Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИИ ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ С МОЛОКОМ У - ИНТЕРФЕРОН.

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИИ ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ С МОЛОКОМ У - ИНТЕРФЕРОН."



На правах рукописи

ГУРЛН АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

Разработка технологии получения трипсгснпм* кроликов, продуцирующих с молоком у - интерферон.

03.00.23. - БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

дисссртации на соискание ученой степени кандидата биологических

наук

Московская область, п. Дубровнцы, 2002

Работа выполнена в лаборатории трансгснных животных Научно-производственного биотехнологического центра по животно водству

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН М. И. Прокофьев

Официальные оппоненты - доктор биологических наук Н, А. Зиновьева, 4©КтсР биологических наук 4■ И. /^ЕИЛСЦ

Ведущее учреждение - ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Защита состоится 2002г. в « 10» часов на заседании

диссертационного совета Д 006.013,01 во Всеросс ""тком государственном научно-исследовательском инс^.и животноводства.

Алрес института -142132, Московская обл , Подольский р-н, п. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке институт?

Автореферат разослан « р, 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета*

кандидат биологических наук; П. Губанов«

/

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Многие лекарственные вещества являются белковыми соединениями. Ввиду, сложности структуры белковой молекулы их пока невозможно получить химическим синтезом. На первом этапе такие белки получали из человеческих источников, таких как кровь (фактор свертываемости крови и другие белки крови) или гипофиз (человеческий гормон роста). Вследствие дороговизны и трудности получения человеческих тканей, эти белки могут производиться в малых количествах и к тому же могут оказаться переносчиками вирусов, таких как вирус гепатита и другие. На втором этапе, с развитием молекулярной генетики, были созданы так называемые рекомбинантные микроорганизмы, которые выращивают в специальных биореакторах и способны производить ценные фармакологические вещества, такие как инсулин, кровесвергывающие факторы (против гемофилии), человеческий гормон роста.

В последние годы появилась возможность использования животных как живых биореакторов со способностью продуцировать ценные лекарственные белки, например, антитромбин -III (Meade at а). 1997), ИГФ - I (Brcni et al:( 1994), протеин С (Velander et al., 1992) и биологически активные вещества для перерабатывающей промышленности, как химозин (Эрнст и др. 1997, Прокофьев М.И., Юткин Е, В. 1999). Стратегия в использовании животных как биорсакторов состоит в том, что с помощью трансгснной технологии можно снабдить клетки животного генами, которые у них в норме отсутствуют и в этом случае вызвать у них синтез лекарственных белков, которые они в норме не производят. С этой целью в ядро зародыша на стадии зиготы вводят чужеродный ген, который в последующем обеспечивает выработку определенного белка и регулирует его выделение с молоком.

Ввиду того, что от животных может быть получено большое количество молока, не. причиняя животному неудобств, этот метод означает огромный прогресс в получении ценных фармакологических веществ.

Выбор животного для трансгенеза определяется, прежде всего, потребностью планируемого продукта на мировом рынке и сроками, требуемыми для производства трансгенкых животных, чтобы удовлетворить потребность рынка.

В наших экспериментах для получения у - интерферона были выбраны кролики, так как потребность в этом препарате не высокая, а короткие сроки получения лакгирующих кртщ;пг ,тп удовлетворения

I цемтрлгч7^--

Ш1ЖШО

потребности в этом продукте составляют 7-8 месяцев, тогда как на крупном рогатом скоте 40 и более месяцев.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Совершенствование эффективности трансгенеза у кроликов. Получение трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком у -интерферон.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработка наиболее эффективного способа вызывания суперовуляцни у кроликов,

2. Изучение юзрасга доноров, способов извлечения эмбрионов и схем гормональных обработок иа эффективность выхода эмбрионов.

3. Выявление оптимальных сроков получения зигот кроликов после обработки ХГ.

4. : Влияние микроикъекции гена в зиготы на выживаемость в процессе беременности.

5. Получение трансгенных кроликов после ■ пересадки микроинъецированных зигот реципиенту и изучение экспрессии гена у трансгенных «роликов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Выявлены наиболее эффективные типы и дозы препаратов СЖК для вызывания суперовуляции у кроликов. Установлен оптимальный возраст кроликов - доноров для получения наибольшего числа зигот. Показано, что 4-х кратная гормональная обработка и хирургическое извлечение зигот у одного и того же кролика повышает число овуляций в 5,4 раза по сравнению с одной спонтанной овуляцией и в 3 раза по сравнению с одной гормонально вызванной овуляцией.

' Продемонстрирована возможность повышения суперовуляции у крольчих после предварительной обработки аналогом проста гландива. Определены оптимальные сроки извлечения зигот для микроинъекции гена после обработки ХГ. Показано негативное влияние микроинъекции гена на развитие эмбриона в организме самки. Впервые получены трансгенные кролики, продуцирующие с молоком у - интерферон. ■■■=•-■■-..

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Показано, что наиболее эффективным препаратом СЖК для вызывания суперовуляции у кроликов является Сергон, а возраст самок не менее 4-х месяцев. Применение техники 2-3-х кратного извлечения зигот по сравнению с убоем более чем в 2 раза повышает выход зигот на одного кролика и почти вдвое сокращает величину затрат на их получение. Наблюдалось повышение эффективности вызывания суперовуляции у кроликов после предварительной

обработки аналогом простагландина. Продемонстрирована новая техника получения у - интерферона с молоком трансгенных кроликов. < V

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации были представлены на третьей международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (ВНИИФБиП с-х животных,. Боровск 2000) и на международной наличной конференции "Актуальные проблемы ДНК-технологий и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных" (ВИЖ, Дубровицы 2001). , ,

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Объём диссертации $4 страницы машинописи, включая 20 таблиц и 1 рисунок. Список литературы включает 190 публикаций, из них 177 на иностранных языках. ,

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ,

1. Применение очищенных препаратов СЖК для стимуляции суперовуляции у кроликов более эффективно, чем нативного по числу овуляций.

2. Наибольшее число овуляций наблюдалось у кроликов 4-5 месячного возраста по сравнению с 3-мссячными, но 5-месячные кролики превосходили 4- месячных

по числу ооцитов с

пронуклеусами.

3. Число овуляций у кроликов обработанных СЖК с целью вызывания суперовуляции уменьшается с увеличением кратности гормональных обработок. V

4. Обработка кроликов простагландннам и сопровождается увеличением числа овуляций при повторном использовании кроликов-доноров.

5. Применение техники повторного хирургического извлечения зигот у кроликов по сравнению с убоем более чем вдвое повышает выход зигот на одного кролика.

6. Определены наиболее оптимальные сроки извлечения зигот кроликов для микроинъекции гена после обработки ХГ.

7. Наблюдается негативное влияние микроинъекции гена в пронуклсус зиготы на развитие эмбриона в организме самки.

8. Продемонстрировано влияние возраста про нуклеуса на эффективность интеграции гена.

9. Получены трансгенные кролики с геном у - интерферона и продемонстрирована интеграция гена с молоком. . -

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве доноров зигот и реципиентов использовали половозрелых самок кроликов породы шиншилла, начиная с 4-7 месячного возраста. г :.

Использовали ген гамма интерферона (BLG - lyFK - у 2), состоящий из бетга лактоглобулинового промотора (BLG) и структурного геномного гена (lijFN - у), любезно предоставленного нам О. А. Ларионовым.

Для стимуляции суперовуляции у доноров применяли гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (Сергон, Чехия). Каждому донору инъецировали ISO ME Сергона внутримышечно, через 48-72 часа самку спаривали с самцом и индуцировали овуляцию внутривенным введением 100 ЕД хорионического гонадотропина (Московский эндокринный завод). Хирургическое извлечение зигот производили через 18-20. часов после спаривания.

Индукцию овуляции у реципиентов осуществляли с помощью внутривенного введения ■ 100 ЕД хорионического гонадотропина (Московский эндокринный завод) и спаривания с вазектомированным самцом одновременно со спариванием самки-донора зигот (синхронная овуляция), либо непосредственно перед трансплантацией (несинхронная овуляция).

Зиготы и неошюдотворенные яйцеклетки извлекали из яйцеводов кроликов через 17-22 часа после инъекции хорионического гонадотропина. Наиболее простой способ извлечения зигот и яйцеклеток путем убоя кролика в установленные сроки, удаления яйцеводов и кусочка матки и промывания их в направлении иегмуеа. Другой способ извлечения зигот из яйцевода кролика прижизненно, т.е. in situ. При этом кролик фиксируется на операционном столе в спинном положении, проводится местная или общая анестезия, разрез брюшной стенки 2,5-3 см каудальнсе пупка, длиной 4-6 сантиметров. Делается разрез верхушки рога матки,' и в него вводят стеклянную канюлю или пластмассовую трубку/'Стенки рога матки прижимают пальцами к канюле или трубке и с помощью шприца через воронку яйцевода вводят промывную среду в направлении рога матки. Жидкость собирают в чашку Петри и сразу просматривают под микроскопом.

После вымывании зигот брюшную полость кролика-донора зигот зашивают для дальнейшего использования его повторно в качестве донора зигот. . ,

Поиск эмбрионов в чашках Петри осуществляли под бинокулярной лупой Nicon (Japan), при увеличении 400х. .¡ ■

Микроннъекцию производили с использованием инвертированного микроскопа Axiovert 35 при увеличении 400х, ;

Для введения генетического материала в пронуклеус иглу вводили через цитоплазму к мужскому пронуклеусу, который прокалывали. Об успехе микроинъекции судили по увеличению объема пронуклеуеа. В один пронуклеус зиготы инъецировали 1-2 пкл раствора ДНК (Brem et al. 1985, Hammer et aL 1985).

Подсадку микроинъецированных зигот осуществляли реципиентам оперативным путём. Каждому реципиенту пересаживали 15-20 зигот, распределяя их поровну между яйцеводами.

Отслеживание динамики роста и развития трансгенных и нетрансгенных кроликов проводили взвешиванием два раза в неделю до достижения половой зрелости в возрасте четырех месяцев.

Животных, родившихся из инъецированных зигот, индивидуально метили, брали у них пробу ткани для определения интеграции ДНК. Интеграцию ДНК проверяли ПЦР-дна гности кой, дот-блот гибридизацией по Саузерну.

Для доказательства трансгснности использовали полимеразную цепную реакцию.

Для анализа животных методом полимеразной цепной реакции вполне подходит ДНК со средней длиной фрагментов около 20 kb. Поскольку не требуется наличия высокомолекулярной ДНК, для выделения ДНК обычно используются простые методы экстракции (Маниатис Т. и др. 1984),

Пробы ткани непосредственно после их взятия замораживали до -20°С и хранили в таком виде до момента их использования. 50-100 мг образцов ткани помещали в .1.5 мл центрифужную пробирку, содержащую 350 мкл лизирующего буфера с добавлением 10-15 мкл раствора протсиназы К до конечной концентрации 0.7. - 1.0 мг/мл и лнзировалн при температуре 58°С в течение 8-12 часов. Лизис считается завершенным, если в пробирках не визуализируются кусочки ткани.

Для проведения реакции использовали капиллярный термоцнклер FST -1 S (Corbctt Research), в котором тсрмоноситслсм служит воздух.

Продукты амплификации визуализировали в ультрафиолетовом свете с длиной волны 36ó нм и фотографировали (Zenit camera).

Определение активности человеческого гамма интерферона проводили путем микротитрования исследуемого материала на монослое культуры фибробластов эмбрионов человека против

щгтопатического влияния 100 ЦПД вируса энцефаломиокардита мышей (Robinslein S., Fainil letti P. and Pestka S., J., Virol, 1981, 37, p, 755 - 758), ■

Двукратное разведение исследуемого материала добавляли в выросшую культуру и через 24 часа инкубации при температуре 37° С в каждую лунку планшетки добавляли по 0,1 мл вируса, содержащего 100 ЦПД. Еще через 24 часа инкубации проводили учет результатов. За I ЕД активности человеческого гамма интерферона принимают последнее его разведение при котором, наблюдается 50% защиты монослоя клеток от щгтопатического влияния вируса.

Титры человеческого гамма интерферона в образцах молока выражали в интернациональных - единицах (UE) в отношении к стандарту Gg 23 - 901 - 530,

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Выявление наиболее эффективного типа препарата СЖК -для вызывания суперовуляции у кроликов.

Для стимуляции суперовуляции у крольчих доноров были использованы препараты СЖК (Орской биофабрики), Сергон {Биовет, Чехия) и Preginagon (Германия). Результаты этих экспериментов приведены в таблице 1.

Как видно из данных таблицы 1 все препараты вызывали суперовуляцию' у крольчих-доноров. При использовании СЖК оптимальная доза введения препарата составила 200 ИЕ, число овуляций на одного донора - 18,8, а число неовулировавших фолликулов - 2,4. Разница, в группах, где применялся СЖК, статистически достоверна (Р t и<0,05). Кроме того, в яичниках обнаружен в среднем один кистозный или один геморрагический фолликул.

При применении препарата Сергона оптимальная доза составила 150 ИЕ, число овуляций на одного - донора - 32, а число неовулировавших фолликулов - 2,8. В группах с обработкой Сергоном разница по числу овуляций была статистически достоверной (Р^ 6i ,<0,05). Кроме того, в яичниках практически отсутствовали кисгозные или геморрагические фолликулы.

После обработок Preginagon оптимальная доза введения препарата составила 100 ИЕ, число овуляций на одного донора - 29,6, а число неовулировавших фолликулов - 2,2. При применении разных доз Pregmagon в трех группах, разница по числу овуляций была статистически достоверной (Р г, л е, <0,05). Кроме того, в яичниках также практически отсутствовали кисгозные или геморрагические фолликулы.

Таблица 1.

Сравнительное исследование влияния различных типов СЖК для стимуляции опероиуляции у кроликов

Препарат Доза препарата, ИЕ Число доноров Число овуляций Число неовулировавших фолликулов Кисты и геморрагические фолликулы

Всего На 1 донора Всего На 1 донора Всего На 1 донора

Сергон 200 И 233 21,2 ±3,За 36 3,3 ±1,6 51 4,6 ±1,0

Сергоы 150 23 742 32,3 ±7,76 64 2,8±1,1 5 0,2 ±0,3

Сергон 125 . 6 68 11,3 ±2,6в 9 1,5 ±0,6 0 0±0,0

Pregmagon 150 4 86 21,5 ±ЗДг 5 U ±0,6 21 5,3 ±1,0

Pregmagon 125 10 244 24,4 ±3,1д 19 1,9 ±0,5 28 2,8 ±0,7

Pregmagon 100 10 296 29,6 ±4,7е 22 2,2 ±0,9 1 ОД

СЖК 200 28 526 18,8 ±5,1ж 67 2,4 ±1,3 32 1,1 ±0,7

СЖК . 150 13 202 15,5 ±3,9э 29 2Д±и 12 0,9 ±0,7

СЖК 125 6 43 7,2 ±1,9н 10 1,7 ±0,8 5 0,8 ±0,5

К 6, н<0,05, РЬТ.ЛУ>0,05, Рб,.,г,Лх.5,„<0,05, Р6,^0,05, P^.w^O.«, Píi5X),05, РГ(е>1,„<0,05, Рг.д.яХЦ^Р^^ОЗ, Р е> * п<0,05,Ри<0,05,Р„3>0.05,Р,,а<0,05,

При извлечении оплодотворенных яйцеклеток у крольчих со спонтанной овуляцией число овуляций на одного донора составляло 10-12. '

Следует отметить, что разница между оптимальными дозами СЖК и Сергона и СЖК и Рге§п^оп была достоверной (Р < 0,05), а между Сергоном н Рге{*тавоп не достоверной (Р > 0,05).

З.Х Изучение влиянии ряда факторов на эффективность стимуляции супсровуляции и получение эмбрионов.

С целью разработки более эффективных методов стимуляции супсровуляции и повышения выхода зигот, наиболее пригодных для микроннъецирования генов было проведено изучение некоторых факторов, которые по нашему мнению могли оказать влияние на эти показатели. . . . "

Для получения наибольшего числа эмбрионов,- находящихся на нужной нам стадии развития, были взяты кролики-доноры различного возраста:3-х, 4-х и 5-ти месячные. Сравнительные результаты получения эмбрионов приведены в таблице 2.

Таблица 2

Число зигот полученных от кроликов разного возраста.

Возраст Число самок Число эмбрионов по стадиям развития

Одноклеточные Двуклеточн ые

Без пронуклеуса С пронуклеусом

п % п % п %

; 3 месяца 8 18+3,4а 56,3 11+2,8г 34,4 3+1,3 9,3

4 месяца 17 6+2,16 28,6 21±3,2д 71,4 0 0,0

5 месяцев И 1+0, Зв 4,0 24+3,бе 96 0 0,0

Р*,й<0,01, Ре,»<0,01, Рб>11<0,01,Рг.д<0,01, Рг,в<0,01, Рд,,<0,05 Как видно из данных таблицы 2 наибольшее число одноклеточных эмбрионов было получено от самок в возрасте 4-5 месяцев по сравнению с 3 - х месячными (Р<0,01).

Однако, у 4-х месячных крольчих из 27 (100%) одноклеточных эмбрионов, полученных в среднем на одного донора 6 (28,6%) составили эмбрионы без пронуклеусов, в то время как у 5-ти месячных этот показатель равен 1 (4,0%).

Для более эффективного > использования кроликов-доноров эмбрионов проводилось не только вымывание яйцеклеток из яйцеводов убитых животных, ; но и хирургическое извлечение овулировавших яйцеклеток из яйцеводов. Это давало нам возможность

использовать в экспериментах одних и тех же животных три, а иногда четыре раза (табл. 3).

Таблица 3

Зависимость числа овуляций от порядкового номера проведенных гормональных обработок

Гормональные обработки Количество кроликов Всего овуляций Среднее число овуляций

1-я обработка 25 555 22,2 ±3,4а

2-я обработка 14 ■ 187 13,3612,86

3-я обработка 8 74 9,25 ±2,4в

4-я обработка 3 19 6,33 ±1,7г

Спонтанная 20 189 9,45 ±3,2д

Р**<0,01, Р.,„<0,01, Р,.г<0,01, Р„<0,01, Р6^г>д>0,01

Как видно из данных таблицы 3 после первой гормональной обработки число овуляций составляло в среднем 22,2 на одного кролика-донора. После повторной обработки кроликов теми же гормональными препаратами число овуляций резко понизилось до 13,36 овуляций на одного кролика. Число овуляций у животных, подвергнутых третьей обработке, составило 9,25 овуляций на одного донора. Этот показатель был примерно такой же, как и у интактных кроликов со спонтанной овуляцией (9,45).Применение четверток обработки не вызвало реакции на стимуляцию овуяциии и среднее число овуляций на одного донора составило всего лишь 6,33.

Таким . образом, применение двух гормональных обработок примерно в 4 раза повышало число овуляций по сравнению с интактнымн животными и эта разница была статистически высоко достоверной (Р<0,01). Применение 4-х гормональных обработок повышало число овуляций в 5,4 раза по сравнению с одной спонтанной овуляцией.

Как видно из выше приведенных данных, при повторном использовании кроликов-доноров, было установлено снижение числа овуляций у животных.

Это явление обусловлено рядом причин, одной из которых является наличие желтых тел ложной беременности у крольчих. Для устранения действия желтых тел была применена обработка доноров простагландинами (таблица 4). В результате обработки число желтых тел снизилось на 70,8% (Р<0,01), а число Овуляций увеличилось на

43,9% (Р<0,01). Таким образом, обработка доноров простагландинами дозволяет увеличить число овуляций при повторном использовании кроликов-доноров.

Таблица 4.

Влияние обработки кроликов аналогом простагланднна ПГФ

Число доноров Число овуляций Число иеовулировав ших фолликулов Число желтых тел

Всего На I донора Всего ¡опора Всего На 1 донора

Обрабо тайных ПГФ2а ■ 26 367 14,1 ±3,9а 57 2,2 ±0,9в 55 2,1 ±0,4д

Необрабо тайных ПГФ2а 13 127 9,8 ±2,66 69 5,3 ±1,9г 94 7,2 £2,1е

Рв,6<0,01(Р1.г<0,01,Рл,<0)01

Ввиду того, что техника извлечения овулировавших яйцеклеток хирургическим методом значительно осложняет процесс извлечения яйцеклеток, по сравнению со способом удаления яйцеводов и промывания их ампулы в направлении истмуса в лабораторных условиях после убоя животных, представляет интерес сравнительное

Таблица 5.

Эффективность получения зигот при хирургическом

Показатели Извлечение зигот из яйцеводов

После убоя ЖИВОТНЫХ С ПОМОЩЬЮ вымываний

Число доноров 184 236

Число овуляций Всего 5159 5626

На одного донора 28,04±5,3 23,84 ±3,1

Число извлеченн ых зигот Всего 4839 3612

На одного донора 26,3 ±7,1а 15,3 ±4,96

■ Степень извлечения зигот, % 93,8 64,2

Ра.6<0,01

изучение эффективности этих двух способов извлечения зигот (таблица 5).

Как видно из данных таблицы 5, 236 животных-доноров были прооперированы и 184 кролика были убиты с целью извлечения зигот. Число овуляций у кроликов, подвергнутых хирургической операции, составляло 5626 овуляций, а после убоя - 5159 овуляций или в среднем по 28,04 и 23,84 овуляции соответственно на одного донора. Вымыто 3612 яйцеклеток и зигот после хирургической операции, 4839 - после убоя или в среднем по 15,3 и 263, соответственно, на одного кролика.

Четко прослеживается разница между группами по проценту вымытых яйцеклеток. В группе с применением хирургической операции выход яйцеклеток к числу овуляций составил 64,2%, а после убоя - 93,8% и эта разница статистически достоверна (Р„,6<0,01).

В результате установлено, что при использовании хирургического извлечения яйцеклеток потери их составляют почти на 30% выше, чем после промывки яйцеводов убитых животных.

Эту разницу в числе извлеченных зигот и яйцеклеток на одного донора можно объяснить тем, что при хирургической операции нельзя осуществить промывку яйцеводов без потерь яйцеклеток.

Однако, несмотря на разницу в процентном соотношении числа извлеченных эмбрионов разными способами, применение хирургической операции дает возможность провести ее минимум дважды и на третий раз убить это животное. Процент извлечения зигот при этом достигнет 222,2%. (64,2x2+93,8) против 93,8% в случае применения убоя кроликов после стимуляции первой суперовуляции. Таким образом, применение техники хирургического извлечения зигот у кроликов по сравнению с убоем более чем в 2 раза повышает выход зигот на одного кролика. Учитывая, что стоимость животного составляет львиную долю затрат (более 90%), то этот прием почти вдвое сокращает величину затрат на получение знгог, используемых для микроинъецирования генных конструкций. Поэтому все дальнейшие эксперименты проводились с использованием хирургического извлечения зигот из яйцеводов кроликов. /

3.3. Выявление оптимальных сроков швлечения зиют кроликов после обработки ХГ.

Несмотря на достаточно большое число проведенных на кроликах экспериментов с целью получения эмбрионов, пригодных для микроиьецирования и последующей трансплантации, остается недостаточно выясненным вопрос, относительно оптимальных сроков извлечения эмбрионов у доноров после спаривания и гормональной обработки. Поэтому нами были использованы три различных

временных срока извлечения эмбрионов после вызывания суперовуляшш (таблица б).

Нас интересовал процент извлеченных зигот с пронуклеусом перед проведением микроинъецирования генной конструкции. Как видно из таблицы б, наибольшее число эмбрионов на одноклеточной стадии развития было получено через 16,5 - 17 часов после спаривания и обработки ХГ (99,2%). Однако, у 42,3% то них не видны пронуклеусы. В то же время у эмбрионов, извлеченных через 17,5 — 18 часов после спаривания и обработки ХГ на одноклеточной стадии было 94,7% и без пронуклеусов только 14,8% зигот. А при извлечении эмбрионов через 20-22 часа после проведения спаривания и: гормональной обработки было получено 90,8% одноклеточных зигот и 9,2% двуклеточных. Из всего числа одноклеточных эмбрионов 85,5% имели четко выраженные пронуклеусы, а 5,3% эмбрионов были еще без пронуклеусов, •

Таблица 6.

Сталин развития эмбрионов кроликов, извлеченных в разные сроки после гормональной обработки.

Извле чение эмбрио нов после обра болей ХГ Число кропи ков • Число эмбрионов В т.ч. по стадиям развития

всего на донора Одноклеточные Двуклешч ные

Без ронуклеу : са С ронуклеу сом

п % п % п %

20-22 8 210 26,3 ±5,2 11 5,3а 180 85,5г 44

16,5-17 16 512 32,0 ±8,5 217 42,36 302 56,9д 14 0,8з

17,5-18 11 272 24,7 ±6,6 40 14,8в 228 83,9е 15 1,3и

Рв. б<0,05/ Р., ,<0,05, Р6, ,<0,05, Рм<0,05, Ря, 4<0,05, Рг, е>0,05, Р, „<0,05, Р^ОЗ.Р,, „>0,05

Таким образом, извлечение эмбрионов через17,5 - 18 часов после спаривания и стимуляции суперовуляции хорионическим гонадотропином обеспечивает достаточно высокий уровень (83,9%) оплодотворенных яйцеклеток с четко видимыми пронуклеусами. Этот показатель достоверно выше (Р<0,05) по сравнению с извлечением эмбрионов через 16,5 - 17 часов после обработки ХГ. Процент одноклеточных эмбрионов, полученных через 20 - 22 часа после обработки ХГ также был высоким (85,5%), однако в эти сроки отмечался и высокий процент двуклеточных эмбрионов (9,2%) по

сравнению с извлечением через 16,5 - 17 часов(0,8%) и 17,5 -18 часов (1,3%) и эта разница была статистически достоверной (Р<0,05). Известно также, что пронуклсусы на более поздней стадии (20-22часа) развития менее пригодны для обеспечения высокой степени интеграции гена. , •

3.4. Изучение эмбриональных потерь во второй половине сукролыюстн у кролнков-рецшшенгок.

Ставилась. задача сравнить эффективность дальнейшего развития обычных и микроинъецированных эмбрионов после трансплантации, от имплантации и до рождения живого потомства (таблица 7). ,

Как видно из данных, таблицы 7, 15 (28,3%) из 53 мнкроинъецированных эмбрионов достигли имплантации и 8 (14,5%) из 53 продолжали развиваться до рождения живого потомства. В то же время как из - зигот, не. подвергнувшихся микроинъецированию, успешно имплантировались 135(74,2%) из 182 зигот, а до рождения развились 53 (29,1%) из 182, т. е. эффективность их развития была вдвое выше, чем микроинъецированных зигот, и эта разница была статистически достоверной (Р<0,05).

Таблица 7

Оценка эмбриональных потерь во второй половине сукрольиостн кролнкон-рсциинсшин. <

Транспланти руемые зиготы Число реципи ентов Из них сукроль иых Число г трансплантир ованных зигот в расчете на сукрольных самок Развитие зигот до

нмпланта ции рождения

п %. п % и %

Микроинъеци ро ванные 4 4 100- 53 15 28,3а 8 14,5в

Интактные 16 11 68,75 182 135 74,26 53 29,1г

Р„б<0,05,Р,.г<0,05

Анализируя полученные данные можно сделать вывод о том, что микроинъецирование оказывает отрицательное влияние на развитие эмбрионов кроликов, примерно вдвое уменьшает процент развития зигот ДО имплантации и егце раз вдвое до рождения потомства. Эти наблюдения дают основание заключить, что процедура микроиъекцин гена и, возможно, присутствие чужеродного гена существенно уменьшают жизнеспособность микроинъецированных эмбрионов.

Чтобы установить является ли это уменьшение жизнеспособности эмбрионов действием процесса микроинъекции гена или присутствием чужеродного гена в эмбрионе требуются дополнительные исследования.

3.5. Получение трансгенных кроликов с геном у - интерферона ' 3.5.1. Изучение влияния возраста пронуклеуса па эффективность интеграции гена.

Как известно, чтобы повысить эффективность интеграции гена нужно вводить генную конструкцию на ранних стадиях формирования пронуклеусов. Несмотря на это нет экспериментальных данных, которые бы четко указывали на какой временной стадии развития пронуклеуса нужно осуществлять микроинъекцию гена Визуально определить оптимальную стадию развития пронуклеуса, когда предпочтительность сроков м икрои нъекцня гена определить достаточно сложно, так как на самой ранней'стадии развития размер пронуклеуса слишком мал и введение в него генной конструкции с одной стороны затруднено, а с другой - может вызвать разрушение пронуклеуса.

Основываясь на этом, наши исследования проводились в направлении установления временных параметров формирования пронуклеусов, принимая за начало отсчета время спаривания и инъекции ХГ кролику-донору зигот.

При проведении эксперимента было выделено три временных границы: микроинъекцию гена проводили через 16 час. 30 мин. - 18 час. 00 мин., через 18 час. 00 мин. - 20 час. 00 мин., и через 20 час. ООмин. - 22 час. 00 мин. (таблица 8),

Таблица 8

Анализ интеграции гена у - интерферона в зависимости от времени инъекции гена в зиготы кролика.

Время Число Число Приплод (% от Из них

инъекци сукроя. ( эмбрио числа эмбрионов) трансгсишх (%

общее нов от числа

число эмбрионов)

рециписн Всего Из них Всего Из них

TOB (%) живых живых

20-22 3/3(JOO) 47 15(31.9) 15(31.9) 1(2.1) Н2.1)

16,5-18 5/7(71,4) 102 16(15,7) 13(12,8) 0 0

18-20 4/4 (100) 55 15(27,3) 13(23,6) 2(3,6) КЬ8)

Итого 12/14(85,7) 204 46(22,5) 41(20,1) 3(1,5) 2(0,98)

Приживляемость пересаженных мякроинъецированных эмбрионов была очень высокой, в среднем 85,7%, с колебаниями от 71,4% до 100%. ...

Сравнивая полученные данные эффективности интеграции гена, можно отметить тенденцию увеличения процента интеграции в период микроинъекции генной конструкции от 18 до 20 часов (3,6% трансгенных от общего числа инъецированных эмбрионов) по сравнению с промежутком от 16,5 до 18 часов (0%) и от 20 до 22 часов (2,1% трансгенных от общего числа инъецированных эмбрионов).

Отсюда можно заключить, что микроинъекция гена в пронуклеус кролика на очень ранней стадии развития мало эффективна, по сравнению с оптимальной. Проведение мнкроинъецнрования гена в промежутке от 20 до 22 часов сопровождается значительным снижением эффективности интеграции введенного гена в пронуклеус зиготы кролика по сравнению с введением через 18 - 20 часов.

Таким образом, на примере использования гена у - интерферона подтверждено оптимальное время введения генной конструкции в пронуклеус кролика между 18-20 часами после спаривания и инъекции ХГ.

: 1"

3.2.5. Изучение эффективности получения трапегеиных ¡Г кроликов с введением у - ннтерферопа в зиготу,

В этой серии опытов было исследовано несколько фрагментов генной конструкции, полученных с использованием одинаковой техники конструирования, но в разнос время (таблица 9).

В результате проведения этих экспериментов отмечено, прежде всего, повышение с 61% до 76% пркживляемости эмбрионов после пересадки их реципиентам с индуцированной овуляцией одновременно с донором (синхронная) по сравнению с реципиентами, у которых овуляция была' индуцирована позднее (не синхронная), в момент извлечения эмбрионов у доноров, И эта разница обнаружилась у двух из трех групп. * ' -

Какова же эффективность получения трансгенных потомков? В ходе эксперимента с первым фрагментом генной конструкции не было получено трансгенных потомков. Это мы склонны объяснить не совершенством техники в начале эксперимента. В экспериментах со вторым фрагментом, получено 3 трансгенных потомка (1,5% от числа пересаженных эмбрионов), в том числе, 2 крольчонка родились живыми(0,98% от числа пересаженных эмбрионов), а один крольчонок мертвым. При проведении третьего эксперимента получен 1 трансгенный кролик (0,38% от числа пересаженных эмбрионов).

Получено всего 4 трансгенных потомка, в том числе, трое (75%)

Таблица 9.

Результаты экспериментов по ннъскци» гена у - интерферона разных серий в зиготы кролика

Порадк овый номер фраг мента генной конст рукции ингерф ерона Число реципи ентов / из них с синх рошюй овуля «ней В том числе сукраиышх/ из них с синхронной овуляцией Число эмбри оное Развились до рождения/ Процент к числу пересаженных эмбрионов Из них трансгекных/ ■ Процент к числу пересаженных эмбрионов

о л живых п живых

1 34 (13) 17(10) 50(76,9) 690 90(13) 85(12,3) 0(0) 0(0)

2 14(8) 12(7) 86(87,5) 204 46(22,6) 41(20,1) 3(1,5) 2(0,98)

3 16(4) 10(2) 63(50) 263 67(25,5) 37(14,1) 1(0,38) 1(0,38)

Итого 64(25) 39(19) 61(76) 1157 203(18) 163(14) 4(0,4) 3(0,3)

крольчат родились живыми, а один крольчонок мертвым (25%).

3.5.3. Изучение динамики роста н развития неггрансгенных н трансгенных кроликов.

Для изучения динамики роста и развития негрансгенных и трансгенных животных, крольчат отнимали от матерей и содержали отдельно. Рационы кормления всех возрастных трупп были одинаковы.

Проводя наблюдения за ростом и развитием трансгенных крольчат (таблица 10), нами не было установлено каких-либо значительных различий в росте и развитии трансгенных и нетрансгенных кроликов. .Так, при рождении трансгенные крольчата имели живой вес несколько меньший, чем нетрансгснныс кролики, но не отклонялись от среднего показателя по породе. Трансгенные животные при достижении ими половой зрелости даже несколько обогнали в росте и развитии своих нетрансгенных сверстников.

Таблица 10.

Динамика роста ы развития нетрансгеииых и трансгенных кроликов,__

№ возраст число j . живой вес, КГ.

Нетрансгенные . ■

1 при рождении 15 0,07 ±0,012

2 1-месячный 15 0.6 ±0,056

3 2-месячный 15 1,5 ±0,12

4 3-месячный 15 2,3 ±0,9

5: 4-месячный 15 2,9 ±0,14

Трансгенные

1 при рождении 2 0,055 ±0,01

2 1-месячный 2 . 0,45 ±0,015

* 3 2-месячный 1 1,6

4 3-месячный 1 2,45

5 ' 4-месячный 1 3,1

3,5,4. Изучение экспрсссин гена у трансгснных кроликов

В экспериментах было получено три трансгенных (дюдика с геном гамма интерферона (BLG - hjFN - у 2), состоящим из бетта ла ктоглобули нового промотора (BLG) и структурного геномного гена (lijFN - у). Взрослого возраста достигла лишь одна самка №56, а две другие погибли после рождения. В половозрелом возрасте крольчиха №56 была спарена с нетрансгенным самцом. -

После спаривания была установлена беременность, которая продолжалась до времени родов. После родов крольчиха пала. У нее были извлечены два мертвых плода. Вместе с тем в период родов от крольчихи удалось получить два образца молока для дальнейшего исследования экспрессии гена,

Определение активности человеческого гамма интерферона проводили путем микротитрования исследуемого« материала на монослое культуры фибробластов эмбрионов человека против шггопатического влияния 100 ЦПД вируса энцефаломиокардита мышей (Robinstein S., Familletti P. and Pestka S., J, Virol., 1981, 37, p. 755-758).

Тигры человеческого гамма интерферона в образцах молока выражали в интернациональных единицах (UE) в отношении к стандарту Gg 23 - 901 - 530. ,

Анализ образцов молока проводили по шггсрфсроиовой активности два раза: ''■'■■ ■ ; ■

Результаты первого анализа: Молоко трансгенного кролика -16 ЦЕ/т1 молока Молоко нетрансгенного кролика (контроль) - 8 ШЛп! молока Результаты второго анализа: Молоко трансгенного кролика - 64 ЦЕ/т! молока Молоко нетрансгенного кролика (контроль) - 4 иЕ/ш1 молока Таким образом, продемонстрирована экспрессия гена гамма интерферона (ВЬв - 1уЖ - у 2), с бетта лактоглобулиновым промотором (ВЬв) с молоком трансгенного кролика, хотя уровень экспрессии был недостаточно высокий.

4. ВЫВОДЫ.

1 Сравнительное изучение трех различных препаратов гонадотропинов для стимуляции суперовуляции показало проявление различной реакции яичников кроликов на обработку разными типами гонадотропинов. Различия наблюдались как по числу овуляций, так и по числу неовулировавших и геморрагических фолликулов. Применение очищенных гонадотропяых препаратов, Р^шадоп и "Сергон", по сравнению с нативным СЖК сопровождалось повышением числа овуляций на одного донора с 18.8 до 29,6 - 32.3 овуляций, и эта разница была статистически достоверной.

2. Установлено, что после повторной гормональной обработки среднее число овуляций на кролика снижалось с 22,21±3,4 до 13,32±2,8 овуляций. При проведении дальнейших гормональных обработок число овуляций не превышало 9,25±2,4 или было ниже (4-ая обработка, 6,33±1,7 овуляций), чем у животных со спонтанной овуляцией.

Доказано, что для устранения действия желтых тел, как фактора, влияющего на число овуляций, необходима обработка доноров простагландинами. В результате таких обработок число желтых тел снизилось с7,2±2,1 до 2,1±0,4 (на 70,8%), а число овуляций увеличилось с %8±2,6 до 14,Ш,9 (на 43,9%),

3, Уточнено влияние возраста кроликов - доноров на число и качество зигот. Наибольшее число одноклеточных эмбрионов было получено от самок в возрасте 4-5 месяцев. Однако, у 4-х месячных крольчих из общего числа полученных одноклеточных эмбрионов 28,6% составляли эмбрионы без пронуклеусов, в то время как у 5-ти месячных этот показатель равен только 4,0%.

4. Сравнивалась эффективность получения эмбрионов из яйцеводов кроликов при хирургическом извлечении и после убоя. Процент извлеченных яйцеклеток при хирургическом извлечении (64,2%) статистически достоверно ниже, чем после'убоя (93,8%) (р <0,001). Вместе с тем, проведение двух хирургических операций и затем убоя кролика, повышает вдвое эффективность использования доноров по числу извлеченных зигот, по сравнению с тем, которое получали при убое кроликов-доноров. . ,

5. Получено 3 трансгснных кролика (1,5% от общего числа инъецированных эмбрионов) через 18 - 20 часов и только 1 (0,4% от общего числа инъецированных эмбрионов) в промежутке от 20 до 22 часов после инъекции ХГ. Мнкроинъекции гена через 16,5 - 18 часов после введения ХГ не сопровождались интеграцией гена.

6.. Изучена динамика роста и развития нетрансгенных и трансгенных кроликов. Не было установлено каких-либо значительных различий в росте и развитии трансгенных и нетрансгенных кроликов. Так, при рождении трансгенных крольчат живой вес был несколько меньший (0,055 ±0,01 кг), чем у нетрансгенных кроликов (0,07 ±0,012 кг), но не отклонялся от среднего показателя по породе (0,05 - 0,08 кг). .

7. Наличие экспрессии гена у- интерферона (64 ЦЕ/т1 молока) у трансгенного кролика свидетельствует о достигнутом успехе всего эксперимента по получению трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком у - интерферон.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Для стимуляции суперовуляции у кроликов-доноров зигот с целью получения трансгенных животных предпочтительно использовать очищенный препарат сыворотки крови жеребых кобыл (СЖК) - Сергон или Рге^1^оп, по сравнению с нативной СЖК.

2. Для повышения эффективности использования кроликов в качестве доноров зигот рекомендуется использовать кроликов в возрасте не менее 5 месяцев.

3. При повторных хирургических извлечениях зигот из яйцеводов кроликов, по сравнению с убоем кроликов-доноров для извлечения зигот, эффективность их использования повышается примерно вдвое. При этом рекомендуется проводить обработку кроликов простагландином после каждого извлечения зигот.

4. Для получения максимального процента зигот с пронуклеусом и обеспечения оптимального уровня интеграции гена извлечение зигот

и микроинъекцию гена необходимо проводить через 18 - 20 часов после инъекции ХГ и спаривания кроликов.

6. ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ

РАБОТЫ:

Шепель Н, И., Гурин А. В., Пинюгнна М, В., Мсзина М_ Н. «Изучение возможности увеличения выхода эмбрионов для получения трансгенных кроликов». Сборник докладов научной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве", ВНИИФБиП с-х животных, Боровск 2000. С. 445-446.

Гурин А. В., ЮткниЕ. В., МезинаМ. Н., Шепель Н. И. «Разработка методов повышения эффективности извлечения эмбрионов при получении трансгенных кроликов». Рукопись депонирована в 2.2 выпуске электронного издания БД «Агрос» № 0329600034 в НТЦ «Информрегистр» за 2001 г.

Прокофьев М. И.. Ларионов О. А„ Мезнна М,- Н., Юткин Е. В., Косоруков В. С., Гурин А. В., Шепель Н. И. «Получение трансгенных кроликов, продуцирующих гамма интерферон с молоком», Сборник докладов научной конференции "Актуальные проблемы ДНК-технологий и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных", ВИЖ, Дубровицы 2001. С. 114-115.

Мсзина М. Н., Гурин А. В., Шепель Н, И., Прокофьев М. И, «Изучение влияния различных факторов на эффективность стимуляции суперовуляцин и получение эмбрионов у кроликов». Сборник докладов научной конференции "Актуальные проблемы ДНК-технологий и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных", ВИЖ, Дубровицы 2001. С. 110-112.

Зак .31

Тираж /бО эю.

' AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44