Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Генотипирование чёрно-пёстрого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и BLAD-мутации методами ДНК-технологии

ВАК РФ 06.02.07, Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Генотипирование чёрно-пёстрого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и BLAD-мутации методами ДНК-технологии"

00500 /ю*

На правах рукописи /

ВАЛИУЛЛИНА ЭЛЬВИРА ФАНИЛЕВНА

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ЧЁРНО-ПЁСТРОГО СКОТА ПО ЛОКУСАМ КАППА-КАЗЕИНА, БЕТА-ЛАКТО ГЛОБУЛИНА И ВЬАБ-МУТАЦИИ МЕТОДАМИ ДНК-ТЕХНОЛОГИИ

06.02.07. - Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 2 ЙНВ2С12

Казань-2012

005007132

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетно образовательном учреждении высшего профессионального образован! «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Бауман;

Научный руководитель: доктор биологических наук

Ахметов Тахир Мунавирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мухаметгалиев Нурвахит Нургалиевич

доктор ветеринарных наук, профессор Фаизов Тагир Хадиевич

Ведущая организация: ФГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт племенного дела», Московская область, Пушкинский р-н, п. Лесные Поляны.

Защита диссертации состоится « 20 » января 2012 г. в « 15.00 » часов заседании диссертационного совета Д.220.034.02 при ФГБОУ ВПО «Казанск государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» : адресу: 420029, г. Казань, Сибирский тракт, 35; тел. (8432) 73-96-17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанск государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Бауман; автореферат размещен в сети интернет на сайте www.ksavm.senet.rU/ru_doska.p и www.mon.gov.ru.

Автореферат разослан « // » декабря 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ^—.

доктор биологических наук, профессор —Р-Я. Гильмутдш

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Насыщение рынка продовольствия качественными продуктами отечественного производства в достаточном объёме невозможно без интенсификации животноводства, где одной из составляющих является эффективная селекция. Сегодня уже ни у кого не вызывает сомнения эффективность использования генетических маркёров, таких как группы крови, биохимические белки, ферменты, а также новых маркёров, выявляемых с помощью ПЦР-анализа (полимеразная цепная реакция). Применение такой маркерной технологии в селекции позволяет выявлять генетические дефекты и прогнозировать генетический потенциал продуктивности животных сразу после рождения (Г.М. Гончаренко, 2009).

Опыт многих стран с развитым животноводством свидетельствует о важности использования генетических маркеров, которые связаны с качественными признаками молочной продуктивности крупного рогатого скота. В качестве потенциальных маркеров молочной продуктивности могут рассматриваться гены молочных белков, а именно каппа-казеина и бета-лактоглобулина (Е.С. Усенбеков, 1995; Б.С. Иолчиев, В.И. Сельцов, 1999; Л.А. Калашникова, 2003; Е.А. Денисенко, 2004; О.В. Костюнина, 2005; H.H. Мухаметгалиев, 2006; Э.Ф. Валиуллина и др., 2007; Я.А. Хабибрахманова, 2009,0.Г. Зарипов, 2010).

Ген каппа-казеина связан с белковомолочностью и технологическими свойствами молока. Аллель В гена каппа-казеина ассоциирован с более высоким содержанием белка в молоке. Ген бета-лактоглобулина отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока (N. Strzalkowska et al., 2002; H.A. Зиновьева и др., 2002; Т.М. Ахметов, 2009; P.A. Хаертдинов, М.П. Афанасьев, P.P. Хаертдинов, 2009). Аллель В гена бета-лактоглобулина связан с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, высоким процентом жира, тогда как аллель А характеризуется с высоким содержанием сывороточных белков.

Широкий обмен генетическим материалом между странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний, а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. В отдельных случаях наблюдается высокая скорость распространения таких мутаций. Огромный экономический ущерб обусловливает необходимость строгого генетического контроля импортируемого генетического материала, а также изучение возможных механизмов распространения мутаций (В.И. Глазко и др., 2001; А.Е. Mapiyua, 2005).

Одним из таких наследственных заболеваний крупного рогатого скота является BLAD-иуттт, характеризующаяся дефицитом лейкоцитарной адгезии (Р.В. Биккинин, 2007; Г.М. Гончаренко, 2009).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина, определяющих молочную продуктивность и технологические свойства молока крупного рогатого скота, а также выявление животных-носителей ßi/Ш-мутации.

Учитывая вышеизложенное, в настоящей работе поставлены следующие задачи: - совершенствовать технику выделения ДНК из крови и спермы крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований;

- совершенствовать технику проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и Ж/Ш-мутации; разработать новые способы проведения ПЦР;

- изучить частоту отдельных типов каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций, а также BL/lD-мутации у крупного рогатого скота;

- определить молочную продуктивность коров и матерей быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций;

- оценить технологические свойства молока коров с разными генотипами каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций.

Научная новизна. Усовершенствована техника выделения ДНК из крови, спермы и проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и В1/Ш-мутации. Разработаны способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина. Вьивлен полиморфизм и определена частота встречаемости аллелей и генотипов по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и BLAD-ыутдмт. Изучена молочная продуктивность, качество и технологические свойства молока чёрно-пёстро х голштинских коров в зависимости от генотипов каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций.

Практическая значимость. Разработанные и усовершенствованные приемы проведения ПЦР-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и Ж/Ю-мутации позволяют вести грамотную селекционно-племенную работу на повышение молочной продуктивности и улучшение технологических свойств молока коров, а также выведение из разведения животных-носителей BLAD-мутации.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- всероссийской научно-практической конференции «Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства», посвященной 85-летию КГАУ (Казань, 2007);

- международной научно-практической конференции «Современные подходы развития АПК», посвященной 135-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2008);

- международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства (Казань, 2010).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 12 научных статей, в том числе 8 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Усовершенствованная нами техника экстракции ДНК и проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и ВМОчиутации позволяет проводить маркирование аллелей и генотипов, связанных у животных с молочной продуктивностью и резистентностью к заболеваниям.

- Разработанные нами способы высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A v. В гена CSN3 в усовершенствованной технике 2-х стадийной ПЦР обеспечивают более результативную наработку специфичных ампликонов, которые далее являются мишенями для праймеров в системе 100% комплементарности.

- Определен аллельный полиморфизм генов CSN3, LGB и BLAD-щтацш у чёрно-пёстрого скота в условиях Республики Татарстан.

- Наличие в геноме чёрно-пёстро х голштинских коров S-аллеля гена CSN3 и Л-алпеля гена LGB приводит к повышению показателей молочной продуктивности. При этом молоко от чёрно-пёстро х голштинских коров, несущих в своем геноме В-аллель генов CSN3 и LGB более сыропригодное, тогда как молоко от животных, имеющих в геноме Л-аллель более устойчивое к тепловой обработке.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 158 страницах, содержит 24 таблицы, 17 рисунков. Состоит из: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, предложения производству, списка использованной литературы (всего 220 источников, в том числе 75 иностранных) и приложения.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования по теме диссертационной работы проводились в период с 2005 по 2011 гг. на кафедре технологии животноводства ФГБОУ ВПО «Казанская государственный академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», в отделе генно-молекулярной диагностики ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», в ГУП головном племенном предприятии «Элита» Высокогорского района и ООО им. Тукая Балтасинского района Республики Татарстан.

Научно-хозяйственные опыты поставлены согласно схеме исследования (рис. 1).

Для определения полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина, оценки молочной продуктивности и технологических свойств молока у коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина было отобрано в ООО им. Тукая 107 чёрно-пёстро х голштинских коров. Также определили полиморфизм генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у отобранных 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей в ГУП ГПП «Элита». Наряду с этим, провели на данном поголовье исследования для выявления носителей ¿¿/Ш-мутации.

Определение частоты АнВ аллелей, генетических вариантов каппа-казеина и бета-лактоглобулина, а также наличие носителей BLAD-мутацт у коров и быков-производителей проводили методами ДНК-технологиии.

По принципу аналогов (А.И. Овсянников, 1976) были сформированы группы чёрно-пёстро х голштинских коров-первотелок с разными генотипами каппа-казеина, бета-лактоглобулина, а также с разными комбинациями генотипов CSN3 / LGB.

При проведении научно-хозяйственных опытов использовали документацию зоотехнического и племенного учета ООО им. Тукая (материалы годовых отчётов и бонитировки, племенные свидетельства, карточки быков-производителей и коров - форма 1-МОЛ и 2-МОЛ, а также акты контрольных доек коров).

Основным фоном, на котором были изучены хозяйственно-полезные и другие биологические особенности крупного рогатого скота с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина были одинаковые условия кормления и содержания, что способствовало более полному проявлению генетических особенностей животных.

Исследование полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у чёрно-пёстрого скота, а также наличие у него носителей ВЛДО-мутации методами ДНК-технологии

т

Выявление аллельных вариантов, оценка частоты встречаемости аллелей и генотипов,

степени гетерозиготности наличия генного равновесия

т т

быки-производители Ч/П и помесные по голштинской породе чёрно-пёстро х голшгинские коровы

т т

Выявление гетерозиготных носителей ВЬАО-мутации

т т

Группы Группы

Генотипы кагта-казаша и бега-лакгоглобулина Генопшы каппа-казеина и бега-лакгоглобулина

АА | АВ | ВВ АЛ 1 АВ 1 ВВ

Т т

Оценка быков-производителей по молочной продуктивности (удой, содержание и количество жира) их матерей Оценка влияния генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина на хозяйственно-полезные признаки коров

Молочная продуктивность коров с разными генотипами

_каппа-казеина, бега - л а кто гл о бул н н а и их комбинаций__

Удой за лактацию и на 1 дн. лактации, содержания и количество бежа и жира в

_молоке, интенсивность молокоотдачи_

__ т ______

Технологических свойств молока коров с разными генотипами

_каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций _

_Сыропригодность, термоусгойчивосгь и термосгабильность молока_

Рис. 1. Схема исследования

Рационы коров ООО им. Тукая в основном, состояли из местных кормов, зимний период основными кормами были: сено кострецовое, силос кукурузны сенаж из однолетних трав, патока кормовая, которые животные получали равных количествах. При этом корнеклубнеплоды, концентрированные корма минерально-витаминные добавки задавались животным из расчета живой масс а также фактического удоя коров. В летний период основными кормами был зелёного корма на пастбище и в виде резки при стойловом содержани Концентраты давали коровам из расчета 300-360 г на 1 кг молока. Структу рациона по питательности в зимний период состояла из грубых кормов - 18-2 Г сочных - 40-46%, концентрированных - 33-38%, в летний период - зеленые кор! - 79-82%, концентрированные 18-21%. При этом затраты кормов составили 0,9 1,04 ЭКЕ, соответственно за лактацию 5095-5150 ЭКЕ. В ООО им. Тукая рацио? кормления коров были составлены с учетом норм и рационов кормлен сельскохозяйственных животных (А.П. Калашников и др., 2003).

Кровь, отобранную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 1 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. Сперма от быков-производител поступала в замороженном виде.

Выделение ДНК из крови и спермы проводили разработанными усовершенствованным нами аммиачным и комбинированным щелочным способо

Анализ локуса гена каппа-казеина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме реакционной смеси 20 мкл, с использованием следующих праймеров:

1) Праймеры АВ1: 5'-TGTGCTGAGTAGGTATCCTAGTTATGG-3 и АВ2: 5-GCGTTGTCTTCTTTGATGTCTCCTTAG-S', сконструированные А. Барросо и др. (A. Barroso et al, 1998) для амплификации фрагмента длиной 453 Ьр.

2) Праймеры К1: У-САААТСССТАССАТСААТАСС-З' и К2: 5'-ССАТСТА CGCTAGTTTAGATG-З', сконструированные С. Камински (S. Kaminski, 1993) для амплификации фрагмента длиной 271 Ьр.

3) Праймеры JK5: 5-ATCATHATGGCCATTCCACCAAAG-3' и ЖЗ: 5'-GCCCAT TTCGCCTTCTCTGTAACAGA-S', сконструированные Дж Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J.F. Medrano and Е. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента длиной 350 Ьр.

4) Праймеры JK5-hs: 5-GGGGGATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3 и JK3-hs: 5''-CCCCGCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3/, сконструированные Р.Р. Вафиным и др. (2007) для амплификации фрагмента длиной 359 Ьр.

5) Праймеры N-JK5: s'-GGGCAGAGGTGATTATGGCCATTCCACCAAAGO и N-JK3: S'-GGGCAGAGGTGATTCGCCTTCTCTGTAACAGA-S', сконструированные Р.Р. Вафиным и др. (2007) для амплификации фрагмента длиной 363 Ьр.

Для ПДРФ-идентификации генотипов гена каппа-казеина 20 мкл ПЦР-пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Я/и/ I в 1* буфере «О» фирмы СибЭнзим (Россия) или 10 ед. эндонуклеазы рестрикции HindlII в 1хбуфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 °С течение ночи.

6) Праймеры B-F-hs: 5'-CCCCCGTGAGCCTACAAGTACACCTACCAT-3 , В-R-hs: S'-CCCCCGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC-S', A-F-hs: 5'-GGGGGCT GTTCACACACAAAAACAGTAAAG-3' и A-R-hs: 5'-GGGGGGTGCCTAACCTTA TACAGCCTTTCG-3', сконструированные P.P. Вафиным и др. (2008) для амплификации фрагментов длиной 242 Ьр (А) и 156 Ьр (В).

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1*ТВЕ буфере.

Анализ локуса гена бета-лакгоглобулина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров BLGP3: 5'-GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA-3 и BLGP4: 5'-CAGGACACCGGCTCCCGGTATATGA-3'', сконструированных Дж. Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J.F. Medrano and Е. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента длиной 262 Ьр.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Нае III в 1хбуфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 °С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1 *ТВЕ буфере.

Анализ BLAD-мутации. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров BLAD-F: 5-

TCCGGAGGGCCAAGGGCTA-З' и BLAD-R: 5'-GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGT AGTACAGG-З', сконструированных K.E. Грир и др. (С.Е. Greer et aL, 1991).

Для выявления BL/Ш-мутации 20 мкл ПЦР пробы обрабатьшали 5 ед. эвдонуклеазы рестрикции Нае III в 1 хбуфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 °С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 4,0% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1*ТВЕ буфере.

Частоту встречаемости генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина определяли по формуле:

р = n/N, где р - частота определения генотипа, п - количество особей,

имеющих определенный генотип, N- число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формуле:

РА = (2пАА +пАВ) : 2N и qB = (2пВВ+пАВ) : 2N, где РА- частота аллеля А,

qB - частота аллеля В, N - общее число аллелей.

По закону Харди-Вайнберга (B.JI. Петухов, А.И. Жигачёв, Г.А. Назарова, 1985) рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.

Молочную продуктивность определяли ежемесячно путём проведения контрольных доек (ежедекадно). Содержание жира и белка в молоке определяли на приборе ЛАКТАН 1-4. Для определения сыропригодности молока использовали сычужную и сычужно-бродильную пробы, согласно ГОСТа 922584. Термоустойчивость молока определяли по тигловой пробе.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel. Уровень достоверности полученных результатов определяли по критерию Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка и совершенствование техники выделения ДНК из крови и спермы

ДНК из крови выделяли разработанным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Выделенные нами препараты ДНК из крови и спермы аммиачным и комбинированным щелочным способами показали эффективность своего применения в ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина и бета-лактоглобулина, а также для выявления у него носителей BLAD-мутации.

Комбинированный щелочной способ выделения ДНК из крови и спермы крупного рогатого скота позволяет сохранить экстрагированные нуклеиновые кислоты для ПЦР-анализа в течение 1 года с более чем 30 кратной заморозкой-разморозкой.

3.2. Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену каппа-казеина нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: АВ1+АВ2, К1+К2, Ж5+ЛСЗ по усовершенствованной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. «2. Материалы и методы исследования»).

Праймеры АВ1+АВ2 инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 453 Ьр, а ПДРФ-//м/7 профиль (АА=326/100/27 Ьр, 55=426/27 Ьр и >45=426/326/100/27 Ьр) и ПДРФ-ЯшЖ/ профиль (А4=453 Ьр, 55=351/102 Ьр и >45=453/351/102 Ьр) идентифицируют его генотипы (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ЦДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами АВ1+АВ2 и эндонуклеазным расщеплением ферментом Нт/1 или ШпсИП Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа ВВ гена каппа-казеина (453 Ьр); 2) генотип ВВ (426/27 Ьр (Нт/1)); 3) генотип ВВ (351/102 Ьр (НтИЩ); 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (453 Ьр); 5) генотип АА (326/100/27 Ьр (Нт/1)); 6) генотип АА (453 Ьр (НтсЧЩ); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АВ гена каппа-казеина (453 Ьр); 8) генотип АВ (426/326/100/27 Ьр (Нт/Г)); 9) генотип АВ (453/351/102 Ьр (НтсШГ)).

1500 Ьр 1 ООО Ьр

500 Ьр 40О Ьр эоаъч. 200 Ьр 100 Ьр

102/100 Ьр 27 Ьр

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами АВ1+АВ2 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов. Слабый «фон неспецифики» по сравнению с сильным ПЦР-сигналом (453 Ьр) существенно не влияет на информативность и точность интерпретации генотипов.

Праймеры К1+К2 инициируют амплификацию фрагмента гена-каппа казеина крупного рогатого скота длиной 271 Ьр, а ПДРФ-#ги/7 профиль (АЛ=131/91/49 Ьр, 55=222/49 Ьр и ^5=222/131/91/49 Ьр) и ПДРФ-НтШ профиль (АА=271 Ьр, 55= 182/89 Ьр и Л5=271/182/89 Ьр) позволяют установить его генотипы (рис. 3).

М 1 234 5 6789

Рис. 3. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами К1+К2 и эндонуклеазным расщеплением ферментом Шп/1 или НикИИ Обозначения: 1) цельный ПЦР-фраг мент генотипа ВВ гена каппа-казеина (271 Ьр); 2) генотип ВВ (222/49 Ьр (Нт/1)); 3) генотип ВВ (182/89 Ьр (НЫШ)); 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казенна (271 Ьр); 5) генотип АА (131/91/49 Ьр (Нт/1)); 6) генотип АА (271 Ьр (НМШ)); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АВ гена каппа-казеина (271 Ьр); 8) генотип АВ (222/131/91/49 Ьр (Нт/Г)); 9) генотип АВ (271/182/89 Ьр (НтсИЩ; М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим).

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ-анализа гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами К1+К2 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов; а наличие димерности (трек 1, 3, 4, 6, 7 и 9) на одной длине с информативным фрагментом Яги/7 рестрикции (49 Ьр) не снижает эффективности генотипирования с данным протоколом реакции.

Праймеры Ж5+ЛСЗ инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 350 Ьр, а ПДРФ-Яг'я/7 профиль (^4=134/131/85 Ьр, 56=265/85 Ьр и ^5=265/134/131/84 Ьр) позволяет установить его генотипы (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина

крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 и эндонуклеазным расщеплением ферментом Hinfl Обозначения: 1-4) генотип ВВ (265/85 bp (.Hinfl)); 5-6) генотип АА (134/131/85 bp (Hinfl))- 7-8) генотип АВ (265/134/131/84 bp (Hinfl)); 9) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АВ гена каппа-казеина (350 bp); M) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим).

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов. Для точной интерпретации генотипов необходимо делать ориентир на мажорные идентифицирующие ПДРФ-Яги/7 фрагменты: 265 bp (генотип ВВ), 134/131 bp (АА) и 265/134/131 bp (АВ) соответственно.

3.3. Разработка способа проведения высокоточной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина

Разработанный нами способ проведения высокоточной ПЦР, схож с разновидностями «touch up» ПЦР (F. Weighardt, G. Biamonti, S. Riva, 1993; M. Ailenberg, M. Silverman, 2000) тем, что в качестве праймеров используются олигонуклеотиды, которые состоят из З'-участка, комплементарного последовательности-мишени, и 5-участка, не комплементарного последовательности-мишени, отличим тем, что в качестве праймеров используются олигонуклеотиды с потенциальной температурой гибридизации по всей длине, превышающей температуру отжига их З'-комплементарного участка на 5-10°С, а при проведении ПЦР отжиг ведут при температуре, соответствующей указанной потенциальной температуре гибридизации.

Выбранная стратегия проведения высокоточной ПЦР основывается на том, что используется фиксированная температура потенциального оптимума отжига праймеров по всей 5-З' длине, при этом связывание З'-комплементарного участка олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой исследуемого биологического объекта затрудняется в виду

несоответствия температур гибридизации на 5-10°С, однако неспецифичное праймирование находится в значительно более угнетенном состоянии, чем достигается более эффективная наработка только специфичных ампликонов, которые в дальнейшем являются мишенями для праймеров в системе 100% комплементарности.

Разработанный способ проведения высокоточной ПЦР нами протестирован в сравнении с классической ПЦР и ближайшим аналогом на предмегг оценки аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота.

На основании положительного результата по исключению неспецифичной амплификации при использовании предлагаемого способа проведения ПЦР с модифицированными праймерами ЖЗ-!^ и ЖЗ-Ьэ нами были предприняты дальнейшие действия по усовершенствованию режима 2-х стадийной ПЦР с

температурным совмещением стадий отжига и синтеза при 68(72) С (рис. 5 и 6).

м

2

■мак ¡¡Ш

1500 Ьр-704 1>р

354 Ьр 270 Ьр 222 Ьр

-»—1.49/137/131 Ьр 891)р

Рис. 5. ПЦР-11ДРФ-Яги/7 (НШШ) профиль гена каппа-казеина крупного рогатого скота, инициированный праймерами Ж5-Ь$ и ЛО-Ъэ при температуре 68°С на стадии «отжиг-синтез»

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СябЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагменг генотипа ВВ гена каппа-казеина (359 Ьр); 2) генотип ВВ (270/89 Ьр (Яш/7)); 3) генотип ВВ (222/137 Ьр (ИШНГ))\ 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АЛ гена каппа-казеина (359 Ьр); 5) генотип АА (139/131/89 Ьр (Яш/7)); 6) генотип АА (359 Ьр (НтсИЩ); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АВ гена каппа-казенна (359 Ьр); 3) генотип АВ (270/139/131/89 Ьр (Ят/7)); 9) генотип АВ (359/222/137 Ьр (НШШ)).

234 5678 9

М

шр в»

1

1500 Ьр-700 Ьр -

400 Ьр

300 Ьр

200 Ьр

■

359 Ьр 270 Ьр

««¡¡¡^ 222 Ьр

' "-«-139/137/131 Ьр 89 Ьр

1ооър-Н1ШШННВЁ

Рис. 6. ПЦР-ПДРФ-Я«и/7 (ПШШ) профиль гена каппа-казеина крупного рогатого скота, инициированный праймерами Л£5-Ь$ и ЛКЗ-!« при температуре 72°С на стадии «отжиг-синтез»

Обозначения; М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа ВВ гена каппа-казеина (359 Ьр); 2) генотип ВВ (270/89 Ьр (Я/и/7)); 3) генотип ВВ (222/137 Ьр (НШПГ))\ 4) цельный ПЦР-фрагменг генотипа АА гена каппа-казеина (359 Ьр); 5) генотип АА (139/131/89 Ьр (Яот/7)); 6) генотип АА (359 Ьр (НтсИ1[))\ 7) цельный ПЦР-фрагменг генотипа АВ гена каппа- казеина (359 Ьр); 8) генотип АВ (270/139/131/89 Ьр (Яш/7)), 9) генотип АВ (359/222/137 Ьр (НтсПЩ).

В режиме 2-х стадийной ПЦР модифицированные праймеры JK5-hs и JK3-hs эффективно инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 359 bp, а ПДФР-HinJI профиль (ЛЛ=139/131/89 bp, 55=270/89 bp и Л5=270/139/131/89 bp) и ПДФР-HindIII профиль (ЛЛ=359 bp, £5=222/137 bp и ^5=359/222/137 bp) идентифицируют его генотипы (рис. 5 и 6).

Полученные результаты ПДРФ-ПЦР гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5-hs +JK3-hs являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

Таким образом, разработанный способ и усовершенствованная техника проведения высокоточной ПЦР в режиме 2-х стадийной ПЦР с температурным совмещением стадий отжига и элонгации при 68 (72)°С является действенным инструментом генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина.

3.4. Разработка способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям АиВ гена каппа-казеина

Существуют различные способы ДНК-анализа аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота (J.F. Medrano, Е. Aguilar-Cordova, 1990; S. Kaminski, 1993; G. Rincón and J.F. Medrano, 2003), среди которых выделяется способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина.

В способе проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям АиВ гена каппа-казеина, предложенном Г. Ринкон и Дж. Медрано (G. Rincón and J.F. Medrano, 2003) используется принцип тетра-праймерной ARMS-PCR, где в реакции применяют 4 олигонуклеотида, два из которых являются внешними (общие праймеры «JK5» и «JK3»), инициирующие при совместном фланкировании амплификацию фрагмента ДНК гена каппа-казеина любого из его аллелей, а остальные два - внутренними (аллель-специфичные праймеры «INNERKCAS FORWARD» и «INNERKCAS REVERSE»), каждый из которых при совместном фланкировании только с одним из внешних праймеров инициирует амплификацию соответствующего аллель-специфичного фрагмента ДНК. Следует отметить, что каждый внутренний праймер помимо рефрактерного з'-терминального «mismatch-нуклеотида» имеет дополнительный некомплементарный ни к одному из аллелей гена каппа-казеина «mismatch-нуклеотид» в позиции -2 от З'-терминального нуклеотида (- 0 +) пранмера (рис. 7).

Нами разработан способ проведения аллель-специфичной ПЦР доя генотипирования крупного рогатого скота по аллелям АиВ гена каппа-казеина, схожий со способом, предложенным Г. Ринконом, Дж. М^фано (G. Rincón, J.F. Medrano, 2003), включающим подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ, буферной системы, Taq ДНК псшимеразы, 4-х праймеров; проведение ПЦР; детемдаю амплифицированных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза; отличающийся тем, что, используются другие последовательности праймеров, все ю которых являются аллель-специфичными, не имеющие дополнительных некомплементарных ни к одному из аллелей гена каппа-казеина крупного рогатого скота «mismatch-нуклеогадов» в позиции -2 от З'-терминальпых нуклеошдов праймеров, но имеющие 5-некомплеменгарные учалки (п) длиной 5-3 нуклестадов: 5-аллель-специфичные праймеры

«B-F-hs» и «B-R-hs», которые инициируют амплификацию ß-аллель-специфичного фрагаенга ДНК гена каппа-казеина крупною рогатого скота размером 156 Ьр; Л-аллаль-специфичные хрймеры «A-F-bs» и «A-R-hs», которые инициируют амплификацию ,4-аттель-спеиифичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 Ьр; проводят 2-х стадийную ПЦР с совмещением температуры отжига и синтеза при 72°С (рис. 7).

Л л ■ Ч

lOOhp- ................■■■............■■■■■ ■■■

Рис. 7. Электрофореграмма предложенного способа аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с праймерами «B-F-hs»+«B-R-hs»+«A-F-hs»+«A-R-hs». Обозначения: М) ДНК-маркеры 100-1000 Ьр (СибЭнзим); 1) генотип АА гена каппа-казеина кр.рог.ск (242 Ьр); 2) генотип ВВ гена каппа-казеина кр.рог.ск (156 Ьр); 3) генотип А В гена каппа-казенна кр.рог.ск. (242/156 Ьр).

Разработанный способ проведения аллель-специфичной ПЦР с протоколом 2-х стадийной ПЦР является более эффективным способом генотипирования гена каппа-казеина, в сравнении со способами ПЦР-ПДРФ, в связи с тем, что не требует проведения обработки ПЦР-продукта рестриктазами, таким образом, сокращая время анализа и материальные затраты.

3.5. Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров: ВЬОРЗ+ВЬОР4 по усовершенствованной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. «2. Материалы и методы исследования»),

Праймеры В1Х}РЗ+В1Х}Р4 инициируют амплификацию фрагмента гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота дайной 262 Ьр, а/З-ЮВ-ПД^Ф-НаеШ профиль 64/1=153/109 Ьр, ДВЧ09/79/74 Ьр и АВ=153/109/79/74 Ьр) вдеигифшдаруег его генотипы (рис. 8).

Рис. 8. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена /?-лактоглобулина крупного рогатого скота с праймерами ВЬОРЗ+ВЬСР4 и эндонуклеазным расщеплением ферментом НаеШ

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим); 1, 4, 5) генотип153/109/79/74 Ьр);

262 Ьр 153 Ьр 109 Ьр 79/74 Ьр

rtOO 500 400 ЗОО Ьр 200

I OO Ьр

2, 8) генотип А А (153/109 Ьр); 3, 6, 7) генотип ВВ (109/79/74 Ьр); 9) цельный ПЦР-фрагмент гена бета-лактоглобулина (262 Ьр).

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ с праймерами ВЬОРЗ+ВЬОР4 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина.

3.6. Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для выявления у крупного рогатого скота ВЬАО-мутлптя

Для оценки качества работы известных протоколов по выявлению у крупного рогатого скота ЙА/Ш-мутации нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров: ВЬАБ-Р+ВЬАО-]* по усовершенствованной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. «2. Материалы и методы исследования»),

Праймеры ВЬАО-р-ьВЬАЭ-Я инициируют амплификацию фрагмента для | выявления ВЬАВ-мутации крупного рогатого скота длиной 58 Ьр (рис. 9).

11 2 3 3 IV-!

Рис. 9. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ для выявления у крупного рогатого скота ВЬАО-мутации с праймерами ВЬАО-Р+ВЬАВ-Н и эндонуклеазным расщеплением ферментом НаеШ Обозначения: 1) цельный ПЦР-фрагмент гена СО 18 (58 Ьр); 2, 3, 4, 5) генотип с отсутствием ЯЫ£>-мутации; М) ДНК-маркеры 1 ООО-100 Ьр (СибЭнзим).

У здоровых животных ПДРФ-НаеШ профиль 49/9 Ьр, у больных животных 30/19/9 Ьр и у животных-носителей ВЬАй-мутации 49/30/19/9 Ьр.

Полученные результаты ПЦР-ПДРФ с праймерами ВЬАО-Р) ВЬАО-К являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и выявления у крупного рогатого скота /?/,/!/З-мутации.

Следует отметить, что из протестированных 70 быков-производителей, принадлежащих ГУП ГПП «Элита» и 107 коров, принадлежащих ООО им. Тукая методом ПЦР на носителъство В/./Ю-мутации, нами не выявлено ни одного животного-носителя данного генетического заболевания.

I

3.7. Оценка полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота

Анализ результатов ДНК-тестирования быков-производителей по локусу гена каппа-казеина показал, что из 70 быков 48 (68,6%) имели генотип АЛ; 18 (25,7%) -АВ и желательный генотип ВВ - 4 (5,7%). При этом частота аллеля А была на уровне 0,81, а аллеля 5-0,19. Среди коров получены следующие результаты, что из 107 коров 68 (63,6%) имели генотип АА; 36 (33,6%) - АВ и лишь 3 (2,8%) - ВВ. При этом частота аллеля А составила 0,80, а аллеля В - 0,20 (табл. I).

Таблица 1

Частота встречаемости генотипов и аллелей гена каппа-казеина у _ быков-производителей и коров __

Частота генотипов Частота

Хозяйство п АА АВ ВВ аллелей Х2

п % п % п % А В

ГУН ГПП Н 70 48 68,6 18 25,7 4 5,7 0,81 0,19 0,85

«Элита» О 46 65,6 21 30,8 3 3,6

ООО им. Н 107 68 63,6 36 33,6 3 2,8 0,80 0,20 0,38

Тукая О 69 64,0 34 32,0 4 4,0

Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов.

Расчет соответствия фактического распределения генотипов по локусу каппа-казеина теоретически ожидаемому с использованием методов Харди-Вайнберга и у2 показал, что в данных стадах быков-производителей и коров не имеется статистически достоверного сдвига генетического равновесия ни по одному из трех генотипов. Следовательно, в данных стадах не проводился искусственный отбор, затрагивающий генотипы животных по локусу гена каппа-казеина.

С помощью метода ПЦР-анализа быков-производителей по локусу гена бета-лактоглобулина нами получены следующие результаты. Так из 70 быков-производителей 9 (12,9%) имели генотип АА, 26 (37,1%) - генотип Л В и 35 (50,0%) быков - генотип ВВ. При этом частота аллеля А составила 0,31, а аллеля В - 0,69. Из 107 коров 14 имели генотип АА, 60 коров - генотип АВ, 33 коровы -генотип ВВ. Частота гомозиготного генотипа АА составила 13,1%, гетерозиготного генотипа АВ - 56,1%, гомозиготного генотипа ВВ -30,8%, при этом частота аллеля А составила 0,41 и аллеля В - 0,59 соответственно (табл. 2).

Таким образом, использование математического анализа методом Харди-Вайнберга и методом %2 показало, что в стадах быков-производителей и коров нет статистически достоверного смещения генетического равновесия ни по одному из трех генотипов локуса гена бета-лактоглобулина (АА, АВ и ВВ). Полученные результаты показывают, что в этих стадах не проводится искусственный отбор, затрагивающий генотипы животных по локусу гена бета-лактоглобулина.

Таблица 2

Частота встречаемости генотипов и аллелей гена бета-лактоглобулиа у

быков-производителей и коров

Частота генотипов Частота

Хозяйство п АА АВ ВВ аллелей Х2

п % п % п % А В

ГУПГПП Н 70 9 12,9 26 37,1 35 50,0 0,31 0,69 1,23

«Элита» О 7 9,6 30 42,8 33 47,6

ООО им. Н 107 14 13,1 60 56,1 33 30,8 0,41 0,59 2,55

Тукая О 18 16,8 52 48,4 37 34,8

Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов.

Среди быков-производителей выявлено 8 разных комбинаций генотипов. Из 70 быков-производителей имели комбинацию CSNЗ АА / ¡1-1,0В АА 6 (8,6%) быков-производителей, СБЮ АА / /3-1,0В АВ - 18 (25,7%), СБЫЗ АА / /З-ЮВ ВВ -24 (34,3%), СБА'З АВ / р-ЮВ АА - 2 (2,9%), СБЫЗ Л В / [1-ШВ АВ - 5 (7,1%), СБЮ

ABI fi-LGB ВВ-11 (15,7%), CSN3 ВВ / fi-LGB АА - 1 (1,4%) и CSN3 ВВ / fi-LGB АВ - 3 (4,3%) соответственно. При этом комбинация CSN3 ВВ / fi-LGB ВВ в данном стаде быков-производителей не встречалась (табл. 3).

Таким образом, в стаде быков-производителей наиболее часто встречались три комбинации: CSN3 АВ ! fi-LGB ВВ с частотой 15,7%, CSN3 АА / fi-LGB АВ -25,7% и CSN3 АА / fi-LGB ВВ - 34,3% соответственно.

В стаде коров выявлено 7 разных комбинаций генотипов. Из 107 коров имели комбинацию CSN3 АА / fi-LGB АА 11 (10,3%) коров, CSN3 АА / fi-LGB АВ -31 (29,0%), CSN3 АА / fi-LGB ВВ - 26 (24,3%), CSN3 АВ / fi-LGB АА - 3 (2,8%), CSN3 АВ / fi-LGB АВ - 26 (24,3%), CSN3 АВ / fi-LGB ВВ-1 (6,5%), и CSN3 ВВ / fi-LGB АВ - 3 (2,8%) соответственно. При этом комбинации CSN3 ВВ / fi-LGB АА и CSN3 ВВ / fi-LGB ВВ в данном стаде коров не встречались (табл. 3).

Таблица 3

Частота встречаемости комбинаций генотипов каппа-казеина и

бета-лактоглобулина у быков-производителей и коров

Генотип по генам Частота комбинаций генотипов

CSN3/LGB быки-производители коровы

п % D %

АА/АА 6 8,6 11 10,3

АА/АВ 18 25,7 31 29,0

AAIBB 24 34,3 26 24,3

АВ/АА 2 2,9 3 2,8

АВ ! АВ 5 7,1 26 24,3

АВ/ВВ 11 15,7 7 6,5

ВВ/АА 1 1,4 - -

ВВ/АВ 3 4,3 3 2,8

Таким образом, в стаде коров наиболее часто встречались три комбинации: СХЛ/З АЛ / /«.Сй ЛВс частотой 29,0%, СБЮ АА /(1-1СВ ВВ - 24,3% и CSNЗAB/fi-LGBAB-243%.

3.8. Характеристика быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей

Наибольший удой был у матерей быков с генотипом по гену каппа-казеина ВВ - 9394 кг, а наименьший у матерей быков с генотипом АВ - 8642 кг. При этом матери быков-производитеяей с генотипом АА по данному показателю имели промежуточные значения.

Более высокое содержание жира в молоке имели матери (4,01%) быков-производигелей с генотипом ВВ, а более низкое у матерей быков с генотипом АВ (3,84%). Матери потомков с генотипом ВВ превосходили по содержанию жира аналогов с генотипом^ на 0,10%. По выходу молочного жира тенденция сохранилась.

Проведенные исследования быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина по продуктивности их матерей показали, что наибольшую молочную продуктивность (удой за лактацию, содержание и выход молочного жира) имели матери быков с генотипом ВВ.

Удой матерей быков с генотипом ВВ бета-лактоглобулина был ниже на 1299 кг (Р<0,01) молока, чем у матерей быков с генотипом АВ, и на 1038 кг (Р<0,05), чем удой у матерей быков с генотипом АА.

Жирность молока матерей быков с генотипом ВВ была ниже, чем у матерей быков с генотипами АА и AB на 0,11% и на 0,09%, соответственно, и составила 3,85%. По выходу молочного жира матери быков с генотипом ВВ также уступали матерям быков с генотипами АА и AB на 50 кг (Р<0,05) и 58,4 кг (Р<0,01).

Таким образом, по результатам оценки быков-производителей по происхождению более высокие показатели были у быков с генотипом AB, чьи женские предки имели более высокую молочную продуктивность.

Наибольший удой за лактацию отмечен в группе матерей быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB AB и составил 9437 кг молока, а наименьший у матерей быков с комбинацией генотипов CSN3 АА / LGB ВВ - 8003 кг.

Более высокое содержание жира в молоке имели матери быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АА - 4,51%, а более низкое у матерей быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB AB - 3,77%. Матери быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АА превосходили по данному показателю животных других групп на 0,54-0,74% (Р<0,05-0,001).

Наибольший выход молочного жира (419,9 кг) отмечен у матерей быков, которые имели комбинацию генотипов CSN3 ВВ / LGB АА. Они превосходили по данному показателю аналогов на 47,3-106,3 кг молочного жира (Р<0,05 и 0,001).

Таким образом, полученные данные показали, что наибольшую молочную продуктивность имели матери быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АА, а наименьшую матери быков с комбинацией генотипов CSN3 АА / LGB ВВ.

3.9. Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина

Удой первотелок с разными генотипами каппа-казеина был в пределах от 4977 кг (АА) до 5293 кг (AB) молока. Коровы, несущие в своем генотипе В аллель каппа-казеина превосходили сверстниц на 185-316 кг молока (табл. 4).

Таблица 4

Показатели Генотипы Разница

АА АВ ВВ АВ-АА ВВ-АА

п 68 36 3 - -

удой, кг 4977±90,4 5293±129,1 5162±377,6 +316* + 185

жир, % 4,04+0,03 4,01±0,02 3,99±0,10 -0,03 -0,05

молочный жир, кг 201,7±3,73 212,3±5,48 206,0+12,40 +10,6 +4,3

белок, % ЗД4±0,02 3,22+0,02 3,31+0,04 +0,08** +0,17***

молочный белок, кг 156,3±3,06 170,4+4,73 170,9+14,54 +14,1* +14,6

* - Р<0,05; * * - Р<0,01; * * * - Р<0,001.

Животные с генотипом АА уступали по количеству молочного жира сверстницам с генотипами АВ и ВВ на 4,3-10,6 кг.

Наибольшим содержанием белка, характеризовалось молоко от коров с генатипами АВ и ВВ (3,22% и 3,31%). Животные, несущие в своем геноме В аллель каппа-казеина превосходили сверстниц с генотипом АА на 0,08-0,17%) (Р<0,01-0,001). От животных с генотипами АВ и ВВ получено больше молочного белка, чем от коров с генотипом АА на 14,1 кг (Р<0,05) и 14,6 кг соответственно.

Таким образом, коровы с генотипами АВ и ВВ каппа-казеина обладали более высоким уровнем молочной продуктивности по сравнению с животными с генотипом АА. Однако животные с генотипом АА превосходили аналогов с другими генотипами каппа-казеина по содержанию жира в молоке.

Удой первотелок в группе с генотипом бета-лактоглобулина ВВ составил 4899 кг, АВ - 5142 кг и ВВ - 5309 кг. Первотелки с генотипом бета-лактоглобулина ВВ уступали аналогам на 243-410 кг молока (табл. 5).

Наибольшее содержание жира в молоке (4,06%) имели коровы с генотипом АА. Наибольшее количество молочного жира (206,7-215,6 кг) получено от животных, несущих в своем геноме А аллель гена бета-лактоглобулина, они превосходили сверстниц по данному показателю на 9,3-18,2 кг.

Первотелки, имеющие в своем геноме аллель А превосходили по содержанию и выходу молочного белка животных с генотипом ВВ на 0,05-0,06% и 10,2-16,1 кг.

Таблица 5

Молочная продуктивность коров с разными генотипами бета-лактоглобулина

Показатели Генотипы Разница

АА АВ ВВ АА-ВВ АВ-ВВ

п 14 60 33 - -

удой, кг 53091227,2 5142±95,3 48991130,1 +410 +243

жир, % 4,06±0,05 4,02±0,02 4,03 ±0,04 +0,03 -0,01

молочный жир, кг 215,6+10,03 206,7±4,05 197,4+4,83 +18,2 +9,3

белок, % 3,20±0,03 3,19±0,02 3,14±0,02 +0,06 +0,05

молочный белок, кг 169,9±7,98 164,013,46 153,8+4,29 +16,1 +10,2

Таким образом, более высокими показателями молочной продуктивности характеризовались коровы-первотёлки с генотипами АА и АВ бета-лактоглобулина. В целом более низкие показатели молочной продуктивности были получены от коров с генотипом ВВ бета-лактоглобулина.

Наибольший удой отмечен в группах животных с комбинацией генотипов СЖ/УЗ АВ / ШВ АА, СБЮ АВ / ШВ АВ и составил 5422 кг и 5346 кг молока, при этом наименьший удой был в группах с комбинацией генотипов С&\3 АА / ШВ АВ (4968 кг) и СБЮ АА / ШВ ВВ (4860 кг) (табл. 6).

Таблица 6

Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина и

бета-лактоглобулина

Показатели Комбинации генотипов схда / ШВ

АА1АА АА/АВ АА1ВВ АВ/АА АВ/АВ АВШ ВВ/АВ

п И 31 26 3 26 7 3

удой, кг 5278+ 4968+ 48601 5422+ 5346+ 50441 51621

282,1 117,0 148,7 313,3 159,5 280,5 377,6

жир, % 4,03+ 4,06± 4,04± 4,18+ 3,99± 4,02± 3,99+

0,06 0,04 0,04 0,08 0,02 0,05 0,10

молочный жир, кг 212,7+ 201,7+ 196,3+ 226,6+ 213,3+ 202,8+ 206,0±

12,25 5,16 5,49 14,93 6,84 10,67 12,40

белок, % 3,18+ 3,15± 3,12± 3,26± 3,22± 3,20± 3,31+

0,04 0,02 0,03 0,02 0,02 0,03 0,04

молочный белок, кг 167,8+ 156,5± 151,6+ 176,8+ 172,1+ 161,41 170,91

9,83 3,96 4,83 11,39 5,94 9,43 14,54

По содержанию жира в молоке выгодно отличались животные с комбинацией генотипов С&УЗ АВ / ШВ АА (4,18%), что выше, чем у других первотелок на 0,120,19%. Коровы с комбинацией генотипов СБМЗ АВ / ШВ АА имели больше молочного жира (226,6 кг), что выше, чем у других животных на 13,3-30,3 кг.

Первотелки с комбинацией генотипов СБЫЗ АВ / ШВ АА, СБЫЗ АВ / ШВ АВ и СБМЗ ВВ / ШВ АВ имели наибольшее содержание белка в молоке (3,22-3,31%) и количество молочного белка (170,9-176,8 кг), что выше, чем у животных с другими комбинациями генотипов СБИЗ / ШВ на 0,02-0,19% и 3,1-25,2 кг.

Таким образом, более высокой молочной продуктивностью обладали животные с комбинацией генотипов С5М АВ / ШВ АА и СБИЗ АВ / ШВ АВ. При этом наибольшее содержание белка в молоке имели коровы с комбинацией генотипов СБЮ ВВ! ШВАВ.

3.10. Сыропригодность молока коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина

Из молока 50,0% коров с генотипом АА каппа-казеина получен казеиновый сгусток рыхлого и дряблого состояния. Присутствие В аллеля в генотипе животных значительно улучшило состояние казеинового сгустка. Доля молока с плотным состоянием сгустка у гетерозиготых коров А В - 80,6%, гомозиготных коров ВВ - 100,0%.

Лучшими показателями по продолжительности свёртывания характеризовались коровы с генотипом ВВ, у них свёртывание молока происходило за наименьшее время - 18,9 мин. Наибольшее время свёртывание молоко происходило у первотелок с генотипом АА и составили 31,7 мин., при этом у животных с генотипом АВ этот показатель был на промежуточном уровне - 25,4 мин.

Таким образом, наилучшими сыродельческими свойствами молока обладали коровы с генотипом ВВ каппа-казеина, у них был наибольший выход желательного плотного сычужного сгустка и наименьшая продолжительность свёртывания молока. При этом худшими сыродельческими свойствами молока обладали животные с генотипом АА.

Среди коров с разными генотипами бета-лактоглобулина наилучшие сыродельческие свойства характерны для молока коров с генотипом ВВ. От 78,8% молока этих коров получен плотный и лишь от 6,7% дряблый сгусток. У животных с генотипами АВ и АА свертывание молока было хуже, так выход плотного и дряблого сгустка составил соответственно (56,6% и 6,7%) и (42,8% и 14,4%).

По времени свертывания молока лучшие показатели имели коровы с генотипами АВ и ВВ. У этих животных свертывание происходила за 28,2-28,8 мин. Этот показатель у коров с генотипом АА был наихудшим и составил 33,0 мин., что выше, чем в аналогов, несущих в своем геноме В аллель на 4,2-4,8 мин. (Р<0,01).

Таким образом, среди происследованных коров наилучшими сыродельческими свойствами молока обладали животные с генотипом АВ и ВВ бета-лактоглобулина, т.е. у них наибольший выход желательного плотного казеинового сгустка и наименьшая продолжительность свёртывания молока. Они по этим показателям превосходили коров с генотипом АА бета-лактоглобулина.

Наилучшие сыродельческие свойства молока у коров с комбинациями генотипов СЛЫЗ ВВ / ШВ АВ. Молоко коров с данной комбинацией генотипов обладало свойством образования плотного казеинового сгустка за очень короткое время - 18,9 мин.

Первотелки с комбинацией генотипов СБМЗ АА / ШВ АА и С£ЛУ АА / ШВ АВ имели нашедшие сыродельческие свойства молока. Так, молоко от коров с комбинацией генотипов СЖ? АА / ЮВ АА и СШЗ АА/ШВАВ свертывалось под действием сычужного фермента соответственно за 34,7 мин. и 32,5 мин., что выше, чем у сверстниц с другими комбинациями СБЫЗ / ЮВ на 3,1-15,8 мин. (Р<0,01-0,001). Группы коров с комбинациями генотипов С8ЫЗ АА / ШВ АА и СБИЗ АА / ЮВ АВ имели наибольшее количество животных (63,6-67,7%), в молоке, которых рыхлый и дряблый казеиновый сгусток.

Таким образом, наилучшими сыродельческими свойствами молока обладали коровы, несущие в своем геноме В аллеля каппа-казеина и бета-лактоглобулина. При этом наибольший выход желательного плотного казеинового сгустка и наименьшая продолжительность свёртывания молока была у животных с комбинациями генотипов СЭЫЗ ВВ / ШВАВ.

3.11. Термоустойчивость молока коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина

Молоко коров с генотипом ВВ каппа-казеина характеризовалось пониженной термостабильностью - 39,3 мин., с генотипом АА - повышенной - 57,2 мин., при этом животные с генотипом АВ имели промежуточное значение - 56,5 мин. Первотелки с генотипом АА каппа-казеина превосходили аналогов с генотипами АВ и ВВ на 0,7 мин. и 17,9 мин. (Р<0,01) соответственно.

Таким образом, коровы, имеющие в своём геноме аллель А гена каппа-казеина превосходили сверстниц с гомозиготным генотипом ВВ по термостабильносги молока.

Термостабильность молока животных с разными генотипами бета-лактоглобулина была в пределах от 56,0 мин. (ВВ) до 58,5 мин. (АА). Первотелки, несущие в своем геноме В аллель бета-лактоглобулина уступали по этому показателю аналогам с гомозиготным генотипом АА на 2,2-2,5 мин.

Таким образом, генотип животных по гену бета-лактоглобулина оказывае незначительное влияние на термостабильность молока. Однако наибольшей термосгабильносгью молока обладали первотелки с генотипом ЛЛ бета-лактоглобулина

Термостабильность молока коров с разными комбинациями генотипов СЖ? ШВ была в пределах от 39,3 мин. (СБЫЗ ВВ / ШВ АВ) до 58,6 мин. (СБЮ АА ШВ АА). Животные с комбинацией генотипов СБИЗ АА / ШВ АА превосходил сверстниц с другими комбинациями генотипов СБМЗ / ШВ на 0,5-19,3 мин. Первотелки с комбинацией генотипов СБЮ ВВ / ШВ АВ уступали по данном показателю аналогам с другими комбинациями СБЮ / ШВ на 16,1-19,3 мин.

Таким образом, более высокой термостабильностью обладало молоко коро] несущих в своем геноме А аллель каппа-казеина и бета-лактоглобулина.

ВЫВОДЫ

1. Аммиачный и комбинированный щелочной способ выделена нуклеиновых кислот, разработанные нами для экстракции ядерной ДНК I лейкоцитов и спермы крупного рогатого скота, являются приемлемым способами пробоподготовки ДНК для молекулярно-генетических исследований.

2. Усовершенствованные нами известные протоколы ПЦР-ПДРФ да" генотипирования крупного рогатого скота по СБШ, ЮВ и 5/,/Ш-мутаци являются эффективными средствами ПЦР-анализа аллельного полиморфизм

Разработанные нами способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А к В гена CSM3 с усовершенствованной техникой 2-х стадийной ПЦР значительно повышают специфичность амплификации исследуемых участков гена.

3. У чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей и чёрно-пёстро х голштинских коров преобладал аллель А и генотип А А гена CSN3, а также В аллель и генотип ВВ гена LGB с наиболее часто встречающейся комбинацией генотипов CSN3/LGB у быков CSN3 АА I LGB ВВ и у коров CSN3 АА / LGB АВ. Животных носителей Л/./ID-мутации не обнаружено.

4. При оценке быков-производителей с разными генотипами CSN3 и LGB по молочной продуктивности их матерей выявлены более высокие показатели удоев, содержания и выхода молочного жира у матерей быков с генотипами ВВ CSN3 и АВ LGB. Более низкие показатели отмечены у матерей быков с генотипом АВ CSN3 и ВВ LGB. Наибольшие показатели были у матерей быков с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АВ и CSN3 ВВ / LGB АА , а наименьшие у матерей быков с комбинацией генотипов CSN3 АА / LGB ВВ.

5. Первотелки, несущие в своем геноме В аллель гена CSN3 и А аллель гена LGB превосходили сверстниц с генотипом АА CSN3 и ВВ LGB по удоям за 305 дней и на 1 день лактации, содержанию белка в молоке, количеству молочного жира и белка в молоке и интенсивности молокоотдачи. Наибольшие показатели молочной продуктивности имели коровы с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА и CSN3 АВ / LGB АВ, а более высокую белковомолочность - CSN3 ВВ / LGB АВ.

6. Наиболее сыропригодное молоко у коров, несущих в своем геноме В аллели генов CSN3 и LGB. Животные с генотипами АА CSN3 и АА LGB уступали по сыропригодности молока аналогам с другими генотипами. При этом на термостабильность молока оказывает благоприятное влияние наличие в геноме животного А аллелей генов CSN3 и LGB. А наилучшие технологические свойства молока у коров с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АВ (по сыропригодности) и CSN3 АА / LGB АА (по термостабильности).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для увеличения показателей молочной продуктивности и повышения жизнеспособности крупного рогатого скота необходимо проводить генотипирование всех племенных животных по аллелям каппа-казеина, бета-лактоглобулина и ШЛ£)-мутации.

2. Молоко от коров, несущих в своем геноме В аллель генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина целесообразно направлять на выработку сыра и творога, поскольку оно характеризуется наилучшими сыродельческими свойствами. Тогда как молоко от коров, несущих в своем геноме А аллель генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина целесообразно направлять на выработку стерилизованных молочных продуктов, поскольку данное молоко способно более продолжительное время выдерживать обработку сверхвысокими температурами.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вафин, P.P. Разработка методики высокоточной ПЦР. / P.P. Вафин, Р.Х. Равилов, P.P. Вафин, И.Х. Бакиров, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина // Ветеринарная практика. - Санкт-Петербург. - 2006/2007. - № 4 (35). -С. 43-51.

2. Ахметов, Т.М. Разработка способа высокоспецифичной ПЦР. / Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, P.P. Вафин // Вестник КГАУ. -2006. -№ 3,- С. 33-37.

3. Вафин, Р.Р. Оптимизация способов генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина / P.P. Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, C.B. Тюлькин // Ветеринарная практика. - Санкт-Петербург. - 2007. - № 2 (37)- С. 54-59.

4. Валиуллина, Э.Ф. Характеристика быков-производителей с различными комбинациями генотипов каппа-казеина, бета-лакгоглобулина по молочной продуктивности их матерей. / Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, C.B. Тюлькин, Т.М. Ахметов, Р.Р. Вафин // Ветеринарная практика. - Санкт-Петербург. - 2007. - № 4 (39).- С. 59-64.

5. Ахметов, Т.М. Молочная продуктивность и воспроизводительная способность голштинизированных коров в зависимости от генотипа каппа-казеина. / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин. Э.Ф. Валиуллина//Ветеринарный врач. -2007. - №4.- С. 58-61.

6. Ахмегов, ТМ Качество и технологические свойства творога, изготовленного из молока коров с разными генотипами каппа-казеина / ТМ. Ахмегов, СВ. Тюлькин, ОГ. Зарипов, Э.Ф. Валиуллина// Ученые записки Казанской ГАВМ.- Казань. - 2009. - Т. 196. - С. 45-49.

7. Ахмегов, Т.М. Состав молока и его физико-химические показатели у коров с разными генотипами каппа-казеина. / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин, О.Г. Зарипов, Э.Ф. Валиулгшна // Ученые записки Казанской ГАВМ. - Казань. - 2009. - Т. 196. - С. 49-54.

8. Ахметов, Т.М. Молочная продуктивность коров с разными генотипами бета-лакгоглобулина. / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Ученые записки Казанской ГАВМ. - Казань. - 2010. - Т. 202. - С. 31-36.

9. Ахметов, Т.М. Генотипирование коров по локусам каппа-казеина, бета-лакгоглобулина и BLAD-мутации. / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Ученые записки Казанской ГАВМ. - Казань, 2011Т. 205,- С. 11-17.

10. Вафин, P.P. Способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина. Патент на изобретение РФ № 2337141 / P.P. Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, P.P. Вафин // Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - опубликовано 27.10.2008. — Бюл. № 30.

11. Ахметов, Т.М. Характеристика быков производителей с различными генотипами бета-лакгоглобулина по молочной продуктивности их матерей. / Т.М. Ахметов, ОГ. Зарипов, СБ. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Материалы всероссийской научно-пракгаческой конференции «Технологические и технические аспекш развития сельского хозяйства». Посвящается 85-лешю Казанского ГАУ. - Казань, 2007. - Т. 74. - Ч. 3-4,- С. 7-10.

12. Ахметов, Т.М. Технологические свойства сыра, произведенного из молока коров с разными генотипами каппа-казеина / Т.М. Ахметов C.B. Тюлькин, О.Г. Зарипов, Э.Ф. Валиуллина // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Современные тенденции развития ветеринарной медицины и инновационные технологии в ветеринарии и животноводстве». Ученые записки Казанской ГАВМ. - Казань. - 2009. - Т. 199. - С. 12-17.

13. Ахметов, Т.М. Молочная продуктивность коров с разными генотипами бета-лактоглобулина / Т.М. Ахметов, C.B. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Материалы международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» Ученые записки Казанской ГАВМ. - Казань. - 2010. - Т. 202. - С. 12-17.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 12.12.2011 г. Печ.л.1,0 Заказ ХгК-7095. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Валиуллина, Эльвира Фанилевна, Казань

61 12-3/385

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ИМЕНИ Н.Э. БАУМАНА

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ЧЁРНО-ПЁСТРОГО СКОТА ПО ЛОКУСАМ КАППА-КАЗЕИНА, БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА И ВЬАВ-МУТАЦИИ МЕТОДАМИ ДНК-ТЕХНОЛОГИИ

Специальность: 06.02.07. - Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

На укописи

ВАЛИУЛЛИНА

ЭЛЬВИРА ФАНИЛЕВНА

ДИССЕРТАЦИЯ

Научный руководитель: доктор биологических наук Ахметов Т.М.

Казань-2012

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................... 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................... 9

1.1. Молочная продуктивность, качество и технологические свойства

• • •• V/ и и А

молока коров черно-пестрой и голштинскои пород и их помесей.. 9

1.2. Аллельный полиморфизм генов каппа-казеина, бета-лактоглобулина и его влияние на молочную

продуктивность, качество и технологические свойства молока.... 23

1.3. Распространенность рецессивных мутаций на примере

ВЬАИ в стадах крупного рогатого скота.................................. 41

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................ 45

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ................ 58

3.1. Разработка и совершенствование техники выделения

ДНК из крови и спермы...................................................... 58

3.2. Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина........................ 58

3.3. Разработка способа проведения высокоточной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота

по гену каппа-казеина......................................................... 61

3.4. Разработка способа проведения аллель-специфичной ПЦР

для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В

гена каппа-казеина.............................................................. 66

3.5. Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина............... 68

3.6. Совершенствование техники ПЦР-ПДРФ для выявления у крупного рогатого скота ВЬАБ-мутации................................. 69

3.7. Оценка полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота........................ 70

3.7.1. Полиморфизм гена каппа-казеина у быков-производителей......... 72

3.7.2. Полиморфизм гена каппа-казеина у коров................................ 73

3.7.3. Полиморфизм гена бета-лактоглобулина

у быков-производителей..................................................... 74

3.7.4. Полиморфизм гена бета-лактоглобулина у коров...................... 75

3.8. Встречаемость комплексных генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота........................ 77

3.8.1. Встречаемость разных комбинаций генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у быков-производителей......................... 77

3.8.2. Встречаемость разных комбинаций генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у коров................................................ 78

3.9. Характеристика быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина

по молочной продуктивности их матерей................................ 80

3.9.1. Характеристика быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина по молочной продуктивности их матерей............. 80

3.9.2. Характеристика быков-производителей с разными генотипами бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей.... 82

3.9.3. Характеристика быков-производителей с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей................................................. 84

3.10 Молочная продуктивность коров с разными генотипами

каппа-казеина и бета-лактоглобулина.......................................... 86

3.10.1. Молочная продуктивность коров с разными

генотипами каппа-казеина........................................................ 87

3.10.2. Молочная продуктивность коров с разными

генотипами бета-лактоглобулина.......................................... 88

3.10.3. Молочная продуктивность коров с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина....................... 90

3.11. Технологические свойства молока коров с разными

генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина..................... 93

3.11.1. Сыропригодность молока коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина.................................... 94

3.11.1.1. Сыропригодность молока коров с разными генотипами каппа-казеина.................................................................. 94

3.11.1.2. Сыропригодность молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.......................................................... 96

3.11.1.3. Сыропригодность молока коров с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина....................... 97

3.11.2. Термоустойчивость молока коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина..................................... 99

3.11.2.1. Термоустойчивость молока коров с разными генотипами каппа-казеина................................................................... 99

3.11.2.2. Термоустойчивость молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина..............................................................................100

3.11.2.3. Термоустойчивость молока коров с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина....................... 101

3.12. Диагностика ВЬАБ-мутации у крупного рогатого скота.............. 102

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ................. 103

5. ВЫВОДЫ........................................................................ 123

6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ...................................... 125

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................... 126

ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................ 152

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота.

ДСН - додецилсульфат натрия (SDS - sodium dodecyl sulfate).

ДТТ - дитиотрейтол (DTT - dithiotreitol).

МДЖ - массовая доля жира.

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фргаментов (RFLP -Restriction Fragment Length Polymorphism).

ПЦР - полимеразная цепная реакция (PCR - Polymerase Chain Reaction). ЭДТА - этилендиаминтетрауксуая кислота (EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid).

ЭКЕ - энергетическая кормовая единица. А - adenosine (А - аденозин).

BLAD - bovine leukocyte adhesion deficiency (дефицит адгезии лейкоцитов у

крупного рогатого скота).

bp - base pair (п.о. - пары оснований).

С - cytosine (Ц - цитозин).

CSN3 (к-Сп) - каппа-казеин.

CVM- complex vertebral malformation (сложное позвоночное уродство). dNTPs - deoxynucleosidtriphosphates (дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты). G - guanosine (Г - гуанозин). Т - thymidine (Т - тимидин).

TULIPS-PCR - Touch-Up and Loop Incorporated PrimerS (разновидность «Touch-Up» ПЦР с инвертированными праймерами). ß-LGB (ß-Lg) - бета-лактоглобулин.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Насыщение рынка продовольствия качественными продуктами отечественного производства в достаточном объёме невозможно без интенсификации животноводства, где одной из составляющих является эффективная селекция. Сегодня уже ни у кого не вызывает сомнения эффективность использования генетических маркёров, таких как группы крови, биохимические белки, ферменты, а также новых маркёров, выявляемых с помощью ПЦР-анализа (полимеразная цепная реакция). Применение такой маркёрной технологии в селекции позволяет выявлять генетические дефекты и прогнозировать генетический потенциал продуктивности животных сразу после рождения (Г.М. Гончаренко, 2009).

Опыт многих стран с развитым животноводством свидетельствует о важности использования генетических маркеров, которые связаны с качественными признаками молочной продуктивности крупного рогатого скота. В качестве потенциальных маркеров молочной продуктивности могут рассматриваться гены молочных белков, а именно каппа-казеина и бета-лактоглобулина (Е.С. Усенбеков, 1995; Б.С. Иолчиев, В.И. Сельцов, 1999; Л.А. Калашникова, 2003; Е.А. Денисенко, 2004; О.В. Костюнина, 2005; H.H. Мухаметгалиев, 2006; Э.Ф. Валиуллина и др., 2007; Я.А. Хабибрахманова, 2009, О.Г. Зарипов, 2010).

Ген каппа-казеина связан с белковомолочностью и технологическими свойствами молока. Аллель В гена каппа-казеина ассоциирован с более высоким содержанием белка в молоке. Ген бета-лактоглобулина отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока (N. Strzalkowska et al., 2002; H.A. Зиновьева и др., 2002; Т.М. Ахметов, 2009; P.A. Хаертдинов, М.П. Афанасьев, P.P. Хаертдинов, 2009). Аллель В гена бета-лактоглобулина связан с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, высоким процентом жира, тогда как аллель А характеризуется с высоким содержанием сывороточных белков.

Широкий обмен генетическим материалом между странами

сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний, а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. В отдельных случаях наблюдается высокая скорость распространения таких мутаций. Огромный экономический ущерб обусловливает необходимость строгого генетического контроля импортируемого генетического материала, а также изучение возможных механизмов распространения мутаций (В.И. Глазко и др., 2001; А.Е. Мар1уца, 2005).

Одним из таких наследственных заболеваний крупного рогатого скота является 5£/41)-мутация, характеризующаяся дефицитом лейкоцитарной адгезии (Р.В. Биккинин, 2007; Г.М. Гончаренко, 2009).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение полиморфизма генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина, определяющих молочную продуктивность и технологические свойства молока крупного рогатого скота, а также выявление животных-носителей ВЬАО- мутации.

Учитывая вышеизложенное, в настоящей работе поставлены следующие задачи:

- совершенствовать технику выделения ДНК из крови и спермы крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований;

- совершенствовать технику проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и Ш^£)-мутации; разработать новые способы проведения ПЦР;

- изучить частоту отдельных типов каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций, а также ЯЫГ)-мутации у крупного рогатого скота;

- определить молочную продуктивность коров и матерей быков-производителей с разными генотипами каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций;

- оценить технологические свойства молока коров с разными генотипами каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций.

Научная новизна. Усовершенствована техника выделения ДНК из крови, спермы и проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и Ш^£>-мутации. Разработаны способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина. Выявлен полиморфизм и определена частота встречаемости аллелей и генотипов по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и ВЬАО-иутации. Изучена молочная продуктивность, качество и технологические свойства молока чёрно-пёстро х голштинских коров в зависимости от генотипов каппа-казеина, бета-лактоглобулина и их комбинаций.

Практическая значимость. Разработанные и усовершенствованные приемы проведения ПЦР-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и ВЬАП-мутации позволяют вести грамотную селекционно-племенную работу на повышение молочной продуктивности и улучшение технологических свойств молока коров, а также выведение из разведения животных-носителей ВЬАИ-мутации.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- всероссийской научно-практической конференции «Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства», посвященной 85-летию КГАУ (Казань, 2007);

- международной научно-практической конференции «Современные подходы развития АПК», посвященной 135-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2008);

- международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства (Казань, 2010).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 12 научных статей, в том числе 8 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Усовершенствованная нами техника экстракции ДНК и проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и ££Л/)-мутации позволяет проводить маркирование аллелей и генотипов, связанных у животных с молочной продуктивностью и резистентностью к заболеваниям.

- Разработанные нами способы высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А к В гена CSN3 в усовершенствованной технике 2-х стадийной ПЦР обеспечивают более результативную наработку специфичных ампликонов, которые далее являются мишенями для праймеров в системе 100% комплементарности.

- Определен аллельный полиморфизм генов CSN3, LGB и Ж/Ш-мутации у чёрно-пёстрого скота в условиях Республики Татарстан.

- Наличие в геноме чёрно-пёстро х голштинских коров Б-аллеля гена CSN3 и Л-аллеля гена LGB приводит к повышению показателей молочной продуктивности. При этом молоко от чёрно-пёстро X голштинских коров, несущих в своем геноме Б-аллель генов CSN3 и LGB более сыропригодное, тогда как молоко от животных, имеющих в геноме ^4-аллель более устойчивое к тепловой обработке.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 158 страницах, содержит 24 таблицы, 17 рисунков. Состоит из: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, предложения производству, списка использованной литературы (всего 220 источников, в том числе 75 иностранных) и приложения.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молочная продуктивность, качество и технологические свойства молока коров чёрно-пёстрой и голштинской пород и их помесей

В настоящее время из всех пород молочного скота самой многочисленной в Российской Федерации является чёрно-пёстрая порода. Молочная продуктивность коров чёрно-пёстрой породы в целом достигает 3000 кг молока с содержанием жира 3,77% и белка 3,14%. Однако уровень молочной продуктивности не достигает потенциальных возможностей данной породы (Е.А. Денисенко, 2004).

По данным A.M. Русяева, Г.Е. Русановой (1987) чёрно-пёстрая порода является среди всех отечественных пород нашей страны, наиболее приспособленной к условиям промышленного производства молока. При этом она в большей массе не отвечает требованиям интенсивной технологии, имеются существенные недостатки экстерьера и, прежде всего, неравномерность развития четвертей вымени, выраженности молочного типа.

По данным JI.K. Эрнста и др. (1997) новый тип чёрно-пёстрого скота получил признание в 1985 г. при апробации его в племзаводе «Петровский» Ленинградской области. Плановое использование быков-производителей голштинской породы в этом хозяйстве позволило повысить генетический потенциал породы более чем на 1000 кг молока, при создании новых высокопродуктивных типов (ленинградский, московский, уральский) и племенных стад, продуктивность которых на уровне лучших европейских.

В ведущих племенных хозяйствах ГПЗ «Лесное» и «Петровский» Ленинградской области 49,0% и 40,3% коров чёрно-пёстрой породы имеют удой выше 7000 кг молока за лактацию, 45% и 26% - выше 9000 и 13% и 9% - более 10000 кг соответственно. Средняя живая масса коров в племенных хозяйствах 550-650 кг, товарных - 500-550 кг, убойный выход - 54-56% (Л.К. Эрнст, А.П. Калашников, 1990).

Молочная продуктивность коров-первотелок чёрно-пёстрой породы в условиях лесостепного Поволжья находилась на следующем уровне: удой за 305 дн. лактации - 3759-5291 кг молока, содержание жира и белка соответственно 3,55-370% и 2,83-3,08% (H.A. Тюлюкина, 2010).

Преимущество по удою за лактацию сохраняется за коровами чёрно-пёстрой породы из стад Омской области с удоем свыше 5 тыс. кг (5445 кг). Разница над животными из стад с удоем до 4 тыс. кг составила 1928 кг (Р<0,001), с удоем 4-5 тыс. кг - 1121 кг (Р<0,01). По количеству молочного жира и белка коровы в стадах с удоем свыше 5 тыс. кг молока превосходили животных из стад с удоем 4-5 тыс. кг и до 4 тыс. кг на 45,2-85,6 кг (Р<0,01-0,001) и на 42,2 кг и 66,4 кг (Р<0,001) соответственно (E.H. Юрченко, 2007).

В настоящее время в Омской области ведутся работы по апробации западносибирского типа чёрно-пёстрой породы, сочетающего генетический потенциал продуктивности голштинов с приспособленностью популяции местного скота. Удой первотелок в стадах с уровнем продуктивности до 4000 кг молока увеличился с 3232 до 3465 кг. В стадах с удоем 4001-5000 кг продуктивность животных возросла с 3828 до 4616 кг молока, в более продуктивных стадах с 4654 до 5785 кг (И.П. Литовченко, 2007).

В результате использования быков-производителей голштинской породы в Зауралье создан новый тип чёрно-пёстрого скота с удоем 33003500 кг, МДЖ в молоке - 3,8%. Совершенствуются заводские типы животных с удоем 6000-7000 кг молока, МДЖ в молоке - 3,88-4,13%. Использование в племенных заводах генетического потенциала молочных качеств немецкой чёрно-пёстрой породы способствовало увеличению удоев, содержания жира и белка в молоке (Г.П. Лещук, 2007).

На основе использования племенных ресурсов советской чёрно-пёстрой, голландской и голштинской пород создан таджикский тип молочного скота;