Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии получения трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком γ-интерферон

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гурин, Андрей Владимирович

1 Введение

2 Обзор литературы. 7 2.1 Трансгенные животные 7 2.2. Возможности использования трансгенных сельскохозяйственных 11' животных

2.2.1. Генетические модели и ксенотрансплантация

2.2.2 Изменение состава молока

2.2.3 Изменение эндогенных молочных белков

2.2.4 Экспрессия рекомбинантных белков в молоке

2.3 Методы создания трансгенных животных

2.3.1 Микроинъецирование

2.3.2 Эмбриональные генеративные клетки

2.3.3 Другие методы

2.4 Выбор вида животного для получения трансгенных продуктов 22 2.4.1 Кролик, как продуцент у - интерферона

2.5 Биология, функция, методы получения и применения интерферонов

2.5.1 Образование интерферона в клетках крови и фибробластах

2.5.2 Биосинтез в генетически сконструированных микроорганизмах 30 3. Материалы и методы исследования

3.1. Схема исследований

3.2. Объекты исследования

3.3. Генные конструкции

3.4. Подбор доноров и реципиентов 32 , 3.4.1. Схема гормональной подготовки доноров 32 3.4.2 Синхронизация овуляции у реципиентов.

3.5. Методика извлечения зиготу кроликов.

3.6. Оценка полученных эмбрионов и микроинъекция гена.

3.7. Пересадка микроинъецированных эмбрионов

3.8. Получение и выращивание крольчат.

3.9. Наблюдение за ростом и развитием нетрансгенных и трансгенных

3.10. Молекулярно-генетический анализ

3.10.1. Выделение геномной ДНК и анализ интеграции.

3.10.2. Определение экспрессии гена у трансгенных кроликов

4. Результаты исследований.

4.1. Разработка наиболее эффективного способа вызывания суперовуляции у кроликов.

4.2. Изучение влияния ряда факторов на эффективность стимуляции суперовуляции и получение эмбрионов и потомков.

4.3. Изучение качества извлеченных зигот и яйцеклеток после вызывания суперовуляции у кроликов.

4.4. Изучение эмбриональных потерь во второй половине сукрольности у кроликов-реципиентов.

4.5. Получение трансгенных кроликов с геном у - интерферона

4.5.1. Изучение влияния возраста пронуклеуса на эффективность интеграции гена.

4.5.2. Изучение эффективности получения трансгенных кроликов с введением у - интерферона в зиготу.

4.5.3. Изучение динамики роста и развития нетрансгенных и трансгенных кроликов.

4.5.4. Изучение экспрессии гена у трансгенных кроликов

5. Обсуждение результатов исследований.

6. Выводы.

7. Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии получения трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком γ-интерферон"

С тех пор как было получено в начале 80-х годов первое трансгенное животное (Gordon et al., 1980) созданы сотни генетически модифицированных животных. Технология для создания трансгенных животных объединила вместе две других области естественных наук: молекулярную биологию и эмбриологию млекопитающих (Wilmut et al., 1992). Кроме того, разработка новой техники при манипуляциях с эмбрионами и зародышами вместе с повышением знаний о воспроизведении млекопитающих создала почти неограниченные возможности для научно-исследовательских работ и открытия новых взглядов на разведение домашних животных (Janne et al., 1994).

Дополнительно к генетической скорости улучшения, технология трансгене?' предлагает возможности передавать гены через границы вида и вводить модифицированные гены. Чужеродные гены инъецировались сельскохозяйственным животным, чтобы улучшить экономически важные характеристики, такие как производство шерсти, темпы прироста, сопротивляемость к болезням и производство молочных продуктов (Ward, 1991; Ward and Nancarrow, 1991; Muller and Brem, 1994). Кроме того, на трансгенных животных были разработаны модели болезней и ксенотрансплантации (Fetters, 1994; Groth, 1996). Сегодня, перспективное приложение трансгенных сельскохозяйственных животных, особенно высокоудойных, должно увеличить производство биомедицинских белков в их молоке (Wilmut et al., 1991а; Lee and de Boer, 1994; Houdebine, 1995).

Трансгенные животные как продуценты желаемого рекомбинантного белка в молочной железе имеют несколько преимуществ по сравнению с традиционно использующимися микробными системами или выделения белка из человеческих тканей (Houdebine, 1994). Молочная железа высокоудойных животных может продуцировать значительное количество желаемого белка, который можно легко выделить из молока. Кроме того, молоко животных, как правило, не содержит любых токсичных или инфекционных агентов, как, например, вирусы гепатита или прионы. Наконец, существующая техника и инфраструктура молочной промышленности могут использоваться в переработке рекомбинантного белка из молока (Wall et al., 1997).

Несмотря на быстрый прогресс в области биотехнологии гена, получение трансгенных сельскохозяйственных животных - все еще кропотливое и дорогое мероприятие. Основным узким местом является низкоэффективное получение трансгенных животных, что является следствием малого выхода эмбрионов от самок доноров, низкого показателя интеграции гена и непредсказуемость экспрессии белка. Также длительный интервал получения потомков и высокие эксплуатационные издержки делают производство трансгенных животных делом дорогостоящим.

Для получения некоторых лекарственных белков, потребность которых невысокая на мировом рынке вследствие малой дозы при лечении каким является интерферон - гамма, могут быть использованы кролики. От них можно получитт-достаточное количество молока для производства интерферона - гамма. Ввиду непродолжительного репродуктивного периода у кроликов достаточное количество продукта может быть получено в более короткие сроки, чем от крупных животных (овцы, козы, коровы).

Целью наших исследований было повышение эффективности получения трансгенных кроликов и создание исходных трансгенных животных продуцирующих у - интерферон.

В задачу исследований входило:

1) Разработка наиболее эффективного способа вызывания суперовуляции у кроликов.

2) Сравнительное изучение возраста доноров, способов извлечения эмбрионов и количества гормональных обработок на эффективность выхода эмбрионов на одного донора.

3) Выявление оптимальных сроков получения зигот кроликов после обработки ХГ.

4) Влияние микроинъекции гена в зиготы на выживаемость плодов кролика в процессе беременности.

5) Получение трансгенных кроликов после пересадки микроинъецированных зигот реципиенту и изучение экспрессии гена у трансгенных кроликов.

В ходе исследований выявлены наиболее эффективные типы и дозы препаратов СЖК для вызывания суперовуляции у кроликов. Установлен оптимальный возраст кроликов - доноров для получения наибольшего числа зигот. Показано, что 4-х кратная гормональная обработка и хирургическое извлечение зигот у одного и того же кролика повышает число овуляций в 5,4 раза по сравнению с одной спонтанной овуляцией и в 3 раза по сравнению с одной гормонально вызванной овуляцией. Продемонстрирована возможность повышения суперовуляции у крольчих после предварительной обработки аналогом простагландина. Определены оптимальные сроки извлечения зигот для микроинъекции гена после обработки ХГ. Показано негативное влияние микроинъекции гена на развитие эмбриона в организме самки. Впервые получены трансгенные кролики, продуцирующие с молоком у -интерферон.

В качестве практической значимости показано, что наиболее эффективные препаратом СЖК для вызывания суперовуляции у кроликов является Сергон, а возраст самок не менее 4-х месяцев. Применение техники 2-3-х кратного извлечения зигот по сравнению с убоем более чем в 2 раза повышает выход зигот на одного кролика и почти вдвое сокращает величину затрат на их получение. Наблюдалось повышение эффективности вызывания суперовуляции у кроликов после предварительной обработки аналогом простагландина. Продемонстрирована новая техника получения у - интерферона с молоком трансгенных кроликов.

На защиту вынесены следующие положения:

1. Применение очищенных препаратов СЖК для стимуляции суперовуляции у кроликов более эффективно, чем нативного по числу овуляций.

2. Наибольшее число овуляций наблюдалось у кроликов 4-5 месячного возраста по сравнению с 3-месячными, но 5-месячные кролики превосходили 4-месячных по числу ооцитов с пронуклеусами. 3. Число овуляций у кроликов обработанных СЖК с целью вызывания суперовуляции уменьшается с увеличением кратности гормональных обработок.

4. Обработка кроликов простагландинами сопровождается увеличением числа овуляций при повторном использовании кроликов-доноров.

5. Применение техники повторного хирургического извлечения зигот у кроликов по сравнению с убоем более чем вдвое повышает выход зигот на одного кролика.

6. Определены наиболее оптимальные сроки извлечения зигот кроликов для микроинъекции гена после обработки ХГ.

7. Наблюдается негативное влияние микроинъекции гена в пронуклеус зиготы на развитие эмбриона в организме самки.

8. Продемонстрировано влияние возраста пронуклеуса на эффективность интеграции гена.

9. Получены трансгенные кролики с геном у - интерферона и продемонстрирована интеграция гена с молоком.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Трансгенные животные

По определению, трансгенное животное - животное, чья молекула ДНК была изменена, включением чужеродного участка ДНК (Gordon et al., 1980). Если интеграция чужого гена произошла в молекулу ДНК, новый ген, присутствует в каждой клетке полученного животного и передается по наследству.

Существуют два вида генетических манипуляций: передача гена или модификация гена. При передаче гена, выбранный ген или гены (названнь: трансгеном) вводятся в геном, а при модификации гена - существующий ген изменяется или разрушается ("нокаут") (Wilmut and Dark, 1991). Было получено несколько видов трансгенных животных: мыши (Palmiteret al., 1982), крысы, кролики (Buhler et al., 1990), свиньи и овцы (Hammer et al., 1985), козы (Ebert et al., 1991), рыбы (Devlin et al., 1995), куры (Love et al., 1994), крупный и мелкий рогатый скот (Krimpenfort et al., 1991; Bowen, et al. 1994; Hyttinen et al., 1994).

Из сотен различных линий трансгенных животных первыми были получены генетически измененные мыши, несущие части вирусов простого герпеса и вируса обезьяны SV 40 Гордоном с сотрудниками в 1980 (Gordon et al., 1980). Трансгенные мыши широко использовались в фундаментальных исследованиях, для изучения экспрессии гена (Palmiter et al., 1991), развития эмбриогенеза животных (Richards et al., 1993).

Генетически измененные мыши играют важную роль для создания моделей различных болезней и испытания эффективности терапии гена (Connelly et al., 1989; Curt 1994; Camber et al., 1995; Kananen et al., 1995). Трансгенные мыши были созданы для изучения рака, нарушений обмена веществ и дегенеративной болезни (Connelly et al., 1989; Gordon, 1989) путем введения патогенных или дефектных генов, или разрушением некоторых эндогенных генов. Например, трансгенные животные, полученные для обеспечения экспрессии мутантной формы гена белка предшественника В-амилоида, имеют подобные нейропатологические изменения, ка:. и у пациентов с болезнью Альцгеймера (Games et al., 1995).

Трансгенные животные используются для проверки новых лекарств, влияния канцерогенных веществ и получения новых данных об этиологии болезни (Pattengale et al, 1989; Shuldiner, 1996).

Трансгенные мыши полезны в экспериментальных моделях для оценки экспрессии чужеродного гена в биологической системе (Palmiter et al., 1991). Использование специфичных промоторов, позволяет экспрессию трансгена, например ценный фармацевтический белок, прикрепить к желаемой ткани или органу, обычно это молочная железа. Так как производство крупных трансгенных животных, например овец, свиней и крупного рогатого скота, является чрезвычайно дорогим й трудоемким, трансгенные мыши широко использовались как модели для большинства биореакторов (Gordon et al., 1987а; Archibald et al., 1990; Reddy et al, 1991; Nuijens et al, 1997).

Первая публикация по технологии трансгенеза кроликов была опубликована Хаммером и сотрудниками в середине 80-ых годов. Они описали экспрессию человеческого соматотропина (hGH), направленного металлотианиновым промотером (шМТ) мыши в сыворотку трансгенных кроликов и свиней (Hammer et al, 1985). В 1988 Кнайт с сотрудниками сообщили о развитии лимфоцитарной лейкемии у трансгенных кроликов, которые были получены, введением с-тус онкогена связанного с областью энхансера - тяжелой цепи иммуноглобулина (Knight et al, 1988). Это были первые данные о трансгенных кроликах с характерной экспрессией чужеродного гена.

Несколько линий трансгенных кроликов были произведены для биомедицинских целей, чтобы изучить природу человеческих болезней. Были получены трансгенные кролики, например, для изучения атеросклероза (Vigliettaet al, 1996; Taylor and Fan, 1997), СПИДа (Snyder et al, 1995) и рака (Peng et al, 1993).

Полученные трансгенные животные внесли новое в понимание механизмов, которые лежат в основе развития многих человеческих болезней (Petters, 1994).

Получение трансгенных кроликов, менее дорогостоящее и менее трудоемкое, чем получение крупных животных, и, кроме того, они способны произвести V молоком существенное количество чужеродных белков фармацевтического направления (Houdebine, 1995). В дополнение к быстрому получению потомков от трансгенного производителя и удобству манипуляций с эмбрионами, кролики могут быть приспособлены к машинному доению (Duby et al., 1993). Суточный удой кроликов может достигать 100-300 мл в день, при содержании белка -приблизительно 14 %, против 3 - 5 % в молоке крупного рогатого скота (Jeness and Sloan, 1970). Потребность в рекомбинантном белке на мировом рынке не более 1 кг ежегодно, и при содержании белка на уровне миллиграмма в миллилитре, молоко кроликов представляет выгодный экономический продукт (Houdebine, 1995).

Массуд и сотрудники первыми сообщили о разработке технологии трансгена для производства фармацевтических белков на кроликах (Massoud et al., 1990). Они описали экспрессию человеческого альфа -1 антитрипсина в сыворотке трансгенных кроликов. Кроме того, есть данные о получении с молоком кроликов человеческого интерлейкина-2, под контролем В-казеин - промотора (Biihier et al., 1990), человеческого тканевого плазменногенного активатора кДНК под контролем бычьего nSl-казеин промотора (Riego et al., 1993), высокого уровня экспрессии человеческого инсулин подобного фактора-роста 1 (Brem et al., 1994; Wolf et al., 1997). Также отмечалось, что экспрессия рекомбинантной внеклеточной супероксид дисмутазы человека обеспечивает повышение лактации у трансгенных кроликов (Stromqvist et al., 1997). Недавно описана эффективная экспрессия бычьего 6-лактоглобулина, человеческого эритропоэтина в молоке трансгенных кроликов (Korhonen et al., 1997).

Потенциальный белок, который будет получен с помощью трансгенных кроликов - человеческая а-глюкозидаза. Пациенты, испытывающие недостаток этого лизосомального фермента страдают от редкого наследственного заболевания мышц (Reuser et al., 1995)., заканчивающегося параличом и смертью в возрасте от 1 до 40 лет, в зависимости от остаточной активности а-глюкозидазы в организме (Nicolino et al., 1997). Никакого лечения в настоящее время не существует для этого истощающего заболевания, так как производство фермента для терапии с использованием обычных систем культуры клетки очень дорого. Трансгенные мыши (Bijvoet et al., 1996) и кролики (Hersbach, 1997) для получения человеческой tt-глюкозидазы уже созданы, и фермент находится в заключительной стадии подготовки для использования в клинических испытаниях.

Технология трансгенеза имеет огромный потенциал для генетическог-усовершенствования крупных сельскохозяйственных животных. Уже созданы линии трансгенных животных с улучшенными показателями роста (Murray et al., 1989; Pursel et al., 1990), производства шерсти (Ward, 1991; Bullock et al., 1995) и способными производить терапевтические белки или другие биологически активные вещества (Ebert et al., 1991;KrimpenfortetaL, 1991; Ward, 1991; Wright et al., 1991; Velander et al., 1992; Hyttmen et al., 1994). Также были получены трансгенные животные с повышенной сопротивляемостью к болезням (Miiller and Brem 1994).

Первая попытка применять технологию трансгенеза к сельскохозяйственным животным была осуществлена на свиньях, несущих копии бычьих или человеческих генов соматотропина в геноме (Pursel et al., 1989; Pursel et al., 1990). Идея этого первого эксперимента была основана на том, что вставка дополнительных копий гена соматотропина приведет к ускоренному росту животного. Как и ожидалось, трансгенные свиньи росли быстрее, но они также страдали от серьезных побочных эффектов типа хромоты, летаргии и образования язв желудка. Далее были сделаны попытки с улучшенной конструкцией гена соматотропина, но преимущество роста трансгенных животных сопровождалось отрицательными фенотипическими особенностями и проблемами со здоровьем (Rexroad et al., 1990; Wieghart et al., 1990). С тех пор, направление трансгенеза сельскохозяйственных животных сконцентрировалось на получении животных экспрессирующих трансгены, вместе изменения полной физиологии животного (Janne et al., 1992).

Уже демонстрировалось, что молоко трансгенного животного могло бы быть источником рекомбинантных белков. Симоне и Гордон были первыми, кто сообщил об успешной экспрессии В-лактоглобулина у овец (Simons et al., 1987) и человеческого тканевого плазменногенного активатора (tPA) (Gordon et al., 1987) в молоке трансгенных мышей. Из-за минимальной молочной производительности мыши (несколько миллилитров в день) они не могут рассматриваться как животные для крупномасштабного производства рекомбинантных белков. В отличие от грызунов, молочная железа крупных животных может быть использована как эффективный и безопасный реактор для производства рекомбинантных белков (Wilmutetal., 1991).

Экспрессия чужеродного гена в определенных тканях и органах основана на конструкции гена слияния, содержащей, в дополнение к ДНК - кодирующей последовательности смыслового полипептида и генетические регулирующие элементы. Эти элементы определяют ткань, в которой ген экспрессируется, а также время и величина экспрессии. Направленная экспрессия чужеродного гена обеспечивает возможность произвести рекомбинантные белки в биологических жидкостях, типа крови, мочи или молока наследственно измененных животных. Например, есть данные об экспрессии человеческого альфа-1-антитрипсина (Wright et al., 1991) и человеческого антигемофильного фактора IX (Dark et al., 1989) в молоке овцы, экспрессии человеческого tPA в молоке козы (Ebert et al., 1991), экспресса человеческого белка С в молоке (Velander et al., 1992) и человеческого гемоглобина в крови (Swanson et al., 1992) свиней.

2.2. Возможности использования трансгенных сельскохозяйственных животных

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гурин, Андрей Владимирович

6. выводы

1. Сравнительное изучение трех различных препаратов гонадотропинов для стимуляции суперовуляции показало проявление различной реакции яичников кроликов на обработку разными типами гонадотропинов. Различия наблюдались как по числу овуляций, так и по выходу неовулировавших и геморрагических фолликулов. Применение очищенных гонадотропны. препаратов, Pregmagon и "Сергон", по сравнению с нативным СЖК сопровождалось повышением числа овуляций на одного донора с 18.8 до 29,6 -32.3 овуляций, и эта разница была статистически достоверной.

2. Установлено, что после повторной гормональной обработки среднее число овуляций на кролика снижалось с 22,21±3,4 до 13,32±2,8 овуляций. При проведении дальнейших гормональных обработок число овуляций не превышало 9,25±2,4 или было ниже (4-ая обработка, 6,33±1,7 овуляций), чем у животных со спонтанной овуляцией.

Доказано, что для устранения действия желтых тел, как фактора, влияющего на число овуляций, необходима обработка доноров простагландинами при повторном использовании. В результате таких обработок снизилось число желтых тел с 7,2±2,1 до 2,1±0,4 (на 70,8%), а число овуляций увеличилось с 9,8±2,6 до 14,1±3,9 (на 43,9%).

3.Уточнено влияние возраста кроликов - доноров на число и качество зигот. Наибольшее число одноклеточных эмбрионов было получено от самок в возрасте 4-5 месяцев. Однако, у 4-х месячных крольчих из общего числа полученных одноклеточных эмбрионов 28,6% составляли эмбрионы без пронуклеусов, в то время как у 5-ти месячных этот показатель равен только 4,0%.

4. Сравнивалась эффективность получения эмбрионов из яйцеводе-кроликов при хирургическом извлечении и после убоя. Процент извлеченных яйцеклеток при хирургическом извлечении (64,2%) статистически достоверно ниже, чем после убоя (93,8%) (р <0,001). Вместе с тем, проведение двух хирургических операций и затем убоя кролика, повышает вдвое эффективность использования доноров по числу извлеченных зигот, по сравнению с тем, которое получали при убое кролика-донора.

5. Получено 3 трансгенных кролика 1,5% от общего числа инъецированных эмбрионов через 18-20 часов и только 1 в промежутке 0,4% от общего числа инъецированных эмбрионов от 20 до 22 часов после инъекции ХГ. Микроинъекции гена через 16,5 - 18 часов после введения ХГ не сопровождались интеграцией гена.

Оптимальное время введения генной конструкции в пронуклеус кролика находится, таким образом, в пределах 18-20 часов после спаривания и инъекции ХГ.

6. Изучена динамика роста и развития нетрансгенных и трансгенных кроликов. Не было установлено каких-либо значительных различий в росте развитии трансгенных и нетрансгенных кроликов. Так, при рождении трансгенных крольчат живой вес был несколько меньший (0,055 ±0,01 кг), чем у нетрансгенных кроликов (0,07 ±0,012 кг), но не отклонялся от среднего показателя по породе (0,05 - 0,08 кг).

7. Наличие экспрессии гена у - интерферона (64 UE/ml молока) у трансгенного кролика свидетельствует о достигнутом успехе всего эксперимента по получению трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком у - интерферон.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Для стимуляции суперовуляции у кроликов-доноров зигот, с целью получения трансгенных животных, предпочтительно использовать очищенный препарат сыворотки крови жеребых кобыл (СЖК) - Сергон или Pregmagon.

2. Для повышения эффективности использования кроликов в качестве доноров зигот рекомендуется использовать кроликов в возрасте не менее 4-5 месяцев.

3. При повторных хирургических извлечениях зигот из яйцеводов кроликов, по сравнению с убоем кроликов-доноров для извлечения зигот эффективность их использования повышается примерно вдвое. При этом рекомендуется проводить обработку кроликов простагландином после каждого извлечения зигот.

4. Для получения максимального процента зигот с пронуклеусом и обеспечения оптимального уровня интеграции гена извлечение зигот и микроинъекцию гена необходимо проводить через 18-20 часов после инъекции ХГ и спаривания кроликов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гурин, Андрей Владимирович, Горки Ленинские, Московской обл.

1. Archibald A L, McClenaghan M, Homsey V, Simons J P, Clark A J. High-level expression of biologically active human ai-antitrypsin in the milk of transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 5178-5182

2. Attie A D, Aiello R J, Checovich W J. The spontaneously hypercholesterolemic pig as an animal model of human hypercholesterolemia. In: Swindel M M, ed. Swine as models in biomedical reasearch.: Iowa State University Press: Ames, 1992; 141-55

3. Behboodi E, Anderson G B, Horvat S et al. Microinjection of bovine embryos with a foreign gene and its detection at the blastocyst stage. J. Dairy Sci. 1993; 76: 3392-3399

4. Bijvoet A G, Kroos M A, Pieper F Ret al. Expression of cDNA-encoding human acid alpha-glucosidase in milk of transgenic mice. Biochim. Biophys. Acta 1996; 1308:93-96

5. Bishop J 0, Smith P. Mechanism of Chromosomal Integration of Microinjected DNA. Mol. Biol. Med. 1989; 6: 283-298

6. Bishop J 0. Chromosomal insertion of foreign DNA. Reprod. Nutr.1. Dev. 1996; 36: 607-618

7. Bondioli К R, Biery К A, Hill К G, Jones К В, De Mayo F J. Production of transgenic cattle by pronuclear injection. In: First N, Haseltine F P, eds. In Transgenic Animals. Boston: Butterworth-Heinemann, 1998; 265-273

8. Bowen R A, Reed M L, Schnieke A et al. Transgenic cattle resulting from biopsied embryos: Expression of c-ski in a transgenic calf. Biol. Reprod. 1994; 50: 664-668

9. Brackett В G, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilisation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1971; 68: 353-357

10. Brem G, Haiti P, Besenfelder U et al. Expression of synthetic cDNA sequences encoding human insulin-like growth factor-1 (IGF-I) in the mammary gland of transgenic rabbits. Gene 1994; 149: 351-355

11. Brinster R L, Chen H Y, Trumbauer M E, Yagle M K, Palmiter R D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjection. Proc. Natl. Acad. Sci. 1985; 82: 4438-4442

12. Buhler T A, Bruyere T, Went D F, Stranzinger G, BUrki K. Rabbit l casein promoter directs secretion of human interleukin-2 into the milk of transgenic rabbits. Bio/Technology 1990; 8:140-143

13. Burdon T G, Wall R J. Fate ofMicroinjected Genes in Preimplantation Mouse Embryos. Mol. Reprod. Dev. 1992; 33: 436-442

14. Camber S A, Saunders T L, Kendall S К et al. Implementing transgenic and embryonic stem cell technology to the study gene expression, cell-cell interactions and gene function. Biol. Reprod. 1995; 52: 246-257

15. Campbell К H S, Me Whir J, Ritchie W A, Wilmut 1. Sheep cloned by nuclear transfer from cultured cell line. Nature 1996a; 380: 6466

16. Campbell К H S, Pasqualino L, Otaegui P J, Wilmut 1. Cell cycle coordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev. Reprod, 1996b: 1: 40-46

17. Campbell К H S, Ritchie W A, Me Whir J, Wilmut 1. Featured article: cloning farm animals by nuclear transfer: from cell cycles to cells. Embryo Transfer Newsletter 1996c; 14:12-17

18. Campbell К H S, Wilmut 1. Totipotency or multipotentiality of cultured cells: applications and progress. Theriogenology 1997; 47: 63-72

19. Camper S A, Saunders T L, Kendall S К et al. Implementing transgenic and embryonic stem cell technology to the study of gene expression, cell-ceV interactions and gene function. Biol. Reprod. 1995; 52: 246-257

20. Canseco R S, Sparks A E T, Russel С Get al. Gene transfer efficiency during gestation and"the influence of cotransfer of nonmanipulated embryos on production of transgenic mice. Transgenic Res. 1994; 3: 20-25

21. Capecchi M R. Altering the genome by homologous recombination. Science 1989; 244: 165-174

22. Chandan R C, Parry R M, Shahani К M. Lysozyme, lipase and ribonuclease in milk of various species. J. Dairy Sci. 1968; 51: 606-7

23. Choi T, Huang M, Gorman C, Jaenisch R. A generic intron increases gene expression in transgenic mice. Mol. Cel. Biol. 1991; 1 1: 3070-3074

24. Clark A J, Bessos H, Bishop J Octal. Expression of human antihemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep. Bio/Technology 1989; 7: 487-492

25. Clark A J, Bissinger P, Bullock D W et al.,. Chromosomal position effects and the modulation of transgene expression. Reprod. Fertil. Dev. 1994; 6: 589598

26. Clark A J. Prospects for the genetic engineering of milk. J. Cel. Biochem. 1992; 49: 121-127

27. Clark J A. Genetic modification of milk proteins. Am. J. Clin. Nutr. 1996; 63: 633S-8S Clements J E, Wall R J, Narayan 0 et al. Development of transgenic sheep that express the visna virus envelope gene. Virology 1994; 200: 370-380

28. Coirnan A. Production of proteins in the milk of transgenic livestock: problems, solutions, and successes. Am. J. Clin. Nutr. 1996; 63: 639S-45S

29. Connelly С S, Fahl W E, lannaccone P M. The role of transgenic animals in the analysis of various biological aspects of normal and pathologic states. Exp. Cell Res. 1989; 183:257-276

30. Cousens С, Carver A S, Wilmut I et al. Use of PCR-based methods for selection of integrated transgenes in preimplantation embryos. Mol. Reprod. Dev. 1994: 39:384-391

31. Cozzi E, White D J G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Med. 1995; 1: 964-66

32. Curt G A. The use of animal models in cancer drug discovery and development. Stem Cells 1994; 12:23-29

33. Deviin R H, Yesaki T Y, Donaldson E M, Du S J, Hew С L. Production of germline transgenic pacific salmonids with dramatically increased growth-performance. Can. J. Fisheries Aquatic Sci. 1995; 52: 1376-1384

34. Diamond L E, McCurry К R, Martin M Jet al. Characterization of transgenic pigs expressing functionally active human cd59 on cardiac endothelium. Transplantation 1996; 61:1241-49

35. Dickson D. Pig heart transplant "breakthrough" stirs debate over timing of trials. Nature 1995; 377:186

36. Dominko T, First N L. Male predominance of bovine embryos can be observed at 2-cell stage. Biol. Reprod. 1993; 48: 168

37. Duby R T, Cunniff M B, belak J M, balise J J, Robi J M. Effect of milking on collection of milk from nursing New-Zeland white rabbits. Anim. Biotechnol. 1993; 4: 31-42

38. Ebert К M, Selgrath J P, DiTullio P et al. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression. Bio/Technology 1991: 9: 835-838

39. Eigel W N, Butler J E, Ernstrom С A et al. Nomenclature of proteins of cow's milk: Fifth revision. J. Dairy Sci. 1984; 67: 1599-1631

40. Evans M J, Kaufman M H. Establishment of culture of pluripotent cells from mouse embryos. Nature (Lond.) 1981:292: 154-158

41. Eyestone W H, First N L. Co-culture of early cattle embiyos to the blastocyst stage with oviducal tissue or in conditioned medium. J. of Reprod. Fert. 1989; 85: 715-720

42. Eyestone W H. Challenges and progress in the production of transgenic cattle. Reprod. Fertil. Dev. 1994: 6: 647-52

43. Eystone W H, Gowallis M, Monohan J et al. Production of transgenic cattle expressing human (x-lactalbumin in milk. Theriogenology 1998; 49: 386

44. First N L, Sims M M, Park S P, Kent-First M J. Systems for production of calves from cultured bovine embryonic cells. Reprod. Fertil. Dev. 1994; 6: 532-562

45. Fodor W L, Williams В L, Matis L A et al. Expression of a funtional human complement inhibitor in transgenic pig as a model for the prevention of xenogenic hyperacute organ rejection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: 1115^ 11157

46. Francolini M, Lavitrano M, Lamia С Let al. Evidence for nuclear intemalizationof exogenous DNA into mammalian spem cells. Mol. Reprod. Dev. 1993; 34:133-139

47. Gagne M B, Pothier F, Sirard M-A. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes. Mol. Reprod. Dev. 1991:29:6-15

48. Gagne M, Pothier F, Sirard M-A. Effect of microinjection time during postfertilization S-phase on bovine embiyonic development. Mol. Reprod. Dev. 1995; 41: 184-194

49. Gagne M, Pothier F, Sirard M-A. Study of genomic recombination i, foreign DNA coinjected with restriction endonuclease into maturing and inseminated bovine oocytes. Transgenics 1996; 2: 79-88

50. Games D, Adams D, Alessandrini R et al. AJzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F B-amyloid precursor protein. Nature 1995; 373: 373-385

51. Gordon 1. Culturing the early embryo. In: Persley G, ed. Laboratory production of cattle embryos volume II. Cambridge, UK: CAB International, 1994; 246290

52. Gordon J W, Scangos G A, Plotkin D J, Barbosa J A, Ruddle F H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980; 77: 7380-7384

53. Gordon J W. Transgenic animals. Int. Rev. Cytol. 1989, 115: 171-229

54. Gordon K, Lee E, Vitale J et al. Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk. Bio/Technology 1987a; 5: 1183-1187

55. Gordon K, Lee E, Vitale J et al. Production of human tissueplasminogen activator in transgenic mouse milk. Bio/Technology 1987b; 5: 1183-1187

56. Graves К H, Moreadith R W. Derivation and characterization of putative plutipotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryo. Mol. Reprod. Dev. 1993; 36:424-433

57. Grosveld F, van Assendelft G B, Greaves D R, Kollias G. Position independent, high level expression of the human beta-globin gene. Cell 1987; 51: 975985

58. Groth С G. Transgenic pigs as donors for transplantation. Transgenic animals: Ethics, uses and economy. Hanasaari, Finland: Nordic Committee e Bioethics, 1996

59. Hamada T, Sasaki H, Seki R, Sakaki Y. Mechanism ofchromosomal integration of transgenes in microinjected mouse eggs: sequence analysis of genome-transgene and transgene-transgene junctions at two loci. Gene 1993; 128: 197-202

60. Hammer R E, Pursel V G, Rexroad С E et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 1985; 315: 680-683

61. Haskell R E, Bowen R A. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos. Mol. Reprod. Dev. 1995; 40: 386-390

62. Hersbach G J M. Pharming preparing for clinical trials with two of its leading products; ground breaking for large manufacturing facility. Press Release. Pharming В. V., Leiden, The Netherlands, 1997

63. Hersbach G J M. Pharming produces world's first human lactoferrin from cow's milk for pre-clinical testing with Nutricia. Press Release.: Pharming B.V., Leiden, The Netherlands, 1996

64. Higgs D R, Wood W G, Jarman A P et al. A major positive regulatory region located far upstream of the alpha-globin gene locus. Genes Dev. 1990; 4: 15881601

65. Hill J P. The relationship between 6-lactoglobulin phenotypes and milk composition in New Zealand dairy cattle. J. Dairy Sci. 1988; 76: 281-6

66. Hogan B, Constantini F, Lacy P. Manipulation of the mouse embiyo: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1996

67. Horvat S, Medrano J F, Behboodi E, Anderson G B. Murray J D. Sexing and detection of gene construct in microinjected bovine blastocysts using thepolymerase chain reaction. Transgenic Research 1993: 2: 134-140

68. Houdebine L M. The production of pharmaceutical proteins from the milk of transgenic animals. Reprod. Nutr. Dev. 1995; 35: 609-617

69. Houdebine L-M. Production of pharmaceutical proteins from transgenic animals. J. of Biotechnol. 1994; 34:269-287

70. Huges S H. Will retroviral vectors be used to make transgenic livestock? AgBiotech News and Information 1991;3: 25-28

71. Hughey V L, Johnson E A. Antimicrobiological activity of lysozyme against bacteria involved in food spoilage and food-borne disease. Appl. Environ Microbiol. 1987; 53:2165-70

72. Hyttinen J-M, Peura T, Tolvanen M et al. Generation of transgenic dairy cattle from transgene-analyzed and sexed embryos produced in vitro. Bio/Technology 1994; 12:606-608

73. Hyttinen J-M, Peura T, Tolvanen M, Aalto J, Janne J. Detection of microinjected genes in bovine preimplantation embryos with combined DNA digestion and polymerase chain reaction. Mol. Reprod. Dev. 1996: 43: 150-157

74. Iannaccone P M, Tabor G U, Garton R L, Caplice M D, Brenin D R. Pluripotent embryonic stem-cells from rat are capable of producing chimeras. Dev. Biol. 1994; 163 С

75. Janne J, Alhonen J, Hyttinen J-M, Peura T, Tolvanen M. Transgenic dairy cattle. In: Castro F 0, Janne J, eds. Mammary gland transgenesis: Therapeutic protein production volume 4. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 1998; 177-189

76. Janne J, Hyttinen J-M. Peura T et al, Transgenic Animals as Bioproducers of Therapeutic Proteins. Ann. Med. 1992; 24: 273-280

77. Janne J, Hyttinen J-M. Peura T et al. Transgenic bioreactors. Int. J. Biochem. 1994; 26:859-870

78. Jeness R, Sloan'.R E. The composition of milks of various species-a review. J. Daily Sci. 1970; 32:599-612

79. Jimenez-Flores R, Richardson T. Genetic engineering of the caseins to modify the behavior of milk during processing. J. Dairy Sci. 1988; 71: 2640-54

80. Karatzas С N, Turner J D. Towards altering milk composition by genetic manipulation: current status and challenges. J. Dairy Sci. 1997; 80: 2225-2232

81. Keefer С L, Karatzas С N, Lazaris-Karatzas A, Gagnon I P, S, Downey В R. Isolation and maintenance of putative embryonic stem (ES) cells derived from Nigerian dwarf goat embryos. Biol. Reprod. 1996; 54 (Suppi.): 172

82. Kennedy L G, Boland M P, Gordon 1. The effect of embryo quality at freezing on subsequent development of thawed cow embryos. Theriogenology 1983; 19: 823-832

83. Kim T, Leibfried-Rutledge M L, First N L. Gene transfer in bovine blastocysts using replication -defective retroviral vectors packaged with gibbon ape leukemia virus envelopes. Mol. Reprod. Dev. 1993; 35: 105-113

84. King D, Wall R J. Identification of specific gene sequences in preimplantation embryos by genomic amplification: Detection of a transgene. Mol. Reprod. Dev. 1988; 1:57-62

85. Knight К L, Spieker-Polet H, Kazadin D S, Oi V T. Transgenic rabbit with lymphotic leukemia induced by c-myc oncogene fused with the immunoglobulin heavy chain enhancer. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1988; 85: 3130-3134

86. Korhonen V P, Tolvanen M, Hyttinen J-M et al.,. Expression of bovine B-lactoglobulin/human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits. Eur. J. Biochem. 1997; 245: 482-489

87. Krimpenfort P, Rademakers A, Eyestone W et al. Generation of transgenic dairy cattle using 'in vitro' embryo production. Bio/Technology 1991; 9: 844847

88. Krimpenfort P. The production of human lactoferrin in the milk of transgenic animals. Cancer Detec. Prev. 1993; 17: 301-305

89. Krisher R L, Gibbons J R, Canseco R Set al. Influence of time of gene microinjection on development and DNA detection frequency in bovine embryos. Transgenic Res. 1994;3:226-231

90. Kubisch H M, Larson M A, Eichen P A, Wilson J M, Roberts R M.

91. Adenovirus-mediated gene transfer by perivitelline microinjection of mouse, rat and cow embryos. Biol. Reprod. 1997; 56: 119-124

92. Kubish H M, Hernandez-Ledezma J J, Larson M A, Sikes J D, Roberts R M. Expression of two transgenes in in vitro matured and fertilized bovine zygotes after DNA microinjection.J. Reprod. Pert. 1995; 104: 133-139

93. Lauria A, Gandolfi F. Recent advances in sperm cell mediated gene transfer. Mol. Reprod. Dev. 1993; 36: 255-257

94. Lavitrano M, Camaioni A, Fazio V Metal. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 1989; 57: 717723

95. Lavitrano M, French D, Zani M, Frati L, Spadafora C. The interaction between exogenous DNA and sperm cells. Mol. Reprod. Dev. 1992; 31: 161-169

96. Lee S H, de Boer H A. Production of biomedical proteins in the milk of transgenic dairy cows: the state of the art. J. Control. Release 1994; 29: 213-221

97. Lewis-Williams J, Houseal T, Harvey M, DiTullio P. Ziomek C. Selection of transgenic preimplantation mouse embryos using fluorescence in situ hybridization. Theriogenology 1993; 39:258

98. Lin P, Clarke H J. Somatic Histone HI microinjected into fertilized mouse eggs is transported into pronuclei but does not disrupt subsequent preimplantation development. Mol. Reprod. Dev. 1996; 44: 185-192

99. Lo D, Pursel V, Linton P J et al. Expression of mouse IgA by transgenic mice, pigs and sheep. Eur. J.Immunol. 1991; 21: 1001-1006

100. Love J, Gribbin C, Mather C, Sang H. Transgenic birds by DNA microinjection. Biotechnology 1994; 12:60-63

101. Maga E A, Anderson G B, Huang M C, Murray J D. Expression of human lysozyme mRNA in the mammary gland of transgenic mice. Transgenic Res. 1994; 3: 36-42

102. Mann J R, McMahon A P. Factors influencing frequency produciton of transgenic mice. Methods in Enzymology 1993; 225: 771-781

103. Marquant-Le Guinne B, Nibart M, Guyander С et al. DNA probe sexing of young in vitro fertilized bovine embryos. Theriogenology 1992; 37: 253

104. McClenaghan M, Springbett A, Wallace R, Wilde С J, dark A J. Secretory proteins compete for production in the mammary gland transgenic mice. Biochem. J. 1995; 310:637-41

105. Peippo J, Bredbacka P. Sex related growth rate differences preimplantaion stage mouse embryos in vivo versus in vitro. The Nordic A. 1. Virtanen Institute Symposium on the In Vitro Culture of Domestic Animal Embryos. Kuopio, Finland, 1992; 28-29

106. Peng X, Olson R 0, Christian С В, lang С M, Kreider J W. Papillomas and carcinomas in transgenic rabbits carrying EJ-ras DNA and cottontail rabbit papillomavirus DNA. J. Virol. 1993; 67: 1698-1701

107. Pennisi E. After Dolly, a Pharming Frenzy. Science volume 279, 1998:646.648

108. Perez С F, Botchan M R, Tobias С A. DNA-mediated gene transfer efficiency is enhanced by ionizing and ultraviolet irradiation of rodent cells in vitro. Radiat. Res 1995; 104: 200-213

109. Petters R M. Transgenic livestock as genetic models of human disease. Reprod. Fertil. Dev. 1994; 6:643-5

110. Peura T T, Hyttinen J-M, Tolvanen M, Janne J. Effects of microinjection-related treatments on the subsequent development of in vitro-produced bovine oocytes. Theriogenology 1994; 42: 433-443

111. Peura T T, Tolvanen M, Hyttinen J-M, Janne J. Effects of membrane piercing and the type of pronuclear injection fluid on development of in vitro-produced bovine embryos. Theriogenology 1995; 43: 1087-1096

112. Peura T. Generation of transgenic cattle from microinjected embryos produced in vitro.: Kuopio University Publications C. Natural and Enviromental Sciences 26. 89 p.-Acad. Diss., 1994

113. Pieper F R, Wit I С M, Pronk А С J et al. Efficient generation of functional transgenes by homologous recombination in murine zygotes. Nucleic Acids1. Res. 1992; 20:1259-1264

114. Powell D J, Galli G, Moor R M. The fate of DNA injected into mammalian oocytes and zygotes at different stages of the cell cycle. J. Reprod. Fert. 1992; 95: 211-220

115. Prather R S, Hoffman К E, Schoenbeck R A, Stumpf T T, Li J. Characterization of DNA synthesis during the 2-cell stage and the production of tetraploid chimeric pig embryos. Mol. Reprod. Dev. 1996; 45: 38-42

116. Pursel V G, Hammer R E, Bolt D J, Palmiter R D, Brinster R L. Integration, expression and germ-line transmission of growth-related genes in pigs. J. Reprod. Fert. 1990; Suppi. 41:77-87

117. Pursel V G, Pinkert С A, Miller К F et al. Genetic engineering of livestock. Science 1989; 16:1281-1287

118. Reddy V B, Vitale J A, Wei С et al. Expression of human growth hormone in the milk oftransgenic mice. Anim. Biotechnol. 1991; 2: 15-29

119. Reuser A J, Kroos M A, Hermans M Met al. Glycogenosis type II (acic maltase deficiency). Muscle Nerve 1995; 3: S61-S69

120. Rexroad С E, Hammer R E, Behringer R R, Palmiter R D, Brinster R L. Insertion, expression and physiology of growth-regulating genes in ruminants. J. Reprod. Pert. 1990; Suppi. 41: 119-124

121. Richards W G, Caroll P M, Kinloch R A, Wassarman P M, Strickland S. Creating maternal effect mutation in transgenic mice: Antisense inhibition of an oocyte gene product. Dev. Biol. 1993; 160: 543-553

122. Rieger D. Grisart B, Semple E et al. Comparison of the effects otoviductal cell coculture and oviductal cell-conditioned medium on the development and metabolic activity of cattle embryos. J. Reprod. Pert. 1995; 105: 91-98

123. Riego E, Limonta J, Aquilar A et al. Production oftransgenic mice and rabbits that carry and express the human tissue plasminogen activator cDNA under the control of a bovine alpha SI casein promoter. Theriogenology 1993; 39: 1 173-1 185

124. Rosenkrans С F J, First N L. Culture of bovine zygotes to the blastocyst stage: effects ofamino acids and vitamins. Theriogenology 1991; 35: 266

125. Sato M, lwase R, Kasai K, Tada N. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible alternative of sperm-mediated gene transfer. Anim.1. Biotechnol. 1994:5:19-31

126. Sato M, Tada N, lwase R, Amann E. Gene introduction into mouseblastocysts via "pricking". Mol. Reprod. Dev. 1993; 34: 349-356

127. Schmoeckel M, Noller G, Shahmohammadi M et al. Prevention of hyperacute rejection by human decay-accelerating-factor in xenogeneic perfused working hearts. Transplantation 1996; 62:729-34

128. Schnieke A E, Kind A J, Richie W Act al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblast. Science 1997; 278: 2130-2133

129. Seachrist L. Gene the Bull debuts in US, spawns new company. Bio World Today volume 8,1997; 1-2

130. Seo В В, kim С H, Tojo H et al. Efficient selection of preimplantation transgenic embryos by an improved procedure using Dpn I-Bal 31 digestion and the polymerase chain reaction. Reprod. Fertil. Dev. 1997; 9: 263-269

131. Shuldiner A R. Transgenic animals. Mol. Med. 1996; 334: 653-655

132. Simons J P, McClenaghan M, Clark A J. Alteration of the quality of milk by expression of sheep P-lactoglobulin in transgenic mice. Nature 1987; 328: 530532

133. Snyder В W, Vitale J, Milos P et al. Developmental and tissue-specific expression of human CD4 in transgenic rabbits. Mol. Reprod. Dev. 1995: 40: 419-428

134. Stacey A, Schnieke A, Kerr M. Lactation is disrupted by a-lactalbumin deficiency and can be restored by human (x-lactalbumin gene replacement in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995: 92: 2835-9

135. Stacey A, Schnieke A, McWhir J et al. Use of a double-replacement gene targeting to replace the murine CK-lactalbunain gene with its human counterpart in embryonic stem cells and mice. Mol. Cel. Biol. 1994; 14: 1009-16

136. Stice S L, Robi J M, Ponce de Leon F A et al. Cloning: New breakthroughs leading to commercial opportunities. Theriogenology 1998; 49: 129-138

137. Stinnakre M G, Vilotte J L, Soulier S, Mercier J C. Creation and phenotypic analysis of a-lactalbumin deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:6544-8

138. Stromqvist M, Houdebine L, Andersson J 0 et al. Recombinant human extracellular superoxide dismutase produced in milk of transgenic rabbits. Transgem Res. 1997:6:271-278

139. Swanson M E, Martin M J, O'Donnell J К et al. Production of functional human hemoglobin in transgenic swine. Bio/Technology 1992; 10: 557-559

140. Tada N, Sato M, Hayashi K, Kasai K, Ogawa S. In vitro selection of transgenic mouse embryos in the presence ofG-418. Transgenics 1995; 1: 535-540

141. Takada T, lida K, Awaij T et al. Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker. Nature Biotechnol. 1997; 15: 458-461

142. Takeda S, Toyoda Y. Expression of SV40-lacZ gene in mouse preimplantation embryos after pronuclear microinjection. Mol. Reprod. Dev. 1991; 30: 90-94

143. Taylor J M, Fan J. Transgenic rabbit models for the study of atherosclerosis. Front. Biosci. 1997; 15:D298-D308

144. Telford N A, Watson A J, Schultz G A. Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: A comparison of several species. Mol. Reprod. Dev. 1990; 262: 90-100

145. Thompson E M, Adenot P, Tsuji F I, Renard J-P. Real time imaging oftranscriptional activity in live mouse preimplantation embryos using a secreted luciferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:1317-1321

146. Thomson J A, Kalishman J, Golos T G et al. Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92: 7844-7848

147. Velander W H, Johnson J L, Page R Let al. High-level expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding humanprotein С. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992; 89: 12003-12007

148. Viglietta D N, Berthou L, Emmanuel F et al. Transgenic rabbits expressing human apolipoprotein A-l in the liver. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1996; 16: 1424-1429

149. Vilotte J-L, Soulier S, Stinnakre M-G, Massoud M, Mercier J-C. Efficient tissue-specific expression of bovine a-lactalbumin in transgenic mice. Eur. J. Biochem. 1989; 186:43-48

150. Wall R J, Hawk H W, Nel N. Making transgenic livestock: genetic engineering on a large scale. J. Cel. Biochem. 1992; 49: 113-120

151. Wall R J, Kerr D E, Bondioli K. R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. J. Dairy Sci. 1997; 80: 2213-2224

152. Wall R J, Seidel G E. Transgenic farm animals a critical analysis. Theriogenology 1992; 38:337-357

153. Wall R J. Transgenic livestock: progress and prospects for the future. Theriogenology 1996:45:57-68

154. Ward К A, Nancarrow С D. The genetic engineering of production traits in domestic animals. Experimentia 1991; 47: 913-922

155. Ward К A. The application of transgenic techniques for th -improvement of domestic animal productivity. Cur. Opin. Biotechnol. 1991; 2: 834-839

156. Watanabe M, Naito M, Sasaki E et al. Liposome-mediated DNA transfer into chicken primordial germ cells in vivo. Mol. Reprod. Dev. 1994; 38: 268274

157. Weidle U H, Lenz H, Brem G. Genes encoding a mouse monoclonal antibody are expressed in transgenic mice, rabbits and pigs. Gene 1991; 98: 185-191

158. Wheeler M B, Rund L A, Bleck G T et al. Production of chimeric swine from embryonic stem (es) cells. Biol. Reprod. 1995; 52 (Suppi. 1): 136

159. White D J G. Lamgford G A, Cozzi E, Young V J. Protective effect ofhuman DAF in transgenic pigs. Xeno 1995; 3: 48-51

160. Whitelaw С В, Springbett A J, Webster J, dark J. The majority of GQ transgenic mice are derived from mosaic embryos. Transgenic Res. 1993; 2: 29-32

161. Wieghart M, Hoover J L, McGrane M Metal. Production of transgenic pigs harbouring a rat phosphoenolpyruvate carboxykinase-bovine growth hormone fusion gene. J. Reprod. Pert. Suppi. 1990: 41: 89-96

162. Williams В L, Sparks A E T, Canesco R S et al. In vitro development of zygotes from prepubertal gilts after microin)ection. J. Anim. Sci. 1992; 70: 2207-221 I

163. Wilmut I, Archibald A L, Harris S et al. Modification of milk composition. J. Reprod. Pert. 1990; 41: 135-146

164. Wilmut I, Archibald A L, McClenaghan M et al. Production of pharmaceutical proteins in milk. Experimentia 1991a; 47: 905-912

165. Wilmut I, dark A J. Basic techniques for transgenesis. J. Reprod. Pert. 1991; Suppi. 43: 265-275

166. Wilmut I, Haley С S, Woolliams J A. Impact of biotechnology on animal breeding. Anim. Reprod. Sci. 1992; 28: 149-162

167. Wilmut I, Hooper M L, Simons J P. Genetic manipulation of mammals and its application in reproductive biology. J. Reprod. Pert. 1991b; 92: 245-279

168. Wilmut I, Schnieke A E, Me Whir J, Kind A J, Campbell К H S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385: 810-813

169. Wolf E, Jehie P M, Weber M Met al. Hunman insulin-like growth factor I (IGF-I) produced in the mammary glands of transgenic rabbits: yield, receptor binding, mitotic activity, and effects on IGF-binding proteins. Endocrinol. 1997; 138:307-313

170. Wright G, Carver A, Cottom D et al. High level expression of active human alpha- 1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Bio/Technology 1991; 830-834

171. Xu К P, Yadav В R, King W A, Betterbridge К J. Sex related differences in the development of bovine embryos produced in vitro. Biol. Reprod. 1991; 44: 97

172. Yadav В R, King W A, Betterbridge К J. Relationships between the completion of first cleavage and the chromosomal complement, sex, and developmental rates of bovine embryos generated in vitro. Mol. Reprod. Dev. 1993; 36: 434-439

173. Yanchinski S. New artificial chromosomes may open doors to gene therapy applications. Genetic Engineering News, 1996; 13

174. Yom H-C, Bremel R D, First N L. Mouse mammary tumor vims promoter directs high-level expression of bovine aS I casein in the milk of transgenic heterozygous and homozygous mice. Anim. Biotechnol. 1993; 4: 89-107

175. Зеленин A.B., Тарасенко O.B., Колесников B.A. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в скелетных мышцах мышей mdx после баллистической трансфекции // Генетика. 1998. - Т.34. - №6. - С.730-736.

176. Зиновьева Н.А., Безенфельдер У. Получение яйцеклеток и пересадка микроинъецированных зигот у кроликов. / Онтогенез. 1996. Т.27.№3. с 214-217.

177. Иванова М.М. Изучение рецептор-опосредуемого трансгенеза в клетки эмбрионов млекопитающих доимплантационных стадий развития и анализ ДНК трансгенных животных. / Автореф. М. ВНИИСБ. 1998.

178. Кеда Ю.М. Биологические свойства гормона роста человека. Гормон роста человека: Сб.науч.тр. Пущино, 1988. - Т. 12. - С. 17-23.

179. Кузнецов А.В. Трансгенные животные. Приёмы конструирования // Биотехнология. 1995. - №3-4. - С.3-6.

180. Прокофьев М.И. , Захарченко В.И. и др. Методы получения биоинженерных с/х животных. Сельскохозяйственная биология. 1994, №4, стр. 12 -25.

181. Саркисов Д.С., Пальцин А.А., Втюрин Б.В. Электронно-микроскопоическая радиоавтография клетки. М. :Медицина, 1980.

182. Саркисов Д.С., Пальцын А.А., Колкер И.И. и др. Синтез РНК при активации нейтрофила//Арх. Пат. 1986. - № 12. - С. 6-13.

183. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды./ М. «Мир». 1987. -С. 53-80.

184. Эрнст JI.K. Состояние и перспективы генной инженерии сельскохозяйственных животных //Аграрная наука. 1996. - С.8-9.