Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование ин витро зигот крупного рогатого скота и кролика, микроинъецированных генами бета-1-интерферона человека и асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование ин витро зигот крупного рогатого скота и кролика, микроинъецированных генами бета-1-интерферона человека и асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота"

РГ6 од

российская, академия сельскохозяйственных наук ( .....; (расхн)

всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я. р. коваленко

(ВИЭВ)

На правах рукописи

ДАГДАНОВА Аюна Владимировна

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ИН ВИТРО ЗИГОТ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И КРОЛИКА, МИКРОИНЪЕЦИРОВАННЫХ ГЕНАМИ р1-ИНТЕРФЕРОНЛ ЧЕЛОВЕКА И асРНК К ВИРУСУ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 — Биотехнология

Ав тореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в лаборатории культур тканей, питательных сред и клеточной биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко и Биотехнологическом центре (Горки Ленинские).

Научный руководитель:

академик РАСХН Л. К ЭРНСТ

Научный консультант:

заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор Л. П. ДЬЯКОНОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И. Я. ШИХОВ (ВНИИЖ),

кандидат биологических наук А. К. ГАЗДАРОВ (ВИЭВ)

Ведущее учреждение — Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва)

Защита диссертации состоится » 1993 г.

в часов на заседании специализированного совета

К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан » мая 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. ТЕРЕШКОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность теми. Генетическая трансформация млекопитающих путем введения реиомбинантных ДНК является не только новым подходом изучения фундаментальных проблем организации генома, но имеет й большое практическое значение, так как при направленном воздействии позволяет добиться желательных изменений генома сельскохозяйственных животных уже в первом поколении, тогда как для создания новых пород животных с применением традиционных методов селекции требуются десятилетия.

В настоящее время при использовании технологии рекомбинант-ных ДНК получена наследственные линии мшей, несущих различные чужеродные гены (îownes т. et el., 1985; Chada к., Constantinl ï., 1985; Kriimlauf В. et al., 1985; Goring D.E. et al., 1987; Sinene J.P. et al.,1987; Stecey A. et al., 1988 и Др.).

Имеются многочисленные сообщения о получении, главным образом, интеграции и экспрессии гена гормона роста различных, видов животных и человека у свиней (натиех н.Е. et ai., 1985; Bren G. et »1,1988; Viae P.D. et al., 1988; Ebet К.Ы. et al., 1988; Pursel V.G. et al., 1989), овец (îuraél V.G., Г987; Bexroad C.B. et al., 1988; Clark A.J. et al., 1989), кроликов (Banner R.E. et alr., I985t Buhler T.A. et al., 1990),

в огличиэ от определенных успехов, достигнутых в исследованиях по трансгенезу свиней, овец, кроликов, гораздо труднее обстоит дело с аналогичными: работами на крупном рогатом скотё.

Эти трудности обусловлена огромными затратами, связанными с хирургическим извлечением необходимого количества экспериментального материала - зигот крупного poratoro скота, так как именно на этой стадии проводится мшсроинъекция чужеродных генов

Brem G. et al., 1985; Hammer E.E., 1985); с особенностями мор-фоло'гического строения цитоплазмы яйцеклеток крупного рогатого скота (наличие множественных белково-липиданх гранул), что делает невозможным визуальную оценку, лронуклеусов для проведения процедуры шкроинъекцал, применение гормональных препаратов для вызывания полиовуляцаи у коров-доноров, трансплантацию макро-инъецированных эмбрионов реципиентам.

Разработанные в последние года методы созревания, оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота, дальнейшего культивирования эмбрионов до стадии морулн и бластощсты ин витро (Hanada Д. et al., 1986; Pawish et al., 1986; Эрнст Л.К. с соавт., 1992 и др.) вероятно позволят иметь в достаточном количестве материал для эмбриологических работ, отказаться от использования промежуточных самок-реципиентов для культивирования дакроинъецированных зигот до прешплантационной стадии развития.

Одним из ваанейших направлений генной инканерйи ветеринарии и животноводства является получение трансгенных сельскохозяйственных кавотных, наследственно устойчивых к различным инфекционным заболевания^. В этой связи большой научный и практический интерес представляет использование клонированных генов интерферонов и антисыысловые РНК (Melton D.A., 19885 Welder J., 1988; Inoiije Ы.., 1988).

Цель и задачи исследований. Оптимизировать условия ышсро-инъекцпп клонированных генов '^-интерферона человека и асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в пронуклеус зигот крупного рогатого скота, оплодотворенных вне организма, получить ин витро бластоцпсты; изучить синтез белка и интеграцию встроенных генов в рз.книг эмбрионах. .

В стт с этим б задачи исследований ¡¡ходило:

1. Определить продолжительность периода формирования двух пронуклеусов у зигот крупного рогатого скота, полученных в результате оплодотворения вне организма.

2. Установить оптимальный режим центрифугирования оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота для отделения пронуклеусов от белково-лиггадных гранул цитоплазмы и определить эффективность визуальной оценки ядер.

. 3. Провести культивирование ин витро до стадии морулы и бластоцистн зигот крупного рогатого скота, шкроинъецарованных плазшдой ркгонрг с геном ^Ь-интерферона человека.

4. Провести культивирование ин витро до стадаи морулы и бластоцистн зигот крупного рогатого скота, микрошгьецированных геном асРНК к вирусу лейкоза.

5. Изучить синтез белка у эмбрионов крупного рогатого скота, микроинъецарованннх плазмидой с геном ^Г-инте^ферона человека.

6. Провести микроанъекщш плазмида рМТ в зиготы кролика и их культивирование до. стадаи бластоцистн ин витро, выявить интеграции клонированного гена в полученных эмбрионах

, методом цепной шшмеразной реакции.

Научная новизна работа. Б результате проведенных зкспери-тентов оптимизировали условия микроинъекции клонированных генов : в один из пронуклеусов зигот крупного рогатого скота, получении! в результате созревания и оплодотворения вне организма.

Впервые установлено, что у оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота через 14-18 часов после оплодотворения выявляются пронуклеусн у максимального числа полученных зигот. Показано, что центрифугирование зигот крупного рогатого скота с целью смещения беяково-липидных гранул цито-

плазмы на один полюс для выявления лронуклаусов в режиме 8000 в в градиенте плотности фякола в течение 5 шн является оптимальным.

Получены жизнеспособные эмбрионы (морулы и бластоцистн) крупного рогатого скота и кролика, развившиеся из культивируемых зигот, шкроинъецярованшп плазшдой рЕРХгцрг с генома-интерферона человека и геном асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.

Впервые изучен синтез белков у отдельных эмбрионов крупного рогатого скота, микрошгьецировангшх шазмидой рщтггтр1.

Определена интеграция гена .Д-интерферона человека у 3 вэ 10 анализированных бластоцист (30!?) кролика методом цепной полю,юразной реакции.

Практическая значимость работы. Оптимизированы условия подготовка зигот крупного рогатого скота, полученных в результата созревания и оплодотворения вне организма, для щюведения шкро-инъекции рекомбннантных ДНК.

Апробаяия работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

- Научной конференции "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1992 г.);

- Ученом Совете ШЭВ 28 декабря 1992 г.;

- Ыеядабораторном совещании сотрудников ШЭВ 29 апреля 1993 г.

Структура II объем работы. Диссертация изложена на ^/страницах машзношсного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации и спасок литературы. Материалы дассер-таг;::: к.члвстрированы 9 таблицами и 14 рисунками. Список литературы содер:2!Г ^Гт^т: с г о :: • к с I-.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Материалы и методы

Работа выполнена в 1990-1992 гг. в лаборатории культур тканей, питательных сред и клеточной биотехнологии ВИЭВ, Биотехно-логаческо:.: центре по животноводству (Горки Ленинские).

Яичники крупного рогатого скота, используемые дяя получения и последующего оплодотворения ооцитов, собирали от убойных животных на Московском мясокомбинате и доставляла в лабораторию • в термосе при температуре 20-25°С в течение 1-1,5 часов. Оовдты извлекали из фолликулов диаметром 2-6 мм методом аспирации.

Зиготы кролика получали от сшок-доноров после обработка гормонами (СЕК и ХГ) и спаривания. Для извлечения зигот кролика яйцеводы вырезали вместе с небольшим участком матки через 1920 ч после спаривания и промывали со стороны бахромки 5-7 ш фосфатного буфера.

Дм созревания оститы крупного рогатого скота помещали (по 20 клеток) в капли (0,2 мл) среды М-199 с добавлением 15% астральной сыворотки коров и эстрадаола-17р (I мкг/мл) под минеральным маслом. Культивирование в течение 24-26 часов проводили в С02-инкубаторе при температуре 39°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С02, 02, Г?2.

Для оплодотворения ооцитов использовали замороженно-от-таенную сперму быка. Капацитацав спермы проводили модифицированным методом РаггХаЬ et а1. (1986). Оплодотворение созревших ооцитов проводили в каплях среда РегЬ-ТАЬР, рН 7,6-7,8 под минеральным маслом.

Совместное культивирование яйцеклеток и сперматозоидов проводили в ^-инкубаторе в течение 14-22 часов (в зависимости от эксперимента). Выявление пронуклеусов зигот крупного

рогатого скота проводила после предварительной обработки: освобождение от кумулюса достигали пипетированпем в 0,1-0,2$ растворе гиалуронидазы в фосфатном буфере; смещение белково-липидных гранул цитоплазмы осуществляли центрифугированием оплодотворенных яйцеклеток в градиенте плотности фикола (использовали 20%, 15%, 10%, 5% раствори фикола в фосфатном буфере) в течение 5 мин при 5500 б, 8000 б и 12000 е.

Плазмида рМТ с геном -интерферона была получена

из ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов; ре-комбпнантная конструкция с геном асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота --ВШИ сельскохозяйственной бцотехнолопш.

Макротпгьекцшо чужеродных генов в пронуклеус зигот крупного рогатого скота и кролика проводили на микропанипуляторе под контролем инвертированного микроскопа "ортои", оснащенного оптикой Ноиарекого при 200х. '..'"''

Зиготы крупного рогатого, скота и кролика после манипуяя- -. ций по мпкроинъекцпи культивировали'до стада® морулы и бласто- . цисты в каплях среды '1-159 с добавлением 15* эстральной сыво- , ротки коров на монослое эпителиальных клеток яйцевода коровы в С02-инкубаторе.

Эпителиальные клетки получали их выдавливанием из просвета яйцевода коровы в фосфатный буфер с добавлением 10/5 феталь- .. ной сыворотки крупного рогатого скота/ •

Для цитологического аналлза оплодотворенные яйцеклетки -фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 24 часов и окрашивали 15? раствором лакмопда.

Анализ синтеза белков у мпкроинъецированннх геном _р1-ин-. терферояа человека эмбрионов крупного рогатого скота • проводили . после лечения [о5э] -метношщом и электрофореза в !£?? акрила-®д-

ном геле. Колачественнув оценку включения радиоактивной метки определяли при помощи сцинтилляционного счетчика "Тракор-Европ".

Определение татзграцяд гена £1-интерферона человека в бластоцистах ролика проводили методом цепной полшлеразной реакции на амплификагоре "ТесЬпе" (США.). Продукты реакции подвергали электрофорезу в 2$ агарозногя геле.

2. Результаты исследований

2.1. Определение .продолжительности периода формирования двух пронуклеусов у зигот крупного рогатого скота, полученных в результате оплодотворения вне организма

Для успешного проведения шкроинъекцал чужеродного гена в один из пронуклеусов зиготы крупного -рогатого скота предстояло, учитывая неясность в вопросе о времени достижения оплодотворен-нши вне организма ооцаташ стадии двух пронуклеусов, а также трудности выявления последних из-за множественных белково-липид-ных гранул в цитоплазме яйцеклеток, выполнить ряд предварительных экспериментов. ••

Ввиду того,'что стадия двух пронуклеусов с хорошо заметными ядерными мембранами у зиготы крупного рогатого скота длится несколько часов, необходимо было выяснить, когда она имеет место у оплодотворенных вне организма эмбрионов и ее длительность.

Цитологическим анализом оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота наибольший процент зигот из числа оплодотворенных яйцеклеток с двумя пронуклеусами установлен через 14 часов после оплодотворения и составил 70,0/5 (21/30) ,, (табл. I).

Цитологический анализ хроматина по выявлении пронуклеусов в зиготах в зависимости от времена после оплодотворения вне организма ооцитов крупного рогатого скота

Время после опяодо-творе- .'Исследовано яйцеклеток Зиготы на стадии:

2- -х пронуклеусов { формирования и коньюга-| цш 2-х пронуклеусов

?часы) ! (а) ! ! ! ! п \% от {числа | зигот ! \% от ¡числа яйце-,клеток ! I I ! ! п ! ! ! ! ! % от числа зигот 1 ! 1 ! ! % от числа яйцеклеток

14 30 21 84,0 70,0 4 16,0 ' 13,4

15-16 73 28 57,1 38,4 21 42,8 23,8

17-18 47 ГЗ 67,9 40,4 9 32,1 19, J

20-22 73 17 44,7 23,3 21 55,3 28,8

В последующие два часа процент тагах зигот уменьшился до 38,47». но практически не менялся вплоть до 18 часов после оплодотворения, тогда как к 20 часам после оплодотворения процент зигот на стадии 2-х пронуклеусов составил только 23,3%. Соответственно на кавдом этапе возрастало число зигот, в которых отмечалась конъюгация 2-х пронуклеусов.

Таким образом, оптимальным временем проведения мпкроинъек-цип чужеродного гена в лронуклеус зигот крупного рогатого скота, полученных в результате оплодотворения вне организма, можно считать 14 часов после оплодотворения. Однако, благодаря применению метода оплодотворения вне организма, позволяющего получать большое число зигот, для манппулящШ по трансгенезу мозю использовать эмбрионы и через 15-18 часов после проведения процедуры опдсдотворешя.

2.2, Определение оптимального решша

центрифугирования оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота для отделения пронуклеусов от белково-дшпидша гранул цитоплазмы

Выявив в предыдущем эксперименте время после оплодотворения, при котором наблвдала наибольший процент эигот на стадии 2-х пронуклеусов, необходимо было определить оптимальный режим центрифугирования оплодотворенных яйцеклеток крупного рогатого скота, 'сохраняя их целостность, с целью смещения белково-ли-пидных гранул йа один полюс, так как только при этом условии можно выявить ядра.

В опыте использовала яйцеклетки крупного рогатого скота через 15-1в часов после оплодотворения.

Центрифугирование оплодотворенных яйцеклеток, предварительно обработанных раствором гиалурошдазы для освобождения от клеток кумулюса, проводили в градиенте .плотности фикола (использовали 20, 15, 10, Ъ% растворы фикола) при 5500 е, ' 8000 в, 12000в в течение 5 минут.

Результаты исследований надставлены в табл. 2.

Установлено, что центрифугирование оплодотворенных вне организма яйцеклеток в режиме 8000 в в градиенте плотности фикола в течение 5 мин является оптимальным для смещения белково-липидных гранул цитоплазмы на один полюс с целью визуальной оценки пронуклеусов у зигот крупного рогатого скота. При атом отхождение белково-лвшдных гранул было выявлено у 39 из 51 оплодотворенной яйцеклетка, что соответствует 76,5/5. При ускорении в 5500 в цитоплазма яйцеклеток была еще не освобождена от гранул, а при 12000 е большинство клеток деформировались.

Так как цитологический анализ дает возможность увидеть хроматин ядер эмбриона, но не ядерные оболочки, поэтому следую-

Эффективность смещения белково-липидных гранул цитоплазмы оплодотворенных вне организма ооцитов крупного рогатого скота при разных режимах центрифугирования

Реши ! Число центрифу- !оплодо-гирования !творенных !ооцитов Се) | (п)

I

1_

Число оплодотворенных ооцитов с цитоплазмой

освобожденной на 2/3 объема

неосвобожденной

, деформи-| рованной

5500 8000 12000

46 51

17

6 39 5

13,0 76,5 29,4

40 12

87,0 23,5

12 70,6

щай этап работы представлял визуальную оценку, стадии двух пронуклеусов, имеющих ядерные оболочка.

С этой целью обработанные раствором гиалуронидазн и от-центрифугпрованнне яйцеклетки.крупного рогатого скота через 15-16 часов после оплодотворения при помощи шпетка в минимальном количестве фосфатного буфера помещали в столб масла, приготовленный мегэду двумя покровными стеклами в специальной камере, и исследовали в инвертированном микроскопе "Ор-Ьоа", оснащенном оптикой Номарского при увеличении 200х (ок. 10, об. 20). В результате исследований ядерные оболочки пронуклеусов были выявлены у 52 зигот крупного рогатого скота из 129 оплодотворенных яйцеклеток (40,3/5). ЭТ15 данные соответствует среднему числу зягот, находящихся на стадии 2-х пронуклеусов через 1418 часов после, оплодотворения, выявленных цитологическим ана- ; лпгюм- 38,4-705? (табл. I).

%

Таким образом, время, выбранное для выявления пронуклеу-сов, и режим центрифугирования позволяют с максимальной эффективностью проводить мюкроивъецирование зигот 1фугаюго рогатого скота.

2.3. Культивирование ин витро зигот крупного рогатого скота, микроинъеодроваиянх геном ^1-интерферона человека, до стадии морулн и бластоцнсты

Руководствуясь результатами, полученными в предыдущих экспериментах, мн провели опыты по шкроияъекции рекомбинаятной ДНК - плазмиды рМТ НКрг с геном JSI-интерферона человека в про-нуклеус зигот крутого рогатого скота, оплодотворенных вне организма, ж культивирование ин витро эмбрионов.

Используемая для микроилъекций в зиготы крупного рогатого скота плазмида рМТ l?nj&l содержала ген ^-интерферона человека под контролем металлотионеинового промотора и регуляторных последовательностей плазмиды рШН.

В результате генноинженерных манипуляций были соединены вектор (фратаент плазмида рюн) и вставка (ген ДЕ-интерферона человека из плазмиды pltrpi) с размерами 4,1 т.п.н. и 568 п.н. соответственно. Для проведения мнкроинъекций плазшду pmtlïirpi линеализировали по участку Eco ri и растворяли в буфере: 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 0,2 Ш ЭДН. Конечная концентрация ДНК в растворе 10 иг/мл.

В опытах использовали оплодотворенные ин витро яйцеклетки, разделенные на 3 группы: две экспериментальные и контрольную Первая группа представлена оплодотворенными яйцеклетками (п = 249; 100$) (через 15-16 часов посла оплодотворения), подвергнутыми обработкуферментом (гиалуронидазой) и центрифугированию.

После удаления клеток, имеющих картину дегенерации £п = 60; 24,1$), оплодотворенные яйцеклетки с нормальной морфологией помещали в специальную камеру и исследовали в инвертированном микроскопе "ОрЬоа" с оптикой Номарского. Б один из визуализированных пронуклеусов зигот (п = 119; 47,8$), с помощью микромашпулятора, вводили 2-3 шел буферного раствора с геном ^Х-иятерферона человека. Число нешкроинъецирован-НЫХ яйцеклеток достигало 28,1$ (а = 70).

Вторую экспериментальную грушу составляли интактные оплодотворенные яйцеклетки ( а= 121), обработанные гаалуро-нидазой и отцентрифугированнне.

Контролем служили оплодотворенные яйцеклетки, не подверг-, нутые каким-либо воздействиям {п = 200).

Результаты культивирования до стадии морулн и бластоцис-ты зигот крупного рогатого скота представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что деление микроинъецированнвх зигот наблюдали у 49 из 119 (41,2$), дальнейиее развитие отмечали у . 18 эмбрионов (36,7$). ;'..:-' .

Из 70 нешкроинъецировавных зигот дробление Выявлено у 22 (31,4$). Однако, стадии морулы и бластоцасты не достиг ни один эмбрион. В группе, где культивировала оплодотворенные яйцеклетки, подвергнутые обработке ферментом и центрифугированию, .. из 121 клетки деление отмечали у 35 зигот, что составляет 28,952, 9 из которых развились до стадия морулы и бластоцисты (25,7$).

В контроле число дробящихся элгот составило 40,5,^ (81 из ■ . 200), стадаи морулыи бластодасты достигли 28 эмбрионов (34,6$).

Результаты экспериментов показали, что обработка клеток ферментом' (п:алурош:дазо10 и центрифугирование оказывают некоторое негативное влплкпе на с.знеспособность микроинъецпрован- -

Результаты культивирования ин ввтро зигот крупного рогатого скота, шкроинъецированных плаэшдой с геном _р1-внтерферона человека, до стадии морулы и с5ластоцисты

Группы I Число , яйце-, кле- } ! ток I 1 | Развитие эмбрионов

дробление ! мору-! Оласто- ¡'¡Ло+Кя лы ¡цисты ; ¡(мо) {(£я)

I » ! 1 П 1 а | % { n \ п ) n \ %

1. Оплодотворенные яйцеклетки, обработанные гиалуро-нидаэой и от-центрлфугированные

из них:

- микроинье-цировано

- немикроинъе-цировано

2. Оплодотворенные яйце-• клетки, обработанные гиа-луронидазой и отцентрифуги-рованные

3. Контроль.;

,119 70

49 22й

41,2 31,4

14

121

200

35

eia

28,9 40,5

5

20

18® 35,7

2GL

25,7 34,6

Примечание: ?s б <0,05

кех эмбрионов. Процент дробящихся л развиваетдахся до морул л бластоцпст эмбрионов после воздействия фзрглента и центрифуга-рованяя был нпке.контрольных: 28,S^ л 25,7^ прот::в 40,5^ л 34,6^5 соответственно. Однако, указанное негативное влияние не было обнаружено при рассмотрена результатов развг:?:;я г."!кро-пнъецированных зпгот до сравнению с коптрольш-з. О'етсгло,

9

что это связало о тем, что при подготовке к микроинъекции были отобраны только полноценные зиготы с видимыми пронуклеусаш.

2.4. Культивирование ин витро зигот крупного рогатого скота, микрокнъецированных геном асРНК к вирусу . лейкоза, до стадии морулы и бластоцистн

Наряду ^экспериментом по шкроинъекции гена ^-интерферона человека в пронуклеус зигот крупного рогатого скота и культивированию. эмбрионов до стадаи морулы и бластоцистн были проведены опытн по введении гена асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Исследования проводили по аналогичной схеме: исключением-явилось отсутствие опытной группы с клетками, обработанными ферментом и отцентрифугированными.

В опыте по микроиньекцан было взято 698 ошодотворенных яйцеклеток (100Я. Из них макроинъецаровали 220 зигот (31,5$), тогда как у 373 зигот (53,5$) пронуклеусыне была влзуализиро- . ваны, но они также подвергалась дальнейшему культивированию. Картину дегенерации после центрифугирования наблюдали у 105 оплодотворенных ооцитов (15$). ' :

Послужившая основой для конструирования плазмида рюн содержала ген устойчивости к ампициллину, что позволяло вести отбор клонов.

Рекомбинантная конструкция, используемая для микроинъекции, состоит из фрагмента генома вируса лейкоза крупного рогатого скота (шл) в антисмысловой ориентации против н, 05 области вьу под контролем промотора тимиданкиназы (НО вируса герпеса I типа.

Перед мпкрошъекщей учасгок, содержащий ген асРНК - ТК промотор, выделали обработкой рестриктазой Руп И и растворяли в буфере: 10 ?.£.! Трис-НС1, рН 7,4; 0,2 [¿.1 ЭДТЛ. Конечная

концентрация ДНК в .растворе 10 нг/мл.

Результата культивирования до стадии морулы и бластоцисти зигот, шкроинъецарованных геном асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, представлены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты культивирования ин ватро зигот крупного рогатого скота, микроиньецированних геном асРНК к вирусу лейкоза, до стадии морулы и бластоцисти

Группы

Развитие эмбрионов

1 !

! Число!__- _

I дробление !мо- !бласто-; Мо + Ел

1^1 т Г

!„!„!*! I—:-! - I

±

1. Оплодотворенные яйцеклетки, обработанные гиалуронпда-зой и отцент-рифугированнне:

из них:

- микролнъе-цировано

- немикроияъе-цировано

2. Контроль

220, 1376 62,3 14 17 31г 22,6

373 149а 39,9 12 13 25д 16,8

699 206а 40,9 59 43 • 10 2В 35,7

Примечание. Раб> яр> вд <0,001.

' Деление клеток в микроинъецироваишх зиготах отмечали у 62,3$ (137 из 220), в результата культивирования получили 31 .эмбрион* достигший стадии морулы п бластоцисти (22,ОЙ). В груше с нешкроянъецпровантпп ялцеклетка-.п дроблогое отмечали у 149 из 373 С32,91?), а дальнейшее развитие - у 25 из 149 эмбрионов (16,8$).

В контрольной груше число зигот с дробящимися клетками составило 40,9$ (286 из 699), стада морулы и бластовдсты достигли 102 эмбриона из 286 (35,7$).

В этом эксперименте были выявлены те же закономерности, что и в опытах по махроинъекции. гена _р1-интерферона человека. Так, дробленне, в инъецированных зиготах отмечено более, чем у половины эмбрионов и составило 62,3$ (контроль - 40,9$). Дальнейшее развитие наблюдала у 22,6$ (контроль - 35,7$). Что касается немикроинъецированных эмбрионов, то у них, как и в предыдущем эксперименте, дробление и развитие до стадии морулы и блаотоцисты было ш&е, чем у контрольных: 39,9$, 16,8$ и 40,9$, 35,7$ соответственно.

Таким образом, шкроинъекция генов ^-интерферона человека и асЕПС к вирусу лейкоза крупного рогатого скота может быть с успехом проведена в пронуклеусы зигот крупного рогатого скота, что позволяет получать кизнеспособные бластоцисты для последующей трансплантации реципиентам и получения трансгенного потомства.

2.5. Анализ биосинтеза белка в макроинъецированных геном ^Г-интерферона человека эмбрионах крупного рогатого скота

В экспериментах по микроиньекцин рекомбинантных ДНК в про-нуклеус зигот крупного рогатого скота, полученных вне организма, нас интересовало также действие чужеродного гена (ген £1-интерферона человека) на метаболизм эмбрионов крупного рогатого скота.

С этой целью необходимо было провести анализ синтеза белков в эмбрионах, подвергшихся микроинъекции.

Изучен биосинтез общих белков в зиготах и 8-нн клеточных эмбрионах крупного рогатого скота после шкрокнъекцяи пдазт-ды с геном .^-интерферона человека. Динамическая картина паттерна белков у эмбрионов крупного рогатого скота, находящихся в процессе синтеза, оценивалась количественно - по включении в эмбрион меченой аминокислоты, и качественно - с помощью одномерного гель-электрофореза и флюорографии.

Для сравнения были отобраны б шкроянъецпровачных и 4 ил-тактных зигот, 2 микроинъецировашпсс и 5 иитактных 8-ма клеточных эмбриона.

Белковые профили радиоактивно меченых зигот и эмбрионов (шкроинъецпрованных и интактных) были идентичны.л.

Приблизительно одинаковы и значения вклачешюй метки. Из табл. 5 следует, что среднее значение включенной метки для интактных зигот составляет 914 сра /эмбрион, а 'для шкроинъо-царовашшх - 909 ера/эмбрион. Однако, включение радиоактивной

Таблица 5

ЧЯ

Количество метки з -метионан, включенной в зиготы и эмбрионы крупного рогатого скота

35,

Стадия развития эмбриона

; Количество включенной ( мотки, ерш/эмбрион

Зиготы интактныэ

Зиготы макроинъецированнне

8-клеточные эмбрионы, интактные

8-клеточные эмбрионы, шкронньецпровашше

91-1 (а = 4; 870-234) 900 (п = 6; £09-1007)

802 (а = 5; 6С2-Э10)

ИЗО (а = 2; Ш1 и ИЗО)

метки оказалось несколько большим у гшкрошьецировагашх 8-ш клеточных эмбрионов но сравнению с интактньш. Среднее значение для первых■ составило ИЗО срд/эмбрион, а для эмбрионов второй грушш - 802- с?е /эмбрион.

Б этих исследованиях подтверждено, - что зиготы крупного рогатого скота, полученные в результате созревания и оплодотворения вне организма, устойчивы к таким воздействиям, как центрифугирование, микроинъекция гена £1-интерферона человека, и их биосинтез не отличается от такового у интактных эмбрионов не только через 3-4 часа, но и спустя двое суток после воздействия.

2.6. Получение шкропнъецировашых плазмидой - . с геном ^т-ингерферона бластоцист кролика и , оцределение интеграции чужеродного гена методом цепной полимеразной реакции (ЦПР)

Наряду с экспериментами по микроинъекции в пронуклеус зигот крупного рогатого скота плазшды с геном Д-интерферона человека и гена асРНК к вирусу лейкоза- крупного рогатого .скота проведены опыты по введению гена ^1-интерферона человека в мужской пронуклеус зигот кролика.

Эксперименты по определении интеграции гена ^-интерферона человека были проведены с использованием геномной ДНК всей бластоцистн, так как перед наш стояла задача определения эффективности встраивания рекомбинантной конструкции с Геном ^Г-внтерферона человека, возможность использования в качестве генетического материала для получения трансгенных яивотннх и • применения ЦПР для выявления интеграции чужеродного гена в бластоцистах .тавотных. ''

Б экспериментах использовали 12 кроликов пород советская

- IS -

шниялла, белый великан и кате^оршп^сгая, от которых подучено 130 зигот.

Микроинъекцпю чуяеродного гена проводили через 20 часов после осеменения салок-доноров.

Введение гена JSI-интерферона в мужской прспуклеус зтгот кролика и дальнейшее культа трогали е жкрочнъецпрсвапных эмбрионов до стадии бластоцпсты осуществляли стандартна у метсд&чл.

Результаты культивирования вне организма мнкроннъгцпрован-ннх зигот кролхжа до стадии бластоцпсты п определения ннтегр?.-щш гена Jü-íiHTepfepoiia человека представлены в табл. 5.

Таблица 6

'. Культивирование вне организма' г.мкро:ипьецнровакннх геном ^Г-интерферопа человека зигот кролика до стадии бластоцпсты и определение интеграции чужеродного гена

1 Число ¡ Число • полу- ¡ широченных1, инъецкрован-зигот ¡ ных зигот i aja . % . Развитие эмбрпонов | "Число псследовая-¡ных бластоцпст

дробление j бластоцп сты ¡ всего {интеграция i ¡ {выявлена Il ' % j II .'% , i n ¡ n %

.130 123 94,6 .88 71,5 41 .46,6 10 3 30,0

Иакпм образом, из 1130 полученных зигот кпкрояньецгфовачо плазшдой с геном Б1-антерфорона человека 123 (94,6,1). Дробление выявлено у 8S (71,5$), число эмбрионов, достигших стад;::; ' бластоцистн, составило 46,6$.(41/88).

Интеграции гена jîI-mîTepiepoHa человека в бластоцястах кролика определяли методом цепной лолгаеразной реакции (ЦП?). В результате проведенных исследований интеграция гена ^-интерферона человека выявлена в 3-х бластоцпстах из 1С (3Х-)-

ВЫВОДЫ

1. Определены срока шкроинъекцш клонированных генов в один из пронуклеусов зиготы крупного рогатого скота. Наибольшая эффективность получена при введении чуяеродных генов через 14-18 часов после оплодотворения ин штро.

2. Визуализация пронуклеусов зигот крупного рогатого скота обеспечивается путем их центрифугирования в рекиме 8000^ '

в течение 5 минут в градиенте плотности фикола (20-5$).

3. В процессе культивирования ин витро зигот крупного рогатого скота, шкроинъецированных генами ^-интерферона человека к асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, получено дробление у 41,2^ зигот в первом случае и 62,3$ - во втором, а развитие до стадии морулы и бластоцисты отмечали у 36,7$ и 22,6$ соответственно.

4. Методом гель-электрофореза с использованием радиоактивной метки, -метионин установлено, что белковый спектр кизне способных шкроинъецарованных длазмидой р'ЛТ иирх с геном ^-интерферона человека загот а 8-ми клеточных- эмбрионов не отличается от'такового в коттроле.

5. Цепной полиыеразной реакцией (метод амплификации) выявлено присутствие гена -интерферона человека у 30$ ыикро-инъевдрованных бластоцист кролика.

6. Метод микрошгьекции генных конструкций (плаэмиды р',1Г 1?г?]31 с геном Щ-ттврфврова человека под контролем МТ-промотора и гена асРНК против и, 45 области вируса лейкоза крупного рогатого скота под контролем тимидинкиназного промотора) в пронуклеусы зигот крутого рогатого скота и кролика может быть использован для получения жизнеспособных бласто- '

цист со встроенными генами с целью последующей пересадка реципиентам и получения трансгенного потомства.

ПРАШЧ0СКИВ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложен метод визуализации пронуклеусов зигот крупного рогатого скота, используемцЗСдля микроинъекций чужеродных генов с целью получения трансгенных животных.

Отработанные условия культивирования ин витро и оценка жизнеспособности ооцитов и зигот, жяроютьецированных реком-бинантной ДНК, рекомендуется для экспериментальных работ.'

Цепная полимеразная реакция предлагается для определения встраивания гена £Е-внгерферона человека в геном ранних эмбрионов кроликов.

СПИСОК ОПУЕШШШШХ РАБОТ

I. Дагданова A.B., Сураева Я.М. Культивирование ин витро зигот крупного рогатого скота,-в которые был микро-инъецирован гея асРНК к вирусу лейкоза // Цитология. -1992. - Т. 34, ÏÏ 9. - С. 65.

2. Эрнст Л.К., Прокофьев Ы.И., Дагданова A.B., Сураева Н.М., Захарченко В.И., Лагутина И.С., Долгохатский А.И.,ДьячоновЛ.П. Микроитаекция чужеродных генов, ответственных за устойчивость организма к инфекционным, заболеваниям, в оплодотворенные ин витро зиготы крупного' рогатого скота // Вестник Российской АСХН. - 1993. - JS 5 (в печати).

3. Дагданова A.B., Сураева Н.М., Лагутина U.C., Захарченко В.И. Разработка оптимальных приемов визуализации пронуклеусов у оплодотворенных ин вптро зигот крупного рогатого скота с целью инъекции в один из них чужеродного гена // Вестник Российской АСШ. - 1993. - JS 6 (в печати).