Эмбриологические и генетические аспекты создания и размножения сельскохозяйственных животных с новыми фенотипическими свойствами

Сураева, Наталья Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эмбриологические и генетические аспекты создания и размножения сельскохозяйственных животных с новыми фенотипическими свойствами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Эмбриологические и генетические аспекты создания и размножения сельскохозяйственных животных с новыми фенотипическими свойствами"

На правах рукописи

СУРАЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

Эмбриологические и генетические аспекты создания и размножения сельскохозяйственных животных с новыми фенотипическими свойствами

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы - 2005 г.

Работа выполнена в отделе Биотехцентр ГНУ научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор,

академик РАСХН Эрнст Лев Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Борис Савельевич Народицкий

доктор биологических наук, профессор

Наталья Анатольевна Зиновьева

доктор биологических наук, профессор Виктор Иванович Миташов

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита состоится 17 мая 2005 г. в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д.006.013.01. при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ВИЖ; факс: 65-11-01.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа Автореферат разослан 2005 г.

В.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В XX веке бурное развитие методов селекции привело к значительному улучшению многих хозяйственных признаков домашнего скота. Потенциал крупномасштабной селекции далеко не исчерпан и в наше время. Однако возникновение и развитие биотехнологии на базе клеточной и генной инженерии открыли новые возможности в этой области.

Вначале искусственное осеменение, замораживание спермы, затем трансплантация ранних эмбрионов позволили значительно сократить период создания и размножения новых пород (Прокофьев М.И., 1983). На следующем этапе были разработаны методы получения, созревания и оплодотворения in vitro ооцитов, которые открыли новые перспективы для ускоренной селекции, путем более полного использования генетического материала самок.

С другой стороны, развитие молекулярной генетики привело к разработке методов, открывающих животноводству возможность работы на генном уровне (выделение, копирование, рекомбинация и интеграция в геном организма отдельных генов). Цель таких исследований заключается в получении трансгенных особей, у которых введенные гены путем синтеза чужеродных белков оказывают влияние на определенные свойства животного или придают организму определенные качества. В случае передачи трансгена по наследству возможно создание трансгенных линий.

В последние годы введение чужеродных генов в геном мышей стала рутинной процедурой (Palmiter R.D. et al., 1983; Ward K.et al., 1986; Peshon J.J. et al., 1987; Bowen R.A. et al., 1994). С помощью этой модели удалось достичь значительных успехов в изучении механизма интеграции, экспрессии и наследования введенных генов, и тем самым вплотную подойти к получению трансгенных сельскохозяйственных животных (Ernst L.K. et al., 1991; Прокофьев М.И. и др., 2003).

Одними из первых были получены трансгенные сельскохозяйственные животные (кролики, овцы, свиньи) с экзогенным геном гормона роста

(Hammer R.E., 1985). Известно, что соматотропин играет ключевую роль в обменных процессах. Так, при введении коровам гипофизарного гормона роста человека удается повысить уровень молочной продуктивности на 1015% (Machlin L.J., 1973). Помимо увеличения надоев, после инъекции гормона роста (гипофизарного или микробного происхождения) молодняку различных сельскохозяйственных животных их скорость роста и качество мясной продукции возрастали (Wagner Т.Е. et al., 1981, 1986; Armstrong D.G., 1985).

Еще одним успешным направлением трансгенеза является генетическая модификация сельскохозяйственных животных для производства рекомбинантных белков фармацевтического назначения с молоком кроликов, коз, коров и с белком яйца кур. В настоящее время получено более 60 таких белков с молоком трансгенных животных. Некоторые из них находятся уже на III фазе клинических испытаний. Использование трансгенных сельскохозяйственных животных в качестве живых биореакторов по сравнению с другими технологиями производства рекомбинантных белков обусловлены целым рядом преимуществ. Получение рекомбинантных белков с использованием генетически модифицированных микроорганизмов не обеспечивает посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, фолдинг белка, что приводит к снижению стабильности и физиологической активности получаемого белка. Несмотря на то, что в культуре клеток млекопитающих происходят все необходимые посттрансляционные процессы в рекомбинантном белке, концентрация последнего очень низкая, а сам процесс культивирования дорогостоящий и требует высокого технологического оборудования.

Получение животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, является еще одним важным направлением в трансгенезе. За последние десятилетия существенно расширились представления о вирусной природе целого ряда заболеваний сельскохозяйственных животных. Подробно изучены механизмы репродукции некоторых вирусов. Генетическое регулирование активности вирусных генов может позволить выводить формы животных с повышенной, устойчивостью к вирусным заболеваниям. Большой интерес в этом отношении представляют антисмысловые РНК (асРНК).

Однако, несмотря на тот факт, что в настоящее время различные виды домашних животных (и растений) подверглись генетической модификации, а именно, насекомые, рыбы, птицы, свиньи, кролики, козы, крупный рогатый скот, применение трансгенеза в области животноводства пока не связано с большими успехами, однако уже сейчас можно прогнозировать, что в будущем традиционные методы разведения животных будут дополнены, а отчасти и заменены новыми технологиями.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение молекулярно-клеточных механизмов эмбриогенеза домашних животных, разработка и усовершенствование биотехнологических методов их

размножения и генетической трансформации путем введения чужеродных генов.

Для выполнения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить особенности развития половых клеток и ранних эмбрионов сельскохозяйственных животных и усовершенствовать на этой основе методы созревания, оплодотворения ооцитов и дальнейшего культивирования вне организма эмбрионов крупного рогатого скота.

2. Изучить динамику белкового синтеза у ранних эмбрионов крупного рогатого скота, подвергшихся процедурам культивирования вне организма, замораживанию, а также инъекции чужеродными генами.

3. Разработать новые способы диагностики оплодотворяющей способности спермы быков с использованием процедуры всплывания спермы ("swim-up") и метода оплодотворения вне организма.

4. Усовершенствовать методы инъекции чужеродных генов в оплодотворенные вне организма ооциты крупного рогатого скота.

5. Усовершенствовать методы получения телят из полученных вне организма, замороженных эмбрионов, а также после трансплантации эмбрионов, полученных из инъецированных чужеродным геном зигот.

6. Получить трансгенных кроликов и изучить взаимосвязь между структурой

генных конструкций, эффективностью и характером их интеграции у кроликов, а также их потомков.

7. Усовершенствовать методы получения трансгенных химерных эмбрионов

кур.

Научная новизна исследований: Впервые нами показано, что для созревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro достаточно 18 часов, а не 22-24 часа, как было установлено ранее.

На основании полученных данных о наличии аналогии в процессе продвижения живчиков быка по половым путям самки и их всплывании в процедуре «swim-up» было сделано предположение, что концентрация мужских гамет в шейке матки остается постоянной (пока они жизнеспособны) за счет той силы, которая поддерживает динамическое равновесие между концентрированной малоподвижной (в цервикальном канале) и подвижной разбавленной (в матке) спермой.

Впервые показано, что оценка качества спермы быков по числу подвижных сперматозоидов в процедуре «swim-up» может быть объективным критерием прогнозирования оплодотворяющей способности спермы.

Исходя из концепции процесса оплодотворения у млекопитающих, выдвинутой академиком В.К. Миловановым, выявленное нами повышение эффективности развития эмбрионов крупного рогатого скота после 2-х кратного добавления спермы к ооцитам в условиях in vitro по сравнению с однократным, может быть результатом более эффективного освобождения яйцеклеток от клеток яйценосного бугорка, лучшей избирательностью

проникновения сперматозоидов в яйцеклетку и, как следствие, уменьшением вероятности возникновения эпигинитических нарушений у эмбрионов.

Показана возможность успешного культивирования in vitro ранних эмбрионов крупного рогатого скота на монослое эпителиальных клеток и с сывороткой крови других видов животных, в частности, клеток яйцевода кролика и эстральной сывороткой северных оленей.

Выявлены существенные различия в биосинтезе белка между полученными in vitro и in vivo эмбрионами, свидетельствующие о задержке в переходе синтетической активности с материнской мРНК на мРНК собственного генома у полученных in vitro эмбрионов.

В результате проведенных экспериментов впервые в нашей стране получены трансгенные кролики с геном гормона роста человека, а также выявлена экспрессия этого гена.

Получены впервые трансгенные животные (кролики) с геном асРНК против аденовируса человека. Показана возможность получения потомства от этих трансгенов и наследования введенного гена у потомков. Установлено, что линейная форма плазмиды по сравнению с кольцевой в пять раз более эффективно встраивается в геном кролика.

Определены оптимальные режимы скорости центрифугирования для визуализации пронуклеусов у зигот у крупного рогатого скота.

Процедура микроинъекции чужеродного гена в зиготу крупного рогатого скота после предварительного центрифугирования не останавливала развитие ранних эмбрионов, а также не влияла на уровень и качественный состав синтезируемых белков, как сразу же после инъекции, так и при последующем развитии.

Определены оптимальные концентрации чужеродного гена и плотность эмбриональных клеток кур (бластодермальных и гонадных первичных половых клеток (ППК)) в культуре с целью достижения с их помощью высокого уровня трансфекции эмбрионов.

Практическая значимость работы. Результаты исследований, полученные при изучении процесса созревания ооцитов крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма, могут быть использованы при внедрении данной технологии в производство, а также в целях рационального использования рабочего времени при проведении научных экспериментов.

Использование предложенного способа культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro вместе с соматическими клетками и сывороткой крови от других видов (кролика и северного оленя, соответственно) исключает вероятность переноса инфекционных агентов с белковыми или клеточными компонентами от животных-доноров (авторское свидетельство №1578859 от 15.03.1990).

Преложенный метод 2-х кратного добавления сперматозоидов в среду для оплодотворения с 2-х часовым интервалом повышает в три раза выход полученных вне организма бластоцист крупного рогатого скота.

Определены оптимальные соотношения между сроками в проявлении охоты у реципиента и возрастом эмбриона для проведения эффективной пересадки полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота, а именно, возраст эмбриона должен совпадать или опережать на один день стадию полового цикла реципиента.

Разработанный модифицированный способ отбора подвижных сперматозоидов быка позволяет примерно в пять раз повысить эффективность использования спермы быка при оплодотворении in vitro яйцеклеток крупного рогатого скота.

Предложенный метод диагностики оплодотворяющей способности спермы быков путем сравнительного изучения подвижности сперматозоидов от разных быков в условиях in vitro отличается простотой, дешевизной и быстротой исполнения (положительное решение о выделении патента на изобретение от 30.01.1996 г., заявка №95109519/15 (016259).

Отработана технология замораживания в азоте полученных вне организма эмбрионов . крупного рогатого скота с применением этиленгликоля.

Результаты исследований уровня биосинтеза белка в полученных in vitro эмбрионах крупного рогатого скота в сравнении с полученными in vivo эмбрионами, а также до и после их замораживания, могут быть использованы в качестве оценочного критерия при совершенствовании методов культивирования и криоконсервации ранних эмбрионов.

Установлено, что ППК гонад кур, выделенные на 7-е сутки инкубации, более удобный объект для получения как химер, в том числе и трансгенных, так и для создания долгосрочных культур с целью их, стабильной трансфекции чужеродным геном.

Результаты исследований, направленные на разработку оптимальных приемов микроинъекции чужеродных генов в зиготы кроликов и крупного рогатого скота, трансфекции куриных ППК могут быть использованы как в практической работе по получению трансгенных животных, так и в целях дальнейшего развития методов трансгенеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Модифицированный способ отбора подвижных сперматозоидов быка позволяет примерно в пять раз повысить эффективность использования спермы при оплодотворении яйцеклеток крупного рогатого скота in vitro.

3. Новый метод диагностики оплодотворяющей способности спермы быков в условиях in vitro основан на измерении концентрации подвижных живчиков быка при проведении процедуры «swim-up».

4. Полноценное развитие полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты может поддерживаться сывороткой крови северных оленей или эпителиальными клетками яйцевода кролика.

Использование же биологической жидкости другого вида может в значительней степени ограничить перенос определенных инфекций.

5. Эффективность развития эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты после 2-х кратного добавления сперматозоидов более чем в три раза выше, чем после однократного.

6. Существуют значительные индивидуальные различия между коровами-донорами по эффективности оплодотворения in vitro ооцитов и дальнейшему развитию эмбрионов. Процент дробящихся зигот к числу осемененных ооцитов составил в среднем 36.7% с колебаниями от 22.2% до 72.7% у отдельных животных. Стадии морулы и бластоцисты достигали в среднем 2.4± 1.8 эмбриона на корову с колебаниями от 0 до 5 эмбрионов.

7. Приживляемость эмбрионов крупного рогатого скота повышается при их трансплантации реципиентам в дни цикла, совпадающие с возрастом эмбриона (16.1%) или опережающие на один день (23.1%) по сравнению с отстающими на 1-2 дня (7.1-11.8%).

8. Белковый синтез у полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота имеет минимальную активность на стадии зиготы, вдвое возрастает к 8-ми клеточной стадии и втрое к стадии бластоцисты.

9. Эффективность получения трансгенных кроликов от числа рожденных потомков, в пронуклеусы зигот которых инъецирован ген гормона роста человека, составляет 10.9%. Установлена экспрессия гена гормона роста человека в сыворотке крови трансгенных кроликов.

10. Максимальная эффективность получения трансгенных кроликов от числа рожденных потомков продемонстрирована при инъекции гена асРНК против аденовируса человека и составила 35.7%. Линейная форма плазмиды PGMA с геном асРНК по сравнению с кольцевой более эффективно интегрируется в хромосомную ДНК зигот кроликов. Наследование чужеродного гена наблюдалось у 5 из 14 кроликов первого поколения.

11. Подобранные параметры позволяют трансфецировать бактериальным геном Р-галактозидазы около 30% эмбриональных клеток кур в культуре (бластодермальных и гонадных ППК). После инъекция суспензии трансфецированных клеток реципиентам была выявлена экспрессия чужеродного гена в тканях химерных эмбрионов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчетных сессиях Биотехцентра, НИИПЗК и ВИЭВ в период с 1988 г. по 1997 г., а также на: международных конференциях (Харьков, 1988, Аскания- Нова, 1993, Санкт-Петербург, 1993, Киев, 1994, Дубровицы, 2003 г., Москва 2004 г.), международном симпозиуме (Санкт-Петербург, 1994), международном обществе по пересадке эмбрионов (Ницца, 1997), всероссийской научной школы-конференции в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (1997).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 30 печатных работах, в том числе в центральных журналах - 12, книгах - 2, в зарубежных изданиях - 2, получено 1 авторское свидетельство и 1 положительное решение о выдаче патента на изобретение и методических рекомендациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 270 страницах компьютерного текста, содержит 45 таблиц, 19 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, их результатов и обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список литературы включает 437 источников, в том числе 419 иностранных авторов.

2 . МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводили в период 1986-2004 г.г. на кроликах в "Горках Ленинских" (ЭНИБ "Горки Ленинские") и отделе Биотехцентр Всероссийского института пушного звероводства и кролиководства РАСХН (НИИПЗК) и Всероссийском институте экспериментальной ветеринарии РАСХН (ВИЭВ), на коровах и телках в хозяйствах Московской, Воронежской, Оренбурской и Нижегородской областей, а также оплодотворенных яйцах кур породы кросса «Птичное» (племенной птицеводческий завод «Птичное», г. Наро-Фоминск, Московская область) в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ РАМН.

Яйцеклетки получали из яичников, доставленных с Московского и Подольского мясокомбинатов в течение 1.5-2 часов. Для оплодотворения вне организма использовали замороженную сперму быков с Центральной станции осеменения (п.Быково).

Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота проводилось в среде М-199 с различными биологическими добавками, а оплодотворение - в приготовленной в лабораторных условиях среде Рет1-ТАЬР. Культивирование вне организма эмбрионов кролика проводили в среде Хэма Б-10.

Цитологический анализ эмбрионов крупного рогатого скота и кроликов проводили под микроскопом после предварительной фиксации и окраской лакмоидом, а ППК кур окраской ШИК-реактивом.

Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота осуществляли по стандартной программе на автоматическом приборе ЗЭМ-4 (г.Харьков). Для трансплантации зародышей крупного рогатого скота использовали различные модифицированные катетеры Кассу.

Метаболическое мечение общих белков исследовали методом встраивания радиоактивного по сере метионина в нативные белки эмбрионов крупного рогатого скота, при 1.5 или 2.5 ч их совместной инкубации.

Микроинъекции чужеродных генов в пронуклеусы зигот кроликов и крупного рогатого скота проводили на микроманипуляторе КМ-2 с оптикой Намарского.

Наличие гормона роста человека в сыворотке крови трансгенных кроликов исследовали радиоиммунологическим методом с использованием китов фирмы «Сорин» (Франция).

Трансгенных кроликов идентифицировали с помощью блот-анализа по Саузерну. Хромосомную ДНК выделяли из ушной ткани и спермы, а затем проводили гибридизацию с мечеными зондами.

Трансфекция бластодермальных и гонадных примордиальных первичных клеток, а также эмбрионов кур, осуществляли бактериальным геном Р-галактозидазы с помощью липофекции. Наличие чужеродного гена в химерных эмбрионах определяли методом ПЦР, а его экспрессию - окраской X-gal.

Статистическую обработку результатов проводили с применением биометрических методов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ИХ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И РАННИХ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ ЭМБРИОНОВ ВНЕ ОРГАНИЗМА

Практически невозможно внедрять технологии клеточной и генной инженерии в животноводство, не имея в своем распоряжении достаточного числа зигот. Высокая трудоемкость и дороговизна гормональных обработок доноров эмбрионов, их извлечение и широкая вариабильность в их оплодотворяемости послужили основанием для разработки технологии дозревания ооцитов, полученных при убое крупного рогатого скота на мясокомбинате путем аспирации фолликулов диаметром менее чем 7 мм. Использование метода оплодотворения вне организма открывает также большие возможности в преодолении многих форм бесплодия. Метод оплодотворения яйцеклеток вне организма может быть также эффективно использован и для оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов и яйцеклеток.

В течение последних трех десятилетий были достигнуты значительные успехи в разработке метода оплодотворения вне организма яйцеклеток кроликов, хомяков, мышей, овец, свиней и крупного рогатого скота. Интенсивно проводятся исследования по дальнейшему совершенствованию этого метода и в настоящее время.

3.1.1. Влияние сыворотки крови северных оленей на созревание ооцитов и дальнейшее культивирование in vitro эмбрионов крупного рогатого скота

Обычно для культивирования яйцеклеток и эмбрионов крупного рогатого скота используют инактивированную эстральную сыворотку коров. Однако биологическая жидкость, полученная от гомологичного вида, при культивировании эмбрионов in vitro может быть источником инфекции. Использование же биологической жидкости другого вида в значительней степени ограничило бы риск возникновения подобных ситуаций. В настоящем исследовании изучена возможность добавки в среду для культивирования ооцитов крупного рогатого скота сыворотки крови северных оленей вместо сыворотки крови эстральной коровы.

Как видно из данных таблицы 1, продемонстрирована успешная попытка культивирования ооцитов, а затем после оплодотворения и эмбрионов крупного рогатого скота с использованием инактивированной при 56°С сыворотки крови северных оленей в качестве белковой добавки к среде. После in vitro оплодотворения получено 57,4% дробящихся эмбрионов (в отдельных опытах 70%) от числа ооцитов, созревших в среде М-199 с сывороткой крови северных оленей, против 73,4% эмбрионов в той же среде с сывороткой крови эстральных коров, но разница была статистически недостоверной.

При дальнейшем развитии эмбрионов: 16,2% эмбрионов из числа ооцитов, созревших в среде с добавлением сыворотки крови северных оленей, достигли стадии бластоцисты (в отдельных опытах 27% эмбрионов) и 24,8%, созревших в среде с добавлением сыворотки крови эстральных коров (Р>0.05).

Таблица 1. Созревание ооцитов и развитие ранних эмбрионов в среде с добавлением эстральной сыворотки коров и северных оленей

Показатели Тип сыворотки крови

эстральных коров северных оленей

ооциты,п 192 439

дробящиеся эмбрионы п 141" 252б

% 73.4 57.4

бластоцисты п 35а 41б

% 24.8 16.2

Р а,б>0.05

Таким образом, нами продемонстрирована возможность использования сыворотки крови другого вида животного в качестве белковой добавки при культивировании ооцитов и ранних эмбрионов крупного рогатого скота вне организма.

3.1.2. Влияние продолжительности созревания ооцитов крупного рогатого скота в условиях in vitro на их дальнейшее развитие

Важным элементом в системе оплодотворения яйцеклеток in vitro является выявление оптимальных параметров продолжительности культивирования для эффективного созревания ооцитов. Определение этого параметра важно также и с точки зрения выбора удобного для исследователя время суток для проведения оплодотворения яйцеклеток in vitro после их созревания. По литературным данным интервал проведения этой процедуры варьирует от 22 до 26 часов.

Нами были оценены два периода созревания ооцитов крупного рогатого скота (18 и 24 часа), как по числу дробящихся яйцеклеток, так и по числу эмбрионов, достигших стадии бластоцисты. Не обнаружено достоверных различий в получении полноценных эмбрионов при созревании ооцитов в диапазоне от 18 до 24 часов как по числу дробящихся зародышей (70,9% и 75,9%), так и по их способности к дальнейшему развитию до стадии бластоцисты (25.6% и 24,2%, соответственно, Р>0.05). Этот научный факт имеет также и практическое значение, т. к. интервал использования созревших in vitro ооцитов для оплодотворения in vitro можно расширить еще на 4-е часа (т.е. процедуру оплодотворения можно проводить через 18-26 часов после процедуры созревания ооцитов), чтобы провести эту работу в более удобное для исследователя время суток.

3.1.3 Влияние продолжительности процедуры отбора подвижных сперматозоидов на эффективность оплодотворения яйцеклеток вне организма

Одним из этапов подготовки спермы к оплодотворению in vitro является процедура отбора подвижных гамет. Нами был выбран метод всплывания сперматозоидов, так называемая, «swim-up»- процедура (Lopata A. et al., 1976). Однако в научной литературе отсутствовали данные о временных параметрах всплывания сперматозоидов, не исследовалась возможность более эффективного использования одной дозы спермы для оплодотворения in vitro ооцитов.

В первой серии опытов исследовался временной фактор процедуры всплывания сперматозоидов быка, а именно, действительно ли инкубация в течение 45-60 минут, как это предложено авторами метода, является оптимальным для сбора максимального числа подвижных сперматозоидов. В результате проведенных экспериментов нами было показано, что после 5 мин инкубации концентрация подвижных сперматозоидов уже не увеличивается (таблица 2). Затем было изучено влияние продолжительности инкубации сперматозоидов на эффективность их оплодотворяющей способности в условиях in vitro. Оказалось, что при уменьшении срока инкубации спермы с 60 минут до 15 минут эффективность дробления зигот (52,1% против 65,0%, соответственно, Р>0,05) и дальнейшего развития до стадии морулы и

бластоцисты (24,0% против 21,0%, соответственно, Р>0.05) не снизилась. Таким образом, продолжительность всплывания сперматозоидов может быть сокращена с 60 минут до 15 минут без снижения результативности процесса оплодотворения.

Таблица 2. Эффективность отбора подвижных сперматозоидов в зависимости от времени инкубации

Время инкубации, мин Число

опытов сперматозоидов, млн. в 1 мл

5 5 3.30+0.46

15 6 3.80+0.53

30 5 1.90+0.75

45 5 2.80+0.72

60 6 3.00+0.01

В следующей серии экспериментов исследовалась возможность повторного проведения процедуры отбора подвижных сперматозоидов с одной и той же дозы спермы. Смену среды и инкубацию (15 мин) проводили пять раз. Во второй смене среды число подвижных сперматозоидов/мл было примерно таким же (1,80x106 ±0,21x10*), как и во время первого отбора (2,10x10^0,21x10®). Более того, даже в том случае, когда среду над осадком сперматозоидов меняли пять раз, концентрация сперматозоидов/мл, оставалась приблизительно той же, что была обнаружена в первой порции среды (2,00хЮ6±0,34хЮ6против 2,10х106± 0,21x10®, соответственно).

Полноценность всплывших после 3-х кратной смены среды сперматозоидов определялась по их способности к оплодотворению in vitro яйцеклеток крупного рогатого скота. Как видно из данных таблицы 3, оплодотворяющая способность сперматозоидов, полученных после 3-х кратной замены среды, была несколько ниже, чем у первоначально полученных сперматозоидов (47,0% против 65,0% дробящихся эмбрионов, соответственно, Р<0,05). Однако по числу развившихся морул и бластоцист между этими группами не обнаружено статистически достоверной разницы (Р>0,05).

Таблица 3. Влияние смены среды на оплодотворяющую способность спермы быка

Кратность Число ооцитов Число

смены среды дробящихся морул и

зародышей бластоцист

n % n %

1 253 164 65.0а 34 21.0в

3 220 103 47.0б 21 20.3г

Р а,б< 0.05, Рв,г> 0.05

Таким образом, благодаря приему многократных смен в процедуре «swim-up» можно в несколько раз увеличить эффективность использования одной дозы спермы, что особенно важно, когда применяют сперму от высокоценных быков-производителей.

3.1.4. Влияние процедуры 2-х кратного добавления спермы к ооцитам в условиях in vitro на дальнейшее развитие до стадии бластоцисты

Как известно, эффективность in vitro оплодотворения определяется не только полноценностью созревания ооцитов, условиями капацитации сперматозоидов или составом культуральных сред на всех этих этапах, но, по-видимому, и целым рядом факторов, связанных непосредственно с процессом оплодотворения, а именно, со слиянием мужской и женской гамет.

Еще в 1962 году академик В.К. Милованов выдвинул концепцию о четырех этапах оплодотворения у млекопитающих, согласно которой на первом этапе происходит деполимеризация и растворение межклеточного вещества остаточных скоплений клеток яйценосного бугорка при помощи выделяемого сперматозоидаими фермента гиалуронидазы, и необходимо достаточно большое число живчиков.

Опираясь на изложенное, нами было сделано предположение о том, что при процедуре оплодотворения in vitro, в отличие от in vivo, сперматозоиды большей частью гибнут на первом этапе, и для завершения последних этапов оплодотворения полноценных спермиев уже не хватает. Поэтому, возможно, при добавлении свежей порции гамет можно будет повлиять на результаты оплодотворения in vitro.

С этой целью нами в отличие от традиционного метода однократного введения сперматозоидов в среду с ооцитами при оплодотворении вне организма, было проведено 2-х кратное добавление (с интервалом в два часа). Вначале вносили к ооцитам разбавленную сперму и инкубировали в течение 2-х часов (2-3х106спермиев/мл), а затем заменяли на более концентрированную (1x10' спермиев/мл) и инкубировали еще в течение 1824 часов. Оказалось, что 2-х кратное добавление спермы не оказало влияния на эффективность дробления эмбрионов, в то время как выход бластоцист увеличился более чем в три раза.

Исходя из изложенной выше концепции процесса оплодотворения у млекопитающих, можно предположить, что увеличение в конечном итоге числа сперматозоидов при оплодотворении вне организма в опытной группе способствовало более быстрому освобождению яйцеклеток от клеток яйценосного бугорка и повышению избирательности проникновения сперматозоидов в яйцеклетку, что в свою очередь привело к более полноценному оплодотворению (возможно, к снижению вероятности возникновения эпигинитических нарушений) и, как следствие этого, развитию большего числа оплодотворенных яйцеклеток до более

продвинутых стадий.

3.1.5. Культивирование полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота

Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота вне организма обычно проводится с использованием инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, хотя в зарубежной литературе были сообщения об использовании неинактивированной сыворотки крови в качестве белковой добавки В среду для созревания и культивирования оплодотворенных вне организма ооцитов.

Нами был изучен вопрос, действительно ли инактивированная сыворотка благоприятно воздействует на развитие эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты по сравнении с неинактивированной сывороткой, поскольку существует мнение о том, что при инактивации сыворотки биологически активные вещества (гормоны, ростовые факторы), содержащиеся в ней, частично разрушаются.

Созревание ооцитов крупного рогатого скота вне организма проводили как обычно в среде М-199 с добавлением 20%-ой инактивированной эстральной сыворотки коров. Однако культивирование эмбрионов крупного рогатого скота вне организма до стадии бластоцисты проводили в среде М-199 с добавлением 20%-ой инактивированной эстральной сыворотки коров (контроль) и в среде М-199 с добавлением 20%-ой неинактивированной эстральной сыворотки коров (опыт).

Анализ результатов показал (таблица 4), что число дробящихся эмбрионов в контрольной и опытной группах было различным. Так, в контрольной группе процент дробящихся эмбрионов составил 68,4% (13/19), а в опытной группе - 39,5% (15/38). На седьмой день после оплодотворения процент эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, был также достоверно выше при культивировании эмбрионов с использованием инактивированной сыворотки и составил 23,1% по сравнению с использованием неинактивированной сыворотки, где процент бластоцист был равен 6,7% (Р< 0,05).

Таблица 4. Развитие in vitro эмбрионов крупного рогатого скота в зависимости от добавления инактивированной и неинактивированной сыворотки в среду культивирования

Тип сыворотки Число

ооцитов дробящихся эмбрионов бластоцист

n % n %

Инактивированная 19 13а 68.4 3а 23.1

Неинактивированная 38 15б 39.5 1б 6.7

Ра,б < 0.05

Таким образом, проведенные нами эксперименты показали, что культивирование эмбрионов крупного рогатого скота вне организма лучше проводить с использованием инактивированной сыворотки, которая очевидно не содержит биологически активных веществ, способных оказать негативное влияние на жизнеспособность эмбрионов.

Согласно литературным данным культивирование ранних эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты удалось провести с использованием яйцевода временного реципиента (Boland M., 1984; Imai К. et al., 1997), а также эпителиальных клеток яйцевода крупного рогатого скота (Fukui Y. et al., 1988). Однако использование временного реципиента представляет собой трудоемкий и дорогостоящий метод, тогда как при культивировании на монослое клеток возможна вероятность переноса инфекции клетками того же вида. В наших опытах показана возможность успешного культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота на монослое эпителиальных клеток другого вида животных. Нами были использованы эпителиальные клетки яйцевода кролика, полученные на второй день после овуляции (таблица 5).

Таблица 5. Эффективность развития in vitro эмбрионов крупного рогатого скота на монослое эпителиальных клеток яйцевода коров и кролика

Монослой клеток Число

ооцитов дробящихся эмбрионов бластоцист

n % n %

кролика 63 49 " 77.8 8в 16.3

коровы 73 50б 68.5 12г 24.0

Раб,вг < 0.05

Оказалось, что эпителий яйцевода кролика способен поддерживать в культуре развитие эмбрионов крупного рогатого скота. Однако, процент развившихся бластоцист из числа дробящихся эмбрионов на 8% ниже при сокультивировании с эпителиальными клетками яйцевода кролика по сравнению с эпителиальными клетками яйцевода коровы. Тем не менее, проведенные нами эксперименты убедительно показали, что эпителиальные клетки яйцевода кролика способны поддерживать развитие ранних эмбрионов крупного рогатого скота.

3.1.6. Изучение метаболизма белка в ранних эмбрионах крупного рогатого скота

Полноценность развития оплодотворенных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота в настоящее время оценивается только по эффективности достижения эмбрионами соответствующих стадий развития, то есть по их морфологическим признакам, и по результатам их трансплантации. Можно

полагать, что изучение динамики биосинтеза белка у ранних эмбрионов при их дальнейшем развитии определенно пролило бы свет на механизм молекулярных взаимодействий, имеющих место на данном этапе развития. На молекулярном уровне процессы, происходящие в эмбрионе в ходе его развития, изучены недостаточно. Не изучены также на биохимическом уровне те изменения на молекулярном уровне, которые неизбежно возникнут в эмбрионах после таких процедур, как замораживание, микроманипуляции (получение трансгенных и клонированных животных) и других. В наших исследованиях мы попытались сделать первые шаги к решению этих вопросов на эмбрионах крупного рогатого скота.

Общую картину биосинтеза белка полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота можно охарактеризовать следующим образом: минимальный уровень включения метки наблюдался на стадии зиготы, возрастал вдвое к 8-ми клеточной стадии, и втрое - к стадии бластоцисты, причем на стадиях 16- и 32-клеток синтез белка практически не менялся.

Проведенные нами эксперименты по определению активности биосинтеза белка у полученных in vitro эмбрионов выявили как сходство с аналогичными процессами у полученных in vivo эмбрионов, так и некоторые различия. Так, у полученных in vitro эмбрионов, также как и у полученных в организме животного (Frie R.E. et al., 1989), качественные изменения в биосинтезе белка наблюдались на 8-ми клеточной стадии и стадии бластоцисты. Идентичные процессы наблюдались в биосинтезе белка у полученных in vitro и in vivo эмбрионов при его количественной оценке: с 16 до 32-клеточной стадии уровень включения метки оставался постоянным, а затем возрастал значительно к стадии бластоцисты. Однако выявлены и существенные различия между полученными in vitro и in vivo эмбрионами. Так, у полученных in vitro эмбрионов интенсивность синтеза белка не только не уменьшалась от зиготы к 8-ми клеточной стадии, как это было показано для in vivo эмбрионов, а, наоборот, повышалась. К тому же, соотношение включения метки у in vivo полученных зигот по сравнению с бластоцистами было 6:1, а у in vitro полученных зигот соответственно 3:1, что, очевидно, связано с пониженной метаболической активностью последних.

Считается, что качественные изменения у полученных in vivo эмбрионов крупного рогатого скота на 8-16 - клеточной стадии и минимум уровня синтеза белка на этой стадии связаны с переходом синтетической активности эмбриона с материнской мРНК на мРНК эмбрионального собственного генома (Lawitts J.A. et al, 1991). Действительно, согласно нашим данным, у полученных in vitro эмбрионов хотя и наблюдались изменения в качественном составе синтезируемых белков на 8-ми клеточной стадии, но не такие значительные. Вероятно, у полученных in vitro эмбрионов синтез белка с материнской мРНК все еще продолжался до 8-ми клеточной стадии, что и вызывало торможение процесса переключения биосинтеза белка на эмбриональную мРНК, а значит, и могло понизить их жизнеспособность. Последствия такого торможения, вероятно, отразились и на дальнейшем развитии эмбрионов в виде более низкой интенсивности биосинтеза белка у

in vitro полученных бластоцист по сравнению с полученными в организме.

Таким образом, при совершенствовании метода культивирования in vitro эмбрионов крупного рогатого скота, возможно, следует оценивать его эффективность путем сравнения биосинтетической активности у полученных in vitro и in vivo бластоцист.

Нами был изучен также метаболизм белка у эмбрионов крупного рогатого скота до и после криоконсервации. Было показано, что полученные in vivo бластоцисты крупного рогатого скота до замораживания в глицерине (эмбрионы были заморожены в хозяйстве «Петровское» по стандартной методики для замораживания эмбрионов, полученных in vivo) и после оттаивания ни количественно, ни качественно по биосинтезу белка не имели различий.

Аналогичный эксперимент был проведен с полученными in vitro бластоцистами, которые были заморожены в этиленгликоле. Бластоцисты до замораживания показали идентичный профиль белков, а из числа бластоцист после замораживания и оттаивания половина имели отличающийся белковый профиль в области - 80, 67, 40, 37, 10 т.н.п. По количественному включению метки бластоцисты до замораживания также превосходили бластоцисты после оттаивания.

Таким образом, снижение жизнеспособности оттаянных полученных in vitro эмбрионов по сравнению с полученными in vivo эмбрионами крупного рогатого скота, связано, по крайней мере, с 2-мя факторами: количественным снижением уровня биосинтеза и качественными изменениями, так как эти явления, как было показано выше, не имеют место у in vivo полученных бластоцист.

3.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОПЛОДОТВОРЯЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ СПЕРМЫ БЫКА В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

Метод искусственного осеменения открыл широкую возможность для ведения эффективной племенной работы и получения неограниченного числа потомков от выдающихся производителей. Актуальность метода неоспорима и в вопросах дальнейшего размножения домашних животных, полученных генно-инженерными методами, при этом понятие об оценке семени является одним из ключевых моментов. Наиболее объективным методом определения оплодотворяющей способности спермы быка является прямой метод по результатам осеменения коров и телок. Однако этот "прямой" метод зависит от многих субъективных факторов, таких, как воспроизводительная способность осемененных самок, способа их осеменения, квалификация техника искусственного осеменения и других. Этот метод неудобен при оценке оплодотворяющей способности спермы молодых быков и совершенно непригоден для предварительного определения оплодотворяющей способности отдельных партий эякулятов, предназначенных для искусственного осеменения.

Поэтому многие годы делаются попытки разработать методы определения оплодотворяющей способности спермы быков в лабораторных условиях на основании таких свойств семени, как ее концентрация, а также морфологические и физиологические характеристики сперматозоидов. Был определен ряд тесных и достоверных соотношений между отдельными показателями спермы. Однако большинство исследователей пришли к заключению о малой связи этих показателей с фактической оплодотворяющей способностью семени быка.

Разработка в 80-е годы способа оплодотворения ооцитов сельскохозяйственных животных вне организма, в том числе крупного рогатого скота, открыла возможность прямой оценки оплодотворяющей способности семени. Поэтому в одну из задач настоящего исследования входило изучение оплодотворяющей способности. семени быков методом оплодотворения вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота.

3.2.1. Изучение индивидуальных различий в оплодотворяющей способности спермы быков в условиях in vitro

При разработке технологии in vitro оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота была рассмотрена идея использования данного метода для предварительной оценки оплодотворяющей способности спермы от разных быков, тем более что подобные предположения уже обсуждались (Wright R.W. et al., 1981). Так, к примеру, значительные положительные корреляции наблюдались между дроблением, формированием бластоцист in vitro с показателем отсутствия охоты у коров в течение 56 дней после искусственного осеменения семенем, которое было использовано для оплодотворения in vitro (Sirard M.A. et al., 1988). Вместе с тем необходимо иметь в виду, что многие факторы, определяющие дробление и формирование бластоцист, зависят от условий культивирования эмбрионов (Northey D.L. et al., 1992).

Нами были сопоставлены данные по оплодотворяющей способности спермы четырех быков в условиях in vitro и результатами искусственного осеменения in vivo. По данным таблицы 6 процент дробящихся эмбрионов после оплодотворения вне организма семенем трех быков практически не различался (40,8-45,1%), несмотря на различную оплодотворяющую способность семени по результатам искусственного осеменения (55-76%). Более высокий процент дробящихся эмбрионов был получен после оплодотворения вне организма семенем быка Секрет (66,1%) по сравнению с семенем трех указанных выше быков, и эта разница была статистически достоверна (Р<0,05). Однако его оплодотворяющая способность по результатам искусственного осеменения (65 %) была ниже, чем у двух из трех упомянутых быков (Рислинг и Сантал, 72,0 и 76,0%, соответственно).

Таблица 6. Индивидуальные данные быков-производителей по оплодотворяющей способности их спермы в условиях in vitro и по результатам искусственного осеменения

Кличка быка Результаты искусственного осеменения,% Число ооцитов Число дробящихся эмбрионов Из них достигли стадии

n % 4-х клеток Морулы и бластоцисты

n % n %

1 .Ананас 55.0 76 34б 44.7 21в 61.8 13 2.9

2.Секрет 65.0 59 39а 66.1 24в 61.5 2 5.1

З.Рислинг 72.0 102 46б 45.1 26г 56.5 4 8.7

4.Сантал 76.0 120 49б 40.8 25 д 51.0 7ж 14.3

Р аб,вг,дв,жз < 0.05

Однако через восемь суток культивирования эмбрионов была выявлена тенденция к прямой зависимости между процентом развившихся in vitro морул и бластоцист и показателями оплодотворяющей способности спермы быков по результатам искусственного осеменения. Так, после in vitro оплодотворения ооцитов семенем быков Ананас, Секрет, Рислинг и Сантал процент эмбрионов, достигших стадии морулы и бластоцисты, составил 2,9%, 5,1%, 8,7% и 14,3%, соответственно, а оплодотворяющая способность спермы этих быков по результатам искусственного осеменения - 55%, 65%, 72% и 76%, соответственно. При этом достоверность различия между быками (Р<0,05) по проценту полученных морул и бластоцист была только между быком Ананас, имеющим самую низкую оплодотворяющую способность по результатам искусственного осеменения (55%), и быком Сантал, имеющим наибольшую оплодотворяющую способность (76%). Что касается других быков, то такая зависимость также просматривалась, но вследствие небольших различий между быками по оплодотворяющей способности по результатам искусственного осеменения эти различия были недостоверны.

3.2.2. Изучение взаимосвязи между индивидуальными показателями оплодотворяющей способности спермы быков по результатам искусственного осеменения и числом всплывших спермиев в процедуре «swim-up»

Полученные нами результаты о свойствах подвижных сперматозоидов быка при проведении процедуры «swim-up» привели нас к мысли об изучении возможной корреляции между числом всплывших гамет от различных быков и оплодотворяющей способностью их спермы in vivo.

Оплодотворяющая способность спермы по числу подвижных гамет оценивалась у 5-и быков. Как видно из данных таблицы 7, наблюдалась прямая зависимость между числом всплывших гамет и их способностью к оплодотворению по результатам искусственного осеменения, однако в трех группах (2,5,10) она была недостоверной.

В 6-ти (86%) из 7-ми случаев, разница в оплодотворяющей способности спермы между быками по результатам искусственного осеменения была в пределах 10-17%, и концентрация всплывших гамет различалась на 0.94-1.40 млн/мл и была статистически достоверной. В одном случае (группа 2) несмотря на то, что разница в оплодотворяющей способности спермы между быками Сантал и Секрет была 11%, концентрация всплывших спермиев различалась лишь на 0.28 млн/мл, и эта разница была недостоверной. Недостоверность данных в последнем случае, возможно, связана с неоднозначностью результатов по искусственному осеменению, т.к. известно, что оплодотворяющая способность спермы в зависимости от хозяйства может варьировать от 10-15%.

Таблица 7. Эффективность отбора всплывших сперматозоидов от различных быков

№ Кличка быка Оплодотворяе- Разница в концентрации Р

группы мость ин виво,% всплывших живчиков, млн/мл

1. Сантал 76 +0.20 <0.05

Рислинг 72

2. Сантал 76 +0.28 >0.05

Секрет 65

3. Сантал 76 + 1.24 <0.01

Шкипер 56

4. Сантал 76 + 1.40 <0.01

Ананас 55

5. Рислинг 72 +0.08 >0.05

Секрет 65

6. Рислинг 72 + 1.04 <0.01

Шкипер 56

7. Рислинг 72 + 1.20 <0.01

Ананас 55

8. Секрет 65 +0.94 <0.01

Шкипер 55

9. Секрет 65 +1.08 <0.01

Ананас 55

10. Шкипер 56 +0.16 >0.05

Ананас 55

Было проведено по 5 повторов для каждой группы экспериментов

В трех случаях (группы 1, 5, 10) разница в оплодотворяющей способности спермы между быками колебалась в пределах 1-7%, и разница в концентрации всплывших спермиев была низкой, 0.08-0.20 млн/мл.

Эти наблюдения дают основание заключить, что разница в концентрации всплывших спермиев в пределах 1 млн/мл и более может быть достаточно объективным показателем прогнозирования оплодотворяющей способности семени быков в условиях in vivo.

3.3. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ И ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ ВНЕ ОРГАНИЗМА ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

3.3.1. Получение телят после пересадки полученных in vitro эмбрионов

К тому времени, когда были получены первые морулы и бластоцисты из оплодотворенных вне организма ооцитов крупного рогатого скота, техника трансплантации полученных in vivo эмбрионов уже успешно применялась на практике. Было установлено, что приживляемость эмбрионов после трансплантации зависит от многих факторов. Например, наиболее эффективна пересадка эмбрионов в рог матки со стороны яичника с желтым телом и в верхушку рога матки по сравнению с ее основанием. Однако существенным фактором является и квалификация техника по пересадке эмбрионов. Стадия развития эмбрионов во время нехирургической пересадки также влияет на успех операции. Большинство авторов придерживаются мнения о том, что трансплантация эмбрионов более эффективна через 5-6 дней после начала охоты (Seidel G.F., 1981). Результаты пересадки эмбрионов в значительной мере зависят от синхронности в сроках проявления охоты у реципиента и возраста эмбриона. У крупного рогатого скота максимальное число стельностей получали после синхронной пересадки полученных in vivo эмбрионов.

Поэтому нами был использован весь арсенал знаний для разработки данной технологии в отношении эмбрионов, полученных вне организма. Результативность пересадки служила и показателем полноценности полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота с использованием предложенных нами приемов. Эмбрионы 7-8-дневного возраста на стадии поздней морулы и бластоцисты пересаживали в хозяйствах Московской области (Агрофирма "Ямская", "Барыбино") коровам и телкам-реципиентам на стадии полового цикла, соответствующей возрасту эмбриона (0 дней), на 1-2 суток (+1,+2 дня) раньше возраста эмбриона или на одни сутки (-1) позднее возраста эмбриона (таблица 8). Проведена 91 пересадка полученных in vitro эмбрионов, в том числе 21 эмбрион 7-дневного и 70 эмбрионов - 8-дневного возраста.

При этом наблюдали тенденцию повышения приживляемости эмбрионов, если трансплантация реципиенту была проведена на стадии полового цикла, которая совпадала с возрастом эмбриона (12.5 -17.4%) или

отставала на одни сутки (18.2-50.0%) по сравнению с пересадкой эмбрионов в возрасте, опережающем на 1-2 сутки стадию полового цикла (7,1-11,8%).

Таблица 8. Результативность трансплантации эмбрионов в зависимости от стадии полового цикла реципиента и возраста эмбриона

Возраст эмбриона по отношению к суткам полового цикла реципиента, сутки Число пересадок на сутки цикла Получено телят

7-е 8-е на 7-е сутки на 8-е сутки

n % n %

+2 - 17 - - 2 11.8

+1 2 28 - - 2 7.1

0 8 23 1 12.5 4 17.4

-1 11 2 2 18.2 1 50.0

Этот факт, очевидно, связан с запаздыванием развития эмбриона в условиях in vitro, и как следствие, неспособностью его дальнейшего полноценного развития. Аналогичные предположения выдвигали и зарубежные исследователи (Lee C.N. et al., 1996).

3.3.2. Получение телят после пересадки замороженно-оттаянных полученных in vitro эмбрионов

С развитием метода трансплантации эмбрионов, а также способов синхронизации охоты необходимость содержания большого числа реципиентов на одной стадии полового цикла с донором потеряла свою актуальность в связи с необходимостью международного обмена эмбрионами, но при условии разработки эффективной технологии долгосрочно хранения эмбриологического материала. И технология глубоко замораживания решила эту задачу.

Согласно литературным данным не существует единого мнения по наиболее эффективному использованию определенного агента в качестве криопротектора для замораживания полученных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота. Поэтому нами было изучено влияние двух наиболее используемых криопротекторов - глицерина и этиленгликоля, на жизнеспособность эмбрионов после замораживания и оттаивания.

В опытах использовались 7-8-дневные бластоцисты крупного рогатого скота, которые после введения криопротектора подвергались замораживанию, а затем оттаиванию и культивированию вне организма на монослое эпителиальных клеток яйцевода коров. Использование в качестве криопротектора глицерина при замораживании не обеспечило сохранения жизнеспособности бластоцист крупного рогатого скота (в опытах было

использовано 30 эмбрионов). Применение того же режима замораживания с этиленгликолем обеспечило сохранение жизнеспособности у 41,0% бластоцист (43 из 111). При дальнейшем культивировании замороженных и оттаянных бластоцист на монослое эпителиальных клеток яйцевода коровы 12,0% бластоцист вылупились.

Наиболее объективным критерием полноценности замороженно-оттаянных эмбрионов, полученных вне организма, является их приживляемость после пересадки реципиенту. В связи с тем, что существуют определенные трудности при трансплантации замороженных и оттаянных эмбрионов, полученных вне организма, нами было проведено ряд экспериментов по изучению этой возможности. Для трансплантации телкам-реципиентам были отобраны замороженные и оттаянные 7 и 8 - суточные бластоцисты. Из 21-го пересаженного замороженного и оттаянного восьмисуточного эмбриона ни один не прижился, в то время как из 16-ти пересаженных семисуточных замороженных и оттаянных эмбрионов было получено два теленка (12,5%). Таким образом, замороженные и оттаянные полученные вне организма эмбрионы способны развиваться в организме реципиента, хотя эффективность приживляемости в этих первых экспериментах была еще низкой.

На следующем этапе было проведено четыре широкомасштабных эксперимента (таблица 9) по трансплантации эмбрионов в различных хозяйствах России замороженно-оттаянных семисуточных бластоцист, полученных из оплодотворенных вне организма ооцитов крупного рогатого скота.

Таблица 9. Эффективность трансплантации полученных вне организма замороженно-оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота

Название хозяйства Число Число Получено телят

эмбрионов реципиентов

n %

П/3 «Масловский», Воронежская обл. 19 19 7 36.8

ОПХ Северо-Кулундинской опытной 16 16 1 6.3

станции

ОПХ «Чистое» Орен-

бургского института 26 26 5 19.2

мясного скотоводства

ОПХ «Экспериментальное», Оренбургская 26 26 3 11.5

обл.

Итого 87 87 16 18.4

В порядке совместных исследований, эмбрионы были заморожены и доставлены из Германии в жидком азоте. Как видно из таблицы 9,

эффективность трансплантации изменялась в пределах 6,3-36,8% в зависимости от того, в каком хозяйстве проводился эксперимент. Как и предполагалось, жизнеспособность замороженных полученных in vitro эмбрионов была ниже, чем у незамороженных, так как у последних эффективность приживляемости в среднем составляла в это время 50%. Однако, результаты пересадок в племзаводе "Масловский" Воронежской области (36,8% стельностей) показали, что при наличии полноценных реципиентов возможна эффективная пересадка на коммерческой основе замороженно-оттаянных полученных вне организма эмбрионов, если учесть, что их стоимость в несколько раз меньше, чем полученных in vivo.

3.4. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ

3.4.1. Получение трансгенных кроликов, в геном которых интегрирован ген гормона роста человека

Трансгенные кролики были получены методом микроинъекции клонированного гена гормона роста человека в пронуклеусы зигот. Ген соматотропина человека вводился в составе векторной конструкции pMTSV, содержащей промотор и энхансер гена МТ, а также участки сплайсинга и полиаденилирования РНК из ранней области вируса SV 40. Хромосомную ДНК выделяли из образцов отдельных тканей у 44 родившихся после трансплантации животных и определяли в ней методом блот-гибридизации по Саузерну наличие плазмиды с геном гормона роста человека. У трех кроликов была зафиксирована интеграция чужеродного гена - у двух только в печени и у одного только в сперме.

С целью проверки экспрессии введенного гена кровь 44 животных анализировалась радиоиммунологическим методом на присутствие гормона роста человека. У пяти кроликов, в том числе и у всех с выявленной интеграцией, чужеродный белок присутствовал в сыворотке крови. Так как, интеграция рекомбинантной ДНК анализировалась не во всех органах животного, а только в печени, селезенке, сердце, кишечнике, ухе и сперме, то было выявлено еще два кролика, у которых был обнаружен чужеродный белок, секретируемый, очевидно, каким-то другим органом. Следовательно, учитывая данные по экспрессии гена гормона роста человека, можно заключить, что эффективность получения трансгенных кроликов составила 11,4% от числа родившихся потомков. Примерно такая же эффективность (12,8%) наблюдалась и у зарубежных исследователей при получении трансгенных кроликов (Hammer R.E. et al., 1985).

У кролика № 44 копии гена гормона роста человека соединялись при интеграции в виде тандема, ориентируясь по принципу "голова к хвосту". Такое же расположение копий этого и других интегрированных генов наблюдалось и у трансгенных мышей и свиней (Hammer R.E. et al., 1984;

Pursel V.G. et al., 1987). Было определено, что у кролика № 44 встроилось 150-200 копий рекомбинантных генов на клетку, такое же число копий и даже больше по литературным данным, наблюдалось у трансгенных мышей, свиней, овец, кроликов (Hammer R.E. et al., 1985). У кроликов № 36 и № 45 были обнаружены множественные перестройки плазмидной ДНК, появившиеся при интеграции. Перестройки генных конструкций - явление нередкое при анализе трансгенов, они описаны у трансгенных мышей и овец (Stewart T.A. et al., 1982).

Нами впервые была исследована динамика экспрессии гена гормона роста человека у трансгенных кроликов. На первом месяце жизни продукции чужеродного белка ни у одного из трансгенных животных обнаружить не удалось. Только на третьем месяце были зафиксированы определяемые уровни гормона роста человека у пяти кроликов (таблица 10).

У кролика № 36 уровень чужеродного белка оставался невысоким, хотя и увеличивался с возрастом, у кроликов № 41 и № 44 наблюдалась аналогичная картина, однако максимальная концентрация гормона достигала высокого уровня 37,8 нг/мкл и 29,1 нг/мкл, соответственно. У кроликов № 43 и № 45 до начала 4-го месяца жизни концентрация гормона роста человека возрастала, а к концу 4-го месяца вновь снизилась. Максимальная концентрация соматотропина человека в крови трансгенных животных была зафиксирована у кролика № 43 - 68,7 нг/мл. Аналогичные всплески уровней гормона роста человека наблюдались и у трансгенных свиней (Bolt D.J. et al., 1986).

Таблица 10. Динамика экспрессии гена гормона роста человека у трансгенных кроликов

Номера кроликов Концентрация крови гормона роста человека (нг/мл) в возрасте (дни) Число копий гена гормона роста на геном

25-28 52-53 58-59 65-66 97-98 120

Збх 0 0.7* 1.1* 8.8* 0.2

41 0 1.0 0.9 1.1 37.8

43 0 0.2 0.2 0.6 68.7 5.1

44х 0 0.2 0.6 0.8 1.9 29.1 150-200

45х 0 0.2 0.1 0.6 6.1 0.1 1

* - у кролика № 36 кровь анализировалась в возрасте 61,69 и 103 дня, соответственно х - кролики, у которых установлена интеграция

Плазмида, вводимая в пронуклеус зиготы кроликов, содержала промотор МТ гена мыши. Было показано, что этот промотор способствует экспрессии структурных генов при их совместном введении в хромосомную ДНК мышей (Впп81ег Я.Ь. et а1., 1981). Более того, МТ промотор позволял осуществить регуляцию экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных. Так, при добавлении солей кадмия в крови трансгенных мышей значительно

повышался уровень чужеродного белка (Palmiteг R.D. et а1., 1983).

В целях повышения уровня экспрессии гена соматотропина опытным кроликам в возрасте около 2-х месяцев добавляли в питьевую воду в течение двух недель соли цинка. Пробы крови отбирали три раза, однако значительного повышения продукции гормона обнаружено не было, хотя в это время впервые были зафиксированы определяемые уровни гормона роста человека. Инъекции соли кадмия вызвали возрастание концентрации чужеродного белка только у одного (№44) из 3-х трансгенных кроликов. У этого животного интеграция генетического материала произошла без заметных перестроек, и, возможно, поэтому в ответ на введение тяжелых металлов наблюдалось возрастание уровня гормона роста человека в крови.

Несмотря на большие различия в аминокислотном составе гормон роста человека по сравнению с собственным гормоном роста вызывал у отдельных трансгенных мышей увеличение массы их тела почти в два раза, в то время как у трансгенных свиней подобного увеличения массы тела не наблюдалось (Ригее1 У.О. et а1., 1987). Следовательно, необходимо было установить, влияет ли гормон роста человека на скорость роста трансгенных кроликов. Оказалось, что ни одно из трансгенных животных не обладало повышенной массой по сравнению с кроликами, пронуклеусы которых также инъецировались плазмидной ДНК, но в их крови не было чужеродного белка. Отсутствие повышенной живой массы у трансгенных кроликов в отличие от трансгенных мышей, возможно, связано с тем обстоятельством, что в используемых линиях мышей не велась предварительная селекция по скорости роста, в то время как используемые в экспериментах кролики были отобраны из популяций, в которых уже в течение десятилетий велась селекция по оптимизации параметров роста.

3.4.2. Получение трансгенных кроликов из зигот, инъецированных кольцевыми формами плазмид PGMA и ppSNEO с геном асРНК против аденовируса человека

В качестве объекта исследования был выбран хорошо изученный аденовирус человека (ЛёЫ5) и его Е1А область генома, выполняющая регуляторную роль в развитии вирусной инфекции, и имеющая значительную гомологию с Е1А областью аденовирусов крупного рогатого скота. Были созданы конструкции асРНК против Е1А области ЛёЫ5, векторами для экспрессии которых служили плазмиды рр8КЕО и РОМА. Первый вектор был сконструирован на основе дефектного вируса лейкоза мышей Молони, а второй генно-инженерным путем с регулируемым промотором МТ гена мыши.

В результате проведенных экспериментов было получено три трансгенных кролика - один при введении плазмиды РОМА (таблица И) и два - с плазмидой рр8КЕО. Число трансгенных потомков с кольцевыми формами плазмид РОМА и рр8КЕО было невысоким, и составило,

соответственно, 6,7% и 10,0% от числа рожденных потомков, соответственно.

Таблица 11. Получение трансгенного потомства из зигот кролика, инъецированных плазмидой РОМА кольцевой формы

Показатели Общее Процент от числа

число инъециро- транспланти- реци- потом-

ванных рованных пиентов ков

зигот эмбрионов

Трансплантировано 194 81.9 100.0

Использовано

реципиентов 15 100.0

Получено окролов 7 48.0

Получено крольчат 15 6.3 12.9 100.0

в том числе:

развились нормально 6 2.5 3.1 40.0

погибли сразу после рождения 9 3.8 4.6 60.0

из них с интеграцией 1 0.4 0.5 6.7

Плазмидная ДНК, вводимая в виде кольцевой формы, была обнаружена во всех анализируемых тканях трансгенных животных - в ушах, печени, почках и селезенке. Следовательно, интеграция гена, скорее всего, произошла на ранних стадиях, разбития. Хотя не исключено, что на более поздних стадиях развития также происходило встраивание, так как число участков интеграции не менее 3-х, а число и размер фрагментов с интегрированной ДНК не совпадало в клетках внутренних органов и уха. У всех трех трансгенных кроликов плазмидная ДНК имела множественные перестройки, что, вероятно, также могло быть связано с кольцевой формой вводимой плазмиды.

3.4.3. Получение трансгенных кроликов из зигот, инъецированных линейной формой плазмиды РОМА

В дальнейших экспериментах одна из плазмид (РОМА) была лианезирована с помощью рестриктазы Баш Н1, так как по сообщению зарубежных исследователей такое изменение формы плазмиды приводило к увеличению в пять раз частоты получения трансгенных мышей (Бпш1ег Я.Ь. е1а1.,1985).

Действительно, после микроинъекции в пронуклеусы зигот кроликов плазмиды РОМА линейной формы было выявлено пять трансгенных потомков (из 14), что составило 35,7% от числа рожденных кроликов (таблица 12). Таким образом, как и в случае с мышами, изменение формы плазмиды оказало значительное влияние на эффективность интеграции чужеродной ДНК. При этом также более, чем в пять раз увеличилось число

трансгенных кроликов при замене кольцевой формы плазмиды на линейную (Р<0,1). Пока трудно дать точное объяснение этому факту. Вероятно, свободные концы вводимых линейных молекул ДНК являются специфическими сигналами, воздействующими на репарационные ферменты. Ферменты узнают нуклеиновые кислоты на концах плазмидной последовательности и сшивают их с хромосомной ДНК в месте ее случайного разрыва ^аетвеИ Я. Е. Ы а1., 1983).

Ожидалось, что при введении линейной молекулы вероятность генетических перестроек должна уменьшаться, так как такая форма плазмидной ДНК уже готова к интеграции, а разрыв сделан самими исследователями таким образом, чтобы не повредить структурный ген. Действительно, у трех трансгенных кроликов (из 5) при введении линейных молекул плазмиды РОМА была отмечена интактность интегрированного генетического материала.

Таблица 12. Получение трансгенного потомства из зигот кролика, инъецированных плазмидой РОМА линейной формы

Показатели Общее Процент от числа

число инъецирован- транспланти- реципи- потом-

ных зигот рованных эмбрионов ентов ков

Трансплантировано 135 87.7 100.0

Использовано 9 100.0

реципиентов

Получено окролов 3 33.3

Получено крольчат 14 9.1 10.4 100.0

В том числе:

развились 8 5.2 5.9 57.1

нормально

погибли сразу 6 3.9 4.4 42.9

после рождения

из них с 5 3.2 3.7 35.7

интеграцией

На следующем этапе нашей работы было необходимо установить, передается ли интегрированный ген по наследству, для чего две трансгенные самки (№ 17 и № 18) были спарены с контрольными самцам. Оказалось, что крольчихи способны к размножению и принесли полноценное потомство, одна (№ 17) -12 крольчат, а другая (№ 18) - 22 крольчонка (таблица 13). Самки вскармливали своих крольчат, однако в первый месяц наблюдалась высокая гибель молодняка, что, очевидно, связано с большим числом крольчат в этих двух пометах, особенно у крольчихи № 18. В связи с тем, что трансгенные самки были еще молодыми (около 5 месяцев) и имели первую беременность, у них была вызвана суперовуляция с помощью половых гормонов (СЖК и ХГ), что и привело к рождению такого большого числа

потомков.

Таблица 13. Получение первого поколения трансгенных потомков от трансгенных самок

Номер Получено Число проанализированных из них

самки потомков потомков трансгенных

п % от полученных п %

17 12 8 66.7 4 50.0

18 22 6 27.3 1 16.7

всего 34 14 41.2 5 35.7

Обе трансгенные самки передали плазмидную ДНК своим потомкам: крольчиха № 17 - 4 крольчатам из 8 живых, а № 18 -одному крольчонку из 6 живых, у погибших животных хромосомная ДНК не анализировалась.

Важно отметить, что у трансгенных крольчат от самки № 17 сохранилась интактность плазмидной ДНК, также как у их матери, а самка № 18, у которой имелись значительные перестройки чужеродного гена, передала единственному трансгенному потомку также измененную плазмидную ДНК.

3.5. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ОПЛОДОТВОРЕННЫЕ ВНЕ ОРГАНИЗМА ООЦИТЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Получение трансгенного крупного рогатого скота открывает возможности решения целого ряда научных и практических вопросов, а именно, изучение роли различных генов в организме данных животных, получение особей с повышенной продуктивностью, наследственной устойчивостью к разным заболеваниям, а также живых биореакторов, продуцирующих с молоком фармацевтически важные для человека продукты.

Изучению данных вопросов был посвящен следующий раздел нашей работы. Что касается эмбриологического материала, то были использованы оплодотворенные вне организма ооциты крупного рогатого скота, методы получения которых были уже нами отработаны. Известно, что пронуклеусы в зиготе крупного рогатого скота в отличие от мышей и кроликов не видны из-за белково-липидных гранул. Однако уже были предложены способы визуализации пронуклеусов коров и свиней путем центрифугирования или прижизненного окрашивания (Brem G. et al., 1985; Hammer R.E. et al., 1985).

Перед нами была поставлена задача разработки метода эффективной инъекции различных генов, развития инъецированных эмбрионов до стадии

морулы и бластоцисты и пересадки реципиентам с последующим определением интеграции в тканях телят.

3.5.1. Влияние манипуляционных воздействий на развитие вне организма микроинъецированных чужеродным геном зигот крупного рогатого скота до стадии морулы и бластоцисты

Подготовка оплодотворенных вне организма ооцитов крупного рогатого скота к манипуляциям по инъекции экзогенного гена прежде всего связана с подбором режимов их центрифугирования для освобождения от белково-липидных гранул цитоплазмы эмбриона.

Целью нашей работы явилось более точное установление интервалов режима центрифугирования, а также влияние этой процедуры на развитие эмбрионов.

В результате исследований было выявлено, что после центрифугирования при 7000g у 77 оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота из 111 (69,4%) было отмечено освобождение 2/3 объема цитоплазмы от белково-липидных гранул, при 8000g у 45 (75,0%) из 60, при 9000g - у 90 (80,4%) из 112. При оценке дальнейшего развития у 54 (48,6%) из 111 зигот было отмечено дробление после центрифугирования при 7000g, у 31 (51,7%) из 60 при 8000g, у 63 (56,2%) из 112 при 9000g.

На основании полученных результатов были проведены исследования по микроинъекции рекомбинантной ДНК (плазмиды рМТ IFNpi с геном PI-интерферона человека) в пронуклеус зигот крупного рогатого скота, полученных вне организма, и дальнейшему культивированию этих эмбрионов.

В опытах использовали оплодотворенные in vitro яйцеклетки (n =249, 100%, через 15-16 часов после оплодотворения), подвергшиеся обработке ферментом (гиалуронидазой) и центрифугированию при 9000g. После удаления клеток, имеющих картину дегенерации (n=60, .24,1%), оплодотворенные яйцеклетки помещали в специальную камеру и с помощью микроманипулятора в один из визуализированных пронуклеусов (1-ая группа, n=119, 47,8%) вводили 1-2 пкл буферного раствора с геном pi-интерферона человека (таблица 14). Оплодотворенные ооциты, в которых не удалось визуализировать пронуклеусы и провести микроинъекцию, культивировались отдельно (2-ая группа, n=70,28,1%).

Результаты экспериментов показали, что эффективность развития in vitro эмбрионов до морулы и бластоцисты после манипуляционных процедур по сравнению с контролем примерно одинаковая (15.1 и 14.0%, соответственно), однако если учесть то обстоятельство, что в 1-ю группу были отобраны зиготы с видимыми пронуклеусами (119 из 249), то негативное влияние на жизнеспособность эмбрионов указанных процедур очевидно.

Таблица 14. Культивирование in vitro зигот крупного рогатого скота, микроинъекцированных плазмидой с геном pi-интерферона человека

Группы Число оплодотворенных ооцитов из них развились до морулы+ бластоцисты:

n %

1 119 18 15.1

2 70 - -

Контроль 200 28 14.0

Наряду с экспериментом по микроинъекции гена pi-интерферона человека в пронуклеус зигот крупного рогатого скота и культивированию эмбрионов до стадии морулы и бластоцисты были проведены опыты по введению гена асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (БЛВ). Исследования проводились по аналогичной схеме (таблица 15).

Таблица 15. Культивирование in vitro зигот крупного рогатого скота, микроинъекцированных плазмидой с геном ас РНК к вирусу БЛВ

Группы Число оплодотворенных ооцитов из них развились до морулы+ бластоцисты:

n %

1 группа 220 31 14.1

2 группа 373 25 6.7

Контроль 699 102 14.6

По данным Г. Брема с соавторами 14,5% (45/311) яйцеклеток крупного рогатого скота, созревших и оплодотворенных in vitro после микроинъекции, развивались до стадии морулы и бластоцисты. По данным других исследователей (Leopold F. et al., 1987) из числа микроинъецированных оплодотворенных in vitro яйцеклеток крупного рогатого скота только 6% (49/858) развивались до стадии морулы и бластоцисты. Как видно из приведенных данных, результаты наших экспериментов по эффективности развития микроинъецированных оплодотворенных in vitro ооцитов крупного рогатого скота соответствовали уровню или даже чуть превышали достижения зарубежных исследователей.

Немалый интерес представляют собой исследования по изучению синтеза белка в отдельных эмбрионах после микроинъекции чужеродной ДНК. Для сравнения были отобраны шесть одноклеточных микроинъецированных эмбрионов, которым вводился ген pi-интерферона, и четыре одноклеточных интактных эмбриона. Их белковые профили оказались очень похожими, приблизительно одинаковым был и уровень включения метки. Итак, наши эксперименты подтвердили теперь уже на

биохимическом уровне, что зиготы крупного рогатого скота устойчивы к таким воздействиям, как микроинъекция.

3.5.2. Изучение приживляемости полученных in vitro и микроинъецированных эмбрионов крупного рогатого скота геном асРНК против БЛВ после пересадки реципиентам

В предыдущих исследованиях была продемонстрирована возможность развития полученных in vitro и микроинъецированных чужеродными генами зигот крупного рогатого скота до морулы и бластоцисты вне организма, т.е. до стадии развития, пригодной для трансплантации.

Следующим этапом в определении полноценности и жизнеспособности полученных in vitro и микроинъецированных эмбрионов стало изучение эффективности их приживляемости после пересадки реципиентам.

С этой целью инъецировали геном асРНК против БЛВ оплодотворенные in vitro ооциты крупного рогатого скота и трансплантировали реципиентам. В результате трансплантации 12 морул и бластоцист (по одному эмбриону каждому реципиенту) получено две беременных телки и два живых теленка -бычок и телочка. При этом после пересадки трех эмбрионов на стадии морулы беременность наступила у одной телки, т.е. в 33,3% случаев, а после пересадки 9 бластоцист беременность наблюдалась также только в одном случае, что составило 11,1%. Разницу в приживляемости эмбрионов, пересаженных на стадии морулы и бластоцисты трудно интерпритировать, ввиду малого числа животных в эксперименте.

Несмотря на низкий процент приживляемости (16,6%) после пересадки полученных in vitro микроинъецированных эмбрионов крупного рогатого скота, можно с полной определенностью заключить, что проведенный комплекс микроманипуляций с эмбрионами крупного рогатого скота, а именно, дозревание и оплодотворение ооцитов вне организма, микроинъекция генной конструкции, культивирование

микроинъецированных зигот до стадии морулы и бластоцисты, получение приплода после нехирургической пересадки этих эмбрионов, позволил вплотную подойти к проблеме получения трансгенного крупного рогатого скота. Хотя по результатам анализа в тканях двух новорожденных телят интеграции гена асРНК против БЛВ обнаружить не удалось.

3.6. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ПЕРВИЧНЫЕ ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КУР

Не менее интересным объектом для использования в качестве трансгена является курица. Рекомбинантные белки с яйцом кур могут быть получены значительно быстрее и с меньшими затратами, чем с молоком коз или коров. Короткий генеративный период у кур позволяет получать продуктивных птиц уже через 7 месяцев от момента оплодотворения яйца до

снесения его потомком. По расчетным данным производство 1 грамма рекомбинантного белка в молочной железе оценивается в сумме около 100 долларов, а использование для этих целей куриных яйц позволяет снизить затраты до 10-25 центов.

В связи с тем, что традиционные методы введения чужеродных генов путем микроинъекции гена в пронуклеус зиготы кур мало эффективны и крайне трудоемки, получение трансгенной птицы связано с разработкой технологии выделения бластодермальных и ППК из гонад ранних эмбрионов и манипуляций с этими клетками.

В наших исследованиях изучались методы введения генных конструкций в эмбрионы кур путем инъекции последних в зародышевой диск, кровяное русло зародыша, а также переноса трасфецированных бластодермальных клетокв зародышевый диск реципиента или гонадных трасфецированных ППК в кровяное русло зародыша.

3.6.1. Изучение оптимальной стадии развития эмбрионов кур для эффективной трансфекции ППК чужеродным геном

Известно, что ППК кур, выделенные из гонад на 6-е сутки инкубации, морфологически отличны от окружающих соматических клеток благодаря наличию более крупных размеров и хорошо различимых в инвертированном микроскопе блестящих гранул гликогена и желтка (2аееапаШ Б. et а1., 1990). Эти клетки также относят по их характеристикам к эмбриональным стволовым (В8) и половым (ВО) клеткам (Нап 1.У. et а1, 2002).

С целью выявления наиболее удобной стадии развития эмбриона кур для эффективной трансфекции ППК чужеродными генами впервые были проведены исследования по подсчету и идентификации гонадных ППК с 6-го по 9-ый дни инкубации эмбрионов. Нами было показано, что ППК, выделенные из эмбрионов на 7-ой и 8-ой дни инкубации, сохраняли морфологические и гистохимические (ШИК-реакция на гликоген) особенности ППК, выделенных на 6-е сутки. Число ППК на эмбрион возрастало в зависимости от стадии развития и составляло 1200 клеток на 6-е сутки инкубации; 3380 на 7-е сутки инкубации, 1120 у самок и 2010 у самцов на 8-е сутки инкубации (таблица 16). Доля ППК по отношению к соматическим клеткам на 7-ой день инкубации также была больше, чем на 6-ой день инкубации (2.5 и 4%, соответственно). Уменьшение числа ППК на 8-е сутки инкубации, очевидно, связано с потерей гоноцитами гранул гликогена, а значит, и с невозможностью их морфологической идентификации.

В соответствии с нашими наблюдениями (таблица 17) значительное снижение содержания гликогена в ППК происходило на 8-ой день инкубации. Так, доля ШИК-положительных клеток составляла 2.3% на 7-ой

Таблица 16. Динамика соотношения числа IIIIК в гонадах на 6-8 дни инкубации эмбрионов кур

Сроки инкубации, сутки Число гонадных клеток на эмбрион Число ППК на эмбрион % ППК в клеточной суспензии

б 4.8x10 "±0.72x10 1200±162(5) 2.5

7 8.5х10"±1.22х10*(5) 3380±281(5) 4.0

8 Самец-10.5х10 '±1.45x10 '(3) Самка-5.2х10 4±0.81х10 4(3) 2010±215(3) 1120*150(3) 1.9 2.2

В скобках указано количество эмбрионов

день инкубации, а к 8-му дню уменьшалась почти в четыре раза до 0.6% (р<0.05). Уменьшение запасов гликогена может быть связано с подготовкой гоноцитов к активной пролиферации, которая наступает на 8-11 день развития эмбриона (Romanoff А., 1960). Если предположить, что содержание гликогена может служить показателем способности этих клеток к миграции, то, скорее всего, следует использовать данные клетки в качестве донорских для получения химер не позднее 7-го дня инкубации эмбрионов.

Таблица 17. Динамика распределения ШИК-положительных III 1К в зависимости от сроков инкубации куриных эмбрионов

Сроки инкубации, сутки Число обследованных гонаоных клеток после окрашивания Доля ШИК-положительных клеток от общего количества гонадных клеток, (%)

всего ШИК-положительных

6 2280 (8) 36 1.61

7 1610(7) 34 2.3 2

8 1170(5) 8 0.63

9 1180(5) 7 0.5

В скобках указано количество эмбрионов

Р12<0.1 Р,'<0.05

При культивировании in vitro ППК, выделенные из эмбрионов на 7-е сутки инкубации, уже через неделю образовывали колонии из 5-8-ми сравнительно однородных клеток, тогда как колонии ППК, выделенные из эмбрионов на 6-е сутки инкубации, содержали всего 3-4 клетки, часть из которых имела тенденцию к перерождению. После 7-ми суточного культивирования ППК, выделенные из 7-ми дневных эмбрионов, также оказались ШИК-положительными. Таким образом, можно предположить, что ППК гонад куриц на 7-е сутки инкубации более удобный объект для получения как химер, в том числе и трансгенных, так и для создания

долгосрочных культур с целью их стабильной трансфекции чужеродным геном.

Далее была изучена эффективность трансфекции с помощью липофекции геном бактериальной Р-галактозидазы под CMV промотором культуры гонадных клеток. Согласно нашим данным эффективность такой трансфекции составила 30% от общего числа клеток, включая и стромальные, при этом из четырех проинъецированных 2.5-дневных эмбрионов суспензией трансфецированных гонадных клеток после 3-х суток инкубации у одного эмбриона (в одной из гонад) была обнаружена экспрессия встроенного гена в виде 10-12 окрашенных кластеров клеток.

3.6.2. Трансфекция in vitro культуры бластодермальных клеток и инъекция трансфецированных клеток реципиенту

Были изучены параметры трансфекции геном бактериальной р-галактозидазы под CMV промотором культуры бластодермальных клеток, которые также, как и ППК, относят к предшественникам половых клеток кур. Выделенные из зародышевого диска клетки были диссоциированы в трипсине и обработаны плазмидой, содержащей ген бактериальной р-галактозидазы (0,4-0,5 мкг гена на лунку) с использованием набора для липофекции UNIFECTIN-56™. Затем клетки культивировали в 96-луночном планшете в течение суток.

Согласно данным таблицы 18 наибольший процент (5,4-7.1%) трансфекции был получен при использовании от 2700 до 5400 клеток на лунку. Для изучения влияния концентрации гена на эффективность трансфекции бластодермальные клетки инкубировали с 0,2; 0.5 и 1,0 мкг гена на лунку при оптимальной плотности от 2500 до 5400 клеток. Оказалось, что концентрация гена влияет на эффективность трансфекции. Так при концентрации гена 0,2 и 0,5 мкг на лунку, процент трансфекции составлял 3,9-4,9%, тогда как при концентрации ДНК 1 мкг на лунку эффективность трансфекции снижалась и составляла 1,1-3,1%.

Таблица 18. Эффективность трансфекции бластодермальных клеток в зависимости от их концентрации

Число клеток налунку Число экспрессирующих клеток на лунку Соотношение экспрессирующих клеток к общему количеству клеток влунке Эффективность трансфекции, (%)

1300 0;14 1:93 1,1

2700 141;183 1 19;1:15 6,0

3000 204;207;213;232 1 15;1:14;1:14;1:13 7,1

4000 186;246 1 22;1:16 5,4

5400 249;396 1 22;1:14 6,0

7000 53;154 1 132;1:45 1,5

В связи с тем обстоятельством, что при выделении бластодермальных клеток желток яйца не удается удалить полностью, было проверено влияние желтка на эффективность трансфекции клеток. Оказалось, что при оптимальной концентрации гена 0,5 мкг и плотности клеток 3700 клеток на лунку эффективность трансфекции бластодермальных клеток с добавлением желтка уменьшалась в 2,5 раза, т.е. желток снижал показатели трансфекции.

С целью выяснения вопроса о влиянии на эффективность трансфекции соотношения липофектанта к гену были выбраны, соответственно, следующие соотношения: 2:1; 3:1; 5:1. При выделении бластодермальные клетки были тщательно отмыты от желтка. Как видно из таблицы 19 эффективность трансфекции при использовании данных соотношений примерно одинаковая и составляет 20-24%, хотя наблюдается тенденция к увеличению эффективности трансфекции при использовании соотношения 3:1.

Таблица 19. Влияние соотношения гена к липофектанту на эффективность трансфекции бластодермальных клеток

Число Концен- Соотноше- Число Соотношение Эффектив-

клеток трация ние экспрессируемых экспрессирую- ность

на гена липофектанта клеток ши\ клеток к трансфек-

лунку к гену общему числу ции

2000 0,2 5:1 411;464 1:4,9; 1:4,3 22,1

2400 0,5 2:1 404;583 1:5,9; 1:4,1 20,6

3:1 560;616 1:4,3; 1:3,9 24,5

5:1 547;549 1:4,4 22,9

Далее в бластодиск эмбрионов-реципиентов (стадия X) были инъецированы трансфецированные в культуре бластодермальные клетки. Каждому эмбриону вводили по 4-6 мкл суспензии (400-800 бластодермальных клеток). Перед инъекцией реципиентов стерилизовали. Было проведено два вида стерилизации УФ и радиоактивное облучение (X-гау, 600 рад) при различной продолжительности экспозиции. Эмбрионы извлекали из яйца на 3-й день и оценивали стадию развития. От 50 до 80% эмбрионов достигали к этому сроку 14-16 стадий развития, остальные останавливались в развитии, тогда как в контроле 100% эмбрионов находились на этих стадиях. Как видно из таблицы 20, из развившихся проинъецированных эмбрионов, облученных УФ в течение 75 мин, 180 мин, 210 мин у 2, 3 и 2 эмбрионов наблюдалась экспрессия бактериального гена галактозидазы, соответственно. В эмбрионах большинство клеток, экспрессирующих ген галактозидазы, находились во внеэмбриональной ткани, в области над головой, кровеносных сосудах, а также в теле эмбриона и в хвостовой части.

При экспозиции реципиентов в УФ-лучах в течение 240 мин, а также при радиоактивном облучении, экспрессия гена не была обнаружена, тогда

как процент продолживших свое развитие эмбрионов (67-80%, соответственно) практически не отличался от такового при более короткой экспозиции в УФ.

Таблица 20. Экспрессия гена Р-галактозидазы в 3-х дневных эмбрионах кур

Стерилизация Число эмбрионов Число Эффектив-

всего из них развилось до эмбрионов с ность

стадии 14-16 экспрессией трансфекции

тип время, мин n % гена [%]

УФ 75 10 5 50 2 40

УФ 180 15 10 67 3 30

УФ 210 8 4 50 2 25

УФ 240 6 4 67 - -

Х-гау 7 16 13 81,3 - -

600 рад

Контроль - 7 7 100 - -

3.6.3. Экспрессия гена Р-галактозидазы в 3,5-х и 6,5-дневных эмбрионах после инъекции in vivo ДНК:липосомального комплекса

Трансфекция ППК in vivo проводилась путем инъекции комплекса ДНК:липофектант в аорту 2,5-дневным эмбрионам. В наших экспериментах был проинъецирован ген бактериальной Р-галактозидазы с липофектантом в дорзальную аорту 2.5-дневным эмбрионам. На следующий день после инъекции из 4-х эмбрионов, инъецированных раствором комплекса с липофектантом в соотношении 1:1.6, развилось 3 (75%), и у всех 3-х эмбрионов после вскрытия проявлялась экспрессия гена галактозидазы. При инъекции комплекса в соотношении гена к липофектанту 1:3, соответственно, у 4-х из 5-ти эмбрионов наблюдалась экспрессия гена (80%). Экспрессирующие кластеры клеток располагались в области сердца и кровеносных сосудов.

При вскрытии яиц, инкубированных в течение 3-х суток после инъекции, наблюдался высокий процент остановившихся в развитии эмбрионов (80-100%), поэтому окраске X-gal подвергались как продолжившие развитие эмбрионы, так и остановившиеся. При инъекции 5-ти реципиентам раствора ДНК:липосомального комлекса в соотношении 1:1.6 развился один эмбрион (20%), а экспрессия наблюдалась только у 2-х остановившихся эмбрионов (50%). Из. 4-х эмбрионов, инъецированных раствором комплекса гена к липофектанту в соотношении 1:3, у всех наблюдалась экспрессия (100%), однако эти эмбрионы остановились в развитии. Полагаем, что данный метод имеет перспективы, но при условии подбора соответствующего промотора и повышения процента выживаемости

эмбрионов после процедуры инъекции.

Дальнейшие исследования в данном направлении могут быть направлены на получение потомства после инъекции гена и изучение характера наследования чужеродного гена в потомстве, а также на повышение эффективности трансфекции, что может быть достигнуто за счет подбора регуляторных частей генных конструкций и предварительной селекции трансфецированных клеток в культуре.

6. ВЫВОДЫ

1. Незрелые ооциты крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма завершают стадию созревания через 18 часов и в течение последующих 6 часов сохраняют свои потенции к in vitro оплодотворению, что подтверждается результатами их дробления и дальнейшего развития до стадии бластоцисты (70.9% и 75.9% дробящихся зародышей, 25.6% и 24.2% бластоцист от числа ооцитов, созревших в течение 18 и 24 часов, соответственно).

2. При проведении процедуры swim-up концентрация всплывших сперматозоидов быка не меняется после 5 минут инкубации. При смене сред (среда меняется пять раз над одной и той же дозой спермы) число всплывших живчиков также не меняется. При этом мужские гаметы из каждой порции среды способны к полноценному оплодотворению ооцитов крупного рогатого скота in vitro.

3. Модифицированный способ проведения процедуры swim-up позволяет примерно в 5 раз повысить эффективность использования спермы быка при оплодотворении яйцеклеток крупного рогатого скота in vitro.

4. Концентрация всплывших подвижных сперматозоидов быка при процедуре swim-up коррелирует с оплодотворяющей способностью спермы быка по результатам искусственного осеменения. Поэтому определение концентрации всплывших подвижных сперматозоидов быка в условиях in vitro при сравнении с образцом спермы быка с известной оплодотворяющей способностью по результатам искусственного осеменения обеспечивает прогнозирование оплодотворяющей способности спермы быков.

5. Двух кратное введение сперматозоидов в среду для оплодотворения с 2-х часовым интервалом увеличивает способность развития эмбрионов до стадии бластоцисты более чем в три раза по сравнению с контролем.

6. Ранние эмбрионы крупного рогатого скота характеризуется способностью утилизовать из среды культивирования метаболические компоненты соматических клеток и сыворотки крови других видов. До стадии бластоцисты полноценное развитие может поддерживаться сывороткой крови северных оленей или эпителиальными клетками яйцевода кролика, что свидетельствует об отсутствии реакции видоспецифичности на указанные компоненты среды.

7. Эмбрионы крупного рогатого скота развиваются in vitro до стадии бластоцисты при добавлении в среду культивирования (М-199) инактивированной сыворотки крупного рогатого скота примерно в 4 раза более эффективно, чем неинактивированной (23.1% против 6.7%).

8. Наблюдаются значительные индивидуальные различия между коровами-донорами по эффективности оплодотворения ооцитов in vitro и дальнейшему развитию эмбрионов. Процент дробящихся яйцеклеток к числу осемененных ооцитов составляет в среднем 36.7% с колебаниями от 22.2% до 72.7% у отдельных животных. Стадии морулы и бластоцисты достигают в среднем 2.4± 1.8 эмбрионов на корову с колебаниями от 0 до 5 эмбрионов (38.0 % от числа дробящихся эмбрионов).

9. Полноценность полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота с использованием предложенных нами приемов подтверждена получением потомства после их нехирургической пересадки: при этом отмечена тенденция повышения приживляемости эмбрионов, пересаженных реципиентам в дни цикла, совпадающих с возрастом эмбриона (16.1%) или отстающих на один день (23.1%) по сравнению с пересадкой эмбрионов в возрасте, опережающем на 1-2 дня стадию полового цикла (7.1-11.8%).

10. Качественные изменения в биосинтезе белка у полученных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота, также как и у полученных in vivo, происходят на 8-ми клеточной стадии и стадии бластоцисты. Интенсивность синтеза белка у полученных in vitro эмбрионов, в отличие от полученных in vivo, не уменьшается от стадии зиготы к 8-ми клеточной стадии. Соотношение включения метки у полученных in vitro зигот по сравнению с бластоцистами составляет 3:1, а у полученных in vivo - 6:1.

11. Приживляемость эмбрионов кроликов с инъецированными генами гормона роста человека составила 12.3%, а с генами асРНК против аденовируса человека - 12.9%-18.7%. Линейная форма плазмиды PGMA с геном асРНК против аденовируса человека более эффективно интегрируется в хромосомную ДНК зигот кроликов по сравнению с кольцевой: у 35.7% животных от числа родившихся потомков при инъекции линейной формы плазмиды был обнаружен чужеродный ген против 6.7% животных при инъекции кольцевой формы (РОЛ). В результате спаривания трансгенных самок с геном асРНК против аденовируса человека с нетрансгенными самцами в первом поколении наследование чужеродного гена наблюдалось в среднем у 35.7% потомков.

12. Концентрация соматотропина человека в крови трансгенных кроликов различается у разных животных и зависит от их возраста.

13. Развитие оплодотворенных in vitro инъецированных чужеродными генами интерферона человека и асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота) ооцитов крупного рогатого скота при дальнейшем

культивировании in vitro до стадии морулы и бластоцисты составляет 15.1 и 14.1%, соответственно. Полноценность микроинъецированных эмбрионов подтверждена получением потомства после их нехирургической пересадки.

14. Наиболее оптимальным сроком сбора гонадных IIIIК в качестве донорских клеток для получения химер и трансгенных кур является 7-ой день инкубации. Это обусловлено наибольшим числом клеток на эмбрион (3380 клеток) на 7-ой день инкубации по сравнению с 6-м (1200 клеток) и с 8-м (1120 клеток), максимальным содержанием гликогена в клетках по сравнению со значительным его снижением на 8-ой день инкубации, что служит показателем подготовки их к миграции, и лучшей способностью образовывать колонии при культивировании in vitro по сравнению с 6-м днем инкубации.

15. Определены параметры для эффективной трансфекции бластодермальных клеток кур чужеродным геном in vitro, включая число клеток на лунку, концентрация гена, соотношение липофектанта к гену. Достигнута высокая эффективность трансфекции ППК после инъекции комплекса ДНК: липофектант в аорту 2.5-дневных эмбрионов. Однако высокий процент остановившихся в развитии эмбрионов на 3-й день инкубации после инъекции требует дальнейшей разработки метода.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В целях рационального использования рабочего времени исследователя проводить процедуру созревания ооцитов крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма в течение 18-24 часов. При этом выход эмбрионов на стадии бластоцисты составляет около 25%.

2. Использовать в системе культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro соматические клетки и сыворотку крови других видов, например, кролика или северного оленя, чтобы предотвратить вероятность переноса вирусов с белковыми или клеточными компонентами от животных гомологичного вида.

3. Для повышения эффективности оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота вне организма использовать метод 2-х кратного введения сперматозоидов в среду для оплодотворения с 2-х часовым интервалом.

4. Осуществлять пересадку оплодотворенных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота реципиентам, дни цикла которых совпадают или отстают на один день от возраста эмбриона.

5. Для увеличения эффективности использования спермы быка при оплодотворении яйцеклеток крупного рогатого скота in vitro использовать разработанный нами модифицированный способ отбора подвижных сперматозоидов.

6. Использовать метод диагностики оплодотворяющей способности спермы быков путем сравнительного изучения всплывания подвижных сперматозоидов от разных быков в условиях in vitro.

7. Замораживание в азоте оплодотворенных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота проводить с применением этиленгликоля.

8. Для создания химер, в том числе и трансгенных, и получения долгосрочных культур с целью их стабильной трансфекции чужеродным геном использовать ППК гонад куриц на 7-е сутки инкубации.

9. При трансфекции бластодермальных клеток с помощью липофекции придерживаться следующих параметров: 2500-5700 клеток на лунку 96-луночной плашки, 0,2-0,5 мкг гена на лунку, соотношение гена к липофектанту: 1:2, 1:3 или 1:5. В данной системе эффективность трансфекции составляет 20-24%.

Содержание диссертации опубликовано в 30 научных работах, основными из них являются:

1. Ениколопов Г.Н., Захарченко В.И., Гращук М.А., Сураева Н.М., Георгиев ГЛ., Тинаева Е.А., Рубцов П.М., Скрябин К.Г., Баев А.А., Эрнст Л.К. Получение трансгенных кроликов, содержащих и экспрессирующих ген соматотропина человека // Доклады Академии Наук СССР.- 1988.- Т. 299, №5.-С. 1246-1249.

2. Эрнст Л.К., Тихоненко Т.И., Сураева Н.М., Мирошниченко О.И. Получение трансгенного потомства от кроликов с геном антисмысловой РНК против EIA области ДНК аденовируса AdH5 // Доклады ВАСХНИЛ.-1989.-№ 6.- С. 40-42.

3. Осидзе Д.Ф., Эрнст Л.К., Советкин СВ., Прокофьева Е.С., Сураева Н.М. Основа питательных сред для вымывания, культивирования и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных // Авторское свидетельство №1578859 от 15.03.1990.

4. Ernst L.K., Zakcharhenko V.I., Suraeva N.M. Transgenic rabbits with antisense RNA gene targered at adenovirus H5 // Theriogenology.- 1991.-V.35(5).-P. 1257-1271.

5. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Сураева Н.М., Лагутина И.С., Кесян А.З. Удавленникова Н.Н., Долгохатский А.И., Краснов А.В., Майер П.К. Созревание ооцитов, оплодотворение и дальнейшее развитие эмбрионов крупного рогатого скота вне организма после пересадки реципиентам // Вестник сельскохозяйственных наук.- 1992.- №5-б.-С. 99-104.

6. Prokofiev M.I., Ernst L.K., Suraeva N.M., Lagutina I.S., Udavlennikova N.N., Kesyan A.Z., Dolgohatskiy A.I. Bovine oocyte maturation, fertilization and further development in vitro and after transfer into recipient //Theriogenology. -1992.-V.38.-P.461-469.

7. Сураева Н.М., Кесян А.З., Прокофьев М.И. Оптимальные приемы капацитации спермы быков для оплодотворения яйцеклеток // Вестник РАСХН.- 1993.-№4.-С49-51.

8. Дагданова А.В., Сураева Н.М., Лагутина И.С., Захарченко В.И. Оптимальные приемы визуализации пронуклеусов у оплодотворенных ин витро зигот крупного рогатого скота // Вестник РАСХН.- 1994.- №6.-С53-55.

9. Сураева Н.М., Кесян А.З., Воронина И.М., Удавленникова Н.Н., Пономарева М.С., Прокофьев М.И., Суханов ВА. Особенности биосинтеза белка у оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота// Вестник РАСХН.-1994. -№1.-С. 55-58.

10.Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Дьяконов Л.П., Дагданова А.В., Сураева Н.М., Захарченко В.И., Лагутина И.С. Микроинъекция чужеродных генов, ответственных за устойчивость организма к инфекционным заболеваниям// Вестник РАСХН.-1995.- №1.-С.5б-58.

11.Сураева Н.М. и Трухан Р.С. Некоторые методологические приемы введения чужеродного гена в зиготы животных // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов.-1995.- №1,- С. 227-244.

12.Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Захарченко В.И., Сураева Н.М., Мирошниченко СИ., Бондарук В.В., Лагутина И.С, Мезина М.Н.. Получение трансгенных кроликов инъекцией генов в зиготы// Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. -1995.- №1.- С 111-127.

13.Сураева Н.М., Прокофьев М.И., Тарабрина СВ. Способ экспресс-диагностики оплодотворяющей способности спермы быков// Положительное решение о выделении патента на изобретение от 30.01.1996 г., заявка №95109519/15 (016259). Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знаком. 1997, №20.

14.Сураева Н.М. О получении телят из дозревших и оплодотворенных in vitro микроинъецированных зигот с геном ас РНК против вируса лейкоза крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология.- 1997.- №4.-С.85-88.

15.Сураева Н.М., Удавленникова Н.Н., Газина СВ., Лагутина И.С, Трошко Д.В., Прокофьев М.И. Оплодотворяемость спермы различных быков // Зоотехния.-1997.- № 7.- С.26-28.

16.Сураева Н.М. Развитие эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты при их двухразовом оплодотворении вне организма // Аграрная наука. -1997.- №5.-С 28-29.

17.Сураева Н. М., Толмазова А.Г. Выделение и характеристика первичных половых клеток из гонад 6-9- дневных эмбрионов кур с целью совершенствования метода получения трансгенной птицы // Доклады РАСХН.- 2004.- №2.-С29-32.

18. Сураева Н. М. Современные подходы к проблеме введения чужеродных генов в половые клетки животных // Российский биотеравпевтический журнал.- 2004.- № 4.-С.29-38.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохнна РАМН Подписано в печать 1 8.03.05 Заказ № 168 Тираж 100 экз

1311

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Сураева, Наталья Михайловна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ МЕТОДА ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ВНЕ ОРГАНИЗМА

2.1.1. Извлечение ооцитов.

2.1.2. Созревание вне организма ооцитов домашнего скота.

2.1.3. Оплодотворение ооцитов вне организма.

2.1.3.1. Капацитация сперматозоидов.

2.1.3.2. Оплодотворение в яйцеводах другого вида.

2.1.3.3. Оплодотворение in vitro.

2.1.4. Влияние факторов культуральной среды на развитие оплодотворенных in vitro ооцитов крупного рогатого скота до стадии морулы и бластоцисты.

2.1.5. Пересадка полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота.

2.2. МЕТАБОЛИЗМ РАННИХ ЭМБРИОНОВ ЖИВОТНЫХ.

2.3. ХРАНЕНИЕ И КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ООЦИТОВ И ЭМБРИОНОВ ЖИВОТНЫХ.

2.4. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ.

2.4.1. Методы введения клонированных генов в геном животных.

2.4.1.1. Использование ретровирусов в качестве векторов.

2.4.1.2. Трансфекция эмбриональных стволовых клеток и получение трансгенных химер.

2.4.1.3. Микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы.

2.4.1.4. Трансфекция бластодермальных и первичных половых клеток кур.

2.4.1.5. Пересадка ядер из трансфецированных соматических клеток.

2.4.1.6. Использование сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК.

2.4.2. Особенности интеграции чужеродных генов в организме животных.

2.4.3. Экспрессия чужеродных генов у трансгенных животных.

2.4.3.1. Экспрессия клонированных генов, интегрированных с помощью ретровирусных векторов.

2.4.3.2. Регуляция экспрессии трансгена, интегрированного в составе невирусных плазмид

2.4.3.2.1. Использование тканеспецифичных промоторов.

2.4.3.2.2. Использование промоторов, активирующих экспрессию в ответ на внешние стимулы.

2.5. ТРАНСГЕННЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ.

2.5.1. Экспрессия трансгена в кровь.

2.5.2. Экспрессия трансгенов в молоко.

2.5.3. Трансгенные животные - устойчивые к инфекционным заболеваниям.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Биологический материал и содержание подопытных животных.

3.2. Отбор проб тканей у подопытных кроликов.

3.2. Выделение и культивирование половых клеток и эмбрионов.

3.2.1. Получение зигот кролика.

3.2.2. Извлечение ооцитов крупного рогатого скота, их созревание оплодотворение и культивирование ранних эмбрионов in vitro.

3.2.4 Выделение и культивирование гонадных примордиальных и бластодермальных зародышевых клеток птиц.

3.3. Гистохимические методы окрашивания эмбриональных клеток.

3.3.1. Окрашивание эмбрионов кролика и крупного рогатого скота лакмоидом.

3.3.2. ШИК-реакция для выявления гликогена в гонадных ППК.

3.3.3. Окраска эмбриональных клеток кур по Романовскому-Лейшману.

3.4. Метаболическое мечение общих белков эмбрионов крупного рогатого скота.

3.5. Замораживание и трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота.

3.6. Микроинъекция и трансфекция чужеродных генов в эмбриональные клетки животных.

3.6.1. Микроинъекция чужеродного гена в зиготы кроликов и трансплантация инъецированных эмбрионов реципиенту.

3.6.2. Микроинъекция чужеродного гена в зиготы крупного рогатого скота.

3.6.3. Трансфекция бластодермальных и гонадных клеток геном Р-галактозидазы с помощью липофекции.

3.6.4. Инъекция раствора гена или трансфецированных бластодермальных клеток в эмбрионы кур.

3.7. Идентификация интеграции инъецированных генов с помощью блот-анализа у кроликов.

3.8. Методы определения экспрессии встроенного гена.

3.8.1. Радиоиммунологический метод определения гормона роста человека.

3.8.2. Определение экзогенной Р-галактозидазы в клетках эмбриона кур.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ИХ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И РАННИХ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ ЭМБРИОНОВ ВНЕ ОРГАНИЗМА.

4.1.1.Созревание ооцитов.

4.1.1.1. Влияние добавок в культуральную среду для созревания ооцитов в виде сыворотки крови различных видов животных.

4.1.1.2. Влияние продолжительности созревания ооцитов крупного рогатого скота на их дальнейшее развитие после оплодотворения in vitro.

4.1.1.3. Влияние индивидуальных различий коров-доноров на эффективность развития полученных от них ооцитов после оплодотворения в условиях in vitro.

4.1.2. Оплодотворение ооцитов вне организма животного.

4.1.2.1. Влияние продолжительности процедуры отбора подвижных сперматозоидов на эффективность оплодотворения яйцеклеток вне организма.

4.1.3. Культивирование полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота.

4.1.3.1. Культивирование вне организма эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты с инактивированной и неинактивированной сывороткой крови крупного рогатого скота.

4.1.3.2. Влияние сыворотки крови эстральной коровы на развитие эмбрионов крупного рогатого скота вне организма.

4.1.3.3. Использование монослоя эпителиальных клеток яйцевода кролика для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота.

4.1.4. Изучение метаболизма белка в ранних эмбрионах крупного рогатого скота.

4.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОПЛОДОТВОРЯЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ СПЕРМЫ БЫКА В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ.

4.2.1. Изучение индивидуальных различий в оплодотворяющей способности спермы быков в условиях in vitro.

4.2.2. Изучение взаимосвязи между показателями оплодотворяющей способности спермы быков по результатам искусственного осеменения и концентрацией подвижных спермиев в процессе их отбора in vitro.

4.3.1. Получение телят после пересадки полученных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота.

4.3.2. Криоконсервация полученных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота.

4.4.1. Получение трансгенных кроликов, в геном которых интегрирован ген гормона роста человека.

4.4.2. Интеграция гена асРНК против аденовируса человека у трансгенных кроликов.

4.5. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ОПЛОДОТВОРЕННЫЕ ВНЕ ОРГАНИЗМА ООЦИТЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА.

4.5.1. Влияние манипуляционных воздействий на развитие вне организма микроинъецированных чужеродным геном зигот крупного рогатого скота до стадии морулы и бластоцисты.

4.5.2. Изучение приживляемости оплодотворенных in vitro и микроинъецированных эмбрионов крупного рогатого скота геном асРНК против БЛВ после пересадки реципиентам.

4.6. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ПЕРВИЧНЫЕ ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КУР.

4.6.1. Трансфекция in vitro культуры гонадных ППК и инъекция трансфецированных клеток в 2,5-дневные эмбрионы.

4.5.2. Трансфекция in vitro культуры бластодермальных клеток.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.'.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эмбриологические и генетические аспекты создания и размножения сельскохозяйственных животных с новыми фенотипическими свойствами"

Актуальность работы определяется тем, что благодаря развитию биотехнологических методов и технологий введения ДНК в хромосомы зародыша появилась возможность создания трансгенных животных в качестве моделей для фундаментальных и прикладных научных исследований, или как новые источники для получения фармацевтических продуктов и органов для трансплантации человеку.

В XX веке бурное развитие методов селекции привело к значительному улучшению многих хозяйственных признаков домашнего скота. Потенциал крупномасшатбной селекции далеко не исчерпан и в наше время. Однако возникновение и развитие биотехнологии на базе клеточной и генной инженерии открыли новые возможности в этой области.

Вначале искусственное осеменение, замораживание спермы, затем трансплантация ранних эмбрионов позволили значительно сократить период создания и размножения новых пород. На следующем этапе были разработаны методы получения, созревания и оплодотворения in vitro ооцитов, которые открыли новые перспективы для ускоренной селекции, путем более полного использования генетического материала самок.

Известно, что число ооцитов, овулирующих спонтанно во время эструса, составляет лишь незначительную часть от тысяч половых клеток в яичниках при рождении самок домашнего скота. Остальные дегенерируют внутри яичника, что обычно называют атрезией. Перед исследователями всегда вставал вопрос, является ли нерешаемой проблема перехода большинства ооцитов внутри антральных фолликулов в атретическое состояние или значительная часть ооцитов могут избежать атрезии путем определенных обработок в процессе оплодотворения in vitro. Достижения эмбриологической науки во время проведения настоящих исследований, да и в настоящее время обеспечивают возобновление мейотического созревания у большинства ооцитов, извлекаемых из антральных фолликулов, со стадии диакинеза до метафазы II, однако эффективность их развития после оплодотворения in vitro остается еще более низкой по сравнению с оплодотворенными in vivo. Прогресс в этом направлении требует накопления данных фундаментальных исследований процесса созревания, оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов на ранних стадиях развития in vitro, а также информации о влиянии разных факторов на развитие этих фундаментальных функций ооцитов и ранних эмбрионов.

Развитие молекулярной генетики привело к разработке методов, открывающих животноводству новые перспективы, так • как впервые появляется возможность работы на генном уровне (выделение, секвенирование, рекомбинация и транспорт отдельных генов). Применение таких молекулярно-генетических технологий в исследованиях в области животноводства пока не связано с большими успехами, однако уже сейчас можно прогнозировать, что в будущем традиционные методы разведения животных будут дополнены, а отчасти и заменены новыми технологиями.

Цель таких исследований заключается в получении трансгенных особей, у которых введенные гены путем синтеза чужеродных белков оказывают влияние на определенные свойства животного или придают организму определенные качества. В случае передачи трансгена по наследству возможно создание трансгенных линий.

При получении трансгенных организмов стремятся к тому, чтобы трансген содержался во всех соматических и, прежде всего, в половых клетках животного. Для этого не существует другого способа, кроме введения генов как можно на более ранних стадиях развития организма. Наиболее подходящим объектом является раннее эмбриональное развитие, а точнее стадия, когда будущий организм представлен в виде одной клетки - оплодотворенной яйцеклетки или зиготы. Некоторые методы переноса генов требуют использования более поздних эмбриональных стадий - морул или бластоцист, но в этом случае получаются, как правило, трансгенные химеры.

В последние годы введение чужеродных генов в геном мышей стала рутинной процедурой (294, 372, 304, 44, 53, 407). С помощью этой модели удалось достичь значительных успехов в изучении механизма интеграции, экспрессии и наследования введенных генов, и тем самым вплотную подойти к получению трансгенных сельскохозяйственных животных.

Однако работы на домашних животных еще не достигли заметных практических успехов. Пока трудно получить трансгенных сельскохозяйственных животных, так как геном этих животных, в отличие от мышей, изучен недостаточно, а значит трудно подобрать те генные конструкции, которые бы эффективно интегрировались, а их экспрессия была бы контролируемой. Не менее существенна и высокая стоимость получения трансгенных сельскохозяйственных животных.' К примеру, стоимость получения одной трансгенной особи крупного рогатого скота составляет 500 тыс. американских долларов (402, 403).

Одними из первых были получены трансгены с экзогенным геном гормона роста. Известно, что соматотропин играет ключевую роль в обменных процессах. Так, при введении коровам гипофизарного гормона роста человека удается повысить уровень молочной продуктивности на 1015% (250). Помимо увеличения надоев, после инъекции гормона роста (гипофизарного или микробного происхождения) молодняку различных сельскохозяйственных животных их скорость роста и качество мясной продукции возрастали (23, 400, 399).

Клонированные гены гормона роста крысы и человека были введены в зиготы мышей (293, 294). У родившихся трансгенных мышей в крови был обнаружен гормон роста крысы и человека, соответственно. Причем, у некоторых животных концентрация чужеродного белка достигала уровня нескольких миллиграммов в мл, часть животных отличались ускоренным ростом, их масса вдвое превышала массу контрольных мышей. В этих опытах было показано влияние введенного чужеродного гена гормона роста на фенотип мышей, что представляло научный и практический интерес в случае получения такого же эффекта на сельскохозяйственных животных.

Получение животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, является еще одним важным направлением в трансгенезе. За последние десятилетия существенно расширились представления о вирусной природе целого ряда заболеваний сельскохозяйственных животных. Подробно изучены механизмы репродукции некоторых вирусов. Генетическое регулирование активности вирусных генов может позволить выводить формы животных с повышенной устойчивостью к вирусным заболеваниям. Большой интерес в этом отношении представляют антисмысловые РНК (асРНК).

По экспериментальным данным асРНК эффективно подавляет репродукцию некоторых вирусов в культуре клеток (175, 381). Можно полагать, что продукция трансгенными животными таких продуктов, как асРНК к вирусам, привела бы к значительному повышению устойчивости животных ко многим заболеваниям. Например, аденовирусы поражают широкий спектр хозяев - от человека до рыб, сюда же попадают и основные виды сельскохозяйственных животных - крупный рогатый скот, овцы, птицы. Аденовирусы вызывают тяжелые заболевания глаз, дыхательных органов и пищеварительного тракта у домашнего скота, а у птиц резко снижается яичная продуктивность. Поэтому разработка методов борьбы с аденовирусными заболеваниями через устойчивых к вирусам трансгенных животных имеет существенное хозяйственное значение и представляет собой новый подход к проблеме защиты сельскохозяйственных животных от этой инфекции.

Еще недостаточно данных о характере интеграции генов с вирусными асРНК, неизвестно, какие факторы влияют на эффективность встраивания плазмид с асРНК, каков характер передачи интегрированной чужеродной ДНК в потомстве, активны ли гены асРНК, например, в организме кролика, можно ли эти гены использовать, для введения в геном других сельскохозяйственных животных.

Целью работы являлось изучение молекулярно-клеточных механизмов эмбриогенеза домашних животных, разработка и усовершенствование биотехнологических методов их размножения и генетической трансформации путем введения чужеродных генов. В задачи исследований входило:

4. Усовершенствовать методы инъекции чужеродных генов в оплодотворенные вне организма зиготы крупного рогатого скота.

6. Получить трансгенных кроликов и изучить взаимосвязь между структурой генных конструкций, эффективностью и характером их интеграции у кроликов, а также их потомков.

7. Усовершенствовать методы получения трансгенных химерных эмбрионов кур.

Научная новизна:

1. Впервые показано, что для созревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro достаточно 18 часов, а не 22-24 часа, как было установлено ранее.

2. На основании полученных данных о наличии аналогии в процессе продвижения сперматозоидов быка по половым путям самки и их всплывании в процедуре «swim-up» было сделано предположение, что. концентрация мужских гамет в шейке матки остается постоянной (пока они жизнеспособны) за счет той силы, которая поддерживает динамическое равновесие между концентрированной малоподвижной (в цервикальном канале) и подвижной разбавленной (в матке) спермой.

3. Впервые показано, что оценка качества спермы быков по числу подвижных сперматозоидов в процедуре «swim-up» может быть объективным критерием прогнозирования оплодотворяющей способности спермы.

4. Исходя из, концепции процесса оплодотворения у млекопитающих, выдвинутой академиком JI.K. Миловановым, выявленное нами повышение эффективности развития эмбрионов крупного рогатого скота после 2-х кратного добавления спермы к ооцитам в условиях in vitro по сравнению с однократным, может быть результатом более эффективного освобождения яйцеклеток от клеток яйценосного бугорка, лучшей избирательностью проникновения сперматозоидов в яйцеклетку и, как следствие, малой вероятностью возникновения эпигинитических нарушений у эмбрионов.

5. Показана возможность успешного культивирования in vitro ранних эмбрионов крупного рогатого скота на монослое эпителиальных клеток и с сывороткой крови других видов животных, в частности, клеток яйцевода кролика и эстральной сывороткой северных оленей.

6. Выявлены существенные различия в биосинтезе белка между полученными in vitro и in vivo эмбрионами, свидетельствующие о задержке в переходе синтетической активности с материнской мРНК на мРНК собственного генома у полученных in vitro эмбрионов. i

7. В результате проведенных экспериментов впервые в нашей стране получены трансгенные кролики с геном гормона роста человека, а также выявлена экспрессия этого гена.

8. Получены впервые трансгенные животные (кролики) с геном асРНК против аденовируса человека. Показана возможность получения потомства от этих трансгенов и наследования введенного гена у потомков. Установлено, что линейная форма плазмиды по сравнению с кольцевой в пять раз более эффективнее встраивается в геном кролика.

9. Определены оптимальные режимы скорости центрифугирования для визуализации пронуклеусов у зигот у крупного рогатого скота.

10. Процедура микроинъекции чужеродного гена в зиготу крупного рогатого скота после предварительного центрифугирования не останавливала развитие ранних эмбрионов, а также не влияла на уровень и качественный состав синтезируемых белков, как сразу же после инъекции, так и при последующем развитии.

11. Определены оптимальные концентрации чужеродного гена и плотность эмбриональных клеток кур (бластодермальных и гонадных первичных половых клеток (ППК)) в культуре с целью достижения, с их помощью высокого уровня трансфекции эмбрионов.

На защиту выносятся положения:

3. Новый метод диагностики оплодотворяющей способности спермы быков условиях in vitro основан на измерении концентрации подвижных живчиков быка при проведении процедуры «swim-up».

4. Полноценное развитие полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота может поддерживаться сывороткой крови северных оленей или эпителиальными клетками яйцевода кролика. Использование же биологической жидкости другого вида может в значительней степени ограничить перенос определенных инфекций.

5. Эффективность развития эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты после 2-х кратного добавления сперматозоидов была более чем в три раза выше, чем после однократного.

6. Существуют значительные индивидуальные различия между коровами-донорами по эффективности оплодотворения in vitro ооцитов и дальнейшему развитию эмбрионов.

9. Эффективность получения трансгенных кроликов от числа рожденных потомков, в пронуклеусы зигот которых инъецирован ген гормона роста человека, составляет 10.9%. Экспрессия гена гормона роста человека в сыворотке крови трансгенных кроликов была зафиксирована только в возрасте трех месяцев.

10. Максимальная эффективность получения трансгенных кроликов от числа рожденных потомков продемонстрирована при инъекции гена асРНК против аденовируса человека и составила 35.7%. Линейная форма плазмиды PGMA с геном асРНК по сравнению с кольцевой более эффективно интегрируется в хромосомную ДНК зигот кроликов. Наследование чужеродного гена наблюдается у 5 из 14 кроликов первого поколения.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сураева, Наталья Михайловна

6. ВЫВОДЫ

1. Незрелые ооциты крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма завершают стадию созревания через 18 часов и в течение последующих 6 часов ■ сохраняют свои потенции к in vitro оплодотворению, что подтверждается результатами их дробления и дальнейшего развития до стадии бластоцисты (70.9% и 75.9% дробящихся зародышей, 25.6% и 24.2% бластоцист от числа ооцитов, созревших в течение 18 и 24 часов, соответственно).

6. Ранние эмбрионы крупного рогатого скота характеризуется способностью утилизовать из среды культивирования метаболические компоненты соматических клеток и сыворотки крови других видов. До стадии бластоцисты полноценное развитие может поддерживаться сывороткой крови северных оленей или эпителиальными клетками яйцевода кролика, что свидетельствует об. отсутствии реакции видоспецифичности на указанные компоненты среды.

8. Наблюдаются значительные индивидуальные различия между коровами-донорами по эффективности оплодотворения ооцитов in vitro. Процент дробящихся яйцеклеток к числу осемененных ооцитов составляет в среднем 36.7% с колебаниями от 22.2% до 72.7% у отдельных животных. Стадии морулы и бластоцисты достигают в среднем 2.4±1.8 эмбрионов на корову с колебаниями от 0 до 5 эмбрионов (38.0 % от числа дробящихся эмбрионов).

Интенсивность синтеза белка у полученных in vitro эмбрионов, в отличие от полученных in vivo, не уменьшается от стадии зиготы к 8-ми клеточной стадии. Соотношение включения метки у полученных in vitro зигот по сравнению с бластоцистами составляет 3:1, а у полученных in vivo-6:1.

13. Развитие оплодотворенных in vitro инъецированных чужеродными генами (|31-интерферона человека и асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота) ооцитов крупного рогатого скота при дальнейшем культивировании in vitro до стадии морулы и бластоцисты составляет 15.1 и 14.1%, соответственно. Полноценность микроинъецированных эмбрионов подтверждена получением потомства после их нехирургической пересадки.

14. Наиболее оптимальным сроком сбора гонадных ППК в качестве донорских клеток для получения химер и трансгенных кур является 7-ой день инкубации. Это обусловлено наибольшим числом клеток на эмбрион (3380 клеток) на 7-ой день инкубации по сравнению с 6-м (1200 клеток) и с 8-м (1120 клеток), максимальным содержанием гликогена в клетках по сравнению со значительным его снижением на 8-ой день инкубации, что служит показателем подготовки их к миграции, и лучшей способностью образовывать колонии при культивировании in vitro по сравнению с 6-м днем инкубации.

Определены параметры для эффективной трансфекции бластодермальных клеток кур чужеродным геном in vitro, включая число клкток на лунку, концентрация гена, соотношение липофектанта к гену. Достигнута высокая эффективность трансфекции ППК после инъекции комплекса ДНК:липофектант в аорту 2.5-дневных эмбрионов. Однако высокий процент остановившихся в развитии эмбрионов на 3-й день инкубации после инъекции требует дальнейшей разработки метода.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

2. Использовать в системе культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro соматические клетки и сыворотку крови других видов, например, кролика или северного оленя, чтобы предотвратить вероятность переноса вирусов с белковыми илц клеточными компонентами от животных гомологичного вида.

8. Для создания химер, в том числе и трансгенных, и получения долгосрочных культур с целью их стабильной трансфекции чужеродным геном использовать ППК гонад кур на 7-е сутки инкубации.

При трансфекции бластодермальных клеток с помощью липофекции придерживаться следующих параметров: 2500-5700 клеток на лунку 96-луночной плашки,. 0,2-0,5 мкг гена на лунку, соотношение гена к липофектанту: 1:2, 1:3 или 1;5. В данной системе эффективность трансфекции составляет 20-24%.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Сураева, Наталья Михайловна, Родники

1. Альтштейн А.Д. Семейство Papavaviridae // В кн.: Общая и частная вирусология. М. Медицина.- 1982.- С.463-477.

2. Брем Г., Хорст К, Щтранцингер Г. // Экспериментальная генетика в животноводстве. Москва. -1995.

3. Зиновьева Н.А., Эрнст J1.K., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве. // ВИЖ. -2000/-С. 128.

4. Лария С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмбелл Э. // Общая вирусология. М.1. Мир.- 1981/-С.680.

5. Милованов В.К. // Биология воспроизведения и искусственное осеменениеживотных. Москва. -1962. -С.345.

6. Прокофьев М.И. Достижения и использование эмбриологии в животноводстве. // Международный сельскохозяйственный журнал.-1987.- № 3. С.43-46.

7. Прокофьев М.И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных // Ленинград. Наука.- 1983.-С.264.

8. Прокофьев М.И., Букреев Ю.М., Лагутина И.С. и др. Культивирование ооцитов коровы с использованием половых гормонов. // Бюллетень ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных. -1986.- № 4 (83). С.45-48.

9. Сураева Н.М., Толмазова А.Г. Выделение и характеристика первичных половых клеток из гонад 6-9- дневных эмбрионов кур с целью совершенствования метода получения трансгенных птиц. // Доклады РАСХН.-2004.-№2.-С. 29-32.

10. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Прокофьева Е.С. и др. Получение телят из дозревших и оплодотворенных вне организма коровы фолликулярных ооцитов // Вестник сельскохозяйственной науки. -1987.-№ 6.-С.82-87.

11. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Прокофьева Е.С., Черных В.Я., ЛимоновI

12. В.И., Ильина Т.А., Игнатьева Е.А., Хорошилова Т.В., Захаров А.В. и др. Дозревание и оплодотворение ооцитов коровы вне организма и последующее их развитие в яйцеводе кролика. // Доклады ВАСХНИЛ. — 1985,-№ 10.-С.23-26.

13. Эрнст Л.К., Голубев А.К., Макарова З.Н. и др. Получение потомства из дозревшей и оплодотворенной in vitro яйцеклетки коровы. // Вестник сельскохозяйственной науки,- 1983.-№7.-С. 30-37.

14. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. // Колос. Москва. -1995,

15. Щелкунов С.Н. Клонирование генов // Новосибирск. Наука. -1986.-С.182 .

16. Agca Y., Liu J., Peter A.T. Cryoprotectant and water permeability of immature and in vitro matured bovine oocytes. // Theriogenology.- 1997.- .V.47.-P. 340

17. Anderson G.B., Cupps P.T., Drost V., Horton M.B., Wright P.W. Jr. Induction in beef heifers by bilateral embryo transfer // J. of Animal Science. -1978.-V.46.-№2.-P. 449-452.

18. Anderson G.B. Embryonic stem cells in agricultural species. //In: Murray, J.D., Anderson G.B., Oberbaur A.M., McGloughlin M.M. (Eds.), Transgenic Animals in Agriculture. CABI Publ., New York, USA. -1999.-P. 57-66.

19. Ara R., Lanzone A., Miceli F., Mastrandrea V., Caruso A., Mancuso S., Canipari R. Growth hormone induces in vitro maturation of follicle and cumulus-enclosed rat oocytes. //Mol. Cell Endocrinol.- 1994. V.106.-P. 207-212.

20. Armstrong D.G. The feed compounder. // Proc. 6-th intern. Symp. Ruminan Physiology.-1985.-V.5.-P.16-19.

21. Arav A. and Zeron Y. Vitrification of bovine oocytes using modified minimum drop size technique. // Theriogenology.- 1997.-V.47.-P. 341.

22. Arav A., Yavin S., Zeron Y., Natan D., Dekel I., Gacitua H- New trends in gamete's cryopreservation. //Mol. Cell. Endocrinology.- 2002.-V.187.-P.77-81.

23. Assey R.J., Hyttel P, Greve T, Purwantara B. Oocyte morphology in dominant and subordinate follicles. // Mol. Reprod. Dev.- 1994,-V. 37.-P. 334-335. . •

24. Avarill R.L. W., Adams C.E., Powson L.E.A. Transfer mammalian ova between species. //Nature.- 1955.-V.176.- № 4473.-P. 167-168.

25. Babinet C.A. Simplified method for mouse blastocyst injection. // Exp. Cell. Res.-1980.-V.130.-P.15-19.

26. Babinet C. and Bordenave G.R. Chimaeric rabbits from immunosurgically prepared inner-cell-mass transplantation. //J. Embryol. Exp.Morph.-1980.-V.60.-P.429-440.

27. Ball G.D., Leibfried M.L., Lenz R.W., Ax R.L., Bavister B.D. and First N.L. Factors affecting successful in vitro fertilization of bovine follicular oocytes. // Biol Reprod.- 1983.-V. 28.-P. 717-725.

28. Baltz J.M. Intracellular pH regulation in the early embryo. // BioEssays.т1993.- V.15.-P. 523-530.

29. Bavister B.D. et al. Development of preimplantation embryos of the golden hamster in defined culture medium. // Biol. Reprod.-41983.-V.28.-P. 235-247.

30. Bavister B.D. and Arlotto T. Influence of single amino acids on the development of hamster one-cell embryos in vitro // Mol. Reprod. Dev.-1990.-V.25.-P. 45-51.

31. Bavister B.D. Response to the use of co-culture for embryo development // Hum Reprod. -1993.-V. 8.-P.1152-1162.

32. Bavister B.D. Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts // Hum. Reprod. Update.- 1995.-V.1.-P. 91-148.i

33. Bedford J.M. Limitations of the uterus in the development of the fertilizing ability (capacitation) of spermatozoa. // J. Reprod. Pert. Suppl. -1969.-P. 19-26.

34. Bedford J.M. Sperm capacitation and fertilization in mammals // Biol. Reprod. (suppl.2).-1970.-P. 128-158.

35. Bedford J.M. Sperm transport, capacitation and fertilization // Eds. H. Balin S. Glasur. ExcerptaMedica Amsterdam. In. Reprod. Biol.- 1972.- P. 338-392.

36. Betteridge K.J. and Flechon J.E. The anatomy and physiology of pre-attachment bovine embryos // Theriogenology.-1988.-V.29.-P.155-187.

37. Bevers M.M. et al. Regulation and modulation of oocyte maturation in the bovine // Thenogenology.- 1997.-V.47.-P. 13-22.

38. Biggers J.D., Whittingham D.G. and Donahue R.P. The pattern of energy metabolism in the mouse oocyte and zygote // Prec. Nat. Acad. Sci. -1965.-V.58.-P.560-567.

39. Bishop J.O., Smith P. Mechanism of chromosomal integration of microinjected ,DNA 11 Mol. Biol. Med.- 1989.-V.6.-P. 283-298.

40. Bleil S.D., Wasserman P.M. Sperm-eggs interaction in the mouse. Sequence of events and induction of the acrosome reaction by a zona pellucida glycoprotein // Devel. Biol. -1983.-V.95.-P. 317-324.

41. Boland M.P., Crossby T.F., Cordon J. Induction of twin pregnancy in heifers using a simple non-surgical technique // In. Proc. 8th Intern Congr. Anim. Reprod. Artif. Insem. Krakov. -1976.-V. 3.-P.241-243.

42. Boland M. Use of the rabbit oviduct as a screening tool for the viability of mammalian eggs // Theriogenology.- 1984.-V. 21 .-P. 126-137.

43. Bolt D.J., Pursel V.G., Hammer R., Wall R.J., Palmiter R.D. and Binster R. L.

44. Plasma concentrations of human growth hormone and porcine growth hormoneiin transgenic pigs //J.Anim. Sci.- 1986.-V. 62.-P. 128-133.

45. Bolton V.N., Dades P.G. and Johnson M.N. The relationship between cleavage DNA replications and activation of transcription in the mouse 2-cell embryo // J. Embryol. Exp. Morph. -1984.-V. 79.-P.139-164.

46. Bongso A., Fong C.G., Ng S-C and Ratnam S. The search for improved in vitro systems should not be ignored: embryo co-culture may be one of them // Hum. Reprod.- 1993.-V. 8.- P.l 155-1160.

47. Bosselman R.A., Hsu R.Y., Boggs Т., Hu S., Bruszewski J., Ou S., Kozar L., Martin F., Green C., Jacobsen F. and et al. Germline transmission of exogenous genes in the chicken // Science.- 1989.-V.243.-P.533-535.

48. Boulikas T. Nuclear localization signal peptids for the import of plasmid DNA in gene therapy // Int. J. Oncol. -1997.-V. 10(2).-P. 301-309.

49. Bowen R.A., Reed M.L., Sclmieke A., Seidel Jr. G.E. Stasey A., Thomas W.K. Kajikawa O. Transgenic cattle resulting from biopsied embryos: Expression of c-ski in a transgenic calf// Biol. Reprod. -1994.-V.50.-P. 664-668.

50. Braas, G., Searle, P.F., Slater, N.K., Lyddiatt, A. Strategies for the isolation and purification of retroviral vectors for gene therapy // Bioseparation.- 1996.-V. 6.-№4.-P. 211-228.

51. Braclcett B.G., Oh Y.K., Evans J.F., Danawick W.J. In vitro fertilization of cowova // Theriogenology. -1978.-V.9.-P. 89.

52. Brackett B.G., Bousguet D., Boice M.L., Donawick W.L., Evans M.N., and Dressel M.A. Normal development following in vitro fertilization the cow // Biol. Reprod.-1982.-V. 27.-P. 147-158.

53. Brackett B.C., Keefer C.L., Troop C.G., Danawick W.J., Bennett K.A. Bovine twins resulting from in vitro fertilization // Theriogenology. -1984.-V. 21.- P. 224.

54. Brackett B.G., Zuelke K.A. Analysis of factors involved in the in vitro production of bovine embryos // Theriogenology. -1993.-V. 39.-P. 43-64.

55. Bradley A., Evans M.N., Kaufman M.N. and Robertson E. Formation of germ line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines // Nature. -1984.-V. 309.-P. 255-256.

56. Brazolot C.E., Petitte J.N., Etches, R.J. and Verrinder Gibbins A.M. Efficient transfection of chicken cells by lipofection, and introduction of transfected blastodermal cells into the embryo // Mol. Reprod. And Dev. -1991.-V.30.-P. 304.

57. Brem G., Brenig В., Goodman H.M., Seld R.C., Gfaf F., Kruff B et al. Production of transgenic mice, rabbits and pigs by microinjection into pronucleus 11 Zuchthygiena.-1985.-V.20.-P. 251-252.

58. Brem G., Wanke R., Wolf E. et al. Multiple consequences of human growth hormone expression in transgenic mice // Mol. Biol. Med. -1986. -V.6.-P.531-547.

59. Brem G., Hartl P. High-level expression of prochymosin in the milk of transgenic rabbits // In. Proc.Frontiers of Biotech, in Agriculture Sea of Galilee, Israel.-1991.

60. Brem G., Brenig В., Salmons B. et al. Unerwartete transgene Expression eines gesaeugespezifischen Wachstumshormor Genkonstruktes in dem Bergmaim-Gliazelle der Maus // Tierarztl. Prax.-1991. -V. 19.- P. 1-6.

61. Brem G. Transgenic animals // In. Biol. VCH. -1992.

62. Brinster R.L. The effect of cells transferred into the mouse blastocyst onsubsequent development // J. Exp. Med. -1974. -V. 40. -P. 109-1056.

63. Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E., Yagle M.K., Senear A.W., Warren R. and Palmiter R.D. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice followin injection of a fusion gene into eggs // Cell. -1981. V. 27. -P. 223-231.

64. Brinster R.L., Chen H.Y., Messing A., Dyke T.V., Levine A.J. and Palmiter R.D.Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic braintumors // Cell. -1984. -V.37.-P. 367-379.

65. Brinster R.L., Chen Y.Y., Trumbaner M.F., Yagle M.K. and Palmiter R.D. Factors effecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. -V. 82. P. 4438-4442.

66. Brinster R.L., Allen J.M., Behringer R.R., Gelinas R.E. and Palmiter R.D. Intron increase transcriptional efficiency in transgenic mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA .-1988. V. 85.- P.836-840.

67. Brooadbent P.J. Twinning in beef cattle // British Soc. of Animal Production. -1985.• №10.-P. 155-156.

68. Buchler Th.A., Bruyere Th., Went D.F. et al. Rabbit P-casein promoter direct secretion of human interleikin 2 into the milk of transgenic rabbits // Bio. Tech.-1990. V.8.-P.140-143.

69. Busa W.B., and Nuccitelli R. Metabolic regulation via intracellular Ph //• Am. J. Physiol. -1984.- V.246.- P.409-438.

70. Byskov A.G., Andersen C.Y., Nordholm L., Thogersen H., Guoling X., Wassmann O., Andersen J.V., Guddal E., Roed T. Chemical structure of sterols that activate meiosis // Nature. -1995. -V.374. -P. 559-562.

71. Calareo P.G., McLaren A. Ultrastructural observations of preimplantation stages of the sheep // J. Embryol. Exp. Morph.- 1976.- V.36.- P. 609-622.

72. Carbonneau G., Sirard M.A. Influence of follicular wall on meiotic resumption of bovine oocytes when cultured inside or outside hemi-sections // J. Reprod.• Dev.-1994.-V.40.-P. 125-132.

73. Carlson L., Black D.L., Howe G.R. Oviduct secretion in the cow // J. Reprod.

74. FertiL-1970.- N22.- P.549-552.

75. Carsience, R.S., Clark, M.E., Verrinder Gibbions, A.M., and Etches, R.J. Germline chimeric chiken from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos // Development.- 1993. -V.l 17.- P.669.

76. Chada K., Conctantini F. Specific expression of a foreign beta-globin gene in erythoid cells in transgenic mice // Nature.- 1985. V. 314. -P.377-380.

77. Chada K., Magram J. and Costantini F. An embryonik pattern of expression of human fetal globin gene in transgenic mice //Nature.- 1986.- V.319.- P.685-688.

78. Chang M.C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes // Nature (Lond.).-1951.- V. 168.- P.697-698.

79. Chang M.C. Fertilizating of rabbit ova in vitro // Nature.- 1959. V.l 84.- P.466-467.

80. Chang M.C. Experimental studies of mammalian fertilization // Zoo. Sci.-1984.- №.1.- P.349-364.

81. Chang C.C., Saunders J.A., Chassy B.M., Sowers A.E. Overview of electroporation and electrofusion. In: Chang, C.C., et al. // (Ed.).Guide to electroporation and electrofusion. Academic Press Inc. San Diego. -1992.

82. Cheng W.T.K., Voor R.M. and Polge C. In vitro fertilizftion of pig and sheep oocyte maturetated in vivo and in vitro // Theriogenology.- 1986.-V. 25.- P. 146.

83. Chisholm V. High efficiency gene transfer into mammalian cells // In: Glover, D.M., Hames, B.D.,(Eds.), DNA Cloning 4-a Practical Approach: Mammalian Systems, second ed., IRL Press. -1995. Oxford.

84. Choi Y., Henrard D., Lee I. and Ross S.R. The mouse mammary tymor viruslong terminal repeat directs expression in epithelial and lumphoid cells of different tissue in transgenetic mice //J. Virol. -1987.- V. 61.- P.3013-3019.

85. Chu G., Hayakawa H., Berg P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA // Nucleic Acids Res.- 1987.- V.15.-№3. P.1311-1326.

86. Cibelli J.B., Stise S.L., Golueke P.L., Kane J.J., Jerry J., Blackwell C., Ponce de Leon F.A., Robl J.M. Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem like cells // Nat. Biotechnol. -1998.-V.16.- P. 642646.

87. Clark A.J., Bessos H., Bishop J.O. et.al. Expression of human anti-hemophilic factor ix in the milk of transgenic sheep // Bio/Tech.- 1989.- V.7.- P. 487-492.

88. Clark A.J. Gene expression in the mammary gland of transgenic animals // Biochem. Soc Symp. -1998. V.63.- P. 133-140.

89. Clark A.J., Burl S., Denning C., Dickinson P. Gene targeting in livestock: apreview // Transgenic Research.- 2000.- V. 9.- P.263-275.i 1

90. Clawson R.C. and Domm, L.V. Developmental changes in glicogen content ofprimordial germ cells in chick embrio // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1963.-V.l 12,- P. 533.

91. Cockun S., Sanbuissho A., Lin Y.C. Rikihisa Y. Fertilizabiblity and subsequent developmental ability of bovine oocytes matured containing EGF // Theriogenology.- 1991.- V.36.- P. 485-494.

92. Cockun S., Lin Y.C. Mechanism of action of epidermal growth factor-induced porcine oocyte maturation// Mol. Reprod. Dev. -1994.- V. 42,- P.31'1-317.

93. Cockun S., Lin Y.C. Effects of transforming growth factor-induced porcine oocyte maturation // Mol. Reprod. Dev. -1994.- V. 38.- P.153-159.

94. Colman A. Transcription of DNA's of known sequence after injection into the egge and oocytes of Xenopus Iacvis // Eur J. Biocher. -1975.- V.57.- P.85-96.

95. Constantini F. and Lacy E. Introduction of a rabbit P-globin gene in the mousegerm line // Nature.- 1981.- V.294.- P. 92-94.

96. Constantiny F. and Jaenisch R. Genetic manipulation of the early mammalian embryo // 20 Banbury Report Cold Spring Harbor Laboratory.1985.

97. Covarrubias L., Hishida Y. and Mints B. Early postimplantation embryo lethality due to DNA rearrangemente in a transgenic mouse strain // Proc. Natl. Sci. USA.- 1986.-V.83,-P. 6020-6024.

98. Critser E.S., Leibfied-Rutledre M.L., Eyestone W.H., Northey D.N., First N.L. Acquisition on development al competence during maturation in vitro// Theriogenology. -1986.-V.25.-№ 1.- P.150-155.

99. Critser E.S., Leibfied-Rutledre M.L., First N.L. // Biology of Reproduction.1986.-V.36.-P. 286-290.

100. Crosby J.M., Osborn J.C. Moor R.M. Follicle cell regulation of protein synthesis and developmental competence in sheep oocytes // J. Reprod. Fert.-1981.-V. 62.-P.575-582.

101. Cross P.C. and Brinster R.L. The sensitivity of one-cell mouse embryos to pyruvate and lactate // Exp. Cell. Res.- 1973.- V.77.- P.57-62.

102. Crozet N. Ultrastructural aspects of in vivo fertilization in the cow // Gamete. Res. -1984.-V.10.-P.241-251.

103. Davis B.K. Timing of fertilization in mammals: sperm cholesterol phospholipid ratio as a determinant of the capacitation interval // Proc. Nath. Acad. Sci. USA.-1981.-V.78.-P.7560-7564.

104. Davis B.K. Uterine fluid proteins bind sperm cholesterol during capacitation in the rabbit//Experientia.- 1982.-V.38.- P. 1063-1064.

105. Dieleman S.J., Bevers M.M., Poortman J, van Tol HTM. Steroid and pituitary hormone concentrations in the fluid of preovulatory bovine follicles relative to the peak of LH in the peripheral blood // J. Reprod. Fertil.- 1983.-V.69.- P.641-649.

106. Dieleman S.J., Kruip Th.A.M., Fontijne P., de Jong WHR, van der Weyden

107. G.C. Changes in oestradiol, progesterone and testosterone concentrations in follicular fluid and in the micromorphology of preovulatory bovine follicles relative to the peak of luteinizing hormone // J. Endocrinol.- 1993.-V.97.-P.31-42.i

108. Ding J. Foxcroft G.R. Epidermal growth factor enhances oocyte maturation in pigs // Mol. Reprod. Dev.- 1994.-V.39.- P.30-40.

109. Dobrinsky J.R., Stice S.L., Phillips P.E., Duby R.T., Robl J.M. Development of IVM-IVF bovine embryos following vitrification dilution treatments // Theriogenology.-1992.-V.37.- P.202abstr.

110. Ealy A.D. and Hansen P.J. Induced thermotolerance during early development of murine and bovine embryos // J. Cell. Physiol.- 1994.-V.160.- P. 463-468.

111. Ealy A.D., Howell J.L., Monterroso V.H.,Arechiga C.F., and Hansen P.J.

112. Developmental changes in sensitivity of bovine embryos to heat shock and use ofiantioxidants as thermoprotectants // J. Cell. Physiol.- 1995.-V. 12.- P.67-71.

113. Ebara F. and Fujihara N. Reproductive characteristics of transgenic (TG) chickens carrying an exogenous gene // Asian J. Androl.- 1999.-V.1.- P. 139144.

114. Ebert K.M., Selgrath J.P, Ditullo P. et el. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen acivator in goat milk: generaion of transgenic goat and anakysis of expression // Bio/ Teh. -1991.- V. 9.- P.23.

115. Ephrussi A., Church G.M., Tonewa S. and Cibbert W. Linege-specific interactions of an immunologlobulin enhancer with cellular factors in vitro // Science.-1985.- V.227.- P. 134-140.

116. Ernst L.K., Zaharchenko V.I., Suraeva N.M., Ponomoreva T.I., Miroshnichenko O.I., Prokofiev M.I., Tichonenko T.I. Transgenic rabbits withantisense RNA gene targeted at adenovirus H.5 // Theriogenology. -1991.-V.35.- P.1257-1271.

117. Etches, R.J., Clark, M.E., Toner, A., Liu, G., and Gibbins, A.M. Contribution to somatic and germline lineges of chicken blastodermal cells maintained in culture // Mol. Reprod. Dev. -1996.- V.45.-P.291.

118. Etherton T.D. and Kensinger R.S. Endocrine regulation of fetal and postnatal meat animal growth//J. Anim. Sci.-1984.-V.59.- P.511-517.

119. Evans M.J. and Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature.- 1981.-V. 292.- P.154-156.

120. Evans J.W. and Hollaender A. Genetic engineering of animals // Basic. Life Science.- 1986.-V.37.-P.328.

121. Eyestone .W.H., Northey D.L., Leibfried-Rutledge M.L. Culture of 1-cell bovine embryos in the sheep oviduct // Biol. Reprod. -1985.-V. 32 (suppl.l).-P.100.

122. Eyestone W.H., First N.L. A study of the 8-to 16-cell developmental block in bovine embryos cultured in vitro // Theriogenology.- 1986.-V.25.- P. 152.

123. Eyestone W.H., Vignieri J., First N.L. Co-culture of early bovine embryos with oviductal epithelium //Theriogenology.- 1987.- V.27.- № 1.- P.228-233.

124. Eyestone W.H. et al. Culture of one-cell and two-cell bovine embryos to the blastocyst stage in the ovine oviduct // Theriogenology. -1987.-V.28.- P. 1-7.

125. Eyestone W.H., First N.L. Co-culture of early bovine embryos with oviductal tissue on in conditioned medium// J. Reprod. Fertil.1989, v 85,715-720.

126. Fahning M.L., Schultz R.N. and Graham EF. The free amino acid content of uterine fluid and blood serum in the cow // Reprod. Fertil.-1967.-V.13,- P.229-236.

127. Farin P.W. et al. Transfer of embryos produced in vitro or in vivo I I Theriogenology. -1997.-V. 47.- P.319.

128. Fatehi A.N., Zeinstra E.C., Kooij R.V., Colenbrander В., Bevers M.M. Effect of cumulus cell removal of in vitro matured bovine oocytes prior to in vitro fertilization on subsequent cleavage rate // Theriogenology. -2002.-V.57.- P. 1347-1355,

129. Feigner P.L. Improvements in cationic liposomes for in vivo gene transfer // Hum. Gene Therapy. -1996.-V.7.-№15.- P.1791-1793.

130. Fischer B. and Bavister B.D. Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits // J. Reprod. Fertil.- 1993.-V 99.- P.673-679.

131. Florman H.M., Storey B.T. Mouse gamete interactions. The zona pellucida is the site of the acrosome reaction leading to fertilization in vitro // Devel. Biol.-1982.-V. 91.-P.121-130.

132. Fraser R.A., Carsience R.S., Clark M.F., Etches R.J. and Gibbions A.M.i

133. Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into chimeric chiken embryos // Int. J. Dev. Biol.- 1993.- V.37.- P.381.

134. Frie R.E., Schultz G.A. and Church R.B. Qualitative and quantitative changes in protein synthesis occur at the 8 to 16-cell stage of embryogenesis in the cow //J. Reprod Fertil.- 1989.-V.86.- P.637-641.

135. Fuijmoto Т., Ukeshima A and Kiyofaji R. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo // Anat. Rec. -1976.-V.185.-P.139.

136. Fukui Y, Fukushima M, Ono H. Fertilization and cleavage of bovine follicular oocytes in rabbit reproductive tract after maturation in vitro // J.

137. Reprod. Fertil. -1982.- V. 226.- P.l 15-123.

138. Fukui Y, Fukushima M, Оно H. Fertilization in vitro of bovine oocytes after various sperm procedures // Theriogenology. -1983.-V. 20.- P.651-660.

139. Fukui Y., Ono H. In vitro development to blastocyst of in vitro matured and fertilized bovine oocytes // Vet. Res.- 1988.-V.122.- P.282.

140. Fukui Y and Оно H. Effects of sera, hormones and granulosa cells added to culture medium for in vitro maturation," fertilization, cleavage, and development on bovine oocytes // J. Reprod. Fertil.- 1989.-V. 86.- P.501-506.

141. Fulton S.P. Transgenic production of therapeutics // In biopharmaceutical process economics and optimization. Washington DC: International business communications.-1999.

142. Gandolfi F. and Moor R.M. Stimulation of early embryonic development in the sheep by co-culture with oviduct cells // J. Reprod. Fertil.- 1987.-V.81.-P.23-28.

143. Gardner R.L. Mouse chimaeras obtained by the injection of cell into the blastocyst//Nature.- 1968.- V. 220.- P.596-597.

144. Gardner R.L. and Munro A.J. Successful construction of chimaeric rabbits // Nature. -1974.-V.250.- P. 146-147.

145. Gardner D.K. and Leese H.J. Concentration of nutrients in mouse oviduct fluid and their effect on embryo development and metabolism // J. Reprod. Fertil. -1990.-V. 88.- P. 361- 368.

146. Gautsch J.W. Lack of retrovirus gene expression in teratocarcinoma stem cells in limited to the nucleus // Somat. Cell. Genet.- 1982.-V. 8.- P. 143-149.

147. Goeddel D.V., Heyneker Т., Atrentsen K. Itakura D.G., Yansura J.J. Direct expression in Escherichi coli of a DNA sequence coding for human growth hormone//Nature.- 1979.-V. 81.- P. 544-548.

148. Gong J.G., Bramley T.A., Webb R. The effect of recombinant bovine somatotropin on ovarian follicular growth and development in heifers // J. Reprod. Fertil.-1993.-V.97.-P. 247-254.

149. Gordon M., Daudekar R.V., Bartoszewich W. The surface coat of epididymal ejaculated and capacitated sperm // J. Ultrastruct. Res. -1975.- V. 50.- P. 199-207.

150. Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J., Barbosa J.A. and Ruddle'F.N. Genetic transformation of mouse embryos by microinjections of purified DNA // Proc. Natl. Acad. USA! -1980.-V. 77.- P.7380-7384.

151. Gordon J.W. and Ruddle F.N. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei // Science. -1981.- V. 214.- P.l244-1246.

152. Gordon J.W. Transgenic mice: a new and powerful experimental to mammalian developmental genetics // Developmental Genetics.- 1983.-V. 4.- P. 1-20.

153. Gordon K, Lee E., Vitale I.A., Swith A.E., Westhal H. and Hennighausen L Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk // Bio/Technology. -1987.- V. 5.- P.l 188-1189.

154. Goring D.R., Rossant J., Claroff S., Breitman M.L., Tsui L.C. In situ detection of p-galactosidase in lenses of transgenic mice with a y-crystallin lac z gene // Science. -1987.- V.235.-P.456-458.

155. Gossen M., Freundlieb S., Bender G., Muller G., Hillen W., Bujard H. Trascriptional activation by tetracyclines in mammalian cells // Science. -1995.-V.68.- P. 1766-1769.

156. Grosschedl R., Weaver D., Baltimore D., Conctantini C. Introduction of a mu immunoglobulin gene into the mouse germ line: Specific expression in lymphoid cell and synthesis of functional antibody // Cell.- 1984.- V. 38,- P: 647-658.

157. Grosveld F., Assendelft G.B., Greaves D.R. and Kollias G. Position independent high-level expression of the human-globin gene in transgenic mice // Cell.- 1987.-V. 51.- P. 975-985.

158. Grozet N., Huneau D., Desinedt V., Theron M.C., Szollosi D., Torres S., Sevelec C. In vitro fertilization with normal development in the sheep // Gamete Res. -1987.- V 52.- P. 308-314.

159. Gutierrez-Adan A., Lonergan P., Rizos D., Ward F.A., Boland M.P., Pintado В., Fuente J. de la. Effect of in vitro culture system on the kinetics of blastocystdevelopment and sex ratio of bovine embryos // Theriogenology. -2001.-V.55.-P.l 117-1126.i

160. Hagen D.R., Graboski R.A. Effect of porcine pituitary growth hormone (pGH) on cytoplasmic maturayion of porcine oocytes in vitro // J. Anim. Sci. -1990.-V.68.- P. 446.

161. Hammer R.E., Palmiter R.D. and Brinster R.L. Partial correction of murine hereditary growth disorder by germ-line incorporation of a new gene // Nature. -1984,-V.311.-P. 65-67.

162. Hammer R.E., Pursel V.G., Rexroad C.E., Wall R.J., Bol D.J., Ebert K.M., Palmiter R.D., Brinster R.L. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection//Nature. -1985.- V. 315.- P. 680-683.

163. Hammer R.E., Brinster R.L., Rosenfeld M.G., Evans R.E., Mayo K.E. Expression of human growth hormone releasing factor in transgenic mice results in increased somatic growth // Nature.- 1985.- V.315.- P. 413-416.

164. Han J.Y., Shoffner R.N. and Guise K.S. Gene transfer by manipulation of primordial germ cells (PGCs) in the chicken // As.-Aus. J. Anim. Sci.- 1994.- V. 7.- P. 427-434.

165. Han J.Y., Park T.S., Hong Y.H., Jeong D.K., Kim J.N., Kim K.D. and Lim J.M. Production of germline chimeras by transfer of chicken gonadal primordial germ cells maintained in vitro for an extended period // Theriogenology.- 2002.-V.58.-P. 1531-1539.

166. Handrow R.R, Parrish J.J., First N.L. Heparin stimulates calcium uptake by bovine sperm in vitro // J. Androl.- 1986.- V. 7.- P. 23-28.

167. Herrier A., Lucas-Halm A., Niemann H. Effects of insulin-like growth factor-1 on in vitro production of bovine embryos // Theriogenology.- 1992.- V.37.- P. 12131224.

168. Hers L., Northey P., Lawyer M., First N.L. Acrosome reaction of bovine spermatozoa in vivo, sites and effects of stages of the estrous cycle // Biol. Reprol. -1985.- V.32.- P. 1163-1168.

169. HeymanY., Menezo Y., Chesne P., Camous S., Gamier V. In vitro cleavage of bovine and ovine early embryos: improvd delelopment using co-culture with trophoblastic vesicles // Theriogenology.- 1987.- V. 27.- P. 59-68.

170. Hill K.G., Curry J., DeMayo F.J., Jones-Diller K., Slapak J.R., Bondioli K.R. Production of transgenic cattle by pronuclear injection // Theriogenology. -1992.- V.37.- P. 222.

171. Hirst P.J., De Mayo F.J, Durelow RW et al. Xenogenous fertilization on laboratory and domestic animal in the oviduct of the pseudopregnant rabbit // Theriogenology.- 1981.-V. 15.-P. 67-75.

172. Hizasleima A., Sewaki В., Inkuda Y., Jnouge M. Engereering of the mRNA interfeing complementary RNA immune system against viral infection // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1986.-V. 83.- P. 201-208.

173. Hong, Y.H., Moon, Y.K., Jeong, D.K., Han, J.Y. Improved transfection efficiency of chicken gonadal primordial germ cells for the production of transgenic poultry// Transgenic Research.- 1998.- V. 7.- P.247-252.

174. Hooper, M.L. Embryonal Stem Cells: Introducing Planned Changes into the Germline // In: Evans HJ (ed.) Harwood Academic Publishers, Switzeland. -1992.

175. Horvat S., Mediano J.F., Behboodi E., Anderson G.B., Murray J.D. Sexing an detection of gene construct in microinjected bovine blastocysts using the polyineras chain reaction // Transgenic. Res. -1993.- V. 2,- P. 134-140.

176. Hoshi H. In vitro production of bovine embryos and their application for embryo transfer // Theriogenology.- 2003.- V. 59.- P. 675-685.

177. Howlett S.K. and Bolton V.N. Sequence and regulation of morphological and molecular events during the first cell cycle of mouse embryogenesis // Embryo 1. Exp Morphol. -1985.-V. 87.- P. 175-206.

178. Hu, W.S., Pathak, V.K. Design of retroviral vectors and helper cells for gene therapy // Pharmacol. Rev. -2000.- V.52.- №4.- P. 493-511.

179. Hunter R.H.F. Physiology and Technology of Reproduction in Femaledomestic Animals // Acad. Press. London. -1980.- P. 307.

180. Imai K. et al. Cryopreservation of bovine embryos obtaned by in vitro culture of IVM-IVF oocytes in the presence of linoleic acid albumin // Theriogenology. -1997.-V. 47.- P.347.

181. Iritani A., Gomes W.R. Secretion rates and chemical composition of oviduct and uterine fluids in ewes //Biol. Reprod. -1961.- V. 1.- P. 72-76.

182. Iritani A., Niwa K. Capacitation of bull spermatozoa and fertilization in vitro of cattle follicular oocytes matured in culture // J. Reprod. Fert.- 1977.- V.50.-P.l 19-123.

183. Iritani A. Fertilization in vitro of follicular oocytes matured in culture in cattle pig and human // Arch, of Androl.- 1980.-V. 5.- P. 77-78.

184. Iritani A., Niwa K., Kasai M., Song H.B. Fertilization in vitro of cattle follicular oocytes with ejaculated spermatozoa capacitated in a chemically defined medium // J. Reprod. Fert.- 1984.-V. 70.- P. 487-492.

185. Iwasaki S. and Nakahara T. Cell number and incidence of chromosomal anomalies in bovine blastocysts fertilized in vitro followed by culture in vitro or in vivo in rabbit oviducts // Theriogenology.- 1990.-V. 33.- P. 669-675.

186. Jaenisch R. and Mintz A. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of health adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1974.-V. 71.- P. 1250-1254.

187. Jaenisch R. Germ line integration and Mendelian transmission of exogenous Moloney leukemia virus // Prog. Natl. Acad. Sci. USA. -1976.- V.73.- P. 12601264.

188. Jaenisch R., Jahner L., Nobis P., Simon I., Lohler J., Harbers K. and Grotkopp D. Chromosomal position and activation of retroviral genomes inserted into the germ line ofmice//Cell. -1981.-V. 24.-P. 519-529.

189. Jaenisch R., Harbers K., Schnieke A., Lohler J., Grotkopp D. and Hoffman E. Germ line integration of Moloney murine leukemi virus at the Mov 13 lokus leads to recessive lethal mutation and early embryonic death // Cell.- 1983.-V.32.1. P.209-216.

190. Jaenisch R. Transgenic animals // Science.- 1988.- V. 240.-P. 1468-1474.

191. Jahner D. and Jaenisch R. Integration of Moloney leukemia virus into the germ line of mice: Correlation between site of integration and vims activation // Nature.-1980.- V.287.- P. 456-458.

192. Jahner D., Stuhmann H., Stewart C.L., Harbers K., Lohler J., Simon I. and Jaenisch R. De novo methylation and expression of retroviral'genomes during mouse embryogenesis//Nature.- 1982.-V. 298.- P. 623-628.

193. Jahner D., Haase R., Mulligan R. and Jaenisch R. Insertion of the bacterial gpt gene into the germ line of mice by retroviral infection // Prog. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985,- V.82.- P. 6927-6931.

194. Jahner D. and Jaenisch R. Retrovirus-induced de novo imethylation of flanking host sequences correlates with gene inactivity // Nature.- 1985.-V. 315.-№6020.- P. 594-597.

195. Janne J., Alhonen L., Hyttinen J.M., Peura Т., Tolvanen M., Korhonen V.P. Transgenic bioreactors // Biotechnol. Annu. Rev.- 1998.- V. 4.- P. 55-74.

196. Joyner A.L., Bersnstein A. Retrovirus transduction: Generation of integration retroviruses expressing dominant and selectable genes is associated with in vivo recombination and deletion event // Mol. Cell. Biol.- 1983.- V. 3.- P. 21802190. I

197. Kafri Т., Gao X., Razin A. Mechanistic aspects of genome-wide demethylation in the preimplantation mouse embryo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993.- V. 90.- P. 105 58-10562.

198. Kane M.T. and Foote R.N. Culture of two-and four-cell rabbit embryos to the expanding blastocyst stage in synthetic media // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.1970.-V.133.- P. 921-925.

199. Kane M.T. Culture of mammalian ova // In: Sreenan J.M. (ed), Control of Reproduction in the Cow. Martinus Nijhoff, The Hagye. -1978.- P. 383-397.

200. Kane M.T., Carney E.W., Bavister B.D. Vitamins and amino acids stimulate hamster blastocysts to hatch in vitro // J. Exp. Zool.- 1986.- V. 239.- P. 429-432.

201. Kane M.T. In vitro growth of preimplantation rabbit embryos // In:i

202. Bavister B.D.(ed), The Mammalian Preimplantation Embryo: Regulation of Growth and Differentiation in Vitro. Plenum Press, New York.-1987.- P. 193217.

203. Kane M.T. The effects of water-soluble vitamins on the expansion of rabbit blastocysts in vitro // J. Exp. Zool.- 1988.- V. 245.- P. 220-223.

204. Kane M.T. and Bavister B.D. Protein-free culture medium containing polyvinylalcohol, vitamins, and amino acids supports development of eight-cell hamster embryos to hatching blastocysts // J. Exp. Zool.- 1998.-V. 247.- P. 183187.

205. Katska L. Comparison of two methods for recovery of ovarian oocytes from slaughter cattle // Anim. Reprod. Sci.- 1984.-V. 7.- P. 461-463.

206. Kazdyar F., Colenbrander В., Bevers M.M. The stimulatory effect of growth hormone on in vitro maturation of bovine oocytes is not mediated by IGF-1 // Proc 13th. Int. Congr. Anim.Reprod. Sydney. -1996.- II PI0-7. 1

207. Kazdyar F., Colenbrander В., Bevers M. Growth hormone stimulates in vitro bovine oocyte maturation and subsequent embryonic development // Thenogenology.-1996.-V. 45.- P. 279.

208. Khoury G. and Gruss P. Enhancer elements // Cell.- 1973.- V. 33.- P. 313-314.

209. Khurana N.K., Niemann H. Energy metabolism in preimplantation bovine embryos derived in vitro or in vivo // Biology of Reproduction.- 2000.-V. 62.- P. 847-856.

210. King W.A., Niar A., Botteridge K.J. The nucleolus organizer regions of early bovine embryos // J. Dairy. Sci.- 1985.-V. 68.- P. 249.

211. Kino, K., Pain, В., Leibo, S.P., Cochran, M., Clark, M.F., and Etches, R.J.

212. Production of chiken chimearas from injection of frozen-thawed blastodermal cells // Poult. Sci.- 1997.-V. 76.- P. 753.

213. Kobayashi K., Yamashita S., Hoshi H. Influence of EGF and TGF-a on in vitro maturation of cumulus cell- enclosed bovine oocytes in a defined medium // J. Reprod Fertil.- 1994.-V. 100.- P. 439-446.

214. Kruip ThA.M., van Beneden H., Lieleman S.J., Bevers ОД. The effect of oestradiol -170 on nuclear maturation of bovine oocytes // Prog. 11th Int. Congr. Anim. Reprod. A.J Dublin.- 1988.-V. 111.- P. 336.

215. Krumlauf R., Chapman V.M. Hammer R.E., Brinster R., Tilghman S.M. Differential regulation of a-fetoprotein genes on the inactive X chromosome in exstraembryonic and somatic tissues of transgenic mice // Nature.- 1985.- V. 319.- P. 224-226.

216. Kubota C, Yamakuchi H, Todoroki J, Tabara N, Barber M et al. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture // Proc. Natl. Sci USA. -2000 -V. 97.- P. 990-995.

217. Langlais J., Roberts R.D. A molecular membrane model of sperm capacitation and the acrosome reaction of mammalian spermatozoa // Gamete Res.-1985.-V. 12.-P. 183-224.

218. Langlais J., Sirard M.A., Bernard C., Belang R., Riouse J,E., Leclerc P., Menard D.P., Bedoya M. In vitro fertilization of bovine oocyte rriatured invivo and collected at laparoscopy 11 Theriogenology. -1986.- V. 25.- P. 177183.

219. Larson R.C., Ignotz G.G., Currie W.B. Defined medium containing TGF and bFGF permits development of bovine embryos beyond the "8-cell block" // J. Reprod. Fertil. Series. -1990.- V. 5,- P. 22.

220. Lavitrano M, Camaioni A, Fazio VM, Dolci S, Farace MG and Spadafora C. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice // Cell. -1989.- V. 57.- P. 717-723.

221. Lawitts J.A., Biggers J.D. Overcoming the 2-cell block' by modifying standart components in a mouse embryo culture medium // Biol. Reprod. -1991.-V. 45.- P. 245-251.

222. Lee C.N., Ax R.L. Concentrations and composition of glycosaminoglycans in the female bovine reproductive tract // J. Dairy. Sci.- 1984.-V. 67- P. 20062009.

223. Lee C.N., Clayton H.K., Bushmeyer S.M., First N.L, Ax R.L. Glycosaminoglycans in ewe reproductive tracts and their influence on acrosome reactions in bovine spermatozoa in vitro // J. Anim. Sci. -1986.-V. 63.-P. 861-867.

224. Lee C.N. et al. Pregnancy rate after transfer of fresh or frozen bovine blastocysts // Theriogenology.- 1996.-V. 46.- P. 350.

225. Le Loos F., van Maurik P., van Beneden Т., Kruip ТАМ. Structural aspects of bovine oocyte maturation in vitro // Mol. Reprod. Dev. -1992.- V. 31.- P. 208214.

226. Leese H.J. The formation and function of oviduct fluid // Reprod. Fertil.1988.-V. 82.- P. 843-856.

227. Lehninger A.L. Biochemistry // Worth Publishers, New York. -1975.

228. Leibfried M.L., First N.L. Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro or in vivo // J. Anim. Sci.- 1979- V. 48.- P. 7686.

229. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., Northey D.L., First N.L. Developmental potential of bovine oocytes matured in vitro or in vivo // Biol. Reprod. -1987.- V. 36.- P. 376-383.

230. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., Parrish J.J., First N.L. In vitro maturation and fertilization of bovine oocytes // Theriogenoly.- 1989.-V.31.- P. 61-74.

231. Leibo S.P. A one-step method for direct non-surgical transfer of frozen thawed bovine embryos // Theriogenology. -1984.-V. 21.- P. 767-790.

232. Leibo S.P. Field trial of one-step diluted frozen-thawed bovine embryos a update // Theriogenology. -1985.- V. 23.- P. 201-207.

233. Leibo S.P., Rail W.F. Increase in production of pregnancies by bisection of bovine embryos //Theriogenology.- 1987.-V. 27.- P. 245-250.

234. Leopold F., Vailly J., Cuzin F., Rassoulzadegan M. Germ line maintenance of plasmids in transgenic mice // Cell.- 1987.-V. 51.- P. 885-886.

235. Lindenmann J. Inheritance of resistance to influenza virus in mice // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1964.- V. 116.- P. 506-509.

236. Lindner C.M., Ellis D.E. Refrigeration of bovine embryos // Theriogenology. -1985.-V.23.-P. 202-207.

237. Lo D., Pursel V., Linton P.J. Expression of mouse IgA by transgenic mice, pigs and sheep // Eur. J. Imimmol.- 1991.- V. 21.- P. 1001-1006.

238. Lonergan P. Khatir H, Carolan C, Mermillod P. Bovine blastocyst production in vitro after inhibition of oocyte meiotic resuption for 24 h. // J. Reprod Fertil.- 1997.- V.109.-P. 355-365.

239. Lopata A., Patullo M.J., Chang A., James B. A method for collecting motilespermatozoa from human semen // Fert. Ster.- 1976.- V.27.- P. 677-684.

240. Loskutoff N.M., Coren B.R. Barris D.R. et al. Gene microinjection in bovine embryos facilitated by centrifugation // Theriogenology.- 1986.-V.25.-P. 168-173.

241. Lovrll-Badge R.H., Bygrave A.E., Bradley A., Robertson E., Evans M.J. Transformation of embryonic stem cells with the human type-II collagen gene and its expression in chimeric mice // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. -1985.- V. 50.- P. 707-711.

242. Lu K.H., Polge C. A summary of two-years results in large scale in vitro bovine embryo production // Proc. 12 th. Int. Congr. Anim. Reprod. -1992.- V. 3.-P. 1315-1317.

243. Lurquin P.F. Gene transfer by electroporation // MoL Biotechnol.- 1997.-V. 7 (1).-P. 5-35.

244. Machlin L.J. Effect of porcine growth hormone on growth and carcass composition of the pig // J. Anim. Sci.- 1972.-V.35.- P. 794-800.

245. Machlin L.J. Effect of growth hormone on milk production and fertilization in dairy cows // J. Dairy. Sci.- 1973.-V.56.- P. 575-580.

246. Mahon K.A., Overbeek P.A. Prenatal lethality in a transgenic mouse line in the result of a chromosomal translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1988.-V. 85.-P. 1165- 1168.

247. Mannaerts B.M. Cytological parameters for rating bovine embryo quality // In Sreenan J.M. and Diskin M.J.(eds). Embryonic Mortality in Farm Animals. Martinu Nijhoff Publisher, Dordrecht. -1986.- P. 216-222.

248. Mark W.H., Signorelli К and Lacy E. An insertional' mutation in a transgenic mouse line result in developmental arrest at day 5 of gestation // Cold Spring Harb Symp. Quant. Biol. -1985.-V. 50.- P. 453-464.

249. Marquant Le Guienne В., Gerard M., Solari A. In vitro culture of bovine eggs fertilized either in vivo and in vitro // Reprod. Nutr. Dev. -1989.- V.29.-P.559-568.

250. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryo cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 1981.- V.78.- P. 7634-7636.

251. Massey J.M. Animal production industry in the year 2000 // J. Reprod. Fertile Suppl. -1990.- V. 41.- P. 199-208.f

252. Meyer D.B. Application of the periodic acid-Shiff technique to whole chickjembrios // Stain Technol. -I960.- V.35. -P. 83.

253. Mccreath K.J., Howcroft J., Campbell K.H.S., Colman A., Shnieke A.E., Kind A.J. Production of genetargered sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells // Nature. -2000.- V.405 (6790).- P. 1066-1069.

254. McKnight G.S., Hammer R.E Kuenzel E.A. and Brinster R.L. Expression of the chicken transferrin gene in transgenic mice // Cell.- 1983.-V. 34.- P. 335441.

255. Meyer K.B., Neuberger M.S. The immunoglobin к locus contains aisecond stronger В cell-specific enhancer which is located downstream of the constant region //EMBOJ.-1989.-V.8.-P. 1959-1965.

256. Miller W.L., Coit L. and Martial J.A. Cloning of bovine prolactin cDNA and evolutionar implications of its sequence // DNA. -1981.- V. 1.- P. 37-50.

257. Mills J.A., Jeitles G.G., Brackett B.B. Embryo transfer following in vitro vivo fertilization of rabbit ova // Fertil. and Sterility. -1973.- V. 24.- P. 602608.

258. Mintz B. Preimplantation stages pregnancy // Ciba Found. Symp.- 1965.-P. 194-207.

259. Mintz B. and Illimensee K. Normal genetically mosaic mice produced from malignant teratocarcinoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1975.1. У.12.- P. 3585-3589.

260. Misrahi M., Hai M.T.V., Gyinea N. et al. Molecular and cellular biology of gonadotropin receptors 7/ In: The ovary. Eds EY Adashi, PCK Leung. Raven press LT New York.- 1993.- P. 57-93.

261. Moor R.M., Trounson A.O. Hormonal and follicular factors affecting maturation of sheep oocytes in vitro and their subsequent developmental capacity // J. Reprod Fert.- 1977.- V.49.- P. 101-109.

262. Moor R.M. Contact signalling and co-operaition between follicle cells an dictyate oocytes in mammals.In. McLaren A., WylielL (eds.) Current problems in germ cell differentiation // Cambridge University Press, Cambridge. -1983.- P. 51-57.

263. Motlik J., Koeffoed-Johnson H.H., Fulka J. Breakdown of the germinal vesicle in bovine oocytes cultivated in vitro // J. Exp. Zool.-1978.- V. 205.-P.377-384.

264. Motlik J., Fulka J., Flechon J.E. Changes in intercellular coupling between pig oocytes and cumulus cells during maturation in vivo and in vitro // J. Reprod. Fert. -1986,- V.76.- P. 31-37.

265. Mozdziak P.E., Borwornpinyo S., McCoy D.W. and Petitte J.N. Development of transgenic chickens expressing bacterial p-galactosidase // Developmental Dynamics. -2003.- V. 226.- P. 439-445.

266. Muller M., Brem G. Disease resistance of farm animals // Reprod. Fert.Dev.-1996.- V.6.- P. 605-613.

267. Muramatsu Y., Mizutani Y., Ohmori Y. and Okumura J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expressions in early chicken embryo in ovo // Biochem. Biophys. Res. Com. -1997.- V. 230.- P. 376-380.

268. Naito M., Tajima A. and Kuwana T. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells//Mol. Reprod. Dev.-1994.-V. 39.-P. 153-161.

269. Naito M., Sano A., Tagami Т., Harumi T. and Matsubara Y. Efficient transfection of chicken blastoderms in vivo by lipofection and electroporation using green fluorescent protein gene as a marker // Anim. Sci. J.- 2000.- V. 71(4).-P. 377-385. '

270. Nagao Y., Hoshi M. and Kaiinuma H. Effects of oxygen concentration an oviductal epithelial tissue on the development of in vitro matured and fertilized bovine oocytes cultured in protein-free medium // Theriogenology. -1994.-V. 41.-P. 681-687.

271. Nakamura M, Maeda H and Fujimoto T. Behavior of chick primordial germ cells injected into the blood stream of quail embryos // Okajimas Folia Anat. Jap. -1991.- V.67.- P. 473-478.

272. Nakanishi A and Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods // Mol. Repr. Dev.- 1993. -V. 36.- P. 258-261.

273. Newcomb R., Rowson L.E. Investigation of physiological factors affecting nonsurgical transfer // Theriogenology. -1980. V. 13.- P. 41-49.

274. Newmark P. Protein production in transgenic animals // Bio/Technology. -1987.-V.5.- P. 874.

275. Niall H.D., Hogan R., Sayer R., Rosenblum I.J., Greenwood F. Sequence of pituitary and placenta lactogenic and growth hormones: Evolution from a primordial peptide by gene replication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1971.- V.68.- P. 866-869.

276. Nicolas J.F., Rubenstein J.L.R., Bounerot C., Jacob F. Introduction of genes into embryonal carcinoma cells and preimplantation embryos by retroviral vectors // Cold Spring Harb Symp. Quant. Biol.- 1985.- V. 50.-P.713-720.

277. Nigon V.M., Samarut J., Verdier G., Planmant F., Benchaibi M. Use of avian erytroblastosis virus to produce vectors for gene transfer in poultry // European Poultry Conf. Paris. -1986.- V.I.- P. 1.

278. Norberg M. Ultrastructural aspects of the preattached pig embryo: cleavage anearly blastocyst stages // J. Anat. Entwbesch. -1973.- V. 143.- P. 95-114.

279. Northey D.L., Leibfried-Rutledge M.L., Nuttleman P:R., First N.L. Development of bovine nuclea transfer embryos in vivo vs in vitro // Theriogenology. -1992.- V. 37.- P. 266.

280. Oliphant G., Brackett B.G. Capacitation of mouse spermatozoa in media with elevated ionic strength and reversible decapacitation with epididymal extracts // FerL Steril. -1973-V. 24.-P. 948-955.

281. O'Malley B.W. Steroid hormone action in eukaryotic cells // Clin. Inv.-1984.-V. 74.- P. 307-312.

282. Ono T, Yokoi R and Aoyama H. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chicks embryonic gonads // Exp. Anim. -1996.- V.45.- P.347-352.

283. O'Rand M.G. Modification of the sperm membrane during capacitation // Ann N.Y. Acad. Sci.- 1982.- V. 383.- P. 392-402.

284. Ornitz D.M., Palmiter R.D., Hammer R.E., Brinster. R.L.,» Swift G.H.,Mac Donald R.J. Specific expression of an elastase-huma growth hormone fusion gene in pancreatic acinar cells of transgenic mice // Nature. -1985.-V.313.-P.600-603.

285. Ozato K., Wan YJ. and Orrison B.M. Mouse major histocompatibily class 1 gene expression begins at midsomite stage and is inducible in earlier-stage embryos by interferon // Prog. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.-V. 82.- P. 24272431.

286. Pain В., Chenevier P., Samarut J. Chicken embryonic stem cells and transgenic strategies // Cells Tissues Organs.- 1999.- V.l65(3-4).- P. 212-219.

287. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E., Trumbauer M.E.', Rosenfeld M., Biruberg N.C., and Evans R.M. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes // Nature.- 1982.-V.300.- P. 611-615.

288. Palmiter R.D., Norstedt G., Gelinas R.E., Hammer R.E., Brinster R.L. Metallothionein human GH fusion gene stimulate growth of mice // Science.-1983.-V. 222,- P. 809-814.

289. Palmiter R.D., Wilkie T.M., Chen H.Y., Brinster R.L. Transmission distortion and mosaicism in a unusual transgenic mouse pedigree,// Cell." 1984.-V. 36.-P. 869-877.

290. Palmiter R.D. and Brinster R.L. Germline transformation of mice // Ann. Rev. of Genetics.- 1986.- V.20.- P. 3-60.

291. Papaioannou V.E., Me Burney M.W., Evans R.M. Fate of teratocarcinoma cells iniecte into early mouse embryo // Nature. -1975.-V. 258.- P. 70-73.

292. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L. Capacitation of bovine sperm by heparin // Biol. Reprod. -1989.- V.41.- P. 683-699.

293. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., First M.L. In vitro fertilization of bovine oocyte using heparin treated and swim-up separated frozen thawed bovine semen is repeatable and result in hight // Theriogenology. -1985,- V. 3.- P. 1 7.

294. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., First ML. Role of heparin in bovine sperm capacitation // Biol Reprod.- 1985.- V.32.- P. 211-215.

295. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., First N.L. Capacitation of bovine sperm by , oviduct fluid or heparin is inhibited by glucose // J. Androl.- 1986,- V. 7.- P.2227.

296. Parrish J.J., Susko- Parrish JL., Leibfried-Rutledge M.L., Crister E.S., Eyestone W.H., First N.L. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen // Theriogenology.- 1986.- V. 25.- P. 591-600.

297. Pellicer A., Wagner E.F., and Kareh A.E. Introduction of a viral thymidine kinase gene and the human P-globin gene into developmentally multipotential mouse teratocarcinoma cells // Proc. Acad. Sci. USA. -1980.- V.77.- P. 20982102.

298. Peshon J.J., Behringer R.R., Brinster R.L., Palmiter R.D. Spermatid-specific expression of protamine 1 in transgenic miqe // Proc, Acad. Sci. USA. -1987.1. V. 84.-P. 5316-5319.

299. Petitte J.N., Clark M.E., Liu G., Verrinder Gibbins A.M. and Etches R.J. Producing of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells // Development.- 1990.- V. 108.- P. 185-189.'

300. Pettite J.N. // J. Poult. Sci. -2002.- V.39.- №4.- P.205-228.

301. Peura T.T., Tolvanen M., Hyttinen J-M, Janne J. Effect of membrane piercing and the type of pronuclear injection fluid on development of in vitro-produced bovine embryos // Theriogenology. -1995.- V. 43.- P.1087-1096.

302. Piedrahita J.A., Moore K., Oetama В., Lee C.K., Scales N., Ramsoondar J., Bazer F.W., Ott T. Generation of trasgenic porcine chimeras using primordial germ cell-derived colonies // Biol. Reprod. -1998.- V.58.- P. 1321-1329.

303. Polge C., Wilmut I. et al. The low temperature preservation of cow, sheep and pig embryos // Cryobiology -1974.- V. 11.- P. 560.

304. Polge C. Embryo transplantation and preservation // In: . Control of pig reproduction (eds.) Cole and Foxcraft. Entterworth Scientific. -1982.- P. 277299.

305. Pollock D.P., Kutzko J.P., Brick-Wilson E., Williams J.L., Echelard Y. Meade H.M. Transgenic milk as a method for production of recombinant antibodies // J. Immunol. Methods. -1999.- V. 231.- P. 147-157.

306. Pursel V.G., Rexroad C.E., Bold D.J., Miller K.F., Wall R.J., Hammer R.E., Palmiter R.D., Brinster R.L. Progress on gene transfer in farm animals //Vet. Immunol. Immunopathol.- 1987.-V.17.-P. 303-312.

307. Rail W.F. Cryopreservation of oocytes and embryos: Methods and applications // Amm. Reprod. Sci.-1992.- V. 28.- P. 237-245.

308. Reddy V.B., Vitale J. A., Wei C. et al. Expression of human growth hormone in the milk of transgenic mice // Animal Biotechnology. -1991.- V. 2.- P. 15-29.

309. Renard J.P., Hyman Y., Ozil J.P. Importona of gestation phases after nonsurgica transfer of cultured and noncultured bovine blastocysts // Vet. Rec.-1980.-V.107.-P. 152-153.

310. Renard J.P. and Bahinet C. Genetic engineering in farm animal the lessons from the genetic mouse model // Theriogenology. -1987.- V. 27,- P. 181-200.

311. Restall B.J., and Wales R.G. The fallopian tube of the sheep // Aust. J. Biol. Sci. -1966.- V. 19.- P. 687-698.

312. Rexroad C.E., Powell A.M. Co-culture of sheep ova and cells from sheep ovicduct // Theriogenology.- 1986.-V. 25.- P. 187.

313. Rexroad C.E., Wall R.J. Development of one-cell fertilized sheep ova following microinjection into pronucleus // Theriogenology. -1987.-V. 27.-P.611-620.

314. Rieger D., and Guay P. Measurement of the metabolism of energy substrates in individual bovine blastocysts // J. Reprod. Fert.- 1988.-V. 83.-P.585-591.

315. Rinkerd P.E. and Anderson G.B. Transfer of cultured rabbit embryos // Genete. Res. -1979.-V.2.- P. 65-73.

316. Ritchie K.A., Brinster R.L. and Storb U. Allelic exclusion a control of endogenous immimoglobulin gene rearrangement in ka transgenic mice // Nature.- 1984.-V.312.- P. 517-520.

317. Robl G.M., Dobrinsky R.J. and Duby R.T. The effect of protein supplements phosphate and glucose on the in vitro development of IVM-IVF bovine oocytes // Theriogenology. -1991.-V. 35.-P. 263.

318. Romanoff A. The avian embryo // The Macmillan Company. New York.-1960.

319. Rosenkrans C.F., Davis D.L. and Milliken G. Pig blastocysts' development invitro in affected by amino acids // J. Anim. Sci. -1989.- V. 67.- P. 1503-1508.

320. Rosenkrans C.F., Zeng J. A simple medium for in vitro development of bovine embryos // J. Anim. Sci.- 1990.- V. 68.- P. 430.

321. Rottmann O.J., Antes R., Hoefer P. and Maierhofer G. Liposome mediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells // J. Anim. Breed. Gen.-1992.-V. 109.-P. 64-70.

322. Rubinstein J.L.R., Nicolas I.F. and Jacob F. Introduction of nes into preimplantation mouse embryos by use of a detective recombinant retrovirus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986.- V. 8.- P. 366-368,

323. Rusconi S., Schafner W. Transformation of frog embryos with a rabbit-globin gene //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1981.- V. 7.- P. 5051-5055.

324. Rusconi S, Kohler G. Transmission and expression of a specific pair of rearranged immimoglobulin u and к genes in a transgenic mouse line // Nature.- 1985,- V. 314.- P. 330-334.

325. Saeki K., Hoshi M., Leibfried-Rutledge M.L.,First N.L. In vitro fertilization an development of bovine oocytes matured in serum free medium //Biol. Reprod.-1991.- V. 44.- P. 256-260.

326. Salter D.W., Smith E.J., Hughes S.H., Wright S.E., Crittenden L.B. Retroviruses as vectore to germ line insertion in the chicken // 3 rd. World Congr. of Genetic applied to Livestock Prod. Lincoln. -1986.- V. 12.- P. 51-56.

327. Salter D.W., Smith E.J., Hughes S.H., Wright S.E., Fadly A.M., Witter R.L. and Crittenden L.B. Gene insertion into the chick germline by retroviruses // Polt. Sci. -1986.- V. 65.- P. 1445-1458.

328. Salter D.W., Smith E.J., Hughes S.H., Wright S.E. and Crittenden L.B. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chick germline // Virology.- 1987.-V. 157.- P. 236-240.

329. Schedl A., Beerman F., Thies E. et al. Transgenic mice generated by pronuclea injection of a yeast artificial chromosome // Nucl. Acid. Res. -1992.-V. 20.-P. 3073-3077.

330. Schellander K., Seregi J., Gergatz E. Zur Herstellung monozugoter Schaf zwilling durch Embryomikrochirurgie // Wien. Tierarztl. Mschr.- 1986.- V. Jg|73 (H. 2-3).- P. 45-47.

331. Schneider H.J., Castlebery R.S., Griftin J.L. Comercial aspects of bovine embryo transfer // Theriogenology.- 1980,- V. 13.- P. 73^85.

332. Schultze N., Burki Y., Lang Y., Certa U., Bluethmann H. Efficient- control of gene expression by single step of the tetracycline system in transgenic mice. // Nat. Biotechnol. -1996.-V. 14.- P. 499-503.

333. Seamark R.F. The potential of transgenic pigs and related technology // The pigfarmer. -1988.-V.22.- P. 28-30.

334. Seeburg P.H., Shine J., Martial J.D., Goodman N.M. Nucleotide sequence and amplification in bacteria of the structural gene fir rat growth hormone // Nature.- 1977.-V. 270.- P. 486-494.

335. Seidel G.F., Bowen I.R.A., Kane M.T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova // Fert. and Sterilit.- 1976.-V. 27.- P. 861-870.

336. Seidel G.F. Critical review of embryo transfer procedures with cattle // In Fertilization and embryonic development in vitro/ads. Hasstrpoianni. Biggers. -1981.- P. 323-352.

337. Shea B.F., Latoun J.P.A., Bedirian K.N, Baker R.D. Maturation in vitro and subsequent penetrability of bovine follicular oocytes // J. Anim. Sci.- 1976.-V.43.- P. 804-815.

338. Shemesh M., Gurevich M., Harel-Markowitz E., Benvenisti L., Shore L.S. and Stram Y. Gene integration into bovine sperm genome and its expression in.transgenic offspring // Mol. Reprod. Dev. -2000.- V. 56.- P.306^308.

339. Shi W., Zakhartchenko V., Wolf E. Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer// Differentiation.- 2002.- V.71.- P. 1-23.

340. Shim, H., Gutierres-Adan, A., Chen, L.R., BonDurant, R.H., Behboodi, E., Anderson, G.B. Isolation pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells // Biol. Reprod. -1997.-V. 57.- P. 1089-1095.

341. Shimotohno K., Temin Y.M. Loss of intervening sequences in genomic mouse p-globin DNA inserted in an injections terrovirus vector // Nature.- 1982.- V. 229.- P. 265-268.

342. Simkiss K., Rowlett K., Bumstead N. and Freeman B.M. Transfer of primordial germ cell DNA between embryos // Protoplasma.-,1989.- V. 151.-P.164-166.

343. Sirard M.A., Lambert R.D., Menard D.P., Bedoya H. Pregnancies after in vitro fertilization of cow follicular oocytes, their incubation in rabbit oviduct and their transfer to th cow uterus // J. Reprod. Fert. -1985.-V. 75.- P. 551556.

344. Sirard M.A., Lambert R.D., Guay P., Menard D.P. In vivo and in vitro development of an in vitro fertilised bovine follicular oocyte obtained by laparoscopy // Theriogenology.- 1985.-V. 23.- P. 230-239. •

345. Sirard M.A., Parrish J.J., Ware C.B., Leibfried-Rutledge M.L., First N.L. The culture of bovine oocytes to obtain developmentally competent embryos // Biol. Reprod.- 1988.-V. 39.- P. 546-552.

346. Sirard M.A., Florman H., Leibfried-Rutledge M.L., First N.L. 1989. Timing of nuclear progression and protein synthesis for meiotic maturation of bovine oocytes // Biol. Reprod. -1989.- V.40.- P. 1257-1263.

347. Smith С. Application of embryo transfer in animal breeding // Theriogenology.- 1988.-V.29.- P. 203-212.

348. Smith A.L. and Carson S.A. Incorporation of fluoroscein-isothiocyanate-labelled bovine serum albumin into murine embryos during in vitro culture // Theriogenology.-'1989.-V. 31.- P. 259abstr.

349. Smith K.R. Sperm cell mediated trasgenesis // Anim. Biotechnol.- 1999.-V. 10(1/2).- P. 1-14.

350. Smith K.R. Gene transfer in higher animals: theoretical consideration and key concepts // J. of Biotechnolgy. -2002.-V. 99.- P. 1-22.

351. Sorge J., Hughes S.H. Retrovirus vectors independent of selectable markers // Col. Spring Harbor.-1982,-V. l.-P. 127-132.

352. Southern E.M. Detection of specific sequence among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. -1975.-V. 98.- P. 503-517.

353. Sreenan J. In vitro maturation and attempted fertilization of cattle follicular oocytes // J. Agr. Sci. (Camd\b.)- 1970.-V.75.- P. 393-397.

354. Staigmiller R.B., Moor R.M. Effect of follicle cells on the maturation an developmental competence of ovine oocytes matured outside the follicle // Gamete. Res.- 1984.-V.9.- P. 21-229.

355. Stanke D.F., Sikes I.D., De Young and Tumbleson M.E. Proteins and amino aids in bovine oviductal fluid // J. Reprod. Fertil.- 1974.-V. 38.-P.493-496.

356. Stevart C.L., Vanek M. and Wagner E.F. Exspression of foreign genes from retroviral vectors in mouse teratocarcinoma chimaer // EMBO J. -1985.-V. 4.-P. 3701-3709.

357. Stevens L.C. The developmentof transplantable teratocarcinoma from intranstesticular grafte of pre- and postimplantation embryos // Dev.Biol.-1970.-V. 21.-363 -382.

358. Stewart T.A. and Mintz B. Successive generations of mice proced from a establiened culture line geuploid teratocarcinoma ceels // Proc. Nat.Acad.

359. Sci. USA.- 1981.-V.78.- P.6314-6317.

360. Stewart T.A., Wagner E.F. and Mintz B. Human-globin gene sequences injected into mouse eggs, retained in adults, and transmitted to progeny // Science. -1982.-V. 217.- P.1046-1048.

361. Storb U., O'Brien R.L., McMullen M.D.Gollahon K.A., Brinster R.L. High exspression of cloneimmunoglobulin kappa gene in transgenice is restricted to В lymphocytes // Nature.- 1984.-V.310.- P. 238-241.

362. Strauss W.M., Dausman J., Beard C., Jonson C. Germ line transmission of yeast artificial chromosome spanning the murine a-1(1) collagen locus // Science. New York then Washington.- 1993.- V.259(5103).- P. 1904.

363. Swanson M.E., Martin M.J., O' Donnell J.K. et al. Production of functional human hemoglobin in transgenic swine // Bio/Tech. -1992.- V. 10.- P. 557-559.

364. Swift G.H., Hammer R.E., Me.Donald RJ. and Brinster R.L. Tissue-specific expression of the rat pancreatic elastase 1 gene in transgenic mice // Cell.- 1984.-V. 38.-P. 639-646.

365. Suarez S.S., Meizel S., WoLf D.P., Dravland J.E. The syncronous induction of acrosoms in vitro in capacitated human sperm by a fraction of human follicular fluid//Biol. Reprod.-1985.-V.32.-P. 81-85.

366. Tajima A., Naito M., Yasuda Y. and Kuwana T. Producing of germline chimeras by transfer of primordial germ cells in the domestic chicken // Theriogenology.- 1993.-V. 40.- P. 509-519.

367. Takahashi Y., First N.L. In vitro development of bovine one-cell embryos: influence of glucose, lactate, puruvate, amino acids and vitamins // Theriogenology.- 1992.-V. 37.- P. 963-978.

368. Tervit H.R., Whittingham D.G. and Rowson L.E.A. Sussessful culture in vifro of sheep and cattle ova//J. Reprod. Fertil.- 1972.-V.30.- P. 493-497.

369. Thibault C., Gerard M. Cytoplasmic and nuclear maturation of rabbit oocytes in vitro // An. Biol. Anim.Biochem. Biophys.- 1973.-V. 13.- P. 145

370. Thibault С., Gerard M., Menezo Y. Acquisition par l'ovocyte de lapine et de vea du facteur de decondensation du noyau du spermatozoide fecondant // An. Biol Anim.Biochem. Biophys. -1975.-V. 15.-P. 705-715.

371. Thibault C. Are follicular maturation and oocyte maturation independent process //J. Reprod. Fertil.-1977.-V.51.-P. 1-16.

372. Thompson J.G., Partridge R.J., Houghton F.D., Cox C.I., Leese H.J. Oxygen uptake an carbohydrate metabolism by in vitro derived bovine embryos // J. Reprod. Fertil.- 1996.-V. 106.-P. 299-306.

373. To Y.L., Booth S.C. and Meiman P.E. Inhibition of retriviral replication by antisenc RNA // Mol. Cell. Biol.- 1986.-V. 6.- P. 608-613.

374. Townes Т., Lingrel L., Chen H., Brinster R.L., Palmiter R.D. Erythroid specific expression of human (3 -globin genes in transgenic mice // EMBO J. -1985.-V.4.-P. 1715-1724.

375. Trounson. A.O., Willadsen S.M., Rowson L.E.A. Fertilization and developmental capacities of bovine follicular oocytes matured in vitro and in vivo and transferred to the oviducts of rabbits and cows // J. Reprod. Fertil.-1977.-V.51.-P. 321-325.

376. Tsunoda Y. and Kato Y. The recent progress on nuclear transfer in mammals // Zool. Sci.- 2000.- V. 17(9).- P. 1177-1184.

377. Twaqiramungy H. et al. Cryopreservation of in vitro-derived bovine embryos // Theriogenology.- 1996.- V. 46.- P. 356.

378. Ullah N. et al. Survival of bovine oocytes after exposure to ethylene glycol // 1997.- V.47.- P. 375.

379. Ulmatsu Y., Ryser S., Dembic Z., Borgulya P. In transgenic mice the introduce functional cell receptor gene prevents expression of endogenous genes // Cell.- 1988.- V. 52.- P. 831-841.

380. Van der Putten, Botteri H., Miller F.M., Rosefeld M.G., Fan H., Evans R.M., Verma I.M. Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors // Proc. Natl.Acad. USA. -1985.- V. 82.- P. 6148-6152.

381. Van Tol H.T.A., de Loos F.A.M., Vanderstichele H.M.J., Bevers M.M. Bovine activin A does no affect in vitro maturation of bovine oocytes // Theriogenology.- 1994.- V. 41.- P. 673-679.

382. Van Tol H.T.A., van Eijk M.J.T., Mummery C.L., van den Hurk R., Bevers M.M. The influence of FSH and hCG the resumption of meiosis of bovine oocyte surrounded by cumulus cells connected to membrana granulose // Mol. Reprod. Dev.- 1996.- V.52.- P. 56.

383. Vick L.E., Ying L. and Simkiss K. Transgenic birds from transformed primordial germ cells // Proc. R. Soc. Lond. S.B.- 1993.- V.251.- P. 179-182.

384. Vincent C., Johnson M.N. Cooling, cryoprotectants, and the cytoskeleton of the mammalian oocyte // Oxford Rev Reprod. Biol.- 1992.- V. 14.- P. 71100.

385. Viriyapanich R., Betford J.M. The fertilization performance in vivo // J. Exp. Zool. -1981.- V.216.- P. 169-174.

386. Wagner Т.Е., Mintz B. Transfer of nonselectable genes into mouse teratocarcinom cells and transcription of the transferred human P-globin gene // Mol.Cell.Biol.- 1982.-V.2.- P. 190-198.

387. Wagner Т.Е., Covarrubias L., Stewart T.A. and Mintz B. Prenatal lethalities in mice homozygous for human growth hormone gene sequences integrated in the germ line // Cell. -1983,- V.35.- P. 647-655.

388. Wagner Т.Е., Murray F.A., Minhas В., Minhas В., Kraemer D.C. The possibility of transgenic livestock // Thenogenology. -1984.- V. 21.- P. 29-44.

389. Wagner Т.Е., Keller G., Gilboa E., Ruther U., Stewart C.L. Gene transfer into inurine stem cells an mice using retroviral vectors // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.-1985.- V. 50.- P. 691-700.

390. Wagner Т.Е., Jochle W. Control and manipulation of animal growth // London Butterswrths. -1986.- P. 293-313.

391. Wagner Т.Е., Stewart T.A., Mints B. The human p -globin gene and a functional viral thymidine kinase gene in devellping mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1981.- V. 78.- P. 5016-5020.

392. Wakayama, Т., Yanagimachi, R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age type // Mol. Reprod. Dev.- 2001.-V. 58 (4).- P. 376-383.

393. Wall R.J., Seidel G.E. Transgenic farm animals: A critical analysis // Theriogenology.- 1992.-V.38.- P. 337-357.

394. Wall R.J., Hawk H.W., Nel N. Making transgenic livestock: Genetic engineering о a large scale // J. Cell. Biochem.-1992.-V. 4.- P. 113-120.

395. Wall R.J. Biotechnology for the production of modified and innovative animal products: transgenic livestock bioreactors // Livestock production science. -1999.-V.59.-P. 243-255.

396. Walker S.K., Lampe R.J. and Seawark R.F. Culture of sheep zygotes in synthetic oviduct fluid medium with different concentrations of sodium bicarbonate and HEPES // Thenogenology.- 1989.-V.32.- P. 797-804.

397. Wang W., Niwa K. Synergetic effects of EGF factor and gonadotropins on the cytoplasmic maturation of pig oocytes in a serum free medium // Zygote. -1995.- V.3.-P. 345-350.

398. Ward K., Franklin I.R, Murray J.D. The direct transfer of DNA by embryo microinjection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1986.-V. 90.- P. 6-21.

399. Ward F., Enright В., Rizos D., Boland M., Lonergan P. Optiization of in vitro bovine embryo production: effect of duration of maturation, length of gamete co-incubation, sperm concentration and sire // Theriogenology.- 2002.- V.57.- P. 2105-2117.

400. Wasserman W.G. Effect of cytochemicals on cytoplasmic factor initiating meotic maturation in xenopus oocytes // Exp. Cell. Res.- 1975.-V.91.- P. 381388.

401. Watanabe M., Naito M., Sasaki E., Sakurai M., Kuwana Т., and Oshi T.1.posome-mediated DNA transfer into chicken primordial germ cells in vivo // Mol. Reprod. Dev.- 1994.- V. 38.-P. 268-274.

402. Webb R., Gong L.J., Bramley T.A. Role of growth hormone and intrafollicular peptides in follicle development in cattle // Theriogenology. -1994.-V. 1.-P. 25-30.

403. Weidle U.H. et al. Genes encoding a mouse monoclonal antibody are expressed in transgenic mice, rabbits and pigs // Gene.- 1991.-V. 98.- P. 185-191.

404. Weiher H., Barklis E., Ostertag W., Jaenich R. Two distinct sequence elements mediate retroviral gene expression in embryonal carcinoma cell // J. Virol.- 1987.-V. 61.- P. 2742-2746.

405. Wheeler M.B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review // Reprod. Fertil. Dev. -1994.- V. 6.- P. 563-568.

406. Whitelaw C.B.A., Springbett A.J., Webster J., Clark J. The majority of GO transgenic mice are derived from mosaic embryos // Transgenic Res.- 1993.- V. 2(1).- P. 29.

407. Wiemer K.E., Ambroski G.E., Denniston R.S., White K.L., Godke R.A. Use of a hormone-treated fetal uterine fibroblast monolayer system for in vitro culture ofbovine embryos // Theriogenology. -1987.- V.27.- P. 294-299.

408. Willadsen S.M., Polge C., Rowson L.E.A., Moor R.M. Preservation of sheep embryos in liquid nitrogen // Cryobiology. -1974.-V. 11.- P. 560-566.

409. Willadsen S.M, Polge C. Embryo transplantation in the large domestic species: applications and perspectives in the light of recept experiments with eggs an embryos//J. Royal Agric. Soc. England.- 1980.- V. 141.- P. 115-126.

410. Willadsen S.M. Mammalian egg transfer // Ed. C.E. Adams. CKC Press Inc.Boca.Raton Florida.- 1982.- P. 305.

411. Wilmut J., Shnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H.S. Viable . offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. -1997.- V.385 (6619).- P. 810-813.

412. Wolf D.E., Hagopian S.S., Ishijima S. Chances in sperm plasma membrane lipid diffiisibility after hyperactivation during in vitro capatation in the mouse // J. Cell. Biol. -1986.- V. 102.- P. 1372-1377.

413. Wolf E., Shemthaner W., Zakhartchenko V., Prelle, K., Stojkovic M., Brem G. Transgenic technology in farm animals-progress and perspectives // Exp.Physiol.- 2000.- V.85(6).- P. 615-625.

414. Wright R.W. and Bondioli K.R. Aspects of in vitro fertilization and embryo culture indomestic animals // J. Anim. Sci. -1981.- V. 53.- P. 702-729.

415. Xia P., Tekpetey F.R., Armstrong D.T. Effect of IGF-I on pig oocyte maturation fertilization, and early embryonic development in vitro, and on granulosa and cumulu cell biosynthetic activity // Mol. Reprod. Dev. -1994.- V. 38.- P.373-379.

416. Xu Z.Z., Garverick H.A., Swith G.W., Swith M.F., Hamilton S.A., Youngquist R.S. Expression of FSH and LH receptor mRNA in bovine follicles during the first follicular wave 11 Biol. Reprod.- 1995.- V.53.- P. 951-958.

417. Yanagimachi. R., Usui N. Calcium dependence of the acrosome reaction an activation of guima pig spermatozoa // Exp. Cell. Res.- 1974.- V.89.- P. 161-174.

418. Yanagimachi. R. Mechanisms of fertilization in mammals // Acad. New York.-1981,-P. 82-182.

419. Yang B.S., Oh S.J. Viability of in vitro-produced bovine blastocysts frozen in ethylene glycol supplemented with sucrose or trehalose // Theriogenology.-1997.-V. 47.-P. 360.

420. Yasuda Y., Tajima A., Fujimoto T. and Kuwana T. A method to obtain avian germline chimeras using isolated primordial germ cells // J. Repr. Fert.- 1992.-V.96.-P. 521-528.

421. Yoddart A., Pratt H.RM. Control of events during early cleavage of the mouse embryo. An analysis of the 2-cell block // Embryol. Exp. -1983.- V.73.-P.lll-133.

422. Younis A.J., Brackett B.G., Fayrer-Hosken R.A. Influence of serum and hormones on bovine oocyte maturation and fertilization in vitro // Gamete Res.1989.-V.23.-P. 189-201.

423. Zaccananti F., Vallisneri M. and Quagia A. Early aspects of sex differentiation in the gonads of chick embryos // Different. -1990.- V. 43.- P. 71 -80.

424. Zhang X. and Armstrong D.T. Presence of amino acids and insulin in a chemically defined medium improved development of 8-cell rat embryos in vitro and subsequent implantation in vivo // Biol. Reprod. -1990.- V. 42,- P. 662-668.

425. Zuelke K.A., Brackett B.G. Luteinizing hormone-enhanced in vitro maturation of bovine oocytes with and without protein supplementation // Biol. Reprod.1990.-V.43.-P. 784-787.

Информация о работе

Сураева, Наталья Михайловна
доктора биологических наук
Родники, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Эмбриологические и генетические аспекты создания и размножения сельскохозяйственных животных с новыми фенотипическими свойствами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы