано на определении генетического полиморфизма гена ВоЬА-[ЖВЗ и выявлении аллелей, ассоциированных с устойчивостью или чувствительностью к ВЛКРС и ответственных за формирование иммунной реакции к вирусу.

Рисунок 2. Электрофорез геномной Рисунок 3. Электрофорез продуктов

ДНК из образцов спермы в 1% агарозном геле ПЦР экзона 2 гена ВоЕА-ОКВЗ

риСШМэр 1 -маркер молекулярных масс, К - отрицательный контроль, 1-9 - исследуемые образцы

Образцы ДНК, выделенной из спермы, проверяются с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (рис.2). На рис. 3 видно, что полимеразная цепная реакция с геномной ДНК из образцов спермы прошла хорошо, в геле видна полоса ДНК с ожидаемым размером 284 п.о., что свидетельствует о достаточном количестве в пробе дезоксинуклеозидтрифосфатов, Тас]-ДНК-полимеразы, правильном составе буфера для полимеразной реакции.

Фрагмент 284 п.о. далее расщепляли рестрицирующими эндонуклеазами Яэа I, Нае Ш и/или Вэ! Х21 с последующим разделением полученной смеси фрагментов ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и определением длин рестрикционных. фрагментов (рис. 4).

а) б) в)

Рисунок 4. Электрофорез продуктов рестрикции а) эндонукдеаза Rsa I; б) эндонукяеаза Нае III в) эндонуклеаза Bst X2I pUC19/Msp I - маркер молекулярных масс; 50-61 - исследуемые образцы

Различия в нуклеотидной последовательности различных аллелей гена BoLA-DRB3 (т. е. полиморфизм на уровне ДНК) лежат в основе различного распределения сайтов рестрикции фрагмента 284 п.о., поэтому аллельньш полиморфизм ДНК будет проявляться как полиморфизм длин рестрикциоиных фрагментов (ПДРФ). Аллельные варианты гена определяли по наличию или отсутствию указанных сайтов рестрикции согласно ранее полученным таблицам Сулимовой (1993). Для выявления генетической устойчивости КРС к лейкозу необходимо выявить наличие аллелей гена BoLA-DRB3, ответственных за формирование иммунной реакции к вирусу.

1.2. Аллельньш полиморфизм гена BoLA-DRB3 у быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных регионов

Основная разводимая в Брянской области порода КРС - черно-пестрая голштинизированная, сильно подвержена инфицированию вирусом лейкоза КРС. Изучение аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород имеет важнейшее значение для развития молочного животноводства.

Распределение частот аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС, представлено в таблице 1. Как следует из данных таблицы I, быки из 3 разных регионов имеют в совокупности 17 разных аллелей из 54 возможных. При этом наблюдается значительное преобладание в этих популяциях быков-производителей, несущих аллели восприимчивости к вирусу лейкоза. Наибольшее количество животных несет аллели восприимчивости к вирусу лейкоза КРС *22, *24 и в меньшее количество быков - *8. Общее количество аллелей восприимчивости к лейкозу изменяется от 60,3% в Брянском стаде до 67,2% в Ленинградской области и до 70,8% у белорусских быков.

Распределение аллелей гена BoLA-DRB3 у быков - производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных племенных хозяйств показано на рисунке 5.

Таблица 1

Частота встречаемости аллелей BoLA-DBD3 у быков черно-пестрой и голштинской пород

№ Частота аллелей

аллеля ОАО «Брянское», ОАО «Невское» «ЖодиноАгроПлемЭлита»

(п = = 29) (п=29) (п=12)

Аллели, определяющие чувствительность к лейкозу

8 6,9 1,7 12,5

16 12,0 25,9 16,7

22 19,0 60,3 13,7 67,2 8,3 70,8

24 22,4 25,9 33,3

Аллели, определяющие устойчивость к лейкозу

¡1 8,6 19,1 1,7 12,1 4,2 8,4

23 8,6 6,9

28 1,7 3,5 4,2

Аллели, нейтральные по отношению к лейкозу

3 1,7 20,6 12,1 20,7 12,5 20,8

7 6,9 0 0

9 1,7 0 0

10 1,7 6,9 0

14 0 0 4,2

18 1,7 0 0

20 1,7 0 0

27 0 0 4,2

32 1,7 0 0

37 3,5 1,7 0

Все аллели 100 100 100

Сиектр алледен

Рисунок 5. Распределение аллелей гена Во1_А-1ЖВЗ у быков черно-пестрой породы госплемстанции ОАО «Брянское»

На рис, 5 показано, что аллельный спектр у быков-производителей госплемстанции ОАО «Брянское» достаточно узкий - всего 15 разных аллелей из 54 известных. При этом у быков черно-пестрой породы Брянской области имеются все варианты аллелей чувствительности к вирусу лейкоза КРС, из них преобладают *24 и * 22 аллели с частотой встречаемости 22,4% и 19% соответственно. Из 3 аллелей устойчивости *11 и *23 имеют частоту 8,6% и *28 - 1,7%. Нейтральные аллели представлены только 8 вариантами.

30 25 20 15 1(1 5 0

.................................—

пШоЯЫяЫШЬяь*'

16 »22 *24 "11 *23 »28

Спектр аллелей

"10 -37

Рисунок 6. Распределение аллелей гена ВоЬА-ОШЗЗ у быков черно-пестрой породы госплемстанции ОАО «Невское»

На рисунке 6 видно, что у быков черно-пестрой породы госплемстанции ОАО «Невское» количество чувствительных аллелей в 2 раза превышает количество устойчивых и нейтральных аллелей, при этом почти по 26% приходится на долю *16 и »24 аллелей. В изученной выборке имеются все три аллеля устойчивости, из них доминирующим является 423 аллель. Из 29 особей только 3 быка имеют нейтральные аллели - *3, *10 и *37.

Похожая картина в распределении аллелей наблюдается и у быков голштино-фризской породы из Республики Беларусь (рис. 7). На долю аллелей чувствительности приходится 70,8%. Всего 2 быка имеют аллели устойчивости - *11 и *28. Нейтральные аллели представлены тремя вариантами - *3, *14 и *27.

Анализ полученных данных приводит к выводу, что у быков-производителей черно-пестрой голттинизированной и голштино-фризской пород, принадлежащих госплемстанциям Брянской и Ленинградской областей и Беларуси, наблюдается резкий сдвиг в сторону аллелей чувствительности: 60,3%, 67,2% и 70,8% соответственно. Поскольку степень голштинизации самая низкая у брянских быков и самая высокая у белорусских быков, то можно сделать вывод о корреляции между уровнем голштинизации стада и количеством аллелей чувствительности.

Брянские и ленинградские быки имеют по 3 аллеля устойчивости к ВЛКРС. их количество невелико у брянских быков (19.1%), оно снижается почти в полтора раза у ленинградских животных (12,1%). У быков из Беларуси выявлено 2 аллеля устойчивости к лейкозу, общее их количество составляет 8,4%.

Важное значение имеют данные по полиморфизму нейтральных аллелей -геиотипирование животных показало, что при повышении степени голштинизации происходит не только уменьшение доли нейтральных и устойчивых аллелей, но и резкое сокращение их разнообразия. Общее количество нейтральных по отношению к вирусу лейкоза аллелей практически одинаково во всех 3 группах (20,6% - 20,8%), но важно отметать резкое уменьшение числа аллелей - так называемое «аллельное сужение»: от 8 в ОАО «Брянское» до 3 в остальных популяциях. Это очень опасная тенденция, поскольку ген ВоЬА-ЭКВЗ входит в главный комплекс гистосовместимости и определяет формирование гуморального и клеточного иммунитета не только на вирус лейкоза КРС, но и в ответ на другие патогенные микроорганизмы, в том числе вызывающие опасные заболевания - туберкулез, бруцеллез, мастит и др. Сужение аллельного спектра означает снижение защитной реакции организма на проникновение разных инфекционных микроорганизмов, что может привести к массовому распространению заболеваний, вызываемых этими патогенами.

Полученные результаты хорошо согласуются с результатами генетических исследований быков - производителей из племенных предприятий Ленинградской, Московской и Ростовской областей. Краснодарского края, Карелии и Финляндии (Ковапюк, 2008; Сацук, 2009; Мачульская, 2009).

В работе Сацука В.Ф. (2009) в группе из 293 голштинских быков из госплемстанций Краснодарского края, Ростовской и Ленинградской областей и Карелии было выявлено всего 25

О

Пб *22 *24 *П *28 *3 П4 *2

Спектр аллелей

Рисунок 7. Распределение аллелей гена ВоЬА-ОИБЗ у быков черно-пестрой породы «ЖодиноАгроПлемЭлита»

аллелей гена ВоЬА-1ЖВЗ. При этом аллели, определяющие восприимчивость к вирусу лейкоза, имеют высокую частоту встречаемости, что говорит об их селекционной предпочтительности. В то же время значительная часть аллелей, связанных с устойчивостью или нейтральностью к ВЛКРС, находятся в процессе элиминации. По мнению автора, такая аллельная «узость» при высоком потенциале молочной продуктивности может привести к ограничению пределов компетентности иммунной системы у отдельных животных и стад в целом, и как следствие, сделать их уязвимыми перед внешними неблагоприятными воздействиями.

Масленников М.Г. (2005) также отмечает, что в изучаемых популяциях животных черно-пестрой породы наблюдается низкий уровень гетерогенности. По его мнению, чем выше степень «голштинизации» скота в хозяйстве, тем меньше вариантов аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ, и больше частота встречаемости аллелей чувствительности к лейкозу. Этот вывод подтверждается полученными нами результатами.

Быки-производители, несущие преимущественно аллели восприимчивости к лейкозу, не представляют угрозу для здоровья поголовья КРС в Ленинградской области и в Беларуси в связи с отсутствием возбудителя заболевания - в этих регионах добились полного оздоровления хозяйств от вируса лейкоза. В племенных хозяйствах Брянской области, в которых нет РИД-положительных животных, сперма быков, несущих аллели восприимчивости к вирусу, также не приведет к поражению стада лейкозом. Однако использование спермы изученных быков-производителей в племенных и товарных хозяйствах, где есть вирусоносители и больные животные, будет способствовать дальнейшему распространению болезни.

Для Брянской области, как и для подавляющего большинства регионов России, чрезвычайно опасно использование быков-производителей с генами восприимчивости к лейкозу, так как это приводит к накоплению в популяции КРС аллелей, подавляющих формирование защитных реакций и определяющих восприимчивость к вирусу лейкоза. При наличии ВЛКРС на фермах увеличение доли животных с аллелями чувствительности к вирусу приведет к постоянному росту вирусоносительства и появлению больных животных, что и наблюдается на животноводческих фермах в большинстве регионов страны. Поэтому для оздоровления от лейкоза поголовья КРС племенных и товарных хозяйств, разводящих черно-пеструю и голпггинскую породу, необходима разработка системы мероприятий, учитывающих передачу от быков-производителей потомству преимущественно аллелей чувствительности к вирусу.

1.3. Сравнение быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из разных племенных станций по генотипам гена ВоЬА-ОЯВЗ

Анализ генотипической структуры поголовья быков-производителей из всех трех регионов по гена ВоЬЛ-1ЖВЗ представлен в таблице 2, в которой животные распределены по 6 группам: ЧЧ, ЧН, НИ, УН, УЧ, УУ. Полученные результаты свидетельствуют, что преобладающее большинство составляют особи, имеющие генотипы ЧЧ, ЧН, ЧУ. При этом среди них большинство составляют особи, несущие аллели восприимчивости к гомозиготном состоянии: 41,3% у брянских, 44,8% у ленинградских и 50% у белорусских быков. То есть, с повышением уровня молочной продуктивности и голштинизации наблюдается явная тенденция к увеличению генотипов, несущих аллели чувствительности к вирусу лейкоза в гомозиготном состоянии.

В гетерозиготном состоянии аллели чувствительности встречаются совместно с нейтральными аллелями достаточно часто: 20,7% у брянского поголовья, 27,6% в ленинградском стаде и 33,4% у белорусских быков. Генотипы, имеющие сочетание аллелей устойчивости и восприимчивости, наблюдаются у 17,2% брянских и ленинградских и 8,3% белорусских быков.

Таблица 2

Генотшшческая структура поголовья быков-производителей черно-пестрой породы из разных госплемстанций

Генотип по локусу ВоЬА-ОЯВз' Частота встречаемости генотипа, %

ОАО «Брянское» (п=29) ОАО «Невское» (п=29) «ЖодииоАгроПлемЭлита» (п=12)

Ч/Ч 41.3 44,8 50

У/Ч 17.2 17,2 8.3

У/У 3,5 0 0

Ч/Н 20,7 27.6 33.4

Н/Н 3,5 3,5 0

У/Н 13,8 6,9 8.3

Всего: 100 100 100

Но 0,897 0,793 0,917

Не 0,872 0,821 0,816

О 0.028 -0,034 0,123

X2 0,000705 0,000935 0,012390

По аллелям устойчивости к лейкозу наблюдается противоположная ситуация: только 1 бык из 29 проанализированных животных Брянской области несет аллели устойчивости к лейкозу в гомозиготном состоянии, в ленинградской и белорусской популяциях такие особи не обнаружены. Наибольшее количество быков, несущих аллели устойчивости в гетерозиготном состоянии, также обнаружено в брянском стаде: 31% по сравнению с 24,1% в ленинградской и 16,6% в белорусской популяциях быков.

Таким образом, преобладающее число генотипов быков - производителей содержит аллели восприимчивости к вирусу лейкоза: 79,2% брянской, 89,6% ленинградской и 91,7% белорусской популяций.

Устойчивость к лейкозу является доминантным признаком, поэтому генетически устойчивыми к вирусу являются все быки, несущие аллели *11, *23 и *28 даже в гетерозиготе. в сочетании с аллелями чувствительности или нейтральными аллелями. На рисунке 8видно, что устойчивыми к вирусу является 34,5% брянской, 24,1% ленинградской и 16,6% белорусской популяции черно-пестрых быков. Высокий уровень аллелей чувствительности в популяции, от 65,5% в брянской популяции до 83,4% у белорусских животных, даже при рецессивном проявлении признака может привести к высокому уровню поражения поголовья вирусом лейкоза.

Ь 4*1 ЧН НИ У/У.Ч.Н

и '

Генотипы

й ОАО "Брянское" а ОАО "Невское" ^ ''ЖодпноАгроПлемЭлита"

Рисунок 8. Распределение быков - производителей черно-пестрой и голшгинской пород по устойчивости к лейкозу

Таким образом, голштинизация поголовья черно-пестрой породы с использованием спермы быков голшпшской породы, в том числе западно-европейской селекции, направленная на повышение молочной продуктивности, наряду с увеличением удоев молока у коров, приводит к постоянному росту генетически восприимчивых к вирусу лейкоза животных. На передовых племенных фермах России, а также в Беларуси и ведущих странах Западной Европы, где нет источника инфекции (все животные показывают РИД (-)), этот фактор не играет отрицательной роли в развитии животноводства. Однако в России, где в 63 регионах зарегистрированы РИД-подожительные животные и некоторые хозяйства имеют больных лейкозом коров, использование для разведения спермы быков с аллелями чувствительности в гомозиготном состоянии или в гетерозиготном с нейтральными аллелями, будет приводить к повышению числа РИД-положительных коров и дальнейшему распространению лейкоза.

1.4. Аллелъный полиморфизм гена Во1Л-ОЛВЗу быков-производителей разных пород Брянской области

В настоящее время в хозяйствах Брянской области разводах крупный рогатый скот следующих молочных пород: черно-пестрая, голштинская, швицкая, симментальская, красно-пестрая, и в 2010 году в регионе был начат масштабный проект по развитию мясного животноводства на основе коров абердин-ангусской породы. Основное количество животноводческих хозяйств молочного направления разводит коров черно-пестрой породы, животных остальных пород в области немного, поэтому ОАО «Брянское» имеет всего от 4 до 10 быков-производителей этих пород для получения спермы.

В таблице 3 представлены характер распределения и частота встречаемости аллелей гена ВоЬА-ОЛВЗ у быков швицкой, симментальской, красно-пестрой и абердин-ангусской породы.

Таблица 3

Частота встречаемости разных аллелей гена ВоЬА-01ШЗ у быков разных пород Госплемстанции ОАО «Брянское»

Отношение к № Частота встречаемости разных аллелей Во1,А-ОВВ 3

лейкозу аллеля Швицкая Симментальская Красно- Абердин-

(п=10) (п=9) пестрая (п=4) аигусская

(п=4)

% Всего, % % Всего, % % Всего, % % Всего, %

Чувстви- 8 - 5,5 - -

тельность 16 - 5 16,8 33,3 - 12.5 - 12,5

22 5 5,5 - -

24 5,5 12.5 12,5

Устойчивость 11 - 16,8 25 -

23 20 25 - 22,3 - 25 - 0

28 5 5,5 - -

Нейтральные 1 - 5,5 12,5 12,5

3 - 12,5 -

6 - 5,5 - -

7 25 и;2 12,5 -

10 20 - - -

12 70 44,4 12.5 62,5 62,5 87.5

15 - 11,2 - 12.5

18 - 5,5 - -

20 10 - - -

27 5 - - -

35 _ - 12,5 -

37 5 - - -

44 - 5,5 - -

49 5 - - -

Небольшое количество быков - производителей этих пород не позволяет сделать достоверный вывод о характерном для этих пород распределении аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ, на основании проведенных исследований можно говорить только об некоторых особенностях генетической структуры брянского стада быков-производителей. Так, достоверным является преобладание нейтральных аллелей по сравнению с черно-пестрой породой: у быков швицкой породы нейтральные аллели составляют 70%, симментальской - 44,4%, красно-пестрой 62,5%, абердин-ангусской - 87,5%, в то время как в трех группах быков черно-пестрой породы было 20,6% - 20,8% нейтральных аллелей. Примерно четверть аллелей составляют аллели устойчивости, кроме абердин-ангусской породы, у которой такие аллели не обнаружены. Интересно отметить также очень низкий уровень аллелей чувствительности (5%) у быков швицкой породы.

1.5. Анализ генотипов по гену ВоЬАФЕВЗ быков - производителей разных пород Брянской области

Генотипический анализ распределения животных по гену ВоЬА-ЭГШЗ позволяет увидеть картину реальной устойчивости животных к вирусу лейкоза. Поскольку аллели устойчивости являются доминантными, то животные, имеющие их в гетерозиготном состоянии совместно с аллелями чувствительности, не проявляют признаков персистентного лимфоцитоза.

В таблице 4 представлены данные по распределению всех пород быков -производителей Брянской госплемстанции по генотипам по локусу BoL.A-DR.B3.

Таблица 4

Распределение генотипов по локусу ВоЬА-ОЮЗЗ у быков - производителей разных пород госплемстанции ОАО «Брянское»

Генотип по Частота встречаемости генотипа, %

локусу черно- швицкая симментальская красно- абердин-

ВоЬА- пестрая (и-10) (п=9) пестрая ангусская

DRBЗ (п=29) (п=4) (п=4)

Ч/Ч 41,35 - - - -

У/Ч 17,25 - 22,2 - -

У/У 3,45 - - - -

Ч/Н 20,7 10 44,5 25 25

Н/Н 3,45 40 11,1 25 75

У/Н 13,8 50 22,2 50 -

Всего 100 100 100 100 100

Но 0,897 0,9 0,89 1 0,5

Не 0,872 0,835 0,894 0,844 0,563

О 0,028 0,078 0,0045 0,185 -0,112

х2 0,00072 0,0051 0,000078 0,029 0,0071

Анализ полученных результатов позволяет сделать следующие выводы: - 12 из 29 быков черно-пестрой породы имеют генотип Ч/Ч, для которого характерно подавление формирования защитной реакции на вирус лейкоза КРС, что приводит к развитию лейкоза;

- в стаде отсутствуют быки, имеющие аллели устойчивое™ в гомозиготном состоянии (генотип У/У имел списанный в настоящее время бык Милый черно-пестрой породы, сперма которого была проанализирована);

- в гетерозиготном состоянии аллели устойчивости имеют всего 9 из 29 быков черно-пестрой породы, 4 из 9 быка симментальской породы, половина быков швицкой и красно-пестрой породы. Среди быков абердин-ангуссов генотипов, несущих аллели устойчивости к лейкозу, не имеется.

2. Аллельный полиморфизм быков-производителей разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности и качества молока

Продуктивность коров как полигенный количественный признак, складывается из интегральной экспрессии сотен генов, большая часть которых не связана с процессом лактации. К мажорным генам, определяющим потенциал молочной продуктивности животных, относятся гены р-лактоглобулина (BLG), лролактина (PRL) и соматотропина (GH) по Alu 1 и Msp I маркерам, а также ген, связанный с качеством молока - ген каппа-казеина (CSN). Эти гены представлены в популяции несколькими аллелями, была установлена связь между определенными аллелями каждого из них и интенсивностью лактации и качеством молока -белковомолочностью и жирномолочностью. Для генотипирования животных по этим генам ранее были разработаны методы генетического маркирования на основе ДНК-маркеров.

2.1. Анализ аллельного полиморфизма генов, связанных с молочной продуктивностью и качеством молока у быков-производителей разных пород Брянской области

Нами было проведено генотипирование быков разных пород госплемстанции ОАО «Брянское» по гену гормона роста по Msp 1 - маркеру (рис. 9 а) и Alu 1 - маркеру (рис. 9 б), ß-лактоглобулина по методикам Medrano (рис. 9 в) и Гладырь (рис. 9 г), пролактина (рис. 9 д) и каппа-казеина (рис. 9 е).

в г

Рисунок 9. Электрофоретический анализ продуктов рестрикции при определении генотипа по исследуемым генам: а - ОН по Мэр 1-маркеру; б - ОН по А1и 1-маркеру;

в - р-лактоглобулин по Ме<1гапо; г- р-лактоглобулин по Гладырь; д- РЯЬ; е - СБЮ.

Генотипы образцов указаны на иллюстрациях

Обобщенные данные по аллельному полиморфизму этих генов представлены в таблице

5.

Из данных таблицы видно, что для каждого исследуемого молекулярного маркера, обнаружено по два альтернативных аллельных варианта, включая гены, для которых показано существование других более редких аллелей (каппа-казеин, лактоглобулин). Кроме быков красно-пестрой и абердин-ангусской пород, представленных слишком малой выборкой, у всех остальных пород имеются оба аллельных варианта изучаемых генов в разных соотношениях.

По обоим молекулярным маркерам гена соматотропина наблюдается самая сильная неравномерность по частотам аллелей: «-» и V аллели представлены гораздо реже, чем «+» и Ь аллели. Аллельные варианты генов пролактина, каппа-казеина и р-лактоглобулина представлены в целом более равномерно. Интересно отметить, что у быков черно-пестрой породы частота В аллеля гена каппа-казеина, определяющего пригодность молока для сыроделия, составляет 26%, в то время как у коров в некоторых племенных хозяйствах Брянской области этот аллель вообще отсутствует (Дроздов, 2013).

Можно отметить, что брянские быки, изученные в данной работе, являются носителями несколько более низкого потенциала молочной продуктивности по сравнению с быками ОАО «Невское» и быками из Беларуси (приложение), обладая при этом более высоким соотношением аллелей устойчивости и чувствительности. Складывается впечатление, что между устойчивостью к лейкозу и молочной продуктивностью имеется обратная связь. Но по данным Сацука (2009) и Мачульской (2009), наибольшей продуктивностью обладают животные с УЧ генотипами, различия между носителями только У или Ч аллелей на фоне нейтральных не достоверна. Поэтому можно предположить, что повышенная частота аллелей чувствительности

у быков - улучшателей голштинской породы объясняется изначальной генетической узостью быков этой породы.

Изучение аллельного полиморфизма генов, связанных с молочной продуктивностью и качеством молока, показало наличие значительного разнообразия этих генов у быков производителей. В частности, частота В-аллеля каппа-казеина у быков черно-пестрой породы ОАО «Брянское» составляет около 26% при практически полном отсутствии в изученных стадах коров черно-пестрой породы Брянской области (Дроздов, 2013). Это обеспечивает определенные возможности для подбора производителей с учетом улучшения аллельного состава генов, связанных с продуктивностью и качеством молока, особенно в хозяйствах, снабжающих заводы по производству сыров и молочнокислых продуктов.

При анализе аллельного полиморфизма генов р-лактоглобулина быков-производителей разных пород ОАО «Брянское» были использованы две альтернативные методики, которые позволяют определять одни и те же А и В аллели, но по разным сайтам мутаций, поскольку эти аллели отличаются сразу по двум аминокислотным заменам. Полное совпадение результатов наблюдается только для симментальской породы (п=9), а для всех остальных пород у отдельных особей разные методики дают противоречащие результаты. Эти данные подтверждают полученные ранее на более репрезентативных выборках коров результаты, свидетельствующие о рекомбинационном расщеплении двух данных мутаций и, соответственно, о существовании еще двух аллелей (Дроздов, 2013).

В целом можно заключить, что использование молекулярно - генетических подходов, наряду с традиционными требованиями племенного дела, открывает дополнительные возможности для оздоровления животных и повышения их продуктивности.

Выводы

1. Проведен молекулярно - генетический анализ ДНК спермы у трех групп быков-производителей черно-пестрой голштинизированной породы из Брянской области, Ленинградской области и Беларуси, а также небольших выборок быков других пород из ОАО «Брянское», исследован аллельный полиморфизм гена ВоЬА-ОЯВЗ, ответственного за устойчивость к вирусу лейкоза КРС. Все группы быков различались по спектру аллелей гена Во1_А-ОИ.ВЗ и частоте их встречаемости.

2. При аллельном анализе гена ВоЬА-ПКВЗ обнаружено в общей сложности 24 аллеля, в том числе 17 из них - у черно-пестрой породы.

3. В аллельных спектрах гена ВоЬАЛЖВЗ быков черно-пестрой-голштинской породы преобладают аллели чувствительности к вирусу лейкоза КРС. Их частота увеличивается с ростом степени голштинизации и потенциала продуктивности (60 - 71%), а доля аллелей устойчивости падает (19 - 8,3%).

4. С увеличением уровня голштинизации также связано явление аллельного сужения -аллельное разнообразие гена ВоЬА-ОКВЗ уменьшается с 15 (у быков ОАО «Брянское») до 9 аллелей (у быков ЖодиноАгроПлемЭлита»), Аллельное сужение может привести к ослаблению потенциала устойчивости к различным болезням.

5. У быков-производителей других пород наблюдается преобладание нейтральных аллелей гена ВоЬА-ОЯВЗ (44 - 87%, против 21% у черно-пестрой), при этом частота аллелей устойчивости почти 25% (кроме абердин-ангусской), а минимальная частота генов восприимчивости - 5% у швицкой. У четырех быков абердин-ангусской породы аллелей устойчивости не обнаружено.

6. Аллельный анализ генов, связанных с молочной продуктивностью, позволил выявить у быков-производителей из Брянской области все парные аллели для каждого изучаемого гена при соотношении частот аллелей от 1:9 до 1:1, кроме красно-пестрой и абердин-ангусской пород с очень маленькой выборкой (п=4).

7. У быков-производителей из Брянской области частота аллеля В гена каппа-казеина, ответственного за качество молока, составляет 26%, что дает возможность проводить направленную селекционную работу в хозяйствах, снабжающих заводы по производству сыров и молочнокислых продуктов.

Предложения производству

Молекулярно-генетический анализ быков производителей по маркерам хозяйственно-важных признаков позволяет расширить возможности традиционной селекционно-племенной работы в животноводческих хозяйствах.

Результаты, полученные при выполнении данной работы целесообразно использовать при разработке плана мероприятий для оздоровления хозяйств Брянской области от вирусного лейкоза крупного рогатого скота и повышении его продуктивности, в частности, предлагается:

1. В хозяйствах, благополучных в отношении вируса лейкоза, подбирать сперму быков - производителей так, чтобы избегать чрезмерного накопления аллелей чувствительности и поддерживать при этом по возможности больший уровень ЧУ генотипов и разнообразие нейтральных аллелей.

2. В хозяйствах, где требуется оздоровление от вируса лейкоза, проводить на период оздоровления от вируса насыщение поголовья аллелями устойчивости при уменьшении частот аллелей восприимчивости, используя для этого сперму быков с УУ и УН генотипами, для чего необходимо проводить поиск быков с генотипом УУ.

3. В связи с тем, что в некоторых хозяйствах Брянской области, в том числе имеющих цеха по переработке молока, отсутствуют коровы с В-аллелем каппа-казеина, планировать племенную работу таким образом, чтобы увеличить их частоту. Это позволит повысить выход творожного сгустка и качество сырной продукции.

Таблица 5. Генетическая структура быков разных пород ОАО «Брянское» по генам ОН, рЬО, РКЦ С8Ю

Порода быков Частоты аллелей и генотипов

Соматотролип по Мйр1-марксру Соматотропин по А1и1-маркеру Р-лактоглобулин по Метало Р-лактоглобулин по Гладырь Пролактин Каппа-казеин

+/+ +/- /- и. Ь V АА АВ ВВ А в АА АВ ВВ А В АА АВ ВВ А В АА АВ ВВ А В

Черно-пестрая 0.76 0,24 - 0.88 0,12 0.72 0.28 0.86 0.14 0.1 0.55 0,35 0.38 0.62 0,14 0,52 0,34 0,4 0.6 0,62 0,35 0,03 0.79 0.21 0,62 024 0.14 0.74 0.26

НоЬэ 0.24 0,28 0.55 0,52 0,35 0.24

Нех 0.21 0,24 0,47 0,48 0,33 0,38

*2 0.004 0,007 0,014 0,003 0,0012 0.0516

симментальская 0.67 0.33 0,83 0.17 0.56 0.33 0,11 0,72 0.28 0,78 0.22 0,39 0,61 0.78 0.22 0,39 0.61 0,78 0.22 0,89 0.11 0,22 0.45 0.33 0.44 0.56

НоЬв 0,33 0,33 0.78 0,78 0,22 0,45

Нех 0.2« 0,4 0,48 0,48 0,2 0.49

*2 0,009 0,012 0,188 0.188 0,002 О.ООЗЗ

шяицкая 0,8 0.2 0.9 0,1 0.7 0.3 0,85 0.15 0.3 0.5 0.2 0.55 0,45 0,3 0,6 0,1 0,6 0.4 0,6 0,4 - 0,8 0,2 0,3 0,5 од 0.55 0.45

НоЬй 0.2 0.3 0,5 0,6 0.4 0,5

Нех 0,18 0,26 0,5 0,48 0.32 0.5

х2 (1.002 0.006 0 0,03 0.02 0

красно-пссграя 0,5 0.5 0 75 ] 0.25 1 1 1 0,75 0.25 0,37 0,63 0,5 0.5 0.25 0,75 0,5 0,5 0,75 0,25 1 1

НоЬй 0,5 0.75 0,5 0.5 - --

Нех 0.38 0,47 0,38 0,38

0,038 0,167 0,038 0,038

Аббердин-ангусская 1 1 0.75 0.25 0.88 0,12 1 1 0.25 0,75 0,12 0.88 0,25 0,75 - 0,63 0.37 1 - 1

НоЬэ - 0,25 - 0,25 0,75

Нех 0,21 - 0,21 0,47 -

Х2 - 0,008 0,008 0.167

Список публикации

1. * Смазнова U.A., Козлов А.Л., Заякин В.В., Нам И.Я. Аллельный анализ гена BOLA-DRB3 в стадах крупного рогатого скота Брянской области // Вестник Брянского государственного университета. 2010. №4: Точные и естественные науки. Брянск: РИО БГУ. С. 227-232.

2.Смазнова H.A., Кожевина O.A., Козлов А.Л., Заякин В.В., Нам И.Я. Изучение генетической устойчивости к лейкозу крупного рогатого скота методом ПЦР-ПДРФ: на примере популяции КРС Брянской области // Сборник трудов первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». Санкт-Петербург. 2010. С. 249-251.

3.* Смазнова И.А., Козлов А.Л., Заякин В.В., Нам И.Я. Анализ полиморфизма гена BOLA-DRB3 у симментальской породы крупного рогатого скота // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. т. 13, №5 (3) С. 248-250.

4.Смазнова H.A., Немцова К.Н.. Заякин В.В., Нам И.Я. Анализ генетического потенциала племенных быков Брянской области по гену BoLA-DRB3 // Факторы экспериментальной эволюции организмов. Сборник научных трудов. Киев: Логос. 2013 т. 13 С. 99-105.

5. Смазнова И.А., Нам И.Я., Заякин В.В., Козлов А.Л. Полиморфизм гена BoLA-DRB3 у коров разных пород Брянской области // Научное обеспечение инновационного развития животноводства. Сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции. 24-25 октября. 2013 Жодино С. 144-146

6. Смазнова И.А., Аксенова E.H., Козлов А.Л. Анализ генетического разнообразия крупного рогатого скота разных пород Брянской области и Беларуси по гену BOLA-DRB3, кодирующему устойчивость КРС к лейкозу // Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Трансфер инновационных биотехнологий в растениеводстве, животноводстве, медицине, экологии». Брянск 2012 г., изд. БГУ. С. 7-10.

7. ** Naml.Ya., ZayakinV.V., Smaznova I.A., Egiazaryan A.V., Sulimova C.E., Sheiko EP., Budevich A.l. High Genetic Susceptibility to Leukemia in Breeding Black Pied and Holstein Cattle // Middle-East Journal of Scientific Research. 2014. V. 20 (10). P. 1297-1301

* Журналы, рекомендованные ВАК.

** Статья, опубликованная в изданиях, индексируемых в Web of Science и Scopus.

Подписано в печать 22.04.2014г. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ №73 Отпечатано на ризографе ГНУ СЗНИИ МЭСХ Росеельхозакадемии 196625, Санкт-Петербург, Павловск, Фильтровское шоссе, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смазнова, Ирина Александровна, Санкт-Петербург

ФГБОУ ВПО «БРЯНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И.Г. ПЕТРОВСКОГО» Инновационный научно-образовательный центр биотехнологии и экологии

На правах рукописи

л/чл1/.соа// и "11

СМАЗНОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ВоЬА-БКВЗ, ВЛИЯЮЩЕГО НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЛЕЙКОЗУ, И ГЕНОВ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

Специальность 03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Нам Ирина Ян Гуковна

Санкт-Петербург - 2014

Список сокращений 4

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 13

1.1. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире и 13 в России

1.1.1. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в мире 13

1.1.2. Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в России 15

1.1.3. Характеристика распространенности лейкоза КРС в 16 хозяйствах Брянской области

1.2. Экономический и социальный эффект от поражения КРС 17 лейкозом

1.3. Строение вируса лейкоза, молекулярный механизм заражения 20 клетки и размножения ВЛКРС, генетическое разнообразие ВЛКРС

1.4. Развитие персистентного лимфоцитоза, распространение 23 вируса в популяции

1.5. ВоЬА - комплекс генов, определяющий устойчивость 26 крупного рогатого скота к болезням

1.6. Генетический полиморфизм гена ВоЬА-ОКВЗ, связанного с 31 устойчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота

1.7. Генетический полиморфизм популяций быков - 34 производителей, используемых для разведения КРС в России

1.8. Генетические маркеры молочной продуктивности 39

1.8.1. Аллельный полиморфизм гена бета-лактоглобулина 40

1.8.2. Аллельный полиморфизм гена соматотропина 43

1.8.3. Аллельный полиморфизм гена пролактина 45

1.8.4. Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина 46

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 50

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 63

3.1. Генетический полиморфизм крупного рогатого скота по гену 63 ВоЬА-БКВЗ

3.1.1. Анализ аллельного полиморфизма гена ВоЬА-ЭКВЗ методом 63

ПЦР-ПДРФ

3.2. Аллельный полиморфизм гена ВоЬА-ЭКВЗ у быков- 67 производителей черно-пестрой и голштинской пород из

разных регионов

3.2.1. Сравнение быков-производителей черно-пестрой и 74

голштинской пород из разных регионов по генотипам гена ВоЬА-ЭБШЗ

3.3. Аллельный полиморфизм гена ВоЬА-ОКВЗ у быков- 78 производителей разных пород Брянской области

3.3.1. Анализ генотипов по гену ВоЬА-БКВЗ быков - 83

производителей разных пород Брянской области

3.4. Аллельный полиморфизм быков-производителей 85 разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности и качества молока

3.4.1. Анализ аллельного полиморфизма гена соматотропина у 86 быков-производителей Брянской области

3.4.2. Анализ аллельного полиморфизма гена (З-лактоглобулина 92 у быков-производителей Брянской области

3.4.3. Анализ аллельного полиморфизма гена пролактина 96 у быков-производителей Брянской области

3.4.4. Анализ аллельного полиморфизма гена казеина 98 у быков-производителей Брянской области

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 101

ВЫВОДЫ 104

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 105

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 106

ПРИЛОЖЕНИЯ 127

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

КРС - крупный рогатый скот

ВЛКРС - вирус лейкоза крупного рогатого скота

ПЛ - персистентный лимфоцитоз

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-ПДРФ - полимеразная цепная реакция с изучением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости

BoLA - bovine leucocyte antigen

МНС - major histocompatibility complex

GH - соматотропин

PLG - P - лактоглобулина

PRL - пролактин

CSN3 - каппа-казеин

SNP - единичные однонуклеотидные мутации

ВВЕДЕНИЕ

Для ускоренного развития животноводческого комплекса России необходимо использование современных подходов и методов для выявления и разведения ценных племенных животных, обладающих комплексом хозяйственно - полезных признаков, таких как устойчивость к распространенным в стране инфекционным заболеваниям, высокий генетический потенциал молочной и мясной продуктивности, качество продукции. Поэтому одним из наиболее актуальных направлений современной биотехнологии и генетики сельскохозяйственных животных является разработка ДНК-маркеров хозяйственно - ценных признаков для генотипирования животных и широкое внедрение ДНК-технологий для оценки племенного стада.

Особое значение для разведения крупного рогатого скота имеет генетическая оценка быков-производителей, используемых для производства семени на государственных племенных предприятиях (станциях). Оценка быков проводится по обширному ряду показателей и признаков и включает не только параметры воспроизводительной способности самих быков (темперамент и тип нервной системы, количество и качество спермы, пригодность ее к замораживанию и оплодотворяющая способность), но и многолетнюю оценку их потомства: величину удоя коров-дочерей (максимальная молочная продуктивность выявляется в 3-5 лактацию), содержание жира и белка в молоке, индекс развития и форму вымени, интенсивность молокоотдачи, особенности экстерьера и конституции коровы и др. Стандартная процедура оценки быков-производителей по качеству потомства требует 7-8 лет, по ее итогам определяют, является ли бык - производитель улучшателем, нейтральным или ухудшателем, и по каким показателям. При этом учитывается корреляция между показателями матерей и дочерей, однородность потомства, изменение корреляции между признаками молочной продуктивности у дочерей по сравнению с их матерями, степень наследования этих признаков. Только

после такой длительной и трудоемкой оценки быка дают заключение о возможности использования его семени. В течение всего этого периода семя сотен быков-производителей накапливается и сохраняется, при этом сами быки могут быть выбракованы, и на госплемстанциях хранится несколько тысяч доз их семени.

В развитых странах Евросоюза, США, Канаде и других странах в последние два десятилетия бурно развивается геномная селекция, и для оценки быков используется метод биочипов, позволяющий единовременно определить 54 тысячи мутации по единичным однонуклеотидным локусам (БЫР). Исследователями разных стран проведена огромная работа по составлению каталога ДНК-маркеров сотен показателей, в том числе хозяйственно-ценных признаков устойчивости к инфекционным заболеваниям и стрессорным факторам внешней среды, аллелей генов, связанных с молочной продуктивностью и качеством продукции.

В нашей стране пока не созданы возможности для разработки и внедрения метода геномной селекции при разведении крупного рогатого скота. Даже имеющиеся скромные возможности для проведения молекулярно-генетической оценки племенных быков используются незначительно.

Исследования большой выборки быков-производителей разных пород из государственных племенных станций были проведены в работах Ковалюк (2008), Сацука (2009), Мачульской (2009): авторы изучали генетическую устойчивость к лейкозу и потенциал молочной продуктивности и качества продукции быков-производителей Московской, Ленинградской и Ростовской областей, Краснодарского края, Карелии, Финляндии, Норвегии. По результатам анализа аллельного полиморфизма гена ВоЬА-ОЫВЗ, связанного с генетической устойчивостью животных к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (КРС). Результаты выявили существенное преобладание аллелей чувствительности к ВЛКРС (60-70%), незначительное количество генотипов с аллелями У в гетерозиготном состоянии (11-13%), практически полное отсутствие особей, несущих аллели устойчивости в гомозиготном состоянии. Авторы представили

данные о прогрессирующем накоплении аллелей восприимчивости к лейкозу при голштинизации черно-пестрой породы.

Брянская область по сравнению с другими регионами России относительно благополучна по распространенности лейкоза, однако в 2012 году было выявлено 6,3% голов серопозитивного скота, в том числе гематологически больных животных - 434 гол., вирусоносительство зарегистрировано в 162 хозяйствах области. В некоторых товарных хозяйствах наблюдается высокий уровень поражения КРС вирусом - до 80%.

Ранее нами были проведены исследования генетической устойчивости к лейкозу поголовья 2 племенных хозяйств Брянской области: СПК «Агрофирма «Культура» и ООО «Новый путь», в которых более 20 лет не были зарегистрированы заболевшие лейкозом коровы. Ежегодное обследование всего молочного стада выявляло не более 0,5% РИД - положительных животных, при этом вирусоносителей сразу выбраковывали. Результаты аллельного анализа гена ВоЬА-ОЯВЗ у коров показали, что в этих хозяйствах 38,3% и 34,3% животных несут аллели устойчивости, в том числе 6,4% и 8,3% в гомозиготном состоянии. При этом 57,4% и 51,4%. коров имеют генотип Ч/Н или Ч/Ч, в том числе гомозиготных по чувствительности к вирусу - 31,9% и 24,1%. Таким образом, общее количество генотипов с аллелями чувствительности почти вдвое больше, чем генотипов, несущих аллели устойчивости (Кожевина и др., 2009; Смазнова и др., 2010; Козлов и др., 2011).

Однако генетическая устойчивость к вирусу у быков-производителей Брянской области практически не изучалась, хотя эти результаты имеют важнейшее значение для создания поголовья КРС, устойчивого к болезни. Современные технологии позволяют получать 50-65 тыс. доз спермы от одного быка-производителя в год, и сперма от одного быка, несущего аллели устойчивости к лейкозу в гомозиготном состоянии, позволит получить за год 10-12 тысяч телят, устойчивых к вирусу. Поэтому изучение аллельного полиморфизма гена ВоЬА-ЭКВЗ быков

производителей Брянской области для выявления генетически устойчивых к вирусу особей является актуальной задачей для оздоровления КРС от лейкоза. Большой интерес представляет также исследование генетической устойчивости быков из племхозяйств Ленинградской области и Беларуси, в которых хозяйства Брянской области закупают сперму.

Актуальность.

Для животноводства страны актуальнейшей проблемой является оздоровление крупного рогатого скота от лейкоза. В настоящее время при разведении КРС используются быки-производители западной селекции (или их сперма) с генами восприимчивости к лейкозу, что приводит к накоплению в российских стадах КРС аллелей, подавляющих формирование защитных реакций и определяющих восприимчивость к вирусу лейкоза. При наличии на фермах возбудителя заболевания - ВЛКРС это приводит к постоянному росту вирусоносительства и появлению больных животных.

Использование ДНК-маркеров для генотипирования быков-производителей имеет высокую актуальность для оценки генетического потенциала молочной продуктивности и качества молока и для повышения производства молока и рентабельности сыроделия.

Тема диссертационной работы имеет высокую актуальность не только для Брянской области, но и для большинства других регионов России, в особенности для тех, где высок уровень поражения КРС вирусом лейкоза.

Новизна

Впервые был изучен аллельный полиморфизм гена ВоЬА-БКВЗ у быков-производителей госплемстанции Брянской области разных пород: черно-пестрой, швицкой, симментальской, красно-пестрой и абердин-ангусской. Аллельный полиморфизм гена ВоЬА-БКВЗ был также изучен у быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород Ленинградской области (ОАО «Невское») и быков-улучшателей из «НИЦ НАН Беларуси по животноводству».

Установлено, что у быков черно-пестрой породы преобладают аллели чувствительности и их частота увеличивается с ростом степени голштинизации. С увеличением уровня голштинизации наблюдается сужение аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3.

У быков производителей других пород выявлено преобладание нейтральных аллелей и снижение доли аллелей чувствительности.

Оценен потенциал генетической устойчивости к ВЛКРС быков-производителей из разных племепредприятий.

Также впервые был изучен аллельный полиморфизм генов молочной продуктивности соматотропина, пролактина, бета-лактоглобулина и качества молока - каппа-казеина у быков-производителей госплемстанции Брянской области разных пород. Выявлены все парные аллели для каждого изучаемого гена.

Цели и задачи исследований.

Целью настоящей работы является исследование быков-производителей разных пород Брянской области, быков черно-пестрой породы племенной станции ОАО «Невское» и быков голштинской породы из «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ HAH Беларуси по животноводству, по устойчивости к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), а также изучение генетического полиморфизма быков-производителей разных пород Брянской области по генам молочной продуктивности.

Задачи исследования: 1. Провести анализ генетической устойчивости к ВЛКРС по аллелям гена BoLA-DRB3 быков-производителей разных пород из ОАО «Брянское» - Брянская госплемстанция;

2. Провести генотипирование по гену BoLA-DRB3 быков-производителей черно-пестрой породы из ОАО «Невское» - госплемстанция Ленинградской области;

3. Анализ генетического полиморфизма гена BoLA-DRB3 у быков -производителей голштинской породы из «ЖодиноАгроПлемЭлита» НПЦ HAH Беларуси по животноводству;

4. Провести генотипирование быков - производителей разных пород Брянской области по генам, связанным с молочной продуктивностью и качеством молока:

- ген гормона роста,

- ген бета-лактоглобулина,

- ген пролактина,

- ген каппа-казеина.

Практическая значимость

Установлены различия в аллельной структуре гена BoLA-DRB3 черно-пестрой, швицкой, симментальской, красно-пестрой и абердин-ангусской пород у быков госплемстанции ОАО «Брянское», и черно-пестрой и голштинской пород у быков ОАО «Невское» и «ЖодиноАгроПлемЭлита». Показан невысокий уровень аллельного разнообразия по гену BoLA-DRB3 у быков-производителей черно-пестрой породы. Результаты генотипического анализа быков по гену BoLA-DRB3 являются основой для проведения мероприятий по повышению генетической устойчивости стад КРС к вирусу лейкоза, и позволяют планировать племенную работу по обогащению поголовья КРС Брянской области аллелями устойчивости к ВЖРС.

Молекулярно-генетический анализ генов, связанных с молочной продуктивностью, у быков-производителей Брянской области позволяет разработать систему их использования для повышения продуктивности КРС в хозяйствах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Сравнительная характеристика по аллельному полиморфизму гена BoLA-DRB3 быков-производителей разных пород из ОАО «Брянское» - государственной племенной станции Брянской области.

2. Сравнительная характеристика генетической структуры быков-производителей разных пород ОАО «Брянское» - государственной племенной станции Брянской области по аллелям генов молочной продуктивности и качества молока.

3. Сравнительная характеристика аллельного полиморфизма по гену BoLA-DRB3 быков-производителей черно-пестрой и голштинской пород из ОАО «Невское» - государственной племенной станции Ленинградской области и «ЖодиноАгроПлемЭлита» Минской области.

Апробация работы

Материалы исследований доложены и обсуждены:

Всероссийская выставка «Золотая осень», 2012 год - бронзовая медаль, 2013 год - серебряная медаль; Международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 2010; Научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал молодежи на службу России», Брянск, 2011; «Международная научно-практическая конференция «Трансфер инновационных биотехнологий в растениеводстве, животноводстве, медицине, экологии», Брянск, 2012; III и IV региональная научно-практическая конференция молодых исследователей и специалистов «Приоритетные направления современной науки: фундаментальные проблемы, инновационные проекты», Брянск, 2012, 2013; Международная конференция ученых «Трансфер инновационных биотехнологий в селекции растений, экологии, растениеводстве, животноводстве». Республика Беларусь, г. Брест, 2012; II Среднерусский экономический форум. Выставка-презентация инновационных проектов молодых ученых и специалистов Центрального федерального округа и диалога с экспертами «Молодежь в инновационном пространстве. Идеи молодых в оценке компетентных профессионалов» Курск, 2013; VIII Международная научная конференция "Факторы экспериментальной эволюции организмов", Украина, Алушта, 2013; Международная научно-практическая конференция «Научное обеспечение инновационного развития животноводства», Жодино, Беларусь, 2013; - на конкурсе УМНИК Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере; - на Всероссийской выставке-форуме РосБиоТех-2012 - золотая медаль.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 137 страницах, состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, материал и методика проведения исследований, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Работа соде