Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование биотехнологических приемов получения трансгенных сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование биотехнологических приемов получения трансгенных сельскохозяйственных животных"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ . имени Я.Р. КОВАЛЕНКО

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

Гоголевский Петр Анатольевич

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1892

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследоватальском институте животноводства.

Научные руководители:

академик ВАСХНИЛ Л. К Эрнст . какдитат медицинских наук К. Л. Гольдман

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л П. Дьяконов кандидат биологических наук А. А. Языков

• Ведущее учреждение -Московская ветеринарная академия им. К. И. Скрябина 0

Защита состоится _" д- 1992г. в " IЧ "

часов на заседании Специализированного Совета К 020. 28. 01 при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я Р. Коваленко

Адрес: 10S472 Москва, Кузьминки, ЕИЗВ

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке ВИЗВ

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат ветеринарных наук

. Ф. Г. Терешков

I. ОКЛЯ ХйРАКТЕРНСВИА РАБОТЫ.

I. I. Актуальность темы. Созданная к настсякему времени технология переноса реточбинанткой ДКК в половые клетки хсчекопитаюдих реально позволяет изменять генотип и фенотип животных. Интегрированная в геном организма чухеродная ДНК монет- устойч.чвс перелагаться в ряле поколений (Purse 1 at al. , 1GS9, Bre-м et al. ,1991).

К настоящему времени полнены трансгенн.ые >.<ыл1и, кподики,. свиньи и общ». В экспериментах на шшах научены некоторые ¿Ейкторь:, влияющие на частоту интеграции чужеродных генов. Так определено, что такте параметры как форма молекулы ДНК (линейная или кольцег.ая). концентрация ДНК, число вводимых генокопий и место введения (мужской пронуклеус или цитоплазма) окагыгают значительное влияниэ на частоту интеграции (Brinster et al.,1985). Однако, повышение частоты интеграции рекомбикантной ДНК, особенно у сельскохозяйственных хиноткых, является одной из актуальных задач в проблеме трансгенеза.

При использовании метода микрокнъекции важным является определение оптимального вромени введения рекомбинантной ДНК в мужкой пронуклеус зигот, апробация различных воздействий на геном, способствующих повышению частоты интеграции чужеродных генов. Предстоит определить особенности интеграции и экспрессии различных генных конструкций.

■ Недостаточно изучен вопрос о причинах видовых особенностей в частоте получения трансгенных животных.

1.2. Цель и задачи исследований. Настоящая работа посвящена изучению биологических факторов, влияющих на интеграцию чу/кродной ДКК в геном сельскохозяйственных

¡о'еотных.

Исходя из намеченной цели решались следующие задачи:

- определить оптимальное время проведения шкроинъекции для получения трансгенных эмбрионов кролика с использованием релортерного гена lacZ;

- последовать ьогдакпосаь использования рестриктных эидоиуклеаг для повышения частоты интеграции чужеродней ДНК в

геном кролика;

- получить тракогенных кроликов и изучить частоту интеграции двух рекомбинантньс конструкций, содержадах в себе структурный ген гормона роста крупного рогатого скота;

усовершенствовать технологию получения,

микроинъецирования и трансплантации зигот овец с целью повышения выхода животных-трансплантантов.

I. 3. Научная новизна полученных результатов.

Экспериментально установлено, что для проведения микроинъекции рекомбинантной ДНК с целью получения трансгенных кроликов следует использовать зиготы, находящиеся на стадии ранних и средних пронуклеусов, в стадии синтеза геномной ДНК.

Обнаружено повышение частоты интеграции при. совместное микроинъецировании в мукской пронуклеус зигот кроликов рекомбинантной ДНК и рестриктазы Hindi II.

Получены трансгенные кролики, содержащие в своем геноме ген mMTI/bGH.

Отработана технология, позволяющая подучить зкготы овец с визуализируемыми пронуклеусами при спонтанной охоте и после обработки животных гормональными препаратами с целью вызывания полиовуляции.

Разработана конвейерная система трансплантации микроинъецированных рекомбинантными ДНК зигот овец с использованием доноров в качестве реципиентов, что обеспечивает суягность у 40% овцематок.

1.4. Научно-практическая значимость работы:

ГЬлученные результаты могут быть использованы для повышения эффективности научно-исследовательских работ пс получение трансгенных сельскохозяйственных животных.

I. К. Апробация работы. Материалы диссертационной рабсил-доложены: на научно-методической конференции аспирантов Л колодах ученых £К2а, 1990 г.; на Всесоюзном научно-техническом совещании "Проблемы развития биотехнологии i хивотноводстре", ДуОроьицы, 19Э0 г. ; на X Всесоюзном еимпс-гиумг "Структура и функции клеточного ядра", Гродно, 19-30 г.; нг

Укракисхсй р-спублккалекх^ конференции "Екзтрхно.яогичесие дости».-ккя '>'. перспективы их эагвиткя", Ль вол, 1000 г.

1.6. H^PJJA-^ Диссертация состоит из ■;: ':-ления, оСвора

литератур;;, материала методов исследований, результатов v обсуждения, выводов и списка литературы Объем раСоты З'Э страниц, 19 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 105 рь'от, в том числе 77 на иностранных языках.

2. КАТЕРИМ И 1ЖГОДЫ ИССЛЕЖЯАЗШЯ.

Диссертационная работа выполнялась а отделе биотехнологии БЯй. с 1Ф;Зг. по 1991г.

Работа проводилась н? кроликах и овцах.

Кроликов трех пород: и:ингл:лла, белый великан и калибр.» ийзкад содержали в вивариях ЕКХа и Института прикладной микробиологии С г. Смоленск). Задействованные в эксперименте животные 6ш половозрелые, в возрасте 6-18 мое, с ливой кассой тела 2-Зкг. Крольчих-доноров использовали с целью получений зигот на разных стадиях раз вития прснуклеуеов.

Крольчих-реципиентов использовали как "суррогатных" матерей для получения потомства после трансплантации зигот микроинъецированных рекомЗинантными конструкциями.

Исследования на овцах выполняли в опытном хозяйстве "Мьш&аево" КазШШЮ и ь ОПХ "Тутаево" НПО "Ярославское." на трех породах : казахская тонкорунная, эдильбаовсяая и романовская.

Б ¡-лчестве доноров использовали овец как с естественной охотой, так и после гормональной обработки с целью вызывания оунеровуляции. К донора}/, подбирались реципиенты со спонтанной охотой или использовали для этой цели овец-доноров после 5Ы}.Щ?.аНИЛ о иг от.

В совокупности эксперименты Рыли выполнены на 1302 зиготах '■фоликов к 759 эмбрионах овец.

Зиготы из отпрепарированных яйцеводов крольчцх-донороЕ зкмывнли раствором Хенкса или средой 199, заоуферзпными 25 мМ i'EPES (pII-7,4) в часовые стекла. В среднем от каллой крольчихи

- 4 -

со спонтанной охотой получали 8,6 зигот.

' Ешывание эмбрионов у овец-доноров проводили хирургическ методом, через 24-42 часа после начала охоты.

Шд бинокулярной лупой (Nikon, Япония) осуществлл просмотр . промьшной жидкости и найденные зиготы при помо пипетки отсаживали в капельку, среды для манипуляций. Проце вымываемости зигот определяли подсчетом числа лопнувш фолликулов на. яичнике к он составлял более 99% у кроликов, 72%. до 84% у гормонально обработанных овец и 92Х у овец естественной охотой.

Собранные зиготы отделяли от эпителиальных клеток яйцево и помещали в камеру для микроманипуляций.

Шрфологическую оценку зигот выполняли на микроско (Axiovert-35, ФРГ). Особое внимание обращали на показател характеризующие степень зрелости мужского и женско пронуклеусов, их размеры, расположение, на число и разме проядрышек.

Перенос чужеродного генетического материала в ген кроликов и овец осуществляли методом прямой микроинъеки рекомбинантной ДНК в мужской пронуклеус зигот.

После микроинъекции всех зигот их осматривали на налич видимых морфологических повреждений, переносили в культуральн чашку и трансплантировали реципиенту или культивировали vitro.

Для . проведения эксперимента по получению трансгенн животных были использованы две рекомбинактные конструкции, ог из которых содержала ген гормона роста крупного рогатс скота(ЬСН), а другая - репсртерный ген -галактозидазы (lacZ рис. 1.

За время эксперимента 201 овце и 84 кроликам бь пересажено, соответственно, 759 и 1137 зигс микроинъецированных рекомбинактными ДНК.

Выявление трансгенных животных проводили методом блс гибридизации по Саузерну (Southern et al., 1982).

Выделение ДНК из тканей тестируемых животных проводили

Hiftäiu

Pitl BctoHI FraU P«tl Snil Spol IcoJtl

a.

S.II Siel

F»ll

Pnll

3-€

MTT-ftF-OKOlW 1№ОИОС1МНКЙ ГСМ Ы*Я •—I 100 ГА

Hindin ïcoRI

CUI

Sc cl

Bill

EcoBl agil

ptui: Smal I

Г

Jtsr

промоторы«« часть

Лге-vr

Agjr

Рис.1. Рестриктнзя карта рекомбинантных конструкций a) мКИ/bGH, б) RSV/lacZ.

модифицированному методу Блина и Стаффорда (Blin et al. ,1976).

. Для культивирования зигот кроликов использовали различные питательные среды. В большинстве случаев это была среда 199, в которую добавляли бычий сывороточный альбумин BSA 5-ой фракции в количестве Змг/мл и антибиотики-пенницилин 100 И. Е на мл и 50мкг/мл сульфата стрептомицина.

Культивирование проводили в капельке среды объемом 0,5-0,8 мл., лод слоем вазелинового масла, при температуре 38 С, влачюсти 93-95%, з атмосфере, содержащей 5% СО, и 951 Еоздуха.

Для выявления наличия в эмбрионах продуктов экспрессии гена lacZ мы использовали X-gal в качестве субстрата к Jb - галактозидазе.

Окрашенные эмбрионы исследовали иод микроскопом, фотографировали, и в дальнейшем они использовались для

- б -

приготовления тзталъкыл препаратов. .

а РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Результаты__культивирования__интактных_и

кикроинъе цирозанр ых ре ко мб кнакт к ьми ДНК зигот кроликов.

Эксперимент по культивированию проведен на 134 зиготах кроликов.

Зиготы извлекали ка 16-18 час после осеменения донора. В мужской пронуклеус ыикрокнъецировали рекомбинантную ДНК. Зиготы переносили в культуральные чаики и культивировали в течении 72 часов.

Общепринято считать, что оптимальное количество вводимого в мужской пронуклеус зигот раствора ДНК доллно составляет 1-5 пкл. При позыиекии объема инъецируемого раствора до 10 пкл. процент нормально гробящихся эмбрионов существенно снижается. -Возрастает число лизированных клеток и эмбрионов с аномальным делением. Нередко при выведении к-икроиглы из прокукдеуса можно наблюдать вытекание одного или двух проядрьягек в цитоплазму.

Мы изучили выживаемость зигот кроликов и исследовали дина'кку изменения объема прг.нуклеуса после введен/я в него повышенного количества раствора ДНК. После микроииъекции 10-12 пкл. раствора ре комбинат ной конструкции гМГ1/Ь(ЗН г мужской пронуклеус, только 53% зигот (14 из 24) развилось до стадии изрулы. При зтсм било установлено, что уде через 20-30 ¡.мнут после микроикъекцик, увеличенный объем понуклеуса (30-25 пкл) уменьшался до нормы (20-25 пкл.).

Результаты культивирования зигот кроликов,

микроинъецированных различными рекомбинантныхи ДНК, приведены в таблице. 1.

Как следует из результатов культивирования зигот кроликов, заяе технически оптимальное выполнение микроинъекиии снижает чис-ж) нормально дробящихся эмбрионов ка 8-16% по сравнению с контролем.

Табл. 1. Результаты 72-х часового культивирования нптактиых к ¡/икроинъецироБанных генными конструкциями гигот

КрОЛККОЕ.

Ккгеиируемый Число Останова развития Нормальное развитие

ген. ЗИГОТ. 1-клет. 2-х клет. ¡¡о морулы.

контроль 46 43 (93,4%)

тМП/ЬСЗН 33 1 1 28 (85,8%)

тМП/ЬЗН-аи 23 1 2 18 (78,2%)

35 2 3 27 (7?,1%)

Поскольку нами были запланированы опыты по изучению возможности повышения уроЕня интеграции чужеродной ДНК с использованием рестриктных эндонуклеаз, мы выполнили эксперимент по культивированию зигот кроликов, микроинъецированных одновременно ¡тМП/ьач и ШпсПП.

Раствор Н1 пс1 III (30 и/и1, Вюро1) и раствор ДНК смешивали в соотношении 1:1 непосредственно перед инъецированием. В среднем 4 пкл полученной смеси (6X10 Ед и 400 генокопий) инъецировали в мужской пронуклеус зигот кроликов. Результаты культивирования микроинъецированных зигот приведены в таблице. 2.

Табл.2. Результаты 72-х часового культивирования интактных и микроинъецированных зигот кроликов.

Число ОстглоЕка Развилось Микроинъецировано. зигот. развития. до морулы.

контроль

тмп/кзн

1ГМГ1 /ЬБН+Н1 пс1111

17 21 19

1 5

4

15 (94,1%)

16 (76,2%) 15 (78,97.)

- а -

Очовидно, что процент аягот. микроинъецированных раствором ДНК и зндонуклеазы, развившихся при культивировании до стадии морули, почти на 20% ниже, чем у интактчых зигот, но в токе время практически нет различий от выживаемости зигот, инъецированных только растворсм ДНК Этому имеется два возможных объяснения. Ео- первых, количество дзухцепочечных разрывов в геноме зигот кроликов, индуцированных использованным количеством Ншс1П 1 может быть относительно невелико и поэтому существенно не влиять на развитие эмбрионов до предимплантациониой стадии. Во- вторых, еоэможно, что система репарации клетки быстро устраняет последствия разрывов хромосомной ДНК, индуцированных рестриктазой.

3.2. Гюлученк-з и изучение эмбрионов кроликов, трансгенных по гену 1ас.г.

Нами был проведен эксперимент для выявления оптимального времени микроинъекцни чужеродных генов в мужской пронуклеус зиготы кролика Для микроинъекции мы использовали рекомбинантную конструкцию, содержащую репортерный ген 1асЪ

В опыте было задейстЕпванно 18 крольчих-доноров породы советская шиншилла, со спонтанной охотой, от которых было получено 156 зигот, из них 151 была микроинъецирована.

Инъецирование зигот раствором ДНК проводили в два срока, (табл.3,) 14.5-17 часов (1 группа опытов) и 17-19,5 часов (II группа опытов) после осеменения доноров.

Микрсинъекцив и культивирование зигот проводили стандартным методом.

Анализ материалов, систематизированных в таблице 3. показывает, что процент микроинъецирсванных зигот, остановивших свое развитие на одноклеточной стадии (чзе$з всего лизировавшихея), был выше в первой опытной группе, чем во второй, 20,6% против 6,3

Повышение числа лизировакных зигот в первой группе опытов мы пока можем объяснить особенностями техники микроинъекциу

Табл. 3. Результату культивирования зигот кроликов, микроинъецированяых геном 1ас7,

Еремл вымывания Число Бремя Количество эмбрионов, развив-

зигот. час. зигот, культи- шихся до стации

после осеменения верования 1-кл. 2-кл. 4-кл. 3-кл. 16-кл.

14,5-17 час. 30 г-i 3 б 15 б

58 48 8 1 3 7 39

17-19,5 час. 35 24 2 7 11 16

27 48 2 1 2 5 17

ранни;: зигот. Так, некоторые ранние зиготы имеет диаметр мужского пронукдеуса всего 10-15 ш., ели очень подвижные и "уходят" при попытке введения микроиглы. В этих случаях приходилось по два-три раза пытаться еводить иглу в пронуклеус зиготы, что несомненно наносило ей более сильные механические повреждения.

Из 61 эмбриона, культивированных з течении 24 часов и находящихся на 2-х. 4-х и восьми щеточной стадиях ни один не обнаружил экспрессию гена 1асЪ. Это могло быть связано либо с отсутствием интеграции введенного гена, либо с отсутствием экспрессии уже интегрированного гева.

При увеличении времени культивирования микроикъецированпых 'геном 1гсЪ зигот до 48 часов среди 45 эмбрионов первой опытней группы, развившихся до 8-16-ти клеточкой стадии, было выявлено три эмбриона, в бластомерах которых был обнаружен продукт экспрессии гена 1асй.

Процент эмбрионов, экспрессирующих р> -галактозидазу, составил з наших опытах 2,8% от -общего числа мжреинъецмровэнных зигот от числа зигот I группы -3,4% и от эмбрионов I групты рЗЭВИВВДХСЯ до стадии морулы -5,7%.

Время выбранное нами для извлечения зигот 14,5-17 часов и 17-19,5 часов после спаривания соответствовало пс данным

1С -

Опреоку к Сцопоци (Oprescu, 1955, Szollosi, 1S65) первом раунду репликации HHIi эмбрионального генома и фазе G глеточног цикла соответственно, рис.2. Все трансгенные эмбрионы был получены ча\м при исследовании зигот 1-ой опытной группы.

Таким образом, определяемая по эффекту экспресси интеграция гена lacZ наблюдалась нами при введении его в S-фазе, на ранней стадии формирования прснуклеуса зигот кролика.

Аналогичные результаты ранее были получены на мышах пр использовании плазмиды, содержащий ген казеина коровь поставленный под контроль длинных концевых повторов (LTfi вируса опухоли молочной железы мьшм (MMTR) (Исабеков и Конюхов 1989); а также на синхронизированных по цислу культурах клетг млекопитающих (Setlow, 1985).

Очевидно, что процесс репликации ДНК в зигот млекопитающих является одним из условий, способствующе интеграции экзогеньой ДНК в геном животных.

л п u н в к 17 1« » 2u г|

Рис. .Яки«мика «АЗКИТИЯ эигсти Г.РОЛКХ&. й —клегочный цикл

в —ЧЛСЫ ПОСЛС вПЛОдсТвОРКНМЯ «АЦСКЛСТЯи

В — ч«см послс покрытия донора

•СтгслкэА олтимдльыос 0РСНЯ

ммкроинъекции рскомйкнантмой им К.

3.1. Получение и исследование кроликов, трансгенных г теку горюна роста крупного рогатого скота.

Нами били проведены две серии экспериментов по получен» траисгенных по гену тМГ1/16Н кроликов. С этой целью, в обще

I * ■ I s \ * АГ~1 я

t 1 J 4 I t 7« » Ю 11 6

-----е

- il

сложности, было микроияъецироьано и трансплантировано ¿75 зигот кроликов. Для микроинъекции использовали . рекомбичантнуй конструкцию, содержанию хромосомный ген соматотропкна крупного рогатого скота bGH. В обоих экспериментах были получены траксгенные кролики, табл. 4.

В первом результативном эксперименте Сило использовано 20 крольчих-доноров пород советская ¡пишоилла, белый великан и калифорнийская. Зиготы извлекали на 15-17 час микрочнъецировали и трансплантировали реципиентам. В первом зксперементе был получен трансгенный кролик N. 23, самец, породы советская шиншилла

Трансгенньй кролик родился от реципиента породы калифорнийская, после трансплантации 15 ыикроинъецированных зигот, в псмете с двумя сестрами породы белый великан. До 5,5 мес. каких-либо бидимых морфологических отклонений от породного типа выявлено не было. К сожалению, из-за отсутствия аналогов в помете невозможно было корректно сравнить динамику изменения живой массы. При достижении возраста 5,5 мес. трансгенним кроликом было осеменено три самки породы шиншилла, которые принесли 26 крольчат. В дальнейшем было отмечено резкое снижение половой активности, а в возрасте 7 мес. у трансгенного кролика появились признаки акромегалии.

Во втором результативном опыте для микроинъекции в мужской пронуклеус зигот использовали раствор ДНК и рестриктааы Hir.dlII. В этом опыте в одном из пометов было получено сразу два трансгекных кролика Н. N. 5 и 7. На второй день после рождения, из-за плохих материнских качестЕ крольчихи-реципиента этот помет погиб.

Данный помет был получен после трансплантации '12 микроинтецированних зигот, извлеченных из яйцеводов двух доноров (шиншилла и белый великан) на 16,5 час после осеменения. Среди рожденных крольчат были два животных серой окраски -шиншиллы и два белых . При визуальном осмотре данные кролики были феиотипически нормальными и их развитие соответствовало породным нормам.

Таб. 4. Получение кроликов. трансгеннъгх по гену гормона роста крупного рогатого скота

Мифоктянция Трансплан- Кол во Окролчлось Родилось Получено трак

тировано реципиентов. смш крольчат генных жнвоткш

зигот. всего I всего % всего % I

го I

ЛТ/ЬЗИ 183 16 5 31,3 14 7,6 1 7,1

МП/ЫЗНЛИпсНИ 64 6 4 66,7 И 17.2 2 18,2

С помощью блот-гибридизации по Саузерну среди родившегося потомства были выявлены три крольчонка-трансплантанта (N. N. 5, 7 и 28), содержание в своем геноме последовательности ДНК использованной рекомбинантнсй конструкции. Подробный анализ при помощи расщепления рестриктазами Fstl, FvuIJ и BamHI позволил охарактеризовать интеграции чужеродной ДНК у каждого трансгенного кролика.

Установлено, что в геном кролика К. 5 тандемно встроилось 4-6 копий рекомбинанткой конструкции, не претерпевших каких либо видимых перестроек. Е геноме кролика N. 7 содержится единственная копия рекомбинантной конструкции на диплоидный геном, рис. 3. Рестриктный анализ дает основания предпологать,

Ъ U 5" 6 2 S 3 (О

II

1

О

CS

Рис. 3. Гибридизациокный анализ интеграции гена "MTl/bGH в ДНК из ткани уха кроликов: 1-ДНК трансгенного кролика N.80, полученного ранее (положительный контроль); 2-ДНК трзнсгенного кроли:га N. 5; 3-ДНК трансгенного кролика N. 7; 4-10-ДНК из нетрансгенных кроликов; 11-ДНК крупного рогатого окота, в количестве одной копии на диплоидный геном (положительный контроль). Во всех образцах ДНК расцепление Pstl.

С

1-2 /5^ 9 10 (( !? 1Ъ

\ . : t -t

- Vi?

Vjt^

• ri

- f r -:r ;

* " - : s % > - . t

i-f'-l

I.

; - ii

■ t ; i • r - t

l ОЗЭ |

KS

СЛ?

Рис.4. Гибридиэационный анализ интеграции гена соматотропкка крупного рогатого скога в ДНК трансгенных кроликов: 1-ДНК крупного рогатого скота, расщепленная Pstl (положительный контроль); 2 и 5-PvuII (N28); 3 и 6-PstI (N28); 4-BamKI (N28); 7 и 10 -Pstl (N7); 8-ВалШ (N7); 9-PvuII (N7); 11-BajniiI (N5); 12-PvuII (¡15); 13-Pstl (N5).

что в данном случае имеется перестройка в структурной области гена ЬСН, рис. 4. Анализ ДНК выделенной из различных тканей трансгенных кроликов N. N. 5 и 7 показал идентичную картину гибридизации для всех обследованных органов и тканей, что свидетельствует об отсутствии мозаичной интеграции рекомбиканткой конструкции у данных кроликов.

В геном? трансгенного кролика N. 28 содержится одна копия введенной генной конструкции, не претерпевшая ьаметных изменений. Рестриктный анализ дает основания предполагать,

\

- lb -

гроу- того наличке с:,'? ч-^тя генной конструкции, Естроиьазейся та»:д-'Я!0 о целой ?»пией, рис. 4. Анализ ДНК выдвд-гниоА. из тканей правого и левого уха, а тз.'ц® из крови к;юлика N. 28 зал ивечтнчнне результата

Анализ обрагвоБ ДНК» вылеленных из всех тканей трех' гранегекнш кроликов, ке подвергнутых действию рестриктаз, ЕШЕЛЯеТ гибрипизапк» В ОбЛаСТ* ЕУСОКОМОЛЭКУЛЯрКОЙ хромосомной ДНК, что -также си?етсльствует об интеграции рекомбин&нтной конструкции ft ге иоа и отсутствую в образцах каку.х-лиЬо лабораторных плазгалных -загрязнений.

3.4. Эксперименты на свиах.

Было выполнено два эксперимента.

Зсиерям5нг Н. 1. Ешолнгн в опытном хозяйстве "Мыкбаево" КззШГГИО и состоял из дзух час тел. Первая часть эксперимента при^егсна в теч-'-ние 1Р£9-19Э5 г. на 114 овцах пород казахская тонкорунная и зк'.лъбаевская.

Зиготы от супэровулироаакных доноров вымывали ка 20-41 час после первого спаривания. Раствор ДНК в обьеме 3-5 лкл. инъецировали в больший из пронуклеусов. Эмбрионы, вьгмкгые в поздние сроки (38-41 чзс после первого спаривания) и находящиеся на стадии двух бластсыеров,^ инъецировали в ядра каждого бластомера.

Морфологический анализ показал, что из зигот, полученных в вышеуказанном интервале времени, 5?. имеют на поверхности единичные иди множественные фолликулярные клетки, 13% не имеют признаков завершенности мейоза, £0% имеют в наличии только 1 солярное тельце (ПГ), 42% имеют 2 ПТ и 13Z имеют 3 ПТ. Из 180 зигот, имеющих 2 или 3 полярных тельца только у 55 ( 321) можно 5шю визуализировать один или два прояуклеуса.

Параллельно проведенный выборочный цитологический анализ 5игот и ззуклеточных эмбрионов показал, что в случае не Лнаруженчя с помощью ДКК-рптдак нсомалькш ядерных структур, зки не были обнаружены и на фиксированных препаратах, трш'отовленных с применением фиксатора Ценкзра и окрашенных

гемотаксилином Карачи.

В первой части эксперимента 1989-1990 гг было микроинъецировано и трансплантировано 428 зигот. Из них было получено 33 (7,8%) ягненка. Влет гибридизация по Сауэерну не выявила ни одного случая интеграции введенного гена в геном ягнят.

Низкий выход ягнят-трансплантантов связан по всей видимости с . большим процентом некачественных зигот, обусловленных суперовуляцией.

Вторая часть эксперемента проведена в октябре 1991г на 75 овцах породы казахская тонкорунная.

В данном опыте мы использовали такую гормональную обработку, которая вызывает малую полиовуляцию у овец и позволяет получать 2-6 зигот на донора.

Зкготы от доноров вымывали на 26-32 ч после первого спаривания, и в среднем 4,2 зиготы было получено от одного донора Микроинъекцию проводили только в пронуклеусы зигот или ядра двухбластомерных эмбрионов. Зиготы без видимых пронуклеусов в опыте не участвовали. Всего было микроинъецировано и трансплантировано 91 зкгота и 14 эмбрионов 53 овцам-реципиентам.

Эксперимент N. 2

Данный эксперимент был проведен в марте и сентябре 1991 г. в ОПХ "Тутаево" ОПХ "Ярославское", соответственно, на 35 и 80 овцах романовской порода

Зиготы извлекали из яйцеводов несупероЕулкрованкых доноров. Процент выыываемооти яйцеклеток составил 961 и в среднем 3,1 зиготы было получено одного донора

В описываемом эксперименте была применена конвейерная система трансплантации зигот, предусматривающая использование доноров в качестве реципиентов. Ока заключалось в следующем: ка разовый опыт подготавливали 6-9 животных. У первого донора хирургическим методом (разд. 3.2.) из яйцеводов вымывали зиготы, помещали их в камеру для микроманипуляций и инъецировали раствором ДНК. Затем вымывали зиготы у 2-го донора и ему сразу

яе трансплантировали микрсгшъеиирэваннче зиготы, получены-:- от 1-го донора. Зиготы от 2-гс донора трансплантировали 3-ему, от 3-го четвертому и т. д. Лоследнию трансплантацию проводили чистому реципиенту. Приведенный метод трансплантации позволял более чем в два раза снизить количество ганотных, необходимых для эксперимента. Высокий процент вымываемости зигот практически исключал рождение собстгс-нных ягнят. Еемаловаязшм являлось и то, что одновременно ь микрокнъекшюнной камере находилось не более 5-6 эмбрионов и время на их инъецирование занимало всего лиаъ 10-25 минут.

Е данном эксперименте зиготы извлекали на 28-32 час после первого спаривания, top-icлогический анализ показал, что из 269 полученных зигот, на стали;: пронуклеусов оказалось 194 зиготы (72,1%), на 2-4 клеточной стадии 32 эмбриона (11,9%) и у 43 яйцеклеток (16,0%) пронуклеусы обнаружены не были. В случае визуализации пронуклеусов микроинъекцию гена irMTl/bGH проводили в муж кой пронуклеус. При вымывании двухбластомерных эмбрионов иикрсинъс-цирогали ядра каждого бластомера. ДИК оптика в обоих случаях позволяла контролировать точность введения раствора ДНК по разбуханию ядерного материала (пронуклеуса-или ядра).

При использовании оЕец со спонтанной охотой (романовская порода; и овец, обработанных гормональными препаратами с целью вызьшавания малой полковуляпии, процент зигот, находящихся на стадии пронуклеусов, был соответственно 71% и 69%, а вместе с двухбластомерными эмбрионами, 85% в обоих случаях. При использовании яйцеклеток от суперсвулированных доноров, только 21% зигот были пригодны для микроинъекции раствора ДНК в пронуклеус.

В совокупности, за время выполнения диссертационной работы, в обоих экспериментах было микроинъецировано геном пМИ/ЬОН 506 зигот и двухбластомерных эмбрионов, которые трансплантировали 180 реципиента),!. От экспериментов 1989, 1990, и 1991гг. было получено 57 ягнят-трансплантантов. При тестировании этих ягнят не было выявлено трансгенных ллвотных. В опыте 1991г (осень) 226 зигот и эмбрионов было

- iE -

трансплантировано 115 овцам, от которых в 1392?. ожидается рождение ягнят-трансплантантов, которое буду? исследованы нз трансгенность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проведенных экспериментов на кроликах получены результаты, имеющие принципиально важное значение для повышения частоты интеграции рекомбинантной ДНК, вводимой в пронуклеус зигот. Получена группа трансгенных по гену гормона роста крупного рогатого скота кроликов.

Разработана технология подготовки овец-доноров, обеспечивающая получение у мкогоплодных животных со спонтанной охотой и одноплодных овец, обработанных- гормональными препаратами с целью вызывание полиовуляции, соответственно 2. 8 и 2,6 зигот на одного донора с визуализированными пронуклеусами. В соответствии с примененной конвейерной системой трансплантации, при которой овцы-доноры после вымывания у них зигот использовались в качестве реципиентов, оказалось возможным получить не- менее 40% суягности и выход более 25% ягнят-трансплантантов.

ВЫВОДЫ.

1. Для получения трансгенных кроликов михроикъекиии различными рекомбинантнши ДНК следует выполнять в мужской пронуклеус зигот, находящихся в S-фазе, что соответствует 14,5-17,5 часам после покрытия доноров.

2. Совместная инъекция ь мужской пронуклеус зигот кредитов гена mMTI/bGH к рестриктазы Hind III не уменьшает количества нормально дробящихся в культуре эмбрионов, по сравнению с зиготами, в пронуклеус которых был введен только раствор ДНК

3. • Получены трансгенные кролики как после совместной микроинъекции гена irMFI/bGH и реетригавзы Hindi 11, так к после введения в пронуклеус только конструкции irMTI/bGH, с частотой

интеграции соответственно 18,22: и 7,1%.

4. На многоплодных овцах со спонтанной охотой и обработанных гормональными препаратами с целью вызывания полиовуляции через 28-32 часа после первого осеменения (40-44 часа после начала охоты) можно получить до 80% зигот, с визуализированная пронуклеусамя, соответственно 2,8 и 2,6 на одного донора.

5. Использование овец- доноров в качестве реципиентов з экспериментах по трансплантации микроинъецкрОЕанных зигот дает 40% суягности и 25% ягнят-трансплантантов.

ПРАКТЙЧЕСЖЙБ ПРЕДЖКИШа

1. Для повышения частоты интеграции микроинъецированных рекомбинантных ДНК в геном кролика, следует использовать зиготы, находящиеся в фазе синтеза ДНК.

2. В экспериментах по получению трансгенных овец рекомендуем разработанную технологию подготовки животных, обеспечивающую получение до 80% зигот с визуализирующими пронуклеусами и рождения из микроинъецировышых рекомбинантными ДНК зигот более 25% животных-трансплантантов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.. -

1. Гольдман,}!. JL , Башкеев Е. Д. , Гоголевский II А. . Метод, повышения эффективности трансплантации эмбрионов овец, микроин'ьецированных рекомбинантными ДНК // Рац: предложение N. 1/240, ВИЖ, 1989.

2. Эрнст JL К , Гольдман И. JL , Семеноза R А. , Морзуков С. П., Сшрокоз О. К. , Енкколопов Г. Н., ладанов А. В., Базылев С. Ё. , Гоголевский П. А. Фенотипический эффект трансгенности по гену гормона роста крупного рогатого скота у кролика // Доклады ВАСХНШ1 -1990. -N6. -с. 32-36.

3. Семенова В. А. . Гольдман И. Л , Базылев С. Е. , Гоголевский П. А. и др. Трансплантация зигот кроликов, микроинмцированных рекомбинантными ДНК // Доклады ВАСЖИЛ -1990. -НИ. -с. 51-54.

4 Гольдман И. Л.. Семенова В. А., Базылев С. Е., Гоголевский П. А. Изучение роста и развитие трансгекного кролика по гену гормона роста крупного рогатого скота // Тез. докл. Всесого. науч. -тех. совещания "Проблемы развития биотехнология в животноводстве" -ЕИЖ. -Дубровицы -1990. -с. 94-95.

5. Семенова К А., Базылев . С. 2. , . Гоголевский П. А. Биотехнология получения траксгенных кроликов // Тез. докл. I респ. науч. конф. "Биотехнологические достижения и перспективь их развития" -Львов -1990. --с. 119-120.

6. Гольдман И. Л. , Башке ев Е. Л., Семенова К А. , Гоголевский П. А. Трансплантация микроинъецированных рекомбинантными ДН? зигот с целью получения трансгенных овец // Тез. докл. I респ. науч. конф. "Биотехнологические достижения и перспективы их развития" -Льеов -1990. -с. 113.

7. Гольдмак Я Л , Семенова К А. , Гоголевский П. А. и др. Фенотилический эффект экспрессии гена гормона роста крупного рогатого скота у кролика // Тез. докл. Х-го Всесоюз. сиып. "Структура и функции клеточного ядра" -Гродно -1990. -с. 41.

8. Гоголевский П. А. , Гольдман К. Л. , Гусев ЕЕ и др. Исследование экспрессии гена -галактозидазы в трансгенных ранних эмбрионах кроликов // Доклады ВАСХНКЛ -1991. -N10. -с. 38-43.

9. Гоголевский И А. , Гольдмак К. Л. , Жаданов А. Е. и др. Изучение возможности использования рестриктных окдоиуклеаз для повышения частоты интеграции чужеродных генов // Докладь ВАСХНИЛ -1991. -N12. -с. 24-26.