Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казеина, бета лактоглобулина и мутации BLAD

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казеина, бета лактоглобулина и мутации BLAD"

ЦеЕРОССИИСКИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ • ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи УДК 636.2.034.577.21

УСЕНБЕКОВ Есенгали Серикович

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ЛОКУСАМ КАППА-КАЗЕИНА, БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА И МУТАЦИИ ВЬАЭ

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ—ПУШКИ Н 1995

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогеыетикн Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор А. Ф. Яковлев, кандидат биологических наук С. А. Коваленко.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Л. С. Жебровский, кандидат биологических наук М. Г. Смарагдов.

Ведущая организация — Санкт-Петербургская Государственная Академия ветеринарной медицины.

Защита диссертации состоится Л » Лслл^/Ск. 2995 г в // час на заседании Специализированного совета Д 020.07.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Адрес института: 189620, С.-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИГРЖ.

Автореферат разослан » 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор с-х наук, профессор Ж. Г. Логинов

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАБОТЫ

Актуальность темы. Успех селекционной рабаты в значительной степени зависит от точности определения племенной ценности генотипа животных, В связи с этим особенно возрастает значение разработки методов, позволяющих-более обоснованно и своевременно выявлять лучших животных, прогнозировать их племенные и продуктивные качества в раннем возрасте и в процессе трансплантации эмбрионов.

Известно, что генетические варианты по полиморфным системам белков молока связаны с некоторыми показателями молочной продук-■ тивности, в частности полокусам каппа-казеина и бета-лактоглобу-лина ( Жебровский Л.С., 19??; Митнтько В.Е.,1990; Комиссаренко А.Д.,1994; Ng-Kwai-Hang K.F.,1984; Gonyon D.C. et al, 198?), Изучение частоты аллелей и генетических вариантов по этим локусам представляет научный и практический интерес, так как гомозиготная форма В-аллели к-казеина в молоке связана с выходом сыра и его качеством (Korini D. et al, 1979; Marziali A.S et al, 1986; McLe-'ari D.M. et al, 1989). В молоке эти аллели могут быть легко определены с помощью электрофореза белков, но для проведения генетического анализа и эффективной селекционной работы необходимо тестировать быков-производителей и молодых животных, для чего целесообразнее применять молекулярно-генетические подходы, в частности анализ полиморфизма ДНК (Яковлев А.Ф., 1987; Сулимова Г.Е., 1993; Conan С.М. et al, 1992).

В последнее время в "литературе появились сообщения об использовании методов молекулярной генетики для оценки генотипа по локусам каппа-казеина, бета-казеина и определения пола эмбрионов, в частности на эмбрионах крупного рогатого скота. Hochuan Р. et al (1994) использовали для определения пола эмбрионов крупного рогатого скота, полученных путем оплодотворения in vitro, метод поли-меразной цепной реакции.

Одна из малоизученных областей современной генетики животных является изучение распространенности наследственных болезней и разработка методов их диагностики. Дефицит адгезии лейкоцитов (Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency-BLAD)- наследственная ауто-сомальная рецессивная болезнь, обусловленная точечной мутацией в кодирующей части гена СД18. Мутация связана с пониженной резистентностью потомков к бактериальным инфекциям. Частота D128G аллеля

i

среди быков голатинской породы .в СЫА составила 15'/., а среди коров 6'/.. ¿негодный экономический ущерб, наносимый данной болезнью, определили в пределах пяти миллионов долларов США (51шЛег О.Е. еЬ а1 1932; ЕПЬег1 и.О еЬ а1, 1ЭЭЗ).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение частоты различных аллелей генов, определяющих белковый состав молока и мутации'В1.АО, связанной с резистентностью к заболеваниям у биков-производителей,

Были поставлены следующие задачи: -разработать технологии ПЦР длятенотипировання быков-производителей и предимплантационных эмбрионов, -изучить частоту отдельных типов каппа-казеина, бета-лактоглобу-лина и ВЬАО среди быков голштинской и черно-пестрой пород, -сделать попытку провести анализ связей изученных аллелей с хозяйственно полезными признаками кивотных.

Научная новизна работы. Впервые на основе использования ДНК криоконсервированного семени и метода полимеразной цепной реакции установлена частота генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина и проведена паспортизация быков-производителей в популяциях черно-пестрой и голатинской пород Ленинградской области. Частота генетических вариантов каппа-казенина АА, АВ и ВВ соотвественно составила 28,ОХ, 67,0% и 5'/., бета-лактоглабулина - 20Х, .57^ и 23'/., Показано отсутствие среди исследуемых быков носителей мутации СД 1286, связанной с пониженной резистентностью к заболеваниям. Разработана технология генотипирования предимплантационных эмбрионов по изучаемым генам,

Практическая значимость работы. Результаты аттестации быков используются в селекции. Показана возможность генотипирования эмбрионов по типам вакных в хозяйственном отношении генов перед трансплантацией,

Апробация работы. Результаты исследований неоднократно докладывались на аспирантских сессиях ВНИИГР1 (.1992-1994), Ученом совете ВНИИГРЙ (1992-1994), на-международное симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с-х кивотных" (Санкт-Петербург, 1934) и получили полошительную оценку.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 печатных работ, '

о

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов и предложений производству и списка литературы, включающего 172 источника, в.т.ч. 118 на иностранных языках. Работа изложена на /19 страницах, содеряит /5 таблиц, W рисунков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .

Эксперименты проводили на быках-производителях четно-пестрой и голитинской пород Ленинградского племобъединения "Невское" и на предимплантационнкх эмбрионах, полученных путем оплодотворения_in vitro лабораторией культивирования эмбрионов ВНИИГР1. Всего гено-типировано по каппа-казеиновому локусу 156 быков-производителей, по бета-лактоглобулиновому и на BLftD 143 головы, в том числе 67 быков-производителей, оцененных по качеству потомства. Выделяли ДНК из спермы по методам B.R.Bahnak ( 1988) и А.З. 3efferys (1990). Депротеинизацию ДНИ осуществляли по общепринятой методике (Маниатис Т.,1984). Хранили образцы ДНК при температуре -20 С.

Полимеразнуа цепную реакцию для определения генотипа по типам

каппа-казеина проводили как описано в работах 3.F. Medrano et al

(1990), С.К. Couan et al (1992) с использованием праймеров: ЗК501

5' -ATCATTTATGGCCftTTCCACCAAAG-З' , ЗК 302: 5' -GCCCATT-

TCGCCTTCTCTGTAAGAGA-3' Продолжительность амплификации составляла

о о

25-о0 циклов при режиме 94 С-денатурация, 55 С-откиг праймеров и

73 С-элонгация 60:60:60 сек. Для выявления ДНК полиморфизма гена каппа-казеина была использована рестриктаза Hinf I. После рестрикции продукт реакции был подвергнут электрофорезу в 47. агарозе, окрашенной бромистым зтидием для. определения генетических вариантов. Силу тока устанавливали 150 мА, напряжение 180 U, мощность 50 Вт. Генотипирвание быков-производителей по типам бета-лактог-лобулина проводили методом полимеразной цепной реакции при режиме 94°С-денатурация, 55°С-отмг праймеров, 73 С-элонгацйя, 45:60:60 сек. Были использованы праймеры: 5-TGTGCTGGACACCGACTACAAAAAG-3', 5'GCTCCCGGTftTATGACCflCCCTCT-3'. Затем продукт амплификации был подвергнут воздейтсвию рестриктазы Нае III.

Генотипирование предимплантационных эмбрионов по локусам каппа-казеина и бета-лактоглобулина методом ПЦР проводили согласно

3

методике Т, Peura et al С1991). С целью приготовления лизата эмбрионы, полузмбрионы или 3-4 бластомера помещали в пробирку содержащую 50 мкл лизирующего буфера с протеиназой К. Инкубировали в течение 30-60 мин при температуре 3?°С, Денатурацию протеиназы К осуществляли при 99°С в течение 8 мин. Приготовленный таким образом лизат был использован для проведения полимеразной цепной реакции. Количество циклов было увеличено до 35.

Полимеразную цепную.реакции для выявления носителей мутации BLAD проводили как описано в работе D.E. S.huster et al (1992) с частичными модификациями и были синтезированы праймеры с последовательностью: 5' -ТССе&АББйССАЙ&Б&СТАЗ', 5-GAGTAGGAGAG£TCCATCA&&-ТА£ТАСА£&-3'. Количество циклов устанавливали 35 при ремиме: 94 С денатурация, 65°С - отжиг праймеров и 72°С - элонгация, 30:30:30 сек. Экспериментальным путем подобран оптимальный состав буфера для полимеразной цепной реакций -iОх 500мИ калия хлорида, 100 мН Трис HCl (pH 8,3), 15 мМ магния хлорида и 20 -мг/мл БСА. Для выявления носителей мутации BLAD были использованы рестриктазы Нае 111 и Taq I.

Для выявления особенностей генетической структуры популяции по локусам каппа-казеина и бета-лактоглобулина нами применялись математические формулы по Е.К, Неркурьевой (197?), H.A. Плохинскому (1969, 1970), П.Ф. Рокицкому (1974), А. Robertson (1953). Для проведения дисперсионного анализа была, использована программа "LSML 76". • ' ' ' ^

. ■ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ

3.1. Характеристика исследуемой популяции по каппа-казеиновому и бета-лактоглобулиновому локусам

Частота аллелей и разных генетических вариантов каппа-казеина представлены в таблице 1. В настоящее время известны четыре,аллели каппа-казекна, <обозначенные А, В, С, Д. Наибольшую встречаемость у большинства пород мира имеют две,аллели А и В. Нами установлен полиморфизм по данному локусу. более 6.7% виеотных имели гетерозиготный генотип AB. Доля гомозиготных особей в данной популяции оказалась небольшая и составила АА - 28И и ВВ - 5У.. Выяв-"лбно-ценных с точки зрения сыроделия носителей генотипа ВВ всего 4

8. Этот генотип у быков голштинской породы вообще не обнаружен. У яивотных голштинской породы доля гетерозиготных особей била еще выше, по сравнению с быками черно-пестрой породы, и составила 832. Анализ встречаемости аллелей по каппа-казеиновому локусу показал превосходство в концентрации аллеля к-Сп А (0,62) над аллелей к-СпВ (0,38). По частоте аллелей гена каппа-казеина существенной межпородной разницы не обнаружено.

Анализ встречаемости генетических вариантов бета-лактоглобули-на показывает, что более половины (57У.) животных имеют гетерозиготный генотип АВ.' Частота гомозиготных генотипов ДА и ' ВВ была почти одинаковой - 20'/. и 237. соответственно. В отличие от каппа-казеинового локуса,' по типам гена бета-лактоглобулина обнаружено межпородное различие. Так, у быков голштинской породы частота гомозиготного варианта ftft IV/., а у черно-пестрой - 97.. Гетерозиготный генотип АВ наибольшую частоту имел' у кивотных голитинс-кой породы (74,62). Анализ частоты аллелей гена бета-лактоглобулина показывает, что аллели данного локуса имеют почти одинакова« встречаемость (А - 0,49 и В - 0,51). Выраженного колебания частоты встречаемости аллелей гена бета-лактоглобулина в зависимости от породы не обнаружено.

Таблица 1

Частота разных аллелей и генотипов по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина у быков-производителей племобьединения "Невское"

Число Ло- ' Частота Частота генотипа.

Порода гол кус аллелей АА ЙВ В!

А В п г п г п У.

Черно-пест 133 к-Сп 0,62 0;38 40 30 85 64 8 6

Голотин 23 0,53 0,41 4 17 19 83 - -

В средн 150 0,62 0,38 ' 44 28 104 67 в 5

Черно-пест .120 B-Lg 0,49 0,51 27 22 64 53 29 25

Голштин 23 0.46 0,54 2 9 17 74 4 17

В средн 143 0,49 0,51 29 20 81 57 33 23

Использование критерия хи-квадрат позволяет определить степень соответствия фактического распределения генотипа с его теоретическим значением. Большое несоответствие фактического распределе-

5

пиа генотипа по всем трем генотипам каппа-казеина с теоретическим распределением установлено как для быков черно-пестрой, гак и для голштинской пород. Так, отмечен недостаток гомозигот АА (44 против 60 теоретически ожидаемых) и Вй ( 8 против 23). В каппа-казеиновом локусе наблюдается значительный (табл.2) избыток гетерозигот ЙВ (104 против 73 теоретически.ояимдаеыых) и недостаток'гомозигот ЙА и ВЗ, Критерий соответствия превышал его табличное значение почти в четыре раза (27,2). Это свидетельствует о том, что по исследуемому локусу нет генного равновесия. Последнее, видимо, могшо обяьснить влиянием отбора, в основном искусственного.

Таблица 2-

Степень соответствия фактического распределения генотипа по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина с теоретическим распределением у быков-производителей.Са-коэффициёнт гомогенности, На-уровень полиморфности

Число Ло- АА АВ ВБ хи Са • На

Порода гол кус Ф ■ т Ф' т Ф т квад

Черно-пест 133 40 51 85 63 8 19 16,4 0,528 1,89

Голштин 23 к-Сп 4 8 19 11 - 4 11,8 0,516 1,93

В среди 156 44 60 104 73 8 23 27,2 0,528 1,89

Черно-пест 120 27 29 64 60 29 31 0,53 0,500 2,00

Голитин 23 в-1е 2 5 17 11 - 4 7 6,35 0,503 1,98

В среди . 143 29 34 81 72 33 37 2,29 0,500 1,99

В отличие от каппа-казеинового локуса по бета-лактоглобулино-вому локусу у всех исследуемых еивотных обнаружено генное равновесие. Наибольшая разница иекду числом фактического и теоретического распределения генотипов по бета-лактоглобулиновоиу локусу отмечена по гетерозиготному варианту АВ (9 голов). Показатели хи-квадрат колебались от 0,53 у быков черно-пестрой до В,35 у быков голштинской пород. Дайний показатель в средней по исследуемой популяции составил 2,23 к не превикал его табличного значений при Р=0.01. Это показивает, что по данному локусу генное равновесно не нарушено.

Коэффициент гомогенности у изучаемых особей по казеиновому

локусу составил 0,526. Увеличение значения коэффициента гомогенности свидетельствует оо избыточной встречаемости гетерозиготной формы у исследуемых животных.

Величина другого показателя, обратного коэффициенту гомогенности - уровня полиморфности (На) по каппа-казеиновому локусу у кивотных опытной группы колебалась от 1,89 у черно-пестрой .до 1,93 у голмтинской пород. Среднее значение уровня полиморфности у изучаемых особей составило 1,93. Известно, что максимальное значение уровня полиморфности при двухаллельном локусе равно 2. Увеличение числа особей носителей гомозиготного варианта по исследуемому локусу приведет к повышению коэффициента гомогенности, а последнее в свои очередь к снижении уровня полиморфности.

Несколько другие результаты получены по бета-лактоглобулиново-му локусу. Коэффициент гомогенности был равен в среднем по исследуемой популяции 0,500. Уровень полиморфности имел максимальное значение - 2.

Данные таблицы 3 еще раз подтверждают об избыточной встречаемости гетерозиготного варианта каппа-казеина АВ (104 при теоретически онидаемом 73,50). У исследуемых животных отмечается большой недостаток гомозиготных генотипов Ай и ВВ (52,0 при 'теоретически ожидаемом 82,4). Таким образом, большая часть животных являются носителями гетерозиготного варианта каппа-казеина АВ, что и привело к снккенив доли особей с гомозиготным генотипом (в среднем по исследуемой популяции 33,37.). Доля гомозиготных у быков-производителей голитинской породы составила всего 17%.

па основании полученых нами данных вычислен тест гетерозигот-ности. показывавший косвенно уровень генетического разнообразия популяции, который составил по каппа-казеиновому локусу в среднем у изучаемых особей +112,04. Наибольшее значение имел данный показатель у кивотных голитинской пароды (+342,34).

Аналогичная картина наблюдается и по бета-лактоглобулиновому локусу, отмечается значительный избыток гетерозиготного генотипа АВ и недостаток гомозиготных вариантов АА и ВВ. Доля гомозиготных особей по данному локусу в среднем по исследуемой группе составила 43,ЗХ, И здесь отличалась голвтинская порода, которая имела низкую долю гомозиготности 126%). По обоим локусам быки голитинской породы имели высокую встречаемость гетерозиготного варианта АВ (837. и 747.), Тест гетерозиготности (Т.Г.) по бета-лактоглобу-,

7

линовому локусу имел во всех группах положительное значение и варьировал от +41,75 до +191,66.

Обобщая данные таблицы 3 можно сказать, что по каппа-казеиновому локусу нарушено генное равновесие у исследуемых особей. Об этом свидетельствует и большая степень несоответствия фактического распределения генотипа по каппа-казеиновому локусу-с теоретически ожидаемым.

Таблица 3

Соотношение гомо- и гетерозиготных особей, тест гетерозиготност.и по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина (ф-фактическое, т-теоретичаское)

Порода Чис ло гол Локус Гомозиг Гетерозиг Доля гомоз Тест гетерозиг

Ф т ф т

Черно-пест 133 48 70,3 85 S2.6S 382 +87,08

Голитин 23 к-Сп 4 11,8 19 11.12 17 7. .+383,34

В среди 156 52 82,4 104 73,50 33JC +112,04

Черно-пест 123 56 60,0 64 59,97 467, +41,75

Голмтин 23 B-Lg 6 11,5 17 11,42 262 +191,66

В средн 143 62 ?1,5 81 71.47 W + 41,75

Нами обнаружены ? из 9 теоретически возможных сочетаний генотипов по к-казеину и бета-лактоглобулину (табл. 4), Из данных таблицы 4 видно, что с высокой частотой встречается комплексный генотип-Ай/йВ. Это и понятно, потому что частота гетерозиготного, варианта ЙВ по каппа-казеину была 6Т/. и бета-лактоглобулину Следовательно, у кивотных данной популяции значительно часто встречаются дигетерозиготные особи. Частота носителей комплексного генотипа ftft/fiB и ftB/ftft была почти эквивалентной -13,987. и 13.28К соответственно. Встречаемость ком'лексного гомозиготного по каппа-казеину ftñ и бета-лактоглобулину ВВ генотипа составила 7,697.. Носителей гомозиготного по бета-лактоглобулину ВВ варианта с гетерозиготной формой каппа-казеина выявлено всего 17 животных, или 11,88^ от общего числа, Наиболее низкую встречаемость имели комплексные генотипы, гомозиготные по обоим локусам fifi и гомозиготные по каппа-казеиновому локусу ВВ и гетерозиготные по бета-8

лактоглобулину (5,59%).

Таблица 4

Встречаемость комплексных генотипов по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина у исследуемой группы (п = 143) .

Генотип Сп/Ьв АА/АА АА/АВ АА/ВВ АВ/АА АВ/АВ АВ/ВВ ВВ/АВ

Число кив-х 8 20 И 19 60 17 8

В % от общего 5,59 13,98 7.69 13,28 41,95 11,86 5,59

3.2. Анализ связи генотипа быков-производителей по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина с показателями молочной продуктивности дочерей

В таблице 5 представлено распределение -частоты генотипов по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина. Есть небольшая тенденция в сторону увеличения частоты встречаемости гетерозиготного варианта ЙВ (71,647.), Среди быков, оцененных по качеству потомства, выявлено всего два быка с желательным генотипом ВВ (2,98%), У быков голштинской породы процент гетерозиготных особей доходил до 86,6. Анализ частоты аллелей гена каппа-казеина показывает, небольшое преимущество концентрации аллели А над В. По бета-лак-тоглобулиновому локусу заметна тенденция увеличения числа аивот-ных, носителе'?! гетеразигот.ного варианта ЙВ (76,11%). Данный показатель в среднем по исследуемой популяции был в пределах 57%, Особенно отличаются быки голштинской породы, у которых частота генетического варианта АВ, была 93, 33%. Всего из 57 яивотных выявлено с гомозиготным генотипом АА 5 особей, или 9,11%. Концентрация аллелей бета-лактоглобулина была почти одинаковой с небольшим преобладанием аллели В. Подводя итоги данных таблицы 5 необходимо отметить, что у быков, оцененных по качеству потомства, наблюдается заметное увеличение числа аивотных по обоим исследуемым ло-кусам гетерозиготного варианта АВ.

Таблица 5

Частота'разных аллелей и генотипов по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина у быков-производителей, оцененных по качеству потомства

Чис- Частота . Частота генотипа ■

порода ло Ло- аллелей Art ЙВ • ВВ

гол кус Й В п 7. п У. п г

Черно-пест 52 к-Сп 0.62 0,38 15 28,84 35 67,30 2 .3.84

Голштин 15 0,57 0,43 2 13,33 13 86,66 - -

В среди 6? 0,61 0,39 17 25,37 48 71,64 2 2,98

Черно-пест 52 B-lg 0,45 0,55 5 9,11 37 71,15 10 19,23

Голатин 15 0,47 0,53 - - 14 93,33 1 6,66

В среди 6? 0,45 0,55 5 7,46 51 76,11 11 16,41

•Как показывают донные таблицы 6, по обоим исследуемым локусам обнаружены несоответствия фактического распределения генотипа с теоретическим ожидаемым. По каппа-казеиновому локусу избыток гетерозиготных особей в среднем 16 голов и отмечается недостаток гомозиготных животных (фактически 19 при теоретически оыидаемон 35,01), Избыточная встречаемость гетерозиготного варианта ЙВ привела к нарушению генного равновесия. Об этом. свидетельствуют и показатели хи-квадрат, которые превыиают его табличное значение при Р=0,01.

Так, установлен недостаток гомозигот йй по бета-лактоглобули-новому локусу (5 против 13,87 теоретически ожидаемых) и ВВ (11 против 19,Э).

Коэффициент гомогенности по каппа-казеиновому локусу колебался от 0,50? у быков голктинской породы до 0,531 у черно-пестрой. Заметкой 'разницы в величине коэффициента гомогенности по двум исследуемым локусам не обнаружено. В среднем по бета-лактоглобцли-новому локусу коэффициент гомогенности был 0,502.

Уровень полиморфности у исследуемых нивотных всех групп был почти одинаковым, за исключение« быков черно-пестрой породы п? каппа-казеину, у которых данный показатель имел значительно меньшее значение (1,88). Это свидетельствует о достаточной разнородности генетической структуры данной популяции по изучаемым Ю

локусак.

Таблица 6

Степень соответствия фактического распределения генотипа по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина с теоретическим распределением у быков, оцененных по качеству потомства, Са-козффициент гомогенности, На -уровень полинорфности

Чмсло Ло- АА 1В В хи Са На

Порода гол кус Ф т Ф т Ф т квад

Черн-пес 52 15 20,31 35 24,37 2 7,31 10,32 0,531 1,88

Голитин 15 к-Сп 2 4,80 13 7,35 - 2.81 13,8? 0,507 1,95

В среди 6? 17 25,01 48 31,70 2 10,0 17,71 0.523 1.90

Черн-пес 52 5 10,62 37 25,76 10 15,62 9,59 0.504 1.98

Голитин 15 ВЧд - 3,26 .14 7,46 1 4,28 10,0 0,502 1,99

В среди 6? 5 13,87 51 33,26 11 19,90 19,64 0,504 1,98

Часто для оценки силы влияния изучаемых Факторов на показатели продуктивности используит критерий Итера.- В навек случае коино судить только о тенденции влияния тога или иного фактора. Существенное влияние порода оказывала на содержание вира в молоке дочерей. значение критерия Фишера 8,11 СР=0,940 ). (табл.7).

Если сравнить силу влияния генотипов по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина быков на продуктивность дочерей, то заметно небольшое преимущественное влияние локуса каппа-казеина. Так, значения критерия Фииера по каппа-казеиновоку яокусу на удой 1,58

' . Таблица 7

Влияние генотипа по каппа-казеину и бета-лактоглобулину, породи бнков-производителей на удой, содержанке' аира и белка в иолоке дочерей

I

Фактора - Удой р р ■ 7. нира Р Р У. белка Р Р

Порода К-кйзекн В-лактогл 2,78 0,-900 ' .1,68 0,0,06 0,02 0,010 .8,11 0.940 0,39 0,323 0,71 0,508 2,69 0,893 0,97 0,616 0,18 0,163 ■

И

(Р=0,806)', на содержание жира и белка в молоке дочерей 0,39 (Р=0,616) и 0,97 (Р=0,323) соответственно. Наибольшее влияние по бета-лактоглобулиновому локусу отмечено на содержание вира в мо-. локз дочерей•(0,71) при уровне достоверности Р=0 ,508 . Сила влияния генотипа по бета-лактоглобулиновому локусу на удой и содержание белка в молоке дочерей была незначительная 0,02 и 0,18 при уровнях достоверности Р=0,018 и 0,163'. Еще раз подчеркиваем, что это только направление влияния, так как достоверных данных не получено,

3.3. Определение методом ПЦР генотипа предимплантационных эмбрионов, полученных in vitro

Целью данной работы явилась разработка метода идентификации генотипа по типам каппа-казеин.а и бета-лактогло.булина предимплантационных эмбрионов, полученных путем оплодотворения in vitro. Эксперименты проводили на эмбрионах и полузмбрионах на стадии 8-24 клеток.

Готовили лизирунщий буфер следующего состава: 15мМ Tris HCI, рН 8,9, 50 тМ КС1. 2,5 шК MgCI. ,0,17. Triton xlOO, 150 мг/мл про-теиназы К. В первой серии опытов -использовали для определения генотипа эмбрионов по типам каппа-казеина целые эмбрионы. Во второй серии опытов были использованы половинки эмбрионов- одна половина для определения генотипа по типам каппа-казеина и вторая половина-для генотипирования по типам бета-лактоглобулина. В последующих опытах в качестве матрицы ДНК были использованы 3-4 бластомера, В качестве положительного контроля во всех опытах была- использована ДНК, выделенная из спермы, а в качестве отрицательного - просто дистиллированная вода. Определение генотипа методом полимеразной цепной реакции занимало не более 5-6'часов.

С целью приготовления лизата эмбрионы, полузмбрионы или 3-4 бластомера помещали в пробирку, содержащую 50 мкл лизириующего буфера с составом: 15 мМ Tris HCI, рН 8,9, 50 иМ КСI, 2,5 шМ MgCI ,0,17. Triton xiOO, 150 мг/мл протеиназн К, и инкубировали в течение 30-60 минут при температуре 3? С. Бисекцию эмбриона проводили под микроскопом МБС-9 при увеличении 2x7. Денатурацию протеиназн К осуществляли при 99 С в течение 8 мин. Реакционная смесь содержала 10 мМ dNTP, 10 пмоль каждого праймера, 10 мл 10х ПЦР буфера, 12

25 мкл лизата и 2,5 е.д. фермента Taq. Polymerase. В качестве ио-лонительного контроля была использована ДНК, выделенная из спермы быка. Амплификацию проводили в режиме: денатурация 95 С 180", от-ниг праймеров 55 С 300".и элонгация 73 С 300" и последующие 35 циклов 94-55-73, 45:50:60 сек. Наличие.фрагментов длиной 350 п.о. и 247 п,н,- нуклеотидов свидетельствовало об успешной амплификации.

По результатам генотипирования из 20 эмбрионов 14 оказались гетерозиготными по каппа-казеиновому локусу и S гомозиготными АА, По бета-лактоглобулиновону локусу всего генотипировано 13 эмбрионов, из них 8 оказались гетерозиготными ЙВ, 4-гомозиготныни ВВ и I эмбрион-Aft. При определении генотипа эмбрионов мы' увеличивали продолнительность цикла до 35,

Таким .образом, использование метода полимеразной цепной реакции в сочетании с полиморфизмом длин рестриктных фрагментов позволяет в относительно короткое время (5-6 час.) определить генотип по типам каппа-казеина и бета-лактоглобулина, 1

3,4; Аттестация быков-производителей на'носительство BLAD

Нами был использован для тестирования быков метод, прбдлоаенный Д.Е, Shuster et al с некоторыми модификациями. Авторы рекомендуют проводить полииеразную цепную реакцию при режиме: денатурация 94 С, отяиг и элонгация 69 С, 15 и 20 сек, соответственно. Амплификация в указанных в работе Shuster et al (1992) рекиме не прошла и возникла'необходимость оптимизировать условия реакции приемлемой для реактивов отечественного производства. Амплификации проводили с использованием термоциклера типа Thermal cyclar АН 1001.Реакционная смесь в обьеме .50 мкл содержала следующие компоненты:. 300-500 ng геномной ДНК, ЮмМ смесь dNTP, 6 пика моли каждого праймера, 5 мкл 10х ПЦР буфера, 2,5 ед, фермента Tag Polymerase. .. .

Большинства исследователей утверждают,, что на результативность амплификации огромное влияние оказывает состав буфера, особенно концентрация магния хлорида (Вартапетян А.В, 1991; Булат С.А. и ДР. 1992!. были использованы для проведения полимеразной цепной реакции следующие буферы А,Б,В. Буфер А имел состав: 10х 677 мМ Tris HCI рН 8,4 , 20 гаМ HgCI , 166 вМ. сульфата аммония, ЮОмМ

13

меркаптоэтанола и 20 мкг/мл БСЙ; буфер Б - 1 Ох 500 ыН КС1. 100 иМ Tris HCI рН 8,3, 15 EiM MgCI и 20 мкг/мл БСй; буфер В - 10х 500iK KCI, 200шМ Tris HCI рН 8,4, 25 пМ KgCI и 20 мкг/мл БСЙ. Как видно, состав, буферов отличался незначительно за исключ'неием магния хлорида, концентрация которого колебалась от 15 до 25 мМ. В качестве стабилизирующего .компонента использовалась БСЙ. Количество циклов устанавливали 35 при реаиме: 94 С денатурация, 65 С - отжиг праймеров и 72 С - элонгация, 30:30:30 сек.' Специфическая амплификация прошла при концентрации магния хлорида 15 мМ. при более высоких концентрациях магния хлорида появились дополнительные бэнды неизвестного происхождения.

Экспериментальным путем нами установлена оптимальная температура отжига, которая составила 65 С. Другим немаловажным фактором, влияющим на ПЦР, является температура и продолжительность времени для синтеза фрагмента и последняя зависит от длины фрагмента. Мы также увеличивали продолжительность всех трех режимов: денатурации, отжига и элонгации до 30 сек. Результаты амплификации проверяли электрофорезом в 47. агарозе, окрашенной бромистым этидием. Обнаружение фрагмента размером 58 пн свидетельствовало об успешной амплификации.

Рестрикцию амплификата проводили с НаеШ при температуре 3? С и с Tagl при 65 С в течение 1,5 час. Для рестрикции были взяты амплификат в обьеме 20-25 мил. Продукт рестрикции был подвергнут электрофорезу при режиме: напряжение 180 В, сила тока 150 мй. мощность 50 Вт и продолкительнссть 45-60 мин. Нами были выявлены после электрофореза только три полосы с длиной 58 пн не рестрици-рованный амплификат и 49 пн после рестрикции Нае III. и 32,26 пн после рестрикции Tag I. В качестве маркера использована плазмида pBR 322 рестрицированная ftlu I.

Из 143 быков, тестированных методом полимеразной цепной реакции на носительство мутации BLAD, нами не выявлено ни одного носителя. Все кивотные дали отрицательные результаты.

выводи

1. Выявлена частота генетических вариантов каппа-казеина и бе-та-лактоглобулина, а такке мутации BLftQ среди быков производителей черно-пестрой и голштинской пород Госплемоьбединения "Невс-14

кое" Ленинградской области.

2. Частота полиморфных типов каппа-казеина составила: fifi - 282, fiB - S77., ВВ.- 57.. .бета-лактоглобулина АА - 207., Ай - 5?7., ВВ -237.. Показано отсутствие носителей мутации BLAD (CD 1285) в исследуемой популяции быков.

3. Частота аллелей гена каппа-казеина составила А - 0,62, В -

0.38. бета-лактоглобулина А - 0,4'Э, В - 0,51. Показано нарушение генного баланса по каппа-казеиновому локусу у исследуемых особей (27,2). Генное равновесие по бета-лактоглобулиновому локусу не нарушено.

4. Доля гомозиготных особей по каппа-казеину составила 33,3%, по бета-лактоглобулину- 43,32. Значение теста гетерозиготности по каппа-казеину составило +112,04, по бета-лактоглобулину +41,75. Более 40.2 животных оказались дигетерозиготными.

5. У быков, оцененных по качеству потомства, отмечена тенденция к увеличении частоты гетерозиготных вариантов: по каппа-казеину до 71,612, по бета-лактоглобулину до 76,112,

6. Не обнаружено существенных связей между полиморфными типами исследуемых генов быков и показателями продуктивности их дочерей.

7. Разработана технология генотипирования предимплантационных эмбрионов по каппа-казеину и бета-лактоглобулину методом ПЦР.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуем внедрить в селекционную практику генотипирование быков-производителей и ремонтных бычков по каппа-казеину, бета-лактоглобулину и на носительство мутации СД 128G.

2.Предлагаем проводить методом ПЦР предварительное генотипирование эмбрионов по означенным генаи перед трансплантацией.

' СПИСОК, РАБОТ ОПУШШАШК ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1, Коваленко С.А., Усенбеков Е.-С, Генотипирование аивотных на основе использования материала пятна крови и полинера'знай цепной реакции// Билл, ВНИИГРЗ,- С-Пб., 1993.- Вып.137- С.40-42.

2. Усенбеков Е.С., Козаленко С.А. Частота генетических вариантов каппа-казеина у биков-Производителей и ее связь с продуктивностью дочерей // Häfep. ftspéoñ мекд. конфер, молодых ученых и

15

спец. 16-1? февраля,- Киев, 1994- С.107.

3. Усенбеков Е.С,, Терлецкий В.П. Применение полимеразной цепной реакции для генотипир'ования быков-производителей по типам бе-та-лактоглобулина. // Натер, первой мекд. конфер, молодых ученых и спец. 16-1? февраля,- Киев, 1994,- С.108.

4. Усенбеков Е.С., Бабушкина И.ft., Галиева П.Д., Яковлев А.Ф. Идентификация типов гена каппа-казеина' у предимплантационных эмбрионов, полученных in vitro U Матер, мекд, симпоз, Нолек, генетика и 1-п?тех. в оценке и изменении, геномов с-х нив-х. 24-26 мая-С-Пб, 1994.- С. 33-34

5. Усенбеков Е.С., Коваленко С.А., Яковлев А.Ф, Распределение генетических вариантов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у быков-производителей, оцененных по качеству потомства // Матер, мекд. симпоз. Нолек. генетика и биотех. в оценке н изменении геномов с-х еив-х. 24-26 мая,- С-Пб, 1994,- С. 89.

Подписано в печать 31.01.95г. Формат 60x84 1/16. Печ.1. Тираж 100 экз. ЗаказЗВ. Бесплатно РТП.Тип.ВИР. г.Павловск

! Р