Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Уровень молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти разных генотипов по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Уровень молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти разных генотипов по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина"

На правах рукописи

МАЧУЛЬСКАЯ ЕЛЕНА ВИТАЛЬЕВНА

□03484483

УРОВЕНЬ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ КОРОВ ГОЛШТИНСКОЙ ПОРОДЫ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ МАСТИ РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ ПО ЛОКУСАМ ВоЬА БИВ 3 И КАППА-КАЗЕИНА

06.02.01 - Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

2 6 НОЯ 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2009 г.

003484483

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии отдела разведения и генетики свиней ГНУ «Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук».

Научный руководитель: доктор биологических наук

Ковалюк Наталья Викторовна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных

наук, профессор

Яковенко Алексей Михайлович

кандидат биологических наук Белов Денис Евгеньевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный университет».

Защита диссертации состоится 11 декабря 2009 г., в 1130 часов на заседании диссертационного совета Д.006.078.01 при Ставропольском научно-исследовательском институте животноводства и кормопроизводства по адресу: 355017, Ставропольский край, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 15, тел./факс (8652) 34-76-88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского научно-исследовательского института животноводства и кормопроизводства.

Автореферат разослан « М> 2009 г.

Ученый секретарь ^ . /

диссертационного совета ' М.И. Селионова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в мире активно ведется поиск участков генома, имеющих наибольшее влияние на хозяйственно-полезные признаки и иммунитет животных.

Зарубежными исследователями был выявлен ген BoLA DRB 3 (Bovine Leukocyte Antigens), который является одним из ключевых генов, определяющих первичный иммунный ответ организма на вирусные и бактериальные инфекции. Так, например, разные аллели этого гена играют не одинаковую роль в формировании устойчивости крупного рогатого скота к персистентному лимфоцитозу, вызываемому вирусом лейкоза (BJIKPC)[Xu, Van Eijk, Park, 1993; Mirsky, Lewin, 1998; Mota et al., 2002; Nassiry, Shahroodi, Mosafer, 2005].

Показано, что животные, несущие аллели BoLA DRB 3*11, *23, *28 - У (устойчивые) не склонны к переходу лейкоза в стадию пер-систентного лимфоцитоза (в гематологическую стадию), а животные, несущие в своем генотипе аллели BoLA DRB 3*22, *24, *16, *8 Ч (чувствительные) - напротив, чаще других оказываются в выборке гематологических больных. H (нейтральные) - аллели не ассоциируются ни с устойчивостью, ни с чувствительностью к персистентному лимфоцитозу [Сулимова и др. 1995,2000].

Изучается взаимосвязь тех или иных BoLA DRB 3 аллелей и молочной продуктивности животных. Так в работе Sharif, Mallard, Wilkie, Sargeant, Scott, Dekkers, Leslie [1999] на значительной выборке (n=835) показана достоверная взаимосвязь наличия в генотипе BoLA DRB 3*8 аллели и повышенного уровня молочной продуктивности.

Актуально проведение подобных исследований в условиях Краснодарского края, для определения насколько в этом регионе крупный рогатый скот генетически предрасположен к развитию лейкоза и как BoLA DRB 3 генотип влияет на молочную продуктивность.

Не менее интересные и значимые в хозяйственном отношении исследования проводились и в области изучения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина, его влияния на молочную продуктивность, качественные показатели молока и сыропригодность.

В связи с изложенным выше актуально провести исследования по изучению аллельного полиморфизма гена каппа-казеина в уело-

виях Краснодарского края на голштинской породе черно-пестрой масти.

Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы -изучить влияние генотипа по локусам ВоЬА БИВ 3 и каппа-казеина на хозяйственно ценные признаки крупного рогатого скота голштинской породы черно-пестрой масти.

В связи с этим были поставлены и решены следующие задачи:

1. Оптимизировать ПЦР/ПДРФ тестирование по локусу ВоЬА 3, позволяющее с минимальными потерями реактивов и рабочего времени определять генотип;

2. Установить частоты встречаемости полиморфных вариантов генов ВоЬА Б11В 3 и каппа-казеина у коров голштинской породы черно-пестрой масти;

3. Изучить влияние структуры генов ВоЬА БИВ 3 и каппа-казеина на показатели молочной продуктивности и резистентности к инфекционным заболеваниям коров;

4. Оценить экономическую эффективность применения индивидуального подбора быков-производителей на основе использования маркера ВоЬА БИВЗ в условиях промышленной технологии производства молока.

Научная новизна исследований. Оптимизирована методика эффективного выделения ДНК из спермы быков-производителей с применением реагентов-тиовосстановителей - 10 мМ дитиотрейто-ла (ДТТ) и 0,2% 2-меркалтоэтанола. Усовершенствован метод ПДРФ при определении ДНК-полиморфизма гена ВоЬА ОЛВ 3, с использованием дополнительных рестриктаз В812Ш и АврЬЕЬ Установлена связь генотипа ВоЬА 1ЖВ 3 с показателями молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти III лактации.

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Создана оптимальная схема генотипирования животных по локусу ВоЬА БИВ 3, позволяющая с минимальными потерями реактивов и рабочего времени определять генотип. Использована схема индивидуального подбора быков-производителей с целью максимального повышения у потомства частоты встречаемости оптимального в хозяйственном отношении генотипа Ч/У по локусу ВоЬА БЯВ 3, сочетающего в себе Ч -аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У -аллель - показатель высокого иммунитета. Результаты исследований использованы в работе племенного хозяйства ОАО

«Агрообъединение «Кубань», Усть-Лабинского района Краснодарского края.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

- Усовершенствованный метод ПДРФ, позволяющий точно идентифицировать аллели гена BoLA DRB 3 и пригодный для массового типирования животных.

- Взаимосвязь генотипов по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина с количественными и качественными показателями молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти.

- Внедрение в практику селекционно-генетического способа, позволяющего повысить частоту встречаемости ценного в хозяйственном отношении генотипа по локусу BoLA DRB 3.

Апробация результатов исследований. Автором опубликовано 12 печатных работ, в том числе по теме диссертации - 7 работ. Публикация в издании, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ: Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Зоотехния. - 2007. - №8. - С. 2-4.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях:

- VIII региональная научно-практическая конференция молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». -Краснодар: КубГАУ, 2006.

- 6-я Международная научная конференция «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных».- Дубровицы: ВИЖ, 2006.

- Международная научно-практическая конференция «Современные достижения зоотехнической науки и практики - основа повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». -Краснодар, 2007.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав: материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, предложения производству, список литературы, включающий 144 работы, в том числе 61 зарубежных авторов. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 13 рисунков.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились на базе лаборатории биотехнологии Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства в период 2006-2009 гг. Объектом исследования были .голштинские коровы черно-пестрой масти, быки и их потомство. Материалом для исследований служила кровь коров ОАО «Агро-объединение «Кубань», Усть-Лабинского р-она, п=834 и сперма быков-производителей ООО НПСХП «Астер», г.Краснодар, п=50. Исследования проводили по схеме:

Рисунок 1. Схема исследований.

Забор крови проводился с использованием одноразового инструмента; в качестве антикоагулянта использовался 1,5 М цитрат натрия или ЭДТА. Образцы спермы поступали на анализ в виде гранул, пайетг или на фильтровальной бумаге в высушенном виде.

Для выделения ДНК из крови и спермы, постановки ПЦР, ПДРФ-анализа, электрофореза использовали стандартные методики с собственными модификациями [Van Eijk, Stewart-Haynes, Levin ,1992; Xu, M. Van Eijk., Park, 1993; Херрингтон и др., 1999].

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам [Лакин, 1980] с использованием программного обеспечения MS Excel.

Экономический эффект от создания модельной популяции с использованием генетических маркеров рассчитывали по формуле Р = (OB - 03) / 03 * 100%, где Р - рентабельность, OB - общая выручка, 03 - общие затраты.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Отработка методических подходов к выделению ДНК из спермы быков-производителей.

Образцы спермы быков-производителей были представлены в трех формах хранения:

а) криоконсервированная сперма в гранулах объёмом 200 мкл (12 образцов);

б) криоконсервированная сперма в полипропиленовых соломинках (пайетгах) объёмом 200 мкл (12 образцов);

в) образцы спермы, нанесенные на разные типы фильтровальной бумаги (12 образцов).

Была поставлена задача - отработать оптимальный вариант выделения ДНК из каждой представленной формы хранения семени быков-производителей. Для выделения ДНК из образцов семени использовали:

- набор реагентов Diatom™ Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген»;

- 0,2 % 2-меркаптоэтанол; -10 мМ дитиотрейтол.

Результаты выделения ДНК определяли с помощью электрофореза в агарозном 2,5% геле, окрашенном бромистым этидием. О концентрации ДНК в растворе судили по интенсивности свечения образцов в ультрафиолетовом свете.

Установили, что выделение ДНК из семени быков без использования реагентов-тиовосстановителей (дитиотрейтола или 2-меркаптоэранола) является неэффективным. При этом принципиальной разницы в действии на процесс выделения между 2-меркаптоэтанолом и дитиотрейтолом не наблюдается. При выделении ДНК из семени быков хранящегося в сухом виде на фильтре выход спермальной ДНК оказывается прямо пропорциональным увеличению плотности фильтра.

3.2. Оптимизация подходов для проведения массового тестирования животных.

Массовое тестирование материнского стада необходимо проводить быстро и точно. В этой связи исследования выполнялись в определённой последовательности, что позволило сократить время генотипирования и ряд операций. Применяли следующий алгоритм действий:

1. Анализ Rsa I -электрофореграмм рестрикции позволял гено-типировать 10-20% животных.

2. При использовании параллельно двух рестриктаз - Rsa I и Нае III - удаётся генотипировать 60-70% животных.

Как правило, мы одновременно проводили рестрикцию эндо-нуклеазами Rsa I и Нае III, а полученные результаты заносили в таблицу следующего вида:

Таблица I.- Форма для генотипирования животных по локусу BoLA DRB3

№ пробирки № животного Rsal Нае III BstYI Bst2UI BoLA DRB3 генотип

3. Для некоторых животных требуется рестрикция ПЦР-продукта эндонуклеазами BstYI и/или Bst2UI для определения BoLA DRB 3 генотипа.

При генотипировании нескольких коров и быков возникала ситуация, когда генотип животного можно было определить как 8*28, если идентифицировать паттерны как: f/o, a/b, a/b, b/f; или 10*26, если идентифицировать паттерны как: f/o, a/b, b/a, fib (табл. 2).

Таблица 2.- Сопоставление ДНК-паттернов генотипов 8*28 и 10*26 по локусу BoLA DRB 3

^естриктаза

аллеЬь Rsal Нае III BstYI Bst2UI генотип BoLA DRB3

BoLA \

DRB3 \

*8 f а а b 8*28

*28 о b b f

*10 f а b f 10*26

*26 о b а b

А так как генотипы 8*28 (Ч/У) и 10*26 (Н/Н) принципиально отличаются между собой по статусу отношения к лейкозу, и особенно это важно при генотипировании быков-производителей и при индивидуальном подборе их на коров материнского стада, то возникает необходимость использовать дополнительную рестриктазу, которая бы позволила различать между собой эти два генотипа.

Используя базу данных GenBank получили нуклеотидные последовательности второго экзона гена BoLA DRB 3 для аллелей *8, *28, *10, *26. В программе Primer Premier 5 построили для каждой из них рестрикционные карты и определили ДНК-паттерны, образующиеся при действии на ПЦР-продукт (284 пн) различными ре-стриктазами. Из множества имеющихся в базе данных программы Primer Premier эндонуклеаз рестрикции, отобрали те рестриктазы, которые позволяют дифференцировать генотипы 8*28 (Ч/У) и 10*26 (Н/Н). Рестриктазы-аналоги экзона 2 гена BoLA DRB3 объединили в группы и провели анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз каждой из групп.

Таблица 3.- Рестриктазы, позволяющие дифференцировать генотипы 8*28 (Ч/У) и 10*26 (Н/Н) по локусу BoLA DRB3

Эндонуклеаза рестрикции BoLA DRB3*8, ДНК-паттерны BoLA DRB3*28, ДНК-паттерны BoLA DRB3*10, ДНК-паттерны BoLA DRB3*26, ДНК-паттерны

группа название

1 АссВ71 AcpII Asp 10HII Esp13961 PfIMI Van91I a a b a

2 AccII BepI Bpu95I Bshl236I Bsp50I BstUI Bsu15321 CspKVI FauBII FnuDII Mvnl Thai с m n a

3 AspLEI Cfol FnuDIII Hhal e f g g

4 Hin6I HinPlI HspAI SciNI i j h h

5 Sell d k 1 a

Условно обозначенные ДНК - паттерны и соответствующие им фрагменты рестрикции:

а - 284; Ъ - 181, 103; с - 215, 61, 8; d- 213, 63, 8; е - 118, 98, 68; f - 118, 114, 52; g - 166, 118; h - 168, 116; i - 116, 98, 70; j - 116, 116, 52; k - 167, 117; I - 220, 64; m - 169, 115; n - 222, 62 (в парах нуклеотидов - п.н.)

10 11

Рисунок 2. Электрофорез в 12% полиакриламидном геле продуктов амплификации экзона 2 гена ВоЬА БИВ 3 после рестрикции эндонуклеазами, представленными в табл. 3.

1,2- амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 1; 3,4- амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 2; 5. Маркер молекулярной массы (шаг маркера 50 пар нуклеотидов); 6,7 -амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 3; 8,9- амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 4; 10,11 -амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 5;

1, 3, б, 8, 10 - ДНК (амплификат) от животного с генотипом ВоЬА ОЯВЗ *8/ВоЬА ВИВЗ*28

2, 4, 7, 9, 11 -ДНК (амплификат) от животного с генотипом ВоЬА ОКВЗ * 10/ВоЬА ОЯВЗ *26

Из указанных выше эндонуклеаз (табл. 3) нами была выбрана рестриктаза АврЬЕГ. Таким образом, мы предлагаем проводить ПДРФ-анализ при типировании по по локусу ВоЬА ОЯВ 3, используя эндонуклеазы рестрикции в следующей последовательности:

аза! НаеШ Вз12Х1-* Е^Ш-к АврЬЕ!

3.3. Частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену ВоЬА БИВ 3 в исследуемом стаде.

По гену ВоЬА 011В 3 было генотипировано 834 коровы и 50 быков-производителей голштинской породы черно-пестрой масти (табл. 4).

Таблица 4.- Частота встречаемости генотипов по локусу

ВоЬА БЫВ 3

Генотип ВоЬА БИВ 3 Коровы, (п=834) Быки, (п=50)

количество животных количество животных, % количество животных количество животных, %

(Ч/Ч) 340 40,8 15 30,0

(Ч/У) 154 18,5 8 16,0

(Ч/Н) 222 26,6 15 30,0

(У/У) 14 1,7 2 4,0

(Н/Н) 46 5,5 5 10,0

(Н/У) 58 6,9 5 10,0

Наиболее многочисленными оказались группы животных, относящиеся к Ч/Ч, Ч/У и Ч/Н генотипам, т.е. генотипам, в состав которых входят чувствительные аллели. Эта тенденция характерна как для коров, так и чистопородных голиггинских быков. Соответственно, в распределении аллелей гена ВоЬА 3 наблюдается смещение в сторону чувствительных (Ч) аллелей - 63,3 % (табл. 5).

Таблица 5.- Частота встречаемости аллелей по локусу

ВоЬА БИВ 3

Частота встречаемости аллелей, N=834 процент данного типа аллеля в выборке количество носителей данного аллеля процент носителей данного типа аллеля в выборке

Н 22,3 326 39,1

Ч 63,3 716 85,8

У 14,4 226 27,1

Анализ распределения генотипов в группе выбракованных животных также показывает увеличение доли животных с генотипами Ч/Ч и Ч/Н. Это еще раз подтверждает тот факт, что животные, несущие в своем генотипе чувствительные аллели, чаще других попадают в группу больных и выбывают из стада, особенно по причине инфекционных заболеваний (табл. 6).

Таблица 6.- Распределение генотипов по локусу ВоЬА БКВ 3 у выбракованных животных, ОАО «Агрообъединение «Кубань»

Распределение Частота встречаемости генотипа BoLA DRB 3, %

Ч/Ч Ч/У Ч/Н У/У Н/Н Н/У

По стаду в целом, (N=834) 40,8 18,5 26,6 1,7 5,5 6,9

Все выбывшие, (N=186) 40,3 13,2 30,2 2,7 9,1 4,5

Выбывшие по причине инфекционных заболеваний, (N=157) 44,6 9,2 32,9 1,9 7,2 4,2

Но, тем не менее, в результате искусственного отбора, а точнее селекции на молочную продуктивность, эти генотипы не элиминируются, а, наоборот, продолжают накапливаться. Мы изучили качественные и количественные показатели молочной продуктивности исследуемых животных.

3.4. Качественные и количественные показатели молочной продуктивности голштинских коров черно-пестрой масти и их взаимосвязь с генотипом по гену BoLA DRB 3.

Для удобства проведения расчетов и статистической обработки из общего стада (N=834) была сформирована выборка коров в размере N=115. В каждую из шести полученных групп (Ч/Ч, Ч/У, Ч/Н, Н/Н, У/Н и У/У) попали животные - полные аналоги по возрасту, дате первого отела, условиям кормления и содержания. Таким образом, было отобрано по 30 животных с генотипами Ч/Ч, Ч/У и Ч/Н, по 10 животных с генотипами Н/Н, У/Н и 5 животных с генотипом У/У.

Таблица 7,- Количественные показатели молочной продуктивности коров исследуемой выборки

I лактация

Генотип BoLA DRB 3 Количество измерений Продуктивность, кг/сут., X Cs (%) Продуктивность, (кг/305 дн. лактации)

(Ч/Ч), N=30 235 24,8** ±0,32 1,3 7398±102

(Ч/У), N=30 225 26,0 ±0,34 1,3 7685±107

(Ч/Н), N=30 222 23,9*** ±0,50 2,1 7141±154

(У/У), N=5 30 25,5 ± 1,09 4,2 7604±328

(Н/Н), N=10 62 26,5 ±0,79 2,3 7860±237

(Н/У), N=10 57 24,5* ±0,54 2,2 7306±165

HToro,N=115 831 25,0±0,25 1,0 7447±89

II лактация

(Ч/Ч), N=26 239 24,1*** ±0,51 2,1 7203±158

(Ч/У), N=28 268 26,2 ± 0,33 1,2 7831±101

(Ч/Н), N=23 211 23,9*** ± 0,62 2,6 7143±192

(У/У), N=5 42 25,2 ±0,76 3,0 7532±231

(Н/Н), N=8 80 26,0 ±0,68 2,6 7771±207

(Н/У), N=9 90 24,4** ±0,47 1,9 7293±143

Итого, N=99 930 24,9 ±0,30 1,2 7442±97

Примечание: здесь и далее: * - Р<0.05; ** - Р<0.01; ***- Р<0.001. Достоверность различий определялась относительно группы Ч/У.

Данные по I и II лактациям исследуемых животных показывают превосходство по количественным показателям молочной продуктивности в группах Ч/У, У/У и Н/Н, но так как две последние группы довольно малочисленны и, к тому же, имеют одни из самых высоких показателей репрезентативных ошибок (по I лактации: У/У -1,09; Н/Н - 0,79; по II лактации: 0,76 и 0,68 соответственно), целесообразным будет определение достоверности различий выборочных средних, используя критерий Стьюдента, относительно группы Ч/У.

Группа Ч/У (26,0-26,2 кг/сут) превосходила по молочной продуктивности группы Ч/Ч (24,8-24,1 кг/сут), Ч/Н (23,9 кг/сут) и У/Н (24,5-24,4 кг/сут), достоверно от них отличаясь и имея при этом наименьшее значение ошибки репрезентативности S^ (0,33-0,34). В пересчете на 305 дней лактации животные генотипа Ч/У дают молока на 287-544 кг больше по I лактации и на 628-688 кг больше

по II лактации, в отличие от животных генотипов Ч/Н и Ч/Ч. Во II лактации немного снижаются (24,8 => 24,1 кг/сут) показатели молочной продуктивности у животных с генотипом Ч/Ч, видимо, вследствие более частого поражения инфекционными заболеваниями. Наименьшая молочная продуктивность отмечена в группе животных с генотипом Ч/Н (23,9 кг/сут), причем эти животные изначально имеют низкий продуктивный потенциал и, к тому же, чаще остальных подвергаются выбраковке по причине инфекционных заболеваний.

Были изучены качественные показатели молочной продуктивности коров исследуемой выборки (жир, белок, лактоза, сухое вещество), но достоверных отличий между группами выявлено не было.

Также мы установили, что не отдельные аллели гена ВоЬА 3, а их конкретные сочетания достоверно влияют на количественные показатели молочной продуктивности коров гол-штинской породы.

3.5. Взаимосвязь генотипа по локусу каппа - казеина с показателями молочной продуктивности у голштннских коров черно-пестрой масти.

Изучаемая выборка коров (N=115) была также генотипирована по локусу каппа-казеина. По итогам тестирования выделили три группы - АА, АВ и ВВ. Были определены частоты встречаемости каждого генотипа. В свою очередь, каждая из групп была разбита на подгруппы в зависимости от принадлежности к тому или иному генотипу по ВоЬА 01Ш 3, в каждой из которых были посчитаны среднесуточные показатели молочной продуктивности.

Наиболее встречаемыми являются генотипы группы АА (68,1%), менее встречаемыми - ВВ (1,7%), гетерозиготный генотип АВ по частоте встречаемости занимает среднее положение (30,2%). У быков частоты встречаемости генотипов по локусу каппа-казеина имеют схожие тенденции, что и у коров. Преобладает генотип АА (52%), не на много ему уступает по частоте встречаемости генотип АВ (42%) и самым редко встречаемым, как и в выборке коров, является генотип ВВ (6%).

Таблица 8.- Количественные показатели молочной продуктивности коров различных генотипов по генам ВоЬА БИВ 3 и каппа - казеина

Генотип по локусу каппа-казеина

Генотип по локусу BoLA DRB 3 АА, N=78 АВ, N=35 ВВ, N=2

встречаемость, % с/сут. УДОЙ, х± sx Cs (%) ! встречаемость, % с/сут. удой, х± Sx Cs (%) встречаемость, % j с/сут. удой, х± Sx (

Ч/Ч N=30 20,2 N=23 25,2±0,89 3,5 4,3 N=5 22,6±1,71 7,5 1,7 N=2 25,91:2,63 I

Ч/У N=30 15,7 N=18 25,8±0,72 2,8 10,4 N=12 26,1±1,45 5,5 - -

Ч/Н N=30 14,9 N=17 22,9**±0,7 0 3,0 11,2 N=13 25,0*1,03 4,1 - -

У/У N=5 4,3 N=5 25,6±1,84 7,1 - - - - -

Н/Н N=10 8,7 N=10 26,4±0,46 1,7 - - - - -

У/Н N=10 4,3 N=5 25,3±0,92 3,6 4,3 23,0±0,12 0,5 - -

выборка N=115 68,1 25,0*0,41 1,6 30,2 24,9±0,73 2,9 1,7 25,9*2,63 1

По количественным показателям молочной продуктивности, все генотипы (АА, АВ и ВВ) гена каппа-казеина равнозначны. А наилучшими качественными показателями молока обладают животные, имеющие генотип АВ по гену каппа-казеина.

З.б. Повышение частоты встречаемости оптимального в хозяйственном отношении генотипа BoLA DRB 3.

Для того чтобы добиться повышения молочной продуктивности и повышения резистентности животных к инфекционным заболеваниям, необходимо увеличить частоту встречаемости генотипа Ч/У.

Так как этот генотип является наиболее выгодным в хозяйственном отношении.

В ОАО «Агрообъединение «Кубань» было проведено индивидуальное закрепление быков-производителей на маточное поголовье следующим образом:

$4/4 $Ч/Н ?Н/Н

$У/У

X S У/У Баклан 6352 (11 *23) $У/Н Фокус 1133 (23*23) $Ч/У.

-X 3 Ч/Ч Кубок 1459 (8*24) Хит 7777(16*24)

Таблица 9.- Наблюдаемые и расчетные частоты встречаемости у материнского поголовья и их дочерей в I

поколении.

Частота встречаемости у материнского поголовья (общая по стаду, N=834)

аллелей, % генотипов, %

Ч У Н Ч/Ч Ч/У Ч/Н У/У н/н У/Н

63,3 14,4 22,3 40,8 18,5 26,6 1,7 5,5 6,9

средняя продуктивность (305 дн. лакт.), кг (X 7405±101

Расчетная частота встречаемости при индивидуальном закреплении быков, I поколение

аллелей, % генотипов, %

Ч У Н Ч/Ч Ч/У Ч/Н У/У Н/Н У/Н

45,2 43,7 11,1 9,3 68,5 3,4 - - 18,8

Частота встречаемости у дочерей (I поколение, N=56)

аллелей, % генотипов, %

Ч У н Ч/Ч Ч/У Ч/Н У/У н/н У/Н

44,5 44,5 11,0 10,9 67,3 - - - 21,8

Расчетная средняя продуктивность (305 дн. лакт.), кг 7571

От 115 коров исследуемой выборки было получено 94 теленка, из которых 56 были телочки. В раннем возрасте телочки были исследованы по локусу BoLA DRB 3 и установлены частоты встречаемости аллелей и генотипов этого гена.

В результате индивидуального подбора быков-производителей на маточное поголовье произошло повышение частоты встречаемости выгодного в хозяйственном отношении генотипа Ч/У с 18,5 % у материнского поголовья до 67,3 % у дочерей в I поколении.

Также нами составлен прогноз частоты встречаемости в следующих поколениях тех или иных генотипов по локусу BoLA DRB 3 и количественных показателей молочной продуктивности, с использованием уже имеющихся данных по продуктивности и предполагая, что индивидуальное закрепление быков-производителей на материнское поголовье будет проводиться по указанной выше схеме. Теоретические расчеты показывают, что молочная продуктивность в модельной популяции в последующих поколениях остается высокой (7531 и 7583 кг/305 дн. во II и III поколении, соответственно), а выгодный в хозяйственном отношении генотип BoLA DRB 3 (Ч/У) встречается с частотой 54,7% и 67,1 % во II и III поколении, соответственно. Если учесть, что поголовье станет более резистентным к инфекционным заболеваниям и, в связи с этим, меньше животных будет выбывать из стада, а молочная продуктивность от лактации к лактации будет повышаться, то экономически формирование такой популяции является выгодным.

3.7. Экономическое обоснование исследований

Экономический эффект дан в рассчете на 100 голов: 1. Группа I (исходная группа) (п=100) представлена животными с генотипами по гену BoLA DRB 3:4/4- 40,8 %, Ч/У - 18,5 %, Ч/Н - 26,6 %, У/У - 1,7 %, Н/Н - 5,5 %, Н/У - 6,9 %. Группа II (модельная группа, 1-е поколение) (п=100) имеет следующую структуру по вышеуказанному гену: Ч/Ч - 9,3 %, Ч/У - 68,5 %, Ч/Н - 3,4 %, У/Н- 18,8 %.

2. В течение первых двух лактаций из группы I и II выбывает 22,0% и 17% коров, соответственно (т.е. по 11 голов из группы I и по 8 и 9 голов из группы II за I и II лактации).

3. Средняя продуктивность в группе I составляет в среднем за 305 дней лактации 7405 кг, в группе II- 7571 кг.

4. Молоко реализовывалось по цене 8,0 руб. за 1 кг.

5. Затраты на выращивание телок до первой лактации в обеих группах таковы: 70% корма, 30% - прочие расходы, возраст начала 1 лактации - 2,5 года (при расходе 8 кормовых ед./день себестоимость кормов составляет для одного животного - 18250 руб., а себестоимость выращивания 1 животного-26071 руб.).

6. Затраты на производство 1 кг молока в обеих группах одинаковы: 70% корма, 30% - прочие расходы, на производство 1 кг молока затрачивается 1,1 кормовая единица, стоимость 1 кормовой единицы - 2,5 руб.; тогда себестоимость кормов составляет 2,75 руб., а себестоимость производства 1 кг молока - 3,95 руб.

7. Выручка от реализации молока за 2 лактации в группе I составила 9,893 млн. руб. (89 гол. (100 гол.-11гол.) х 7405 кг х 1 лактацию х 8 руб.+78 гол. (89 гол.-11гол.) х 7405 кг х 1 лактацию х 8 руб.=9,893 млн. руб.). Выручка от реализации молока за 2 лактации в группе II составит 10,599 млн. руб. (92 гол. (100 гол.-8 гол.) х 7571 кг х 1 лактацию х 8 руб.+83 гол. (92 гол.-9 гол.) х 7571 кг х 1 лактацию х 8 руб.= 10,599 млн. руб.)

8. Выход телят в группах составляет 82%, стоимость одного теленка приравнивается к стоимости 100 кг молока. Таким образом, от группы I за 2 лактации можно получить 155 телят (82 гол. (100 гол. х 82 %)+73 гол. (89 гол. х 82 %)), что соответствует 15500 кг молока, или 124000 руб. От группы II за 2 лактации можно получить 157 телят (82 гол. (100 гол. х 82 %)+75 гол. (92 гол. х 82 %)), что соответствует 15700 кг молока, или 125600 руб.

9. Следовательно, общая выручка от реализации молока и телят в группе I равна 10,017080 руб., а в группе II - 10725000 руб.

10. Общие затраты, включая затраты на ДНК-анализы (геноти-пирование по локусу BoLA DRB3), в группе I составляют 7491808 руб., а в группе II - 7860553 руб. Отсюда прибыль в группе I составляет 2525272 руб., а группе II - 2864447 руб.

Таблица 10.- Экономический эффект от создания модельной популяции с использованием генетических маркеров

Показатели Группа I (исходная популяция) Группа II (модельная популяция)

Общая выручка от реализации молока и телят, руб. 10017080 10725000

Общие затраты, руб. 7491808 7840553

Затраты на ДНК анализы, руб. - 20000

Прибыль, руб. 2525272 2864447

Рентабельность, % 33,7 36,4

При расчете экономического эффекта не были учтены затраты на приобретение импортного скота и строительство корпусов для содержания скота, оборудованных по современным технологиям.

ВЫВОДЫ

1.Усовершенствован метод ПДРФ, применяемый для массового типирования животных по гену BoLA DRB 3. Использованы дополнительные эндонуклеазы рестрикции - Bst2UI (обеспечивает высокую точность при дифференцировке аллелей BoLA-DRB3.2 *7 *8 *9) и AspLEI (дифференцировка генотипов BoLA DRB3*8/ BoLA DRB3*28 (Ч/У) и BoLA DRB3*10/ BoLA DRB3*26 (H/H)).

2.Установлено, что для эффективного выделения ДНК из семени быков необходимо применять реагенты-тиовосстановители -0,2 % 2-меркалтоэтанол и 10 мМ дитиотрейтол (ДТТ).

3.По гену BoLA DRB 3 в ОАО «Агрообъединение «Кубань» было прогенотипировано 834 коровы и 50 быков-производителей голштинской породы (ООО НПСХП «Астер»). Определено, что генетическое равновесие смещено в сторону аллелей, имеющих статус чувствительных по отношению к персистентному лимфоци-тозу (Ч - аллелей - 63,3 %, Н - 22,3 %, У - 14,4 %).

4.Наиболее ценным в хозяйственном отношении генотипом является Ч/У, сочетающий в себе Ч - аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У - аллель - показатель высокого иммунитета. В пересчете на 305 дней лактации животные генотипа Ч/У дают молока на 287-544 кг больше в I лактации и на 628-688 кг больше во II лактации, в отличие от животных генотипов Ч/Н и Ч/Ч.

5.Также определено, что не отдельные аллели, а именно их конкретные сочетания влияют на показатели молочной продуктивности коров.

6.Внедрен селекционно-генетический метод, в основе которого лежит схема индивидуального подбора быков-производителей на маточное поголовье с целью повышения частоты встречаемости выгодного генотипа Ч/У в следующих поколениях.

7.0пределены частоты встречаемости генотипов по локусу BoLA DRB 3 у дочерей, полученных от индивидуального подбора и установлено, что частота генотипа Ч/У увеличилась с 18,5 % до 67,3 %.

8.0пределены генотипы по локусу каппа-казеина у коров (N=115) и быков-производителей (N=50) и установлено, что генетическое равновесие смещено в сторону гомозиготного АА генотипа (АА-68,1% и 52,0%, АВ-30,2% и 42,0%, ВВ-1,7% и 6,0% у коров и быков, соответственно).

9.Достоверных отличий по количественным показателям молочной продуктивности между животными различных генотипов (АА, АВ и ВВ) по гену каппа-казеина выявлено не было.

Ю.По качественным показателям молока гетерозиготный генотип АВ достоверно превосходит гомозиготные генотипы АА и ВВ. Группа ВВ-Ч/Ч по содержанию жира в молоке достоверно (Р<0,05) уступает группе АВ-Ч/Ч. Группа АА-Ч/У по этому же показателю достоверно (Р<0,05) уступает группе АВ-Ч/У. По содержанию белка в молоке группы АА-Ч/Ч и ВВ-Ч/Ч достоверно (Р<0,01) уступают группе АВ-Ч/Ч. По содержанию сухого вещества группа АВ-Ч/Ч достоверно (Р<0,05) превосходит группу ВВ-Ч/Ч, а группа АВ-Ч/У - группу АА-Ч/У (Р<0,05).

11.Экономические расчеты показали, что при сложившихся в настоящее время низких закупочных ценах на молоко экономический эффект от создания высокопродуктивного стада селекционно-генетическим способом увеличит рентабельность производства на 2,7 %.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Сельхозпредприятиям по разведению молочного крупного рогатого скота рекомендуется:

Для повышения уровня молочной продуктивности и резистентности голштинских коров к персистентному лимфоцитозу использовать схему индивидуального подбора быков-производителей с целью достижения у потомства максимальной частоты встречаемости ценного в хозяйственном отношении генотипа Ч/У по локусу ВоЬА БИВ 3, сочетающего в себе Ч - аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У - аллель - показатель высокого иммунитета.

2. Исследовательским и диагностическим лабораториям рекомендуется:

- При выделении ДНК из спермы крупного рогатого скота использовать реагенты-тиовосстановители - 0,2 % 2-меркалтоэтанол или 10 мМ дитиотрейтол (ДТТ).

- При анализе ПДРФ использовать дополнительные эндонук-леазы рестрикции Bst2U I (при дифференциации аллелей BoLA DRB3 *7 *8 *9) и AspLEI (при дифференциации генотипов BoLA DRB3 8^28 и 10*26).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Публикация в издании, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Зоотехния. - 2007. - №8. - С. 2-4.

Публикации в других изданиях:

2. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В., Фоменко Д.В. Использование ДНК-технологий в молочном животноводстве // Материалы IV Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», посвященной 100-летию со дня рождения академика Николая Александровича Шманенкова.-Боровск. - 2006.- С. 244-246.

3. Ковалюк Н.В., Мачульская Е.В., Фоменко Д.В. Взаимосвязь генетической структуры популяций с устойчивостью к инфекционным заболеваниям и продуктивностью // Сборник тезисов конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «Юг России «Вклад фундаментальных исследований в развитие экономики Краснодарского края».- Краснодар. - 2006. - С. 141-142.

4. Мачульская Е.В., Ковалюк Н.В. Способ создания группы крупного рогатого скота с заданными свойствами с использованием отбора по генетическим маркерам // Материалы VIII региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». - Краснодар: КубГАУ, 2006. - С. 269-271.

5. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивных групп крупного рогатого скота // Материалы 6 Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных».- Дубровицы: ВИЖ, 2006. - С. 82-85.

6. Мачульская Е.В., Ковалюк Н.В. Взаимосвязь генетической структуры популяций по локусу каппа-казеина с молочной продуктивностью крупного рогатого скота // Сборник научных трудов ме-

ждународной научно-практической конференции «Современные достижения зоотехнической науки и практики - основа повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». - Краснодар, 2007.-С. 174-176.

7. Мачульская Е.В., Ковалюк Н.В., Кононенко С.И., Сацук В.Ф. Изучение частот встречаемости генотипов по локусу ВоЬА ОЛВЗ у быков голштинской и айрширской пород // Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». - Санкт-Петербург, 2007.-С. 252-254.

Подписано в печать 2.11.2009 Формат 60x84 1/1б.Бумага офсетная.Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 138. Типография «Биотех-Юг» 000,350000, г. Краснодар, ул. Рашпилевская 22

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мачульская, Елена Витальевна

Введение

1. Обзор литературы.

1.1. Генетические маркеры.

1.2. Структура и полиморфизм гена BoLA главного комплекса 13 гистосовместимости.

1.3. Структура и полиморфизм гена каппа-казеина.

1.4. Метод ПЦР.

1.5. Молекулярно-генетические методы выявления 29 полиморфизма различных локусов.

2. Материал и методы исследования.

2.1. Методика выделения ДНК из крови.

2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.3. Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДРФ).

2.4. Электрофорез.

3. Собственные исследования.

3.1. Отработка методических подходов к выделению ДНК из 44 спермы.

3.2. Оптимизация подходов для проведения массового 49 тестирования животных.

3.3. Частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену BoLA 57 DRB 3 в исследуемом стаде.

3.4. Частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену BoLA 61 DRB 3 в группе выбывших по состоянию здоровья животных.

3.5. Качественные и количественные показатели молочной 63 продуктивности голштинских коров черно-пестрой масти и их взаимосвязь с генотипом по гену BoLA DRB 3.

3.6. Взаимосвязь генотипа по гену каппа-казеина и показателями 73 молочной продуктивности у голштинских коров черно-пестрой масти.

3.7. Повышение частоты встречаемости оптимального в 77 хозяйственном отношении генотипа.

3.8. Экономическое обоснование исследований.

4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Предложения производству.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Уровень молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти разных генотипов по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина"

Актуальность исследований

Мясная и молочная продуктивность, ростовые и репродуктивные качества, степень выраженности иммунного ответа контролируются у животных большим количеством различных генов. В настоящее время в мире активно ведется поиск участков генома, имеющих наибольшее влияние на хозяйственно-полезные признаки и иммунитет животных.

Зарубежными исследователями был выявлен ген BoLA DRB 3 (Bovine Leukocyte Antigens), который является одним из ключевых генов, определяющих первичный иммунный ответ организма на вирусные и бактериальные инфекции. Так, например, разные аллели этого гена играют не одинаковую роль в формировании устойчивости крупного рогатого скота к персистентному лимфоцитозу, вызываемому вирусом лейкоза (BJIKPC) [Хи, Van Eijk, Park, 1993; Mirsky, Lewin, 1998; Mota et al., 2002; Nassiry, Shahroodi, Mosafer, 2005].

Показано, что животные, несущие аллели BoLA DRB 3*11, *23, *28 - У (устойчивые) не склонны к переходу лейкоза в стадию персистентного лимфоцитоза (в гематологическую стадию), а животные, несущие в своем генотипе аллели BoLA DRB 3*22, *24, * 16, *8 Ч (чувствительные) -напротив, чаще других оказываются в выборке гематологических больных. Н (нейтральные) - аллели не ассоциируются ни с устойчивостью, ни с чувствительностью к персистентному лимфоцитозу.

В нашей стране Сулимова и др. [1995, 2000] провели исследования, профинансированные Фондом фундаментальных исследований Российской академии наук (проект 93-04-06136) и установили на большой выборке животных (п = 500) различных пород (черно-пестрой, айрширской и горбатовской) достоверную взаимосвязь между генотипом по гену BoLA DRB 3 и устойчивостью к лейкозу.

Изучается взаимосвязь тех или иных BoLA DRB 3 аллелей и молочной продуктивности животных. Так в работе Sharif, Mallard, Wilkie, Sargeant, Scott, Dekkers, Leslie [1999] на значительной выборке (n=835) показана достоверная взаимосвязь наличия BoLA DRB 3*8 аллели и повышенного уровня молочной продуктивности.

Таким образом, становится актуальным провести подобное исследование в условиях Краснодарского края, определить насколько в этом регионе крупный рогатый скот генетически предрасположен к развитию лейкоза и как BoLA DRB 3 генотип влияет на молочную продуктивность.

Не менее интересные и значимые в хозяйственном отношении исследования проводились и в области изучения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина, его влияния на молочную продуктивность, качественные показатели молока и сыропригодность.

В связи с изложенным выше становится также актуальным провести исследования по изучению аллельного полиморфизма гена каппа-казеина в условиях Краснодарского края на голштинской породе черно-пестрой масти.

Цель и задачи исследований

Цель диссертационной работы - изучить влияние генотипа по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина на хозяйственно ценные признаки крупного рогатого скота голштинской породы черно-пестрой масти.

В связи с этим были поставлены и решены следующие задачи:

- оптимизировать ПЦР/ПДРФ тестирование по локусу BoLA DRB 3, позволяющее с минимальными потерями реактивов и рабочего времени определять генотип;

- установить частоты встречаемости полиморфных вариантов генов BoLA DRB 3 и каппа-казеина у коров голштинской породы черно-пестрой масти;

- изучить влияние структуры генов BoLA DRB 3 и каппа-казеина на показатели молочной продуктивности и резистентности к инфекционным заболеваниям коров;

- оценить экономическую эффективность применения индивидуального подбора быков-производителей на основе использования маркера BoLA DRB3 в условиях промышленной технологии производства молока.

Научная новизна исследований

Оптимизирована методика эффективного выделения ДНК из спермы быков-производителей с применением реагентов-тиовосстановителей -0,2 % 2-меркалтоэтанола и 10 мМ дитиотрейтола (ДТТ). Усовершенствован метод ПДРФ при определении ДНК-полиморфизма гена BoLA DRB 3, с использованием дополнительных рестриктаз Bst2UI и AspLEI. Установлена связь генотипа BoLA DRB 3 с показателями молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти I-II лактации.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Создана оптимальная схема генотипирования животных по локусу BoLA DRB 3, позволяющая с минимальными потерями реактивов и рабочего времени определять генотип. Использована схема индивидуального подбора быков-производителей с целью максимального повышения у потомства частоты встречаемости оптимального в хозяйственном отношении генотипа Ч/У по локусу BoLA DRB 3, сочетающего в себе Ч — аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У - аллель — показатель высокого иммунитета. Результаты исследований использованы в работе племенного хозяйства ОАО «Агрообъединение «Кубань», Усть-Лабинского района Краснодарского края.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Усовершенствованный метод ПДРФ, позволяющий точно идентифицировать аллели гена BoLA DRB 3 и пригодный для массового типирования.

Взаимосвязь генотипов по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина с количественными и качественными показателями молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти.

Внедрение в практику селекционно-генетического способа, позволяющего повысить частоту встречаемости ценного в хозяйственном отношении генотипа по локусу BoLA DRB 3.

Апробация работы

Автором опубликовано 12 печатных работ, в том числе по теме диссертации - 7 работ. Публикация в издании, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ: Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Зоотехния. - 2007. - №8. - С. 2-4.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях:

VIII региональная научно-практическая конференция молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». - Краснодар: КубГАУ, 2006.

6-я Международная научная конференция «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных».- Дубровицы: ВИЖ, 2006.

Международная научно-практическая конференция «Современные достижения зоотехнической науки и практики - основа повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». - Краснодар, 2007.

Структура и объём работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав: материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, предложения производству, список литературы, включающий 144 работы, в том числе 61 зарубежных авторов. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 13 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных", Мачульская, Елена Витальевна

Выводы

Усовершенствован метод ПДРФ, применяемый для массового типирования животных по гену BoLA DRB 3. Использованы дополнительные эндонуклеазы рестрикции -Bst2UI (обеспечивает высокую точность при дифференцировке аллелей BoLA-DRB3.2 *7 *8 *9) и AspLEI (дифференцировка генотипов BoLA DRB3*8/ BoLA DRB3*28 (Ч/У) и BoLA DRB3*10/ BoLA DRB3*26 (H/H)).

Установлено, что для эффективного выделения ДНК из семени быков необходимо применять реагенты-тиовосстановители - 0,2 % 2-меркалтоэтанол и 10 мМ дитиотрейтол (ДТТ).

По гену BoLA DRB 3 в ОАО «Агрообъединение «Кубань» было прогенотипировано 834 коровы и 50 быков-производителей голштинской породы (ООО НПСХП «Астер»). Определено, что генетическое равновесие смещено в сторону аллелей, имеющих статус чувствительных по отношению к персистентному лимфоцитозу (Ч - аллелей - 63,3 %, Н - 22,3 %, У - 14,4 %). Наиболее ценным в хозяйственном отношении генотипом является Ч/У, сочетающий в себе Ч — аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У - аллель — показатель высокого иммунитета. В пересчете на 305 дней лактации животные генотипа Ч/У дают молока на 287-544 кг больше в I лактации и на 628-688 кг больше во II лактации, в отличие от животных генотипов Ч/Н и Ч/Ч. Также определено, что не отдельные аллели, а именно их конкретные сочетания влияют на показатели молочной продуктивности коров.

Внедрен селекционно-генетический метод, в основе которого лежит схема индивидуального закрепления быков-производителей на маточное поголовье с целью повышения частоты встречаемости выгодного генотипа Ч/У в следующих поколениях.

Определены частоты встречаемости генотипов по локусу BoLA DRB 3 у дочерей, полученных от индивидуального подбора и установлено, что частота генотипа Ч/У увеличилась с 18,5 % до 67,3 %.

Определены генотипы по локусу каппа-казеина у коров (N=115) и быков-производителей (N=50) и установлено, что генетическое равновесие смещено в сторону гомозиготного АА генотипа (АА-68,1% и 52,0%, АВ-30,2% и 42,0%, ВВ-1,7% и 6,0% у коров и быков, соответственно). Достоверных отличий по количественным показателям молочной продуктивности между животными различных генотипов (АА, АВ и ВВ) по гену каппа-казеина выявлено не было.

По качественным показателям молока гетерозиготный генотип АВ достоверно превосходит гомозиготные генотипы АА и ВВ. Группа ВВ-Ч/Ч по содержанию жира в молоке достоверно (Р<0,05) уступает группе АВ-Ч/Ч. Группа АА-Ч/У по этому же показателю достоверно (Р<0,05) уступает группе АВ-Ч/У. По содержанию белка в молоке группы АА-Ч/Ч и ВВ-Ч/Ч достоверно (Р<0,01) уступают группе АВ-Ч/Ч. По содержанию сухого вещества группа АВ-Ч/Ч достоверно (Р<0,05) превосходит группу ВВ-Ч/Ч, а группа АВ-Ч/У - группу АА-Ч/У (Р<0,05). Экономические расчеты показали, что при сложившихся в настоящее время низких закупочных ценах на молоко экономический эффект от создания высокопродуктивного стада селекционно-генетическим способом увеличит рентабельность производства на 2,7 %.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Сельхозпредприятиям по разведению молочного крупного рогатого скота рекомендуется:

Для повышения уровня молочной продуктивности и резистентности голштинских коров к персистентному лимфоцитозу использовать схему индивидуального подбора быков-производителей с целью достижения у потомства максимальной частоты встречаемости ценного в хозяйственном отношении генотипа Ч/У по локусу BoLA DRB 3, сочетающего в себе Ч — аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У - аллель -показатель высокого иммунитета.

2. Исследовательским и диагностическим лабораториям рекомендуется:

- При выделении ДНК из спермы крупного рогатого скота использовать реагенты-тиовосстановители - 0,2 % 2-меркалтоэтанол или 10 мМ дитиотрейтол (ДТТ).

- При анализе ПДРФ использовать дополнительные эндонуклеазы рестрикции Bst2U I (при дифференциации аллелей BoLA DRB3 *7 *8 *9) и AspLEI (при дифференциации генотипов BoLA DRB3 8*28 и 10*26^).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Мачульская, Елена Витальевна, Краснодар

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. № 9 Т. 38.- С. 1173-1195.

2. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1987.- 1050 с.

3. Архипов А., Дульнев В. О типах и рационах кормления скота // Молочное и мясное скотоводство. 1997. -№ 1.- С. 12-15.

4. Балацкий В.Н. Генетический полиморфизм соматотропина и ассоциация его аллелей с количественными признаками животных // Сельскохозяйственная биология. 1998. - № 4. — С. 43.

5. Волкова Р.А. и др. Молекулярно — генетическая диагностика гепатита В // Тез. докл. III Всероссийской научно — практической конференции: Генодиагностика в современной медицине. М., 2000. - С. 45 - 47.

6. Глазко В.И. ДНК технологии животных.- Киев: Нора-принт.-1997.-173 с.

7. Глазко В.И. и др. Полиморфизм молекулярно — генетических маркеров у домашней лошади и лошади Пржевальского // Тез. докл. II международной научн. конф.: Биотехнология в животноводстве и ветеринарии. М., 2000. -С. 151-152.

8. Глазко В.И., Доманский Н.Н., Созинов А.А. Современные направления использования ДНК-технологий // Цитология и генетика. 1998.- Т. 32.- №5.-С.80-93.

9. Глазко В .И., Дунин И.М., Глазко Г.В., Калашникова JI.A. Ведение в ДНК-технологии. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001.- 436 с.

10. Глазко В.И. Проблемы использования ДНК-технологий у животных // Сельскохозяйственная биология. 1998. - №4. - С. 33-41.

11. Глазко В.И., Кириленко С.Д. Идентификация генотипов по каппа-казеину и BLAD-мутации с использованием полимеразной цепной реакции у крупного рогатого скота // Цитология и генетика. 1995.- № 6.-С.60-63.

12. Глазко В.И., Кириленко С.Д., Созинов А. А. Межлокусные ассоциации некоторых генетико биохимических систем у крупного рогатого скота // Генетика. - 1997. - Т. 33. -№ 4. - С. 512 - 517.

13. Говорун В.М., Момыналиев К.Т. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. - № 5. - С. 25-30.

14. Горковенко JI. Г., Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф. Взаимосвязь генотипа по локусу BoLA DRB 3 главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота с молочной продуктивностью // Вестник РАСХН. 2007. -№ 3. - С.73-74.

15. Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Тыщенко В.И. Использование метода фингенпринтинга ДНК для изучения генетической дивергенции в популяциях сельскохозяйственных животных // Вестник РАСХН.- 2003.- № 12.- С.79-80.

16. Жебровский JI.C. Селекционно-генетические основы белкового состава молока коров. М.: Колос, 1973.- 248 с.

17. Зиновьева Н., Гладырь Е., Державина Г., Кунаева Е. Методы маркер -зависимой селекции // Животноводство России. 2006. - № 3. - С. 29-31.

18. Зиновьева Н.А. Генетическая оценка в племенном животноводстве // Материалы международной научной конференции «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». — Санкт — Петербург. — ВНИИРГЖ. -2007.-С. 34-37.

19. Калашникова JI.A., Алипанах М., Тинаев А.Ш. Влияние генотипа каппа-казеина на сыродельческие качества молока коров черно-пестрой породы //

20. Материалы международной научной конференции «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». — Санкт — Петербург. ВНИИРГЖ. -2007.-С. 302-306.

21. Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий. М., 2000.- 31 с.

22. Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И., Рыжова Н.В. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных.- М., 1999.- 148 с.

23. Ковалюк Н.В., Шостак В.А., Сацук В.Ф., Фоменко Д.В. Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу крупного рогатого скота // Вестник РАСХН. -2005. -№ 6. С.67-69.

24. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Зоотехния. 2007.-№ 8. -С.2-4.

25. Кугенев П.В., Барабанщиков Н.В. Практикум по молочному делу. М.: Колос. - 1978, 240 с.

26. Кудрявцева Т.П. Лейкоз животных. М.: Россельхозиздат. - 1980. -158 с.

27. Кузин А.И., Закрепина Е.Н. Влияние лейкоза на продуктивность коров и качество молока // Ветеринария. -1997. № 2. - С. 19-21.

28. Кузнецов А.П., Никитин И.Н. Экономический ущерб, причиняемый лейкозом крупного рогатого скота // Ветеринария. -1993. №8. - С. 14-16.

29. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980. - 293 с.

30. Лактионов A.M. Селекционно — генетические аспекты лейкозов крупного рогатого скота // Ветеринария. - 1972. - № 6. — С. 66 - 69.

31. Лобков В.Ю., Максименко В.Ф. К использованию различных методов оценки генотипа животных // Третья междунар. конфер. «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» / ВНИИФиБП. — Боровск, 2000. С. 409-410.

32. Мазин А.В., Краев А.С., Потапов В.А. Анализ генома. Методы. М.: Мир, 1990.- 176 с.

33. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. — Новосибирск: Наука, 1990. -248 с.

34. Меркурьева Е.К. Биометрия в селекции и генетике сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1979. - 423 с.

35. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР // Государственный комитет санитарно эпидемиологического надзора РФ. -1995.

36. Митюков А.С. Пути повышения эффективности оценки и использования быков-производителей // Материалы международной научной конференции «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». Санкт - Петербург. - ВНИИРГЖ. - 2007. - с. 138-142.

37. Новиков А.А., Ромаиенко Н.И. Генетическая экспертиза племенного материала // Зоотехния. 2001.-№7. - С. 14-17.

38. Перепечина И.О., Стегнова Т.В., Пименов М.Г. Исследование объектов судебно-биологической экспертизы полимеразной цепной реакцией // Методические рекомендации: М., ЭКЦ МВД РФ, 1996. 24 с.

39. Петров Н.И. Возвращаясь к теме лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринарная газета, -1998.-№16 (147).-С.5.

40. Петров Н.И. Диагностика и меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота // Материалы Всероссийского совещания-семинара. Брянск, 2004. - С. 104-106.

41. Петров Н.И. Лейкоз КРС насколько он опасен? // Зооиндустрия. -2001. - № З.-С.15-17.

42. Петров Н.И. Оздоровление хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота //Ветеринария. -1997.-М9.-С. 10-12.

43. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1982. - 368 с.

44. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Изд-во Московского ун-та, 1970. -367 с.

45. Плохинский, Н.А. Руководство по биометрии для зоотехников. — М.: Колос, 1969. 256 с.

46. Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота. Утверждены приказом Минсельхозпрода России от 11 мая 1999, № 359. М.: Зарегистрировано распоряжением Минюста России, регистрационный знак № 1799 от 04 июня 1999.

47. Приймак А.А. и др. ПЦР быстрый и высоко чувствительный метод определения возбудителя туберкулеза в биологических материалах // Пульмонология.- 1995. -№. З.-С. 16-20.

48. Прохоренко П.Н. Современные методы генетики и селекции в животноводстве // Материалы международной научной конференции «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». — Санкт -Петербург. ВНИИРГЖ. - 2007. - с. 3-5.

49. Рис Э., Стернберг М. Введение в молекулярную биологию. — М.: Мир, 2002. 142 с.

50. Слепченко, А.Р. Главный комплекс гистосовместимости сельскохозяйственных животных: иммуногенетические и популяционные аспекты // Успехи современной генетики. — 1994. № 19. - С. 178 - 205.

51. Смирнов Ю.П. Влияние лейкоза на молочную продуктивность коров // Молочное и мясное скотоводство. 1999. - № 4. - С. 25-28.

52. Смирнов Ю.П. Развитие лейкозного процесса у инфицированных BJIKPC коров в зависимости от их возраста // Ветеринария 1999. - № 12.-С. 15-17.

53. Сошенко Л.П., Сафонова А.П., Кухарская А.Г. Резистентность животных и её значение в молочном животноводстве // Вестник Рос. ун-та дружбы народов. Сер. с.-х. н. 2005. - №12. - С. 51-61.

54. Стегнова Т.В., Перепечина И.О., Пименов М.Г., Сыроквашева Е.Ю. Исследование спермы при идентификации личности методом генотипоскопии // Методические рекомендации: М., ЭКЦ МВД РФ, 1993. -24 с.

55. Сулимова Г.Е., Соколова С.С., Семикозова О.П. Анализ полиморфизма ДНК кластерных генов у крупного рогатого скота: гены казеинов и гены главного комплекса гистосовместимости (BoLA) // Цитология и генетика. -1992.- Т. 26.-№5.- С. 18-25.

56. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О, Захаров И.А. ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB 3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу // Генетика. -1995. -№. 9. -С.1294-1299.

57. Сулимова Г.Е., Шайхаев Г.О., Берберов Э.М. Генотипирование локуса каппа казеина у крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции // Генетика. -1991. -Т. 27. - с. 2053 - 2062.

58. Удина И.Г. Гены главного комплекса гистосовместимости человека и животных// Успехи современной генетики. 1994. - № 19. - С. 133-177.

59. Удина И.Г. и др. Использование ДНК-технологий для оценки наследственной устойчивости к заболеванию лейкозом // Тез. докл. II международной научн. конф.: Биотехнология в животноводстве и ветеринарии. М., 2000. - С. 219-220.

60. Удина И.Г., Карамышева Е.Е., Сулимова Г.Е., Павленко С.П., Туркова С.О., Орлова А.Р., Эрнст JI.K. Сравнительный анализ айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота по маркерам гистосовместимости // Генетика.- 1998.- Т.34. -№ 12.- С.1-7.

61. Уильяме Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978. - 272 с.

62. Федотов В.П., Иванов О.В., Иванова О.Ю. Лейкоз крупного рогатого скота в Ивановской области // Ветеринария. 2007. -№ 5. - С.23-25.

63. Херингтон С. и др. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. -М.: Мир, 1999.-558 с.

64. Шипицин А. Г. и др. К вопросу изучения лейкоза крупного рогатого скота в Краснодарском крае. -Ставрополь. — 1999. — С. 156 158.

65. Шипицин А.Г., Скориков А.В., Чопик Т.Н. и др. Лейкоз крупного рогатого скота в Краснодарском крае // Методические рекомендации ГНУ КНИВИ. 2006. - 28 с.

66. Эрнст Л.К., Жигачев А.И., Кудрявцев В.А. Мониторинг генетического груза в черно-пестрой, голштинской и айрширской породах крупного рогатого скота // Зоотехния. — 2007. №3 .- С.5-10.

67. Эрнст Л.К., Сулимова Г.Е., Орлова А.Р. Особенности распространения антигенов BoLA -А и аллелей гена BoLA -DRB3 у черно пестрого скота в связи с ассоциацией с лейкозом // Генетика. -1997. -Т.ЗЗ. - № 1. - С. 87-95.

68. Эрнст Л.К., Шишков В.П. Новые аспекты селекции крупного рогатого скота на устойчивость к лейкозу //С.-х. биология.- 1984.- №2. С.96-104.

69. Юхманова Н., Калашникова Л. Влияние каппа казеина на качество молока и его сыропригодность // Молочное и мясное скотоводство. — 2004. -№8.-С. 24-25.

70. Яковлев А.Ф. Использование полиморфизма ДНК и генов в селекции сельскохозяйственных животных // Материалы международной научной конференции «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». — Санкт Петербург. - ВНИИРГЖ. - 2007. - с. 18-23.

71. Aida Y. et al. Identification of a New Bovine MHC Class II DRB Allele by Nucleotide Sequencing and an Analysis of Phylogenetic Relationships // Biochemical and Biophysical Research Communications. -1995.-vol. 209. -№ 3, P. 981-988.

72. Aird I., Bentall H.H., Roberts J. A. A relationship between cancer of stomach and the ABO blood groups // British Medical Journal. 1953. - №1. - P. 799 -801.

73. Amadori M.I. Archetti L., Verardi R., Berneri C. Role of a distinct population of bovine T cells in the immune response to viral agents // Viral Immunol. 1995. -№ 8.- P. 81-91.

74. Barroso A., Dunner S. Technical Note: Detection of Bovine Kappa-Casein Variants А, В, C, and E by Means of Polymerase Chain Reaction-Single StrandConformation Polymorphism (PCR-SSCP) // J. Anim. Sci. -1998. -76:1535-1538.

75. Behl I.D. et.al. Characterization of genetic polymorphism of the bovine lymphocyte antigen DRB3.2 locus in Kankrej cattle (Bos indicus) // J Dairy Sci. -2007. Jun 90(6). -P.2997-3001.

76. Beier D., Blankenstein P., Fechner H. Possibilities and limitations for use of the polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) infection in cattle // Zentralbl. Veterinarmed. B. -1992. -V. 39 (1). -P. 6977.

77. Brascamp E. W.5 Arendonk J. A. Economic appraisal of the utilization of genetic markers in dairy cattle breeding // Journ. of Dairy Sci. 1993. -V. 76. -№. 4.-P. 1204-1213.

78. Brown J.H, Jardetzry Т., Saper M. A hypothetical model of the foreign antigen binding site of class II histocompatibility molecules // Nature. 1988. -332 :845

79. Burke M.G., Stone R.T., Muggli-Cockett N.E. Nucleotide sequence and northern analysis of a bovine major histocompatibility class II DR beta-like cDNA // Anim. Genet. 1991. - № 22(4). P. 343-352.

80. Camaschella C., Alfarano A., Gottadi E. Prenatal diagnosis of fetal hemoglobin before Boston disease on maternal peripheral blood // Blood. -1990.-№. 75.-P. 2102.

81. Da, Y., Shanks R.D., Stewart J.A., Lewin H.A. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus-infected dairy cattle with persistent lymphocytosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - № 94. - P. 6538-6541.

82. Davies С J. Polymorphism of bovine MHC class I genes Joint report of the Fifth International Bovine Lymphocyte Antigen (BoLA) // European Journal of Immunogenetics. - 1994. - № 21. - P. 239-258.

83. Debacq C., Asquith, В., Reichert M., Burny A., Kettmann R., Willems L. Reduced Cell Turnover in Bovine Leukemia Virus-Infected, Persistently Lymphocytic Cattle // J. Virol. 2003. -№ 77. P. 13073-13083.

84. Dietz A.B., Conen N.D. Bovine lymphocyte antigen Class II Alleles as risk factors for high somatic cell counts in milk of lactating dairy cows // J Dairy Sci. -1997. -№80. -P. 406-412.

85. Dukkipati V.S, Blair H.T, Garrick D.J, Murray A. Ovar-Mhc Ovine major histocompatibility complex : Role in genetic resistance to diseases // N Z Vet J.-2006.- Aug;54(4).-P: 153-160.

86. Fries R., Beckmann I.S., Georgies M. The bovine gene map // Animal Genetics.-1989.-V.20.-P. 3-29.

87. Fries R., Eggen A., Womack J.E. The bovine genome map // Mamm. Genome. -1993.-№ 4.-P. 405-428.

88. Gelhaus A., Schnittger L., Mehlitz D., Horstmann R.D., Meyer C.G. Sequence and PCR-RFLP analysis of 14 novel BoLA-DRB3 alleles // Anim. Genet. 1995. - № 26(3). - P. 147-153.

89. Gilliespie B.E., Jayarao B.M., Dowlen H.H. Analysis and frequency of bovine lymphocyte antigen DRB3.2 alleles in Jersey cows // J Dairy Sci. -1999. -№ 82(9). -P.2049-2053.

90. Groenen M.A. et al. The nucleotide sequence of bovine MHC class II DQB and DRB genes // Immunogenetics. — 1990. -№ 31. P. 37

91. Gupta I. D., Gupta N., Gupta S.C. Genotyping of j3-Lactoglobulin gene by PCR-RFLP in Sahiwal and Tharparkar cattle breeds // BMC Genet.- 2006.-№ 7.-P. 31-33.

92. Harding C.V. МНС molecules and antigen presentation // Animal. Genetics. 1997. — V. 27.-P. 91-96.

93. Hawken R. J., Beattie C. W., Schook L. B. Resolving the genetics of resistance to infectious diseases // Revue Scientifique et Technique. — 1998. — № 17.-P. 17-25.

94. Heringstad В., Gianola D., Chang У. M., Odegard J., Klemetsdal G. Association of toll-like receptor 4 polymorphisms with somatic cell score and lactation persistency in holstein bulls // J Dairy Sci. -2006. -№ 89. P. 3626 -3635.

95. Horin P., Matiasovic J. BoLA DYA polymorphism in Czech cattle // Exp. Clin Immunogenet. 1998. -15 (1). - P. 56 - 60.

96. Kabeya H., Ohashi K., Onuma M. Host immune responses in the course of bovine leukemia virus infection // J Vet Med Sci. -2001.- Jul.-№ 63(7).- P. 703708.

97. Kucerova J., Lund M. S., Sorensen P., Sahana G., Guldbrandtsen В., Nielsen V. H., Thomsen В., Bendixen C. Multitrait quantitative trait Loci mapping for milk production traits in danish Holstein cattle // J Dairy Sci.- June 1. 2006. -P. 2245 - 2256.

98. Kulberg S., Heringstad В., Guttersrud O.A, Olsaker I. Study on the association of BoLA-DRB3.2 alleles with clinical mastitis in Norwegian Red cows // J Anim Breed Genet.- 2007. Aug;124(4). - P.201-207.

99. Lagziel A. et al. An Msp I polymorphism at the bovine growth hormone gene is linked to a locus affecting milk protein percentage // Animal. Genetics. 1999. -V.30.-№ P. 296-299.

100. Lagziel A., Lipkin A., Soller M. Association between SSCP haplotypes as the bovine growth hormone gene and milk protein percentage // Genetics.-1996.-V.142.-P. 945-951.

101. Ledwidge S.A., Mallard B.A. Multi primer target PCR for rapid identification of bovine DRB 3 alleles // Animal Genetics. - 2001. - № 32. - P. 219 -221.

102. Levin H.A., Wu M.C., Steward J.A. Association between BoLA and subclinical in bovine leukemia virus infection in a herd of Holstein Friesian cows // Immunogenetics. - 1988. -27(5). - P. 338 - 344.

103. Lindberg P. G., Andersson L. Close association between DNA polymorphism of bovine histocompatibility complex class I genes and serological BoLA A specificities // Anim. Genet. - 1988. - № 19. - P. 245 - 255.

104. Lunde'n A., Sigurdardottir S., Edfors-Lilja I., Danell В., Rendel J. The relationship between bovine major histocompatibility complex classll polymorphism and disease studied by use of bull breeding values // Anim Genet. -1990.-№ 21.-P. 221-232.

105. Maillard J.C., Renard C., Chardon P., Chantal I., Bensaid A. Characterization of 18 new BoLA-DRB3 alleles // Anim. Genet. 1999. -№ 30(3). - P.200-203.

106. Mikko S., Andersson L. Extensive MHC class II DRB3 diversity in African and European cattle // Immunogenetics. 1995. - № 42 (5).- P. 408-413.

107. Miltiadou D., Law A.S., Russell G.C. Establishment of a sequence-based typing system for BoLA-DRB3 exon 2 // Tissue Antigens. -2003.- Jul.- № 62.- P. 55-65.

108. Miretti M.M., Ferro J.A. Restriction fragment length polymorphism (RLFP) in exon 2 of the BoLA DRB 3 gene in South American cattle // Biochem Genet. — 2001. -№39.-P. 311-324.

109. Mirsky M.L., Lewin H.A. Reduced bovine leukaemia virus proviral load in genetically resistant cattle // Anim. Genet. 1998. - 29. - P. 145 - 252.

110. Mota A.F. et al. Distribution of bovine lymphocyte antigen (BoLA DRB 3) alleles in Brasilian dairy Gir catlle (Bos indicus) // Eur. J. Immunogenet.- 2002. -29 (3).-P. 223-227.

111. Mullis K., Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction//Meth. Enzymol. -1987.-V.155.-P. 335-350.

112. Naj S., Franholm M., Larsen N.J. Growth hormone gene polymorphism associated with selection for milk fat production in lines of cattle // Animal Genetics.-1993 .-V.24.-P. 91-96.

113. Nassiry M.R., Shahroodi F.E., Mosafer J. Analysis and frequency of bovine lymphocyte antigen (BoLA-DRB3) alleles in Iranian Holstein cattle // Genetika. -2005. № 41(6). -P. 817-822.

114. Rando A. et al. Identification of bovine k-casein genotypes at the DNA level // Anim. Genet. 1988. - V. 19. - P. 51 - 54.

115. Ripoli M.V., Villegas-Castagnasso E.E., Peral-Garcia P., Giovambattista G. New polymorphisms for the BoLA-DRB3 upstream regulatory region //Tissue Antigens.-2005.-№66 (2).-P. 136-137.

116. Ripoli M.V., Liron J.P., Deluca J.C. Gene frequency distribution of the BoLA-DRB3 locus in Saavedreno Creole dairy cattle // Biochem Genet. -2004. -№ 42(7-8)P.- 231-240.

117. Rupp R. et al. Association of bovine leukocyte antigen (BoLA) DRB3.2 with immune response, mastitis, and production and type traits in Canadian Holsteins // J Dairy Sci.- 2007. Feb. - 90(2). -P. 1029-1038.

118. Russell G.C., Smith J.A., Oliver RA. Structure of the BoLA DRB3 gene and promoter // European Journal of Immunogenetics. -2004. № 31. - P. 145151.

119. Sharif S. et al. Characterization of naturally processed and presented peptides associated with bovine major histocompatibility complex (BoLA) class II DR molecules // Eur J Immunogenet. 2002. -29 (3). - P. 223 - 227.

120. Sharif S., Mallard B.A. Presence of glutamine at position 74 of pocket 4 in the BoLA DR antigen binding groove with occurrence of clinical mastitis caused by Staphylococcus species // Immunogenetics.- 2000. - № 51. - P. 733 - 742.

121. Sitte K., East I J., Lavin M.F., Jazwinska E.C. Identification and characterization of new BoLA-DRB3 alleles by heteroduplex analysis and direct sequencing // Anim. Genet.-1995. -№ 26(6). P. 413-417.

122. Takeshima S., Nakai Y., Ohta M. Characterization of DRB3 alleles in the MHC of Japanese shorthorn cattle by polymerase chain reaction-sequence-based typing // Journal of Dairy Science. -2002. Vol 85, Issue 6 1630-1632.

123. United States Patent № 5,582,987 Methods for testing bovine for resistance or susceptibility to persistent lymphocytosis by detecting polymorphism in BoLA-DR3 exon 2/ Lewin H.A., van Eijk M. J. Т.- December 10, 1996.

124. Vaiman M., Chardon P., Rothschild M. F. Porcine major histocompatibility complex // Revue Scientifique et Technique. 1998. - № 17. - P. 95-107.

125. Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J. A., Beever J.E. Development of persistent lymphocytosis in cattle is closely associated with DRB2 // Immunogenetics. -1992. 37:64

126. Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J.A., Lewin H.A. Extensive polymorphism of the BoLA DRB3 gene distinguished PCR-RFLP // Anim. Genet. 1992. V.-23. - P.483 - 496.

127. Xu A., Van Eijk V.J. Т., Park Ch. Polymorphism in BoLA -DRB3 Exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus // J. of Immunology. -1993. -V. 151. -№ 12. P. 6977 - 6985.

128. Zadworny D., Kuhlein U. The identification of the kappa-casein genotype in Holstein dairy cattle using polymerase chain reaction // Theor.and Appl. Genetics.-1990.-V.80.-P. 631.

129. Zanotti M. et al. Association of BoLA class II haplotypes with subclinical progression of bovine leukaemia virus infection in Holstein Friesian cattle // Anim. Genet. - 1996. - 27. -P.337 - 341.П1. АКТ ВНЕДРЕНИЯ РАЗРАБОТКИ

130. Использование маркера BoLA DRB3 в селекционно-племенной работе позволяет при подборе быков изменять генетику стада в сторону тех показателей, которые в данный момент являются желательными.

131. Директор ООО НПСХП «Астер», к.с.-х.1. АКТ ВНЕДРЕНИЯ РАЗРАБОТКИ

132. ОАО (<Агрообьедине||^'«Кубащ.>> ЧТ 1)1 Сулименко В Л.