Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические процессы у свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические процессы у свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH"

На правах рукописи

И

I ЦОЛТАВЦЕВА РИММА АЛЕКСЕЕВНА

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ У СВИНЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПО КОНСТРУКЦИИ

\VAP-hGH.

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКОВСКАЯ ОБЛАСТЬ, п. ДУБРОВИЦЫ 1997 год

1 ^

V

Работа выполнена в период с 1993 по 1997 год в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Научные руководители - Вице-президент РАСХН, академик Л.К. ЭРНСТ,

- кандидат биологических наук, ВИЖ В.М. АФАНАСЬЕВ

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, ВИЖ

Н.С. МАРЗАНОВ

- кандидат биологических наук, ВНИИФБиП В.П. РЯБЫХ

Ведущее учреждение - Биотехцентр РАСХН

Защита диссертации состоится '"I? " Ц ЮУч ^_ 1997 г.

в '"Ю " часов на заседании диссертационного совета Д 020.16.02 при Всероссийском научно - исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института. Автореферат разослан И АА_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор с.-х. наук Н.В. Груздев

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Современная биотехнология является новейшей отраслью биологии и в настоящее время интенсивно развивается во всем мире.

Одним из наиболее актуальных направлений биотехнологической науки является изменение генома эукариот ( в том числе сельскохозяйственных животных ) методами генетической инженерии с целью придания им нужных качеств.

В последнее десятилетие развернут широкий фронт исследований по созданию грансгеиных животных с конечной целью повышения продуктивности, использования их, как продуцентов биологически-активных веществ, получения трансгенных животных с повышенной устойчивостью к инфекционным заболеваниям, применения этих животных в качестве биомоделей в медицине, а также для ксено грансплан гацни органов и тканей (Л.К.Эрнст,1993: K.Ward, 1991).

Наступает совершенно новый этап в развитии животноводства, когда традиционный ассортимент продуктов животноводства будет постепенно расширяться за счет продуктов биотехнологии.

Новым важным направлением генетической инженерии является получение сельскохозяйственных животных-продуцентов биологически-активных веществ, необходимых в медицине, ветеринарии и технологии переработки продуктов животноводства.

Многочисленные успешные работы ряда исследователей по получению трансгенных животных, как лабораторных (в основном мышей), так и сельскохозяйственных животных, продемонстрировали широчайшие возможности использования ме-юда генетической трансформации генома организма (Palmiter, R..I986; Gordon К.. 1987; Brem G.,1989).

Применение такого подхода сделало возможным изучение влияния различных регуляторных элементов на уровень и тканеспенифичность экспрессии генов и выяснение влияния экспрессии интегрированных генноинженерных конструкций на организм животного.

Совместными усилиями российско-германских ученых были созданы свиньи, трансгенные по конструкции WAI'-hGH и по конструкции niMTI-hGRF. Конструкция WAP-liGH состоит из структурной части гена гормона росга человека (human growth liormon, liGH) и промотора гена кислого белка сыворотки молока мышей (whey acidic protein, WAP) длиной 2.6 kb. Рекомбинантная генная конструкция

тМТЫЮЯР содержит структурную часть гена рилизинг фактора гормона роста человека (1ЮЯР) и металлотионеиновый промотор1 мыши (шМТ1).

Получение этих животных выдвинуло на первый план необходимость изучения особенностей физиолого-биохимических процессов у трансгенных животных, как у родоначальников (Р0), так и у их потомков (Рп^и выяснения,происходит ли при специфической экспрессии в молочной железе синтез протеина в крови и других тканях, и оказывает ли протеин в результате этого влияние на организм трансгенного животного.

Цель и задачи исследований:

Целыо наших исследований было выявление особенностей физиолого-биохимических процессов в организме свиней, с интегрированной в геном рекомби-нантной генной конструкцией \VAP-hGH.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить потомков от хряка, трансгенного по рекомбинантной генной конструкции \VAP-hGH и определить их трансгенность в ряде поколений методом по-лимеразной цепной реакции (ПЦР).

2) Получить моноклональные антитела (МКА), специфичные к ИОН и разработать на их основе тест-систему для определения гормона роста человека в биологически-активных жидкостях и тканях.

3) Определить уровень экспрессии гена гормона роста человека в организме трансгенных свиней, с помощью полученных МКА, специфичных к ИОН, методами иммуноферментного и иммуногистохимического анализа.

4) Выявить особенности физиолого-биохимических процессов в организме трансгенных свиней, определить активность дегидрогеназ лимфоцитов и лизосо-мально-катионных белков нейтрофилов.

5) Проанализировать хозяйственно-полезные признаки полученных потомков.

Ряд исследований выполнен на свиньях, трансгенных по двум конструкциям -

\УАР-ЮН и тМТМЮЯР.

Научная новизна работы.

Впервые выявлены особенности физиолого-биохимических процессов в организме свиней, с интегрированной в геном конструкцией, содержащей структурную часть гена гормона роста человека с промотором гена кислого белка сыворотки молока мышей.

Показана потенциальная возможность использования ^молочной железы| сельскохозяйственных животных, в частности свиней, в качестве продуцентов биологиче-

ски-активных веществ. Установлено, что свиньи, трансгенные по рекомбинантиой генной конструкции \VAP-hGH, продуцируют с молоком гормон роста человека в концентрации от 30 до 85 нг/мл.

Экспрессия генноинженерной конструкции \VAP-liGH, интегрированной в геном свиней, не носит строго тканеспецифического характера. Наряду с клетками молочной железы экспрессия данной конструкции наблюдается в клетках поджелудочной и слюнных желез.

Интегрированная генноинженерная конструкция \VAP-hGH экспрессирует в гипофизе трансгенных свиней, вызывая секрецию гормона роста человека в кровь свиней до уровня 12-30 нг/мл.

Секреция гормона роста человека в кровь трансгенных свиней способствовала снижению возраста достижения живой массы 100 кг в сравнении с контролем, что свидетельствует об отсутствии абсолютной видовой специфичности гормона роста человека по биологическому действию на организм свиней.

В организме свиней, трансгенных по конструкции \VAP-hGH, происходит изменение метаболических процессов в сторону снижения липогенеза, отмечена тенденция к снижению толщины шпика в сравнении с контрольными животными.

Получены МКА к ИОН, пригодные в качестве универсальных реагентов для определения содержания гормона роста человека. На их основе разработана тест-система для определения концентрации гормона роста человека в биологически-активных жидкостях в организме человека и трансгенных по гену гормона роста человека свиней. Тест- система пригодна для использования в методах иммунофер-ментного анализа (ИФА).

Определены иммунобиологические особенности трансгенных свиней, путем анализа ферментной активности дегидрогеназ лимфоцитов и лизосомалыю - катион-ных белков нейтрофилов.

Практическая значимость работы:

1) Определены биологические особенности развития трансгенных свиней.

2) Установлены особенности гематологических и цитохимических показателей крови трансгенных свиней.

3) Полученные моноклональные антитела к гормону роста человека, позволяют определять его концентрацию в организме человека и трансгенных по этому гену свиней.

4) Предложен тест-набор для определения содержания гормона роста человека в биологически-активных жидкостях и экстрактах тканей.

5) С использованием тест-набора проведено определение концентрации гормона роста у пациентов в клинике Медицинской академии последипломного образования (г. Санкт-Петербург). Имеется акт о внедрении разработанной тест- системы в практику.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на заседании отдела биотехнологии ВИЖа, на годичном отчете по биотехнологии в РАСХН, на II международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных", Киев ,1996 .

По материалам диссертации опубликовано две работы.

Структура и обьем работы:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы. Объем диссертации /¿J страниц машинописи, включает 14 таблиц и 12 рисунков. Список литературы включает 221 источник, в том числе 146 на иностранных языках.

2. Материалы и методы исследований.

Работа выполнена в период с 1993 по 1997 год в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Краткая схема исследований:

I. Получение потомков хряка, трансгенного по конструкции WAP-hGH.

II. Идентификация трансгена в ряде поколений.

III. Получение моноклональных антител к гормону роста человека.

IV. Выявление экспрессии генной конструкции WAP - hGH:

1. Иммуноферментным методом с помощью МКА к hGH.

2. Иммуногистохимическим методом с помощью МКА к hGH.

V. Изучение физиолого-биохимических параметров, в том в числе:

исследование метаболизма: 1) на тканевом уровне;

2) на клеточном уровне;

VI. Хозяйственно-полезные признаки трансгенных свиней.

Исследования проводились на помесных свиньях (крупная белая х ландрас) в экспериментальном хозяйстве ВИЖа "Кленово-Чегодаево".

Первое поколение (Fi), трансгенных по конструкции WAP-hGH свиней, было получено в результате искусственного осеменения нетрансгенных ремонтных свинок семенем трансгенного хряка N 6660, с интегрированной генноинженерной конструкцией WAP-liGH. Семя животного было предоставлено проф. Г. Бремом, Австрия.

Для получения II поколения (F2), трансгенных свинок (Fi) осеменяли семенем хряка N 31, трансгенного по конструкции niMTl-hGRF.

При получении III поколения (Fj), использовали семя хряка N 117 (F2), содержащего в геноме две конструкции - WAP-hGH и mMTI-hGRF.

Трансгенных свиней IV поколения (F4 ) получали путем осеменения свинок, трансгенных по конструкции WAP-hGH или по двум конструкциям -WAP-hGH и (MTl-hGRF, хряками (полусибсами), с интегрированной в геном рекомбинантной конструкцией mMTI-hGRF.

Трансгенность потомков определяли методом ПЦР.

Содержание и кормление свиней осуществляли согласно технологии, принятой в экспериментальном хозяйстве ВИЖа "Кленово-Чегодаево".

На всех этапах исследований в качестве контроля использовали нетрансгенных свиней, которых отбирали по принципу аналогов (порода, возраст, масса тела, общее развитие).

Для целенаправленной экспрессии гена юрмона роста человека в клетках молочной железы, в конструкции WAP-hGH структурная часть гена hGH была сцеплена с 5 '- концевой последовательностью длиной 2.6 кЬ промотора гена сывороточного кислого белка молока мышей (WAP).

Определение тканеспецифичной экспрессии трансгена в молочной железе проводили методом иммуноферментного и иммуногистохимического анализа. Для выполнения этих экспериментов получили моноклональные антитела, специфичные к гормону роста человека.

Для получения моноклональных антител использовали гибридому, полученную в отделе биотехнологии ВИЖа.

В нашей работе мы применяли способ получения МКА in vivo - путем выращивания асцитных опухолей у мышей линии Balb/C.

Выделение МКА из асцитной жидкости проводили с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией.

Для определения эффективности экспрессии рекомбинантной генной конструкции WAP-hGH и двух конструкций-WAP-hGH и mMTI-hGRF у трансгенных лак-тирующих свиноматок III поколения проводили отбор проб молока , крови, слюны.

внутренних органов (сердце, печень, легкие, почки), мышц, а также молочной, поджелудочной и слюнных желез.

Уровень экспрессии трансгена в молоке, крови, слюне и экстрактах тканей определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ELISA) на основе моноклональных антител, специфичных к гормону роста человека. При помощи стандартного тест-набора (производство фирмы "Монсанта") определяли концентрацию свиного гормона роста в крови трансгенных и контрольных свиней.

Биохимические показатели в сыворотке крови, в длиннейшей мышце спины и в ткани печени: общий азот, общие липиды, фосфолипиды, холестерин определяли пс общепринятым методикам (Кондрахин И.П.. Курилов Н.В., Малахова И. Г. и др. 1985).

В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, определяли лейкограмму крови.

Для характеристики состояния процессов энергетического метаболизма в организме свиней определяли активность внутриклеточных ферментных систем: сукци натдегидрогеназы (1.3.99.1), СДГ; а-глицерофосфатдегидрогеназы гиалоплазмати ческой (1.1.1.8), а - ГФДГ ( г); а-глицерофосфатдегидрогеназы митохондриально? (1.1.99.5), а -ГФДГ (м); глюкозо-бфосфатдегидрогеназы (1.1.1.49), Г-6-ФДГ; НАДН дегидрогеназы (1.6.99.3) и НАДФ-Н-дегидрогеназы (1.6.99.1) лимфоцитов перифери ческой крови количественным цитохимическим методом (по методике Нарциссов; Р.П., 1988).

После проведения цитохимической реакции, в мазке крови в 50 лимфоцита; подсчитывали количество гранул формазана - продукта п-нитротетразолия фиолето вого и определяли среднюю арифметическую активность клеточной популяцш ( гранул / лимфоцит).

В нейтрофилах крови определяли лизосомально-катионные белки, тест основа: на использовании анионового красителя прочного зеленого, обеспечивающего сум марное цитохимическое выявление катионных белков: миелопероксидазы, катепсин С, лактоферрина, эластазы, дифенсина, лизоцима ( по методике Пигаревского В.Е, 1989). В качестве статистического показателя использовали средний цитохимическш коэффициент (СЦК).

Для числового контроля за качеством цитохимических реакций использовал! два параллельных препарата.

Из хозяйственно-полезных признаков ( при жизни ) оценивали по общеприня тым методикам: живую массу, прирост :;>ой массы, возраст достижения живой мае

сы 100 кг (в днях); среднесуточный прирост (г) с момента рождения до достижения живой массы 100 кг; среднесуточный прирост (г) с 2 месяцев до достижения живой массы 100 кг; длину туши ( см ); толщину шпика (мм) над 6-7 грудными позвонками при достижении живой массы 100 кг.

Данные обработаны биометрически на персональном компьютере IBM PC в программе "КАРЛТ".

3. Результаты собственных исследований .

3.1. Получение потомства и идентификация трансгенности в ряде поколений.

Трансгенные животные представляют определенную ценность и могут быть использованы в практике животноводства лишь в том случае, если они стабильно передают интегрированный ген потомству. В связи с этим, и исходя из поставленных задач, в процессе проведения работы были получены и проанализированы на транс-генность 4 поколения трансгенных свиней: 1) по рекомбинантной конструкции WAP-hGH; 2) по конструкции mMTI- hGRF; 3) по двум конструкциям - WAP-hGH и mMTI-hGRF;.

Для анализа трпнсгснностн потомков, использовали метод 111ДР.

Для амплификации конструкции WAP-hGH использовали следующие праймс-ры: liGH-FW : 5'-GAAGGGGAGGGAGGAAAATGAA-3'; liGH- RV:5'-TGGGGAG-GGGTCACAGGGAT-3' ( праймеры предоставлены проф. Г.Бремом, Австрия).

Для амплификации рекомбинантной конструкции шМП-hGRF использовали следующие праймеры: RCSI-5- GCTATCTTCACTAACTCTTACCG-3'; RCS2: 5'-TGCCACTCATCGCAGTACTGTTGT-3' ( праймеры предоставлены Г.А. Дворянчи-ковым (ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных).

Из 199 проанализированных свиней (Fi-F-i), у 144 в результате амплификации геномной ДНК синтезировался один или оба, соответствующей длины, фрагмент ДНК, то есть эти свиньи были трансгенными. Трансмиссия трансгена в поколениях (F1-F4) представлена в таблице 1.

Результат одного электрофорегического анализа продуктов амплификации геномной ДНК новорожденных поросят III поколения (п = 6), тестируемых на присутствие генной конструкции WAP-hGH (фрагмент гена гормона роста человека длиной 318 Ьр) в геном представлен на рис. 1.

Рис. 1. ПЦР - анализ на наличие в геноме исследуемых поросят, рекомбинант-ной генной конструкции \VAP-liGH. 1 2 3 4 5 6 7 8

1 - ДНК нетрансгснного животного;

2 - 6 - ДНК трансгенных животных:

7 - отрицательный контроль, ДНК заведомо нетрансгенного животного;

8 - положительный контроль, ДНК заведомо трансгенного животного:

Наличие данного фрагмента ДНК (318 bp) в электрофореграмме, позволяет судить о присутствии в геноме исследуемых поросят, генной конструкции WAP-hGH.

3.1.1. Получение трансгенных потомков.

Первое поколение (Fi), трансгенных по конструкции WAP-hGH свиней, было получено в результате искусственного осеменения нетрансгенных свинок семенем трансгенного хряка N 6660. с интегрированной генноинженерной конструкцией WAP-hGH. Плодотворным осеменение было у 2 свинок.

В результате осеменения было получено 9 животных (3 хрячка и 6 свинок), все свинки (100 %) были трансгенными по WAP-hGH (66,6 % от числа родившихся потомков), а хрячки не содержали в геноме данную генную конструкцию (табл. 1).

Для получения II поколения (F2), трансгенные по конструкции WAP-hGH свинки N7 и N 10 были спарены с хряком N 31. трансгенным по конструкции mMTl-hGRF. В результате этого осеменения было получено 12 потомков( 4 хрячка и 8 свинок), из них 11 были трансгенными (91,7%); конструкция WAP-hGH была выявлена у двух свинок (25 % от общего числа свинок и 16.6 % от общего числа полученных поросят). Конструкция mMTl-hGRF была обнаружена у 6 животных. По двум генам трансгенными были 3 поросенка, две свинки и один хрячок N 117, который в дальнейшем был использован для получения III поколения.

Для получения III поколения (F3), семенем хряка N 117, трансгенного по двум конструкциям - WAP-hGH и mMTl-hGRF, была осеменена 21 ремонтная нетранс-генная свинка. Получено 12 опоросов - 130 порося г. По данным ПЦР-анализа из 130, трансгенными были 89 поросят (68,5 %), из них 56 свинок, в том числе 32 были

рансгенными по конструкции WAP-llGH (32,8 % от общего числа свинок; 16.2 % >т общего поголовья поросят).

Таблица 1

Трансмиссия трансгена в поколениях.

Группы животных Число животных . гол. Из них трансгенных по конструкции:

\VAP-liGH, гол. % \УАР- 1ЮН и шМТМЮКР, гол. % шМТ1- ЬСЯР. гол. %

I поколение

Хрячки 3 - - - - - -

Свинки 6 6 100,0 - - - -

Всего 9 6 66.6 - - - -

II поколение

Хрячки 4 - - 1 25,0 3 75,0

Свинки 8 2 25,0 2 25,0 3 37,5

Всего 12 2 16,7 3 25,0 6 50.0

III поколение

Хрячки 66 - - - - 33 50,0

Свинки 64 32 50,0 21 32.8 3 4.68

Всего 130 32 24,6 21 16,2 36 27,7

IV поколение

Хрячки 28 3 10,7 14 50,0 6 21,4

Свинки 20 2 10.0 8 40,0 5 25.0

Всего 48 5 10.4 22 45,8 11 22.9

Хрячков, трансгенных по рекомбинантной генной конструкции \VAP-hGH или по двум конструкциям - \VAP-hGU и тМТМЮКР получено не было, как и в I поколении. Хрячки, грансгснные но конструкции тМТЫ^ЖР составили 50 % от общего числа хрячков.

Для получения IV поколения (Ра), свинки, трансгенные по конструкции \VAP-

ЬСН или по двум конструкциям - \VAP-hGH и шМТ1- ЬС1?Рбыли осеменены трансгенными хряками (полусибсамп). с генной конструкцией тМТЬЬСЯР. Было получено 48 поросят, в том числе трансгенных - 38 поросят (79,1 %).

При этом по конструкции \VAP-hGH выявили 5 голов, в том числе 3 хрячка (10,7 % от общего числа хрячков) и 2 свинки (10 % от общего числа свинок), что составило 6,3 % и 4 % от общего поголовья потомков соответственно. По двум конструкциям -УУ/М'-ИСН н тМ'ГЫЮЯР трапсгснными были 22 поросенка , из них 14 хрячков (50 % от общего числа хрячков) и 8 свинок (40 % от общего поголовья свинок), 29,1 % и 16,1 % от всего поголовья соответственно.

Таким образом, нами была определена способность трансгенных родоначальников, а затем потомков передавать трансген по наследству.

3.2. Выявление экспрессии гена гормона роста человека в организме трансгенных свиней иммуноферментным п нммупогистохммическнм методами.

Использование трансгенных животных в биотехнологических целях представляется перспективным, если интегрированная генная конструкция эффективно экс-прессирует.

Тканеспецифическую экспрессию в молочной железе определяли методом им-муноферментного и иммуногистохимического анализа. Для этого были получены моноклональные антитела, специфичные к гормону роста человека, используя имеющуюся в отделе биотехнологии ВИЖа гибридому.

3.2.1. Получение, очистка н характеристика моноклональных антител, специфичных к гормону роста человека.

Для получения асцитных препаратов, мышам линии Ва1Ь/С внутрибрюшинно инокулировали взвесь гибридоидных клеток в концентрации 1,0-1,5*107/мл. Предварительно. за 10-14 суток мышам вводили 0,5 мл пристана.

Специфичность асцитных и культуральных препаратов моноклональных антител к гормону роста человека определяли специально отработанным методом твердофазного иммуноферментного анализа типа "сэндвич". Результаты опытов по получению асцитных препаратов МКА приведены в таблице2.

Таблица 2

Получение асцитных препаратов и титр моноклональных антител к гормону роста человека.

Название Количество Срок образования Объем Максималь-

клона мышеи, асцита, сутки асцита , мл ный титр

гибридомы взятых для антител

получения первичное перевивка

асцита введение

клон-1 10 13-14 10-11 3,5-5 5*105

клон-2 10 12-14 10-12 4-6 1*106

Асцитные опухоли образовывались у мышей в течение 12-14 суток после инъекции клеток, причем образование опухолей отмечалось у 100 % привитых животных. Количество асцитной жидкости составило в среднем 4-5 мл от одной мыши. Все клоны обладали способностью перевиваться от мыши к мыши, при этом в первом же пассаже формирование асцитных опухолей ускорилось до 10 суток.

Максимальный титр МКА в асцитной жидкости достигал 5 *105 (клон N I) и 1*106(клон N 2). Титры специфич них антител в асцитных жидкостях являлись качественной характеристикой гибридомных клонов и не менялись в зависимости от кратности пассажей.

Моноклональные антитела к liGH выделяли, проводя осаждение сульфатом аммония с последующей ионнообмениой хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

3.2.2. Определение экспрессии гормона роста человека в молоке, слюне н экстрактах тканей трансгелных и контрольных свиней.

Ткансспецифическуто экспрессию в молочной железе изучали у лактирующих свиноматок, трансгенных rio конструкции WAP-hGH (F3) и у трансгенных по двум конструкциям - WAP-hGH и mMTI-hGRF(pi).

Уровень экспрессии гормона роста человека в молоке определяли методом им-муноферментного анализа типа "сэндвич", на основе моноклональных антител, специфичных к гормону роста человека, используя 96-ти луночные микропланшеты из полистирола фирмы "Costar"(CIIIA), согласно разработанной нами методике.

Для калибровки тестовой системы использовали гормон роста человека, производство МПО " Фермент" г. Вильнюс.

Пробы молока отбирались с момента опороса ( первое доение ) и в течение 42 дней до отъема поросят с периодичностью 7 дней ( всего 7 доений ). Как показал иммуноферментный анализ, содержание hGH в молоке трансгенных свиней в течение лактации варьировало от 30 нг/мл до 85 нг/мл (табл.3).

Таблица 3

Концентрация гормона роста человека в молоке трансгенных и нетранс! енных свиноматок III поколения (п=10), нг/мл, (М + ш).

№ пробы (день лактации) Трансгенные свиньи по конструкции: Негрансгенные свиньи

WAP-hGH WAP-hGH и mMTl-hGRF

1(1-н день) 26.4 + 3,6 20,3 + 2,6 0

2(7 "-") 41,4 + 5.8* 28,0 + 2.3 0

3(14"-") 53,8+.7,7** 34,3 + 1,9 0

4(21"-") 63,6 + 4.9* 42.3 + 2.6 0

5(28 "-") 78,6 + 7,3* 47,3 + 4.8 0

6(35"-") 55,8 + 6,6* 40,3 + 3,9 0

7(42"-") 46.0 + 4,1** 31,6 + 2,1 0

*Р< 0,05; **Р < 0.01-в сравнении трансгенных свиней между собой.

Анализируя полученные данные, мы установили, что концентрация гормона роста человека в молоке свиней, трансгенных по конструкции \VAP-hGH, была минимальной в первый день лактации, составив в среднем - 26,4 нг/мл и постепенно возрастала, достигая концентрации 78,6 нг/мл к 28 дню, затем происходило снижение концентрации до 35 нг/мл к 42 дню.

При сравнении уровня концентрации гормона роста человека в молоке свиней, трансгенных по конструкции \VAP-liGH и по двум конструкциям - \VAP-hGH и тМТЫЮЯР, мы отметили, что он был значительно ниже у свиноматок, трансгенных по двум конструкциям, так максимальная концентрация гормона роста человека у них составила 54 нг/мл против 78.6 нг/мл у свиней, трансгенных по конструкции \VAP-hGH.

В качестве отрицательного контроля использовали молоко нетрансгенных свиноматок, в котором гормон роста человека не был обнаружен. Положительным контролем служила лекарственная форма гормона роста человека ( производство фирмы МПО "Фермент"). Для получения достоверных данных все анализы проводили с 3-х кратным повтором.

С помощью твердофазного ИФА с использованием МКА к ЬСН проводили исследование слюны и экстрактов тканей трансгенных и нетрансгенных свиней.

Исследовались следующие ткани: сердце, печень, почки, легкие, мышцы, фун-дальная часть желудка, щитовидная, поджелудочная и слюнные железы.

В результате проведенного анализа, достоверных данных о наличие гормона роста человека в экстрактах исследованных тканей трансгенных свиней получено не было. Из вышеизложенного можно высказать следующее предположение: если гормон роста человека и содержится в исследуемых образцах тканей, то его концентрация выходит за рамки чувствительности примененного метода.

Уровень экспрессии гормона роста человека в слюне составил 5-7 нг/мл.

3.2.3. Определение гормона роста человека н гормона роста свиньи в крови трапсгепных и нетрансгенных свиней.

Определение наличия гормона роста человека (ИОН) и гормона роста свиньи (рйН) в крови лактирующих и нелактирующих трансгенных свиней проводили методом иммуноферментного анализа типа " сэндвич" .

Для определения содержания гормона роста человека использовали разработанную нами тест- систему. Калибровочную кривую строили, используя лекарственную форму гормона роста человека, производство МПО " Фермент" г. Вильнюс.

Концентрация гормона роста человека у лактнруюншх свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH составила 20,4 нг/мл и была в 2 раза выше, в сравнении со свиньями, трансгенными по двум конструкциям - WAP-hGH и mMTl-hGRF, у которых она была 9,5 нг/мл (табл.4).У нелактирующих свиней концентрация гормона роста человека была значительно ниже н составила 15.6 нг/мл и Ю.5" нг/мл соответственно.

Таблица 4

Концентрация гормона роста человека и гормона роста свиньи в крови трансгенных и нетрансгснных свиноматок 111 поколения, нг/мл, (М + т),

(а=10).

№ пробы Трансгенные свиньи по конструкции: Негрансгенные СПИНЫ)

WAP-hGH WAP-hGH и mMTl-hGRF

hGH pGH hGH pGH hGH pGH

Цлакгиругащие) 2( нелактирующие) 20,4+1,5 15,6+0.8 8,6+0,7 8,4+0,97 9,5+0,96 10,5+0,8 14,5+0,8** 13,4+0,63*** 0,0 0,0 8,3+1,9 7,28±0,8

**Р< 0,01;***Р < ^ffll-в сравнении с контролем.

В кропи нетрачегенных свиней гормон роста человека не был обнаружен, а концен грация гормона роста свиньи была почти на одном уровне в сравнении со свиньями, трапа сными но конструкции \VAP-hGII и ниже в сравнении со свиньями, фансгсиными по двум конструкциям - ШДР-1ЮН и тМТМЮИР

3.2.4. I Ьшунш истохимичсекое исследование экспрессии с помощью Мк'Л.

Пммуногистохимичсская окраска срезов ткани молочной железы лактирую-щих свиней подтверждает присутствие гормона роста человека во всех частях секре-юрных клеток, окрашиваемых тканей.

На гистоло! ическнх препаратах у трансгеных свиней обращает на себя внимание протоковая ткань поджелудочной и слюнных желез, а также ткань гипофиза, в которых наблюдается положительная реакция на гормон роста человека. В железах окрашивание п основном наблюдается в просвете протока и по апикальному краю железистых клеток.

У нетрансгснных животных признаки положительной реакции на гормон роста человека не наблюдали, что свидетельствует об очевидном присутствии гормона ро$,-та человека у трансгенных свиней и его отсутствии у контрольных.

В образцах тканей внутренних органов (сердце, печень, почки, легкие) и мыши трансгенных свиней присутствие гормона роста человека не было обнаружено.

3.3. Физиологические и биохимические процессы в организме трансгенных н контрольных свиней.

Важным разделом исследований по изучению трансгенных свиней является выявление особенностей физиолого-биохимических процессов у этих свиней.

Анализируя биохимические параметры крови трансгенных и нетрансгенных свиней, следует отметить, что они находились в пределах физиологической нормы. Вместе с тем, основной целью изучения биохимических показателей крови, является выявление даже незначительных сдвигов в обмене веществ, происходящих в пределах физиологических границ изучаемых показателей, в связи с уникальностью исследуемых животных.

У свиней, трансгенных по конструкции \VAP-hGH содержание общих липидов было снижено на 13,7 % в сравнении с контролем и на 8 % в сравнении с трансгенными по двум конструкциям - \VAP-hGH и тКТП-ЬСЯР животными, содержание фосфолипидов было на одном уровне в обеих группах трансгенных животных, а в сравнении с контролем ниже на 15,6 % (табл. 5).

Таблица 5

Биохимические показатели липидного обмена в крови трансгенных и нетрансгенных свиней 111 поколения, (М ±_ ш), ,___(п=10).__

Показатели. мг% Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи

WAP-hGH WAP-hGH и mMTl-hGRF

Общие липиды 200,2 ± 15,3 216,7+18,0 231,8 ± 16,6

Фосфолипиды 77,5 + 3,5 77,5 + 3,5 91,8 ± 9.3

Холестерин 72,5 ± 1.6 73,7+1,7 80,6 + 4,9

Содержание холестерина у трансгенных по конструкции \VAP-hGH свиней в сравнении с контролем было ниже на 10 %. а у свиней, трансгенных по двум конструкциям -\VAP-hGH и тМТЫЮКР на 8.6 %, между собой трансгенные животные отличались на 1,7 %.

Для изучения специфичности процессов метаболизма, а также для определения биохимических показателей был произведен убой 4-х контрольных и 4-х трансгенных свинок (две с конструкцией WAP-hGH и две с конструкциями-WAP-hGH и mMTl-hGRF). Анализ проводился в образцах длиннейшей мышцы спины и тканях печени (табл.6).

Таблица 6

Биохимические показатели липидного обмена в длиннейшей мышце спины и тканях печени у транаенных и нетрансгенных свиней III поколения,

(М ±_ т).

Показаicjih. mi% Трансгенные свиньи но конструкции: Нстрансгенные

WAP-liGH WAP-liGII и inMTl-hGRF свиньи

Длиннейшая мышца спины

Общие липиды Фосфолипиды Холестерин 168.8 ± 11,3 194,2 ±13,8 57,5 ±1,2 76,2 ±1.8 56,0+1,4 70,0 ±2,3 Печень 266,6 ± 18,2 115.0+ 1,4 94,0 ±_ 8,5

Общие липиды Фосфолипиды Холестерин 741.4 + 28,1 361.5 ±48,0 264,7 + 18,1 749,6 ±33,1 392,5 ± 35.3 265,0 ±21,2 772,9±24,6 402.9±50,7 263.0±17.5

Анализируя результаты биохимических показателей липидного обмена в длиннейшей мышце спины и гкани печени, отметили тенденцию к снижению липидных фракций у трансгенпых свиней п сравнении с нетрапегенными.

Содержание общих лппидов, фосфолипидов и холестерина в длиннейшей мышце спины у трансгенных по конструкции \VAP-hGH свиней, было ниже, чем в контроле на 36.7 %, 50,0 % и 40.5 % соответстпенно. а у свиней, трансгенных по двум конструкциям- \VAP-hGH и тМТ1-1)01*Р ниже на 27 %, 34 % и 25,5 % соответственно.

В печени у трансгенных свиней также отмечается тенденция к снижению уровня общих липидов, фосфолипидов и холестерина.

Достоверность не определяли в связи с малочисленностью животных в группе убоя (п=2).

Полученные данные по содержанию общего азота в тканях свидетельствуют о том, что в крови трансгенных но конструкции \VAP-hGII свиней (п=10), содержание общего азота повышено на 15 % , а у свиней, трансгенных по двум конструкциям-\VAP-hGH и тМТ1-ЬС1?Р — на 18 %, в сравнении с контролем (табл.7).

Общепризнанно, что повышенный уровень общего азота в крови указывает на склонность животных к интенсивному росту. Отмечена положительная корреляция т- 0,8776 (Р<0,01) между среднесуточным приростом с 2 месяцев до возраста достижения живой массы 100 кг и содержанием общего азота в крови свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH.

Таблица 7

Содержание общего азота в тканях трансгенных и нетрансгенных свиней III поколения, мг% (М ±_ т).

Показатели, ткань Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи

WAP-hGH WAP-hGH nmMTI-hRFG

В крови 3590,3±108,2* 3670,1 ±105,7*** 3120,5±116,4

В печени 4024,3±37,4 3982,2*40,8 3635.2±38.9

В длиннейшей

мышце спины 3129,1± 41,2 3080,4±61,2 2864,3±56.4

* Р< 0, 05: *** Р< 0, 001 в сравнении с контролем.

При анализе показателей общего азота в длиннейшей мышце спины и в тканях печени, отмечалась тенденция к повышению его уровня, выявить достоверность приведенных данных не представлялось возможным, в связи с ограниченным числом животных при убое.

3.3.1. Изучение ферментного статуса лимфоцитов и лизосомально-катионных белков нейтрофилов.

Одним из способов оценки активности внутриклеточных процессов является цитохимический анализ ферментных систем крови, позволяющий изучать метаболизм животных на клеточном уровне.

Обращает на себя внимание снижение доли клеток нейтрофилыюго ряда ( Р < 0,05 ) у трансгенных по двум конструкциям -\VAP-hGH и тМТ1-110ЯР особей по сравнению с этим показателем у контрольных свиней (табл.8).

Согласно данным Кокрякова В.Е. (1988), антимикробные белки и полипептиды лизосомального аппарата клетки, выявляемые в нейтрофилах с помощью лизосо-мально-катионного тссга, представляют молекулярную основу защитных реакций организма. Максимальное количество лизосомально-катионных белков выявлено нами в нейтрофилах у контрольных свиней ( табл.9 ).

Пигаревский В.Е. и соавторы (1989) установили временный переходящий дефицит антимикробных белков нейтрофилов, который может составлять причину функциональной неполноценности фагоцитов, тем самым способствуя развитию инфекционных заболеваний и септических осложнений.

Таблица 8

Лейкоцитарная формула кропи трансгенных и нетрансгенных свиней Ш поколения,(М +_ т), (и. 5).

Форменные элеметы крови Транстснпмс спнш.и но конструкции: 11с|рансгсп!1ые свиньи

\VAP-hGH \VAP-hGH и шМ'П-ЬСИЯ

Базофилы 0.4 + 0.21 0.2 + 0,20

Эозннофилы 0,4+.0,22 1.0+0.21 1.0 +0,21

Нейтрофилы:

- миелоциты 0,2 +0,17 - -

- юные 0.6 +0.21 1,0 + 0,21 0,8 + 0,33

- палочкоядерные 2,2 +0,17 1,4 + 0.45 2,2 ±0,98

- сегментоядерные 33,4+1,28 31,2 + 0.59* 37,4+ 1,65

Лимфоциты 60,8+1,01* 62,4 + 1,07* 55,0 + 1,91

Моноциты 2,0 +0,48 3,0 ±0,48 3,0 + 0,28

*Р< 0.05 в сравнении с контролем

Наряду с увеличением доли лимфоидных клеток в лейкограмме (табл. 8), мы наблюдали достоверное ( Р < 0.05 ) изменение активности отдельных дегидрогеназ. Ферменты контрольных животных расположены по степени их активности, у трансгенных животных этот порядок (ферментный профиль) несколько изменился (табл.9).

Обращает на себя внимание и то. что у трансгенных но конструкции \VAP-liGH свиней, снижена активность только гиалоплазматических ферментов а -ГФДГ (г) и Г-6ФДГ.

Гиалопллзматпческая а-ГФДГ наряду с митохондрнальной а-ГФДГ участвуют

в глицерофосфатном челночном механизме, обеспечивающем перенос водорода

внутрь митохондрий, а катализируемый а-ГФДГ(г) продукт реакции (глицеро-3-•и.

фосфат) является ключевы компонентом синтеза триглицеридов.

Фермент Г-6-ФДГ играет важную роль в метаболизме Сахаров, от этого фермента завпсит,подвергнется ли глюкоза гликолизу,или будет утилизироваться через пентозный шунт.

Следует отметить, что свиньи, трансгенные по конструкции \VAP-hGH и конструкциям \VAP-liGH и тМТЫЮКР, отличались от контрольных достоверно толь-

ко по двум показателям активности дегидрогеназ, в то же время, между собой трансгенные животные этих групп различались по четырем (табл. 9).

Таблица 9

Активность внутриклеточных ферментных систем лимфоцитов и лизосомалыю - катионных белков нейтрофилов у трансгенных и контрольных свиней III поколения(М ±_ т). _(И=5)._

Показатели Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгениые свиньи

WAP-hGH WAP-hGH и mMTl-hGRF

Лейкоцитарный цитохимический тест

Активность фер-

ментов, число гра-

нул/лимфоцит:

сдг 9,7±_0,42 8,9+0,14+а 10,5+0,28

НАД- Н-

дегидрогеназа 10,54^0,49 10,1+0,46 9,5+0,46

а-ГФДГ(м) 8,2 +.0,58 6,9±0,49*ь 7.8+0,36

а-ГДФГ(г) 4.3 ±_0,42*° 6.6+0,33*ь 7,0+0,63

НАДФ-Н-

дегидрогеназа 6,2 ±0.53 4,7+0,40*аЬ 6.6+0,51

Г-6-ФДГ 3.8 ;Н),10*а 4,7+0.34*ь 5,4+0,33

Лизосомалыю-катнонный тест

Средний

цитохимический

коэффициент 0,64±0,04 0,54*0,04 0,93±0,08

*Р<0,05 : а-при сравнении с контролем; Ъ- при сравнении трансгенных свиней между

собой.

Снижение некоторых показателей внутриклеточного метаболизма клеток иммунной системы у трансгенных животных в сравнении с контрольными позволяет сделать заключение о том, что уровень нормы, применяемый для характеристики иетрансгенных животных, вряд ли может быть использован для характеристики трансгенных животных.

Введение в практику обследования трансгенных животных показателей имму -нологической активности дегидрогеназ позволит установить индивидуальные особенности действия чужеродных генов, как в процессе роста и развития, так и при различных функциональных нагрузках, и при ксенотрансплантации органов и тканей.

3.4. Хозяйственно-полезные признаки.

Анализ хозяйственно-полезных признаков у трансгенных и нетрансгенных свиней показал , что при рождении живая масса поросят, трансгенных по генной кон-

струкции WAP-hGH , была выше на 7,6 %, а по двум конструкциям - WAP-hGH и mMTl-hGRF на11(8 %, соответственно, и составила 1,27 и 1,32 кг против 1,18 кг в сравнении с контрольными аналогами. На протяжении всего периода выращивания мы наблюдали более высокие темпы роста свиней, трансгенных, как по конструкции WAP-hGH, так и но двум конструкциям - WAP-hGH и mMTl-hGRF. Более высокая скорость роста трансгенных свиней связана с воздействием гормона роста человека на белковый обмен, что проявляется в усилении анаболизма белков и,как следствие, стимуляции процесса роста организма свинеГцТ Аел • До) .

Таблица 10

Динамика живой массы и среднесуточные приросты трансгенных и нетрансгенных свиней III поколения, М + m

Показатели Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи

WAP-hGH WAP-hGH и mMTl-hGRF

Живая масса, кг

в возрасте, дн:

при рождении 1,27+0,05 1,32+0,08 1,18+0,02

60 16,1+0,5 15,6+0,7 15,5+0,4

120 42,6+0,8 42,5+0,9 39,8+0,9

180 80,0+1,2 78,9+1,3 67,1 + 1,4

240 111,4+1,6 112.6+1,7 100,7+1,5

Среднесуточный прирост живой массы, г

за период, дн:

60-120 442+23,2 447+21,7 403 +19,3

121-180 633+35.3*** 617+32,5*** 463+22,5

181-240 532+28,2 571+27,1 569+30,7

***р< 0,001 в сравнении с контролем

НА

Однако, необходимо отметить, что трансгенность мало влияет скорость роста поросят на ранних этапах развития. И,как показал анализ полученных данных, трансгенные животные с возрастом в большей степени проявляют специфические особенности, не свойственные нетрансгенным сверстникам. Это проявляется прежде всего, в значительном увеличении среднесуточного прироста у трансгенных животных по сравнению с контрольными.

Наибольшее увеличение живой массы у трансгенных свиней наблюдалось в возрасте 180 дней. Так, у поросят, трансгенных по генной конструкции WAP-hGH живая масса составила -'80 кг и была выше на 19,1 % , а у молодняка, трансгенного

по двум конструкциям - 78,9 кг, т.е. на 17.5 % больше по сравнению с нетрансгенны-ми аналогами.

По показателям среднесуточного прироста трансгенные животные также превосходили контрольных. Наибольший прирост живой массы у трансгенных свиней наблюдался в возрастном периоде 121 - 180 дней. У свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH он составил 633 г, у животных с двумя конструкциями - WAP -hGH и mMTl - hGRF - 617 г, против 463 г у нетрансгенных свиней, и был выше соответственно на 36,7 и 33,2 % по сравнению с контролем.

Результаты изучения хозяйственно-полезных признаков показали, что трансгенные по конструкции WAP-hGH животные достигали живой массы 100 кг на 27 дней раньше, чем нетрансгенные, а свиньи, трансгенные по конструкциям - WAP-hGH и mMTthGRF на 32 дня раньше. Данные высоко достоверны ( Р < 0,001 ).

Уровень среднесуточного прироста с момента рождения до возраста достижения живой массы 100 кг у трансгенных свиней по конструкции WAP-hGH и по двум конструкциям WAP-hGH и mMTi-hGRF был также высоко достоверен ( Р < 0, 001), и был выше на 13,2 % ,и на 14,3 % соответственно, по сравнению с контрольными животными.

По среднесуточным приростам с 2-х месяцев до возраста достижения живой массы 100 кг трансгенные свиньи по конструкции WAP-hGH и конструкциям WAP-hGH и mMTI-hGRF, также высоко достоверно опережали нетрансгенных, и их прирост был выше на 15,3% и 20,5 % .соответственно (табл. 11).

Использование методов биотехнологии для увеличения скорости роста животных и улучшения состава туши откормочного поголовья, как полагают многие исследователи, будет играть важную роль в программах разведения свиней. Убедительны данные, показывающие положительное влияние трансгенности на снижение возраста достижения живой массы 100 кг, более высокие среднесуточные приросты живой массы.

Интересные результаты были получены по снижению толщины шпика. При достижении живой массы 100 кг у свиней.трансгенных по конструкции WAP-hGH толщина шпика составила 24,5 мм, по двум конструкциям 27,0 мм, а у контрольных животных была на уровне 32,1 мм, т.е. была на 23,7 % и на 15,9 %, соответственно ниже по сравнению с нетрансгенными животными(табл. 11).

Проведенный анализ особенностей физиолого-биохимических процессов у свиней, трансгенных по рекомбинантной конструкции WAP-hGH и двум конструкциям --WAP-hGH и mMTl-GRF позволяет констатировать, что интеграция данных кон-

струкций в геном, не оказывает отрицательного воздействия на организм свиней и все проанализированные важнейшие параметры жизнедеятельности организма находились в пределах допустимых физиологических норм.

Таблица 11

Откормочные и мясные показатели трансгенных и нетрансгенных свиней III поколения, М+ш.

Показатели Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи

WAP-hGH WAP-hGH и mMTI-hGRF

Число животных, гол 14 11 10

Живая масса в 2-мес.

возрасте, кг 16,0+0,8 17,3+0,9 15,7+0,6

Возраст достижения

живой массы 100 кг,

дней 212.4+5,2*** 207,4+6,2*** 239,9+3,8

Среднесуточный

прирост: со дня

рождения до 100 кг, г 468,5+11,5*** 473,1 + 12,4*** 413,7+6,3

с 2 мес. до 100 кг, г 543,2+21,5*** 567,6+16,2*** 470,8+11,5

Длина туловища

в 100 кг, см 137,3+2.3 137, 3+1,3 137,3+2,3

Толщина шпика

в 100 кг, мм 24,5±3,5 27,0±2.5 32,1+2,3

***Р< 0,001 - в сравнении с контролем.

Следует отметить, что интеграция вышеуказанных конструкций в геном оказывает влияние на генотип особи, изменяя установившиеся в процессе эволюции взаимосвязи развития организма. В этом смысле трансгенез можно сравнивать с образованием точечных мутаций, однако эта мутация является "управляемой", и превно-симый ген обуславливает характер изменения признака. И если, внедренная реком-бинантная конструкция будет так же стойко наследоваться в дальнейших поколениях. можно ожидать (при условии использования направленной селекции) получения линий животных с уникальными хозяйственно-полезными качествами.

В организме трансгенных свиней обменные процессы проходят интенсивнее, прослеживается тенденция изменения метаболических процессов в сторону снижения липогенсза, отмечена тенденция к снижению толщины шпика. Полученные данные также позволяют сделать вывод с высоким уровнем достоверности о более высоких среднесуточных приростах у трансгенных свиней по сравнению с контрольными.

Выявлены тенденции в изменении хозяйственно-полезных признаков у трансгенных потомков, что позволяет определить селекционные критерии для работы с трансгенными животными и выявить перспективы для их дальнейшей селекции.

Выводы:

1. Свиньи, трансгенные по рекомбинантной генной конструкции, включающе последовательности гена гормона роста человека под промотором гена кислог белка сыворотки молока мышей (\VAP-hGH), продуцируют с молоком гормон рост человека в концентрации от 30 до 85 нг/мл.

2. Экспрессия генноинженерной конструкции \УАР-ЬОН, интегрированной геном свиней, не носит строго тканеспецифический характер . Наряду с клеткам молочной железы, экспрессия данной конструкции наблюдается в клетках подже лудочной и слюнных желез. При этом уровень экспрессии трансгена в слюнных же лезах составил 5-7 нг/мл.

3. Установлено, что интегрированная генноинженерная конструкция \УАР 1ЮН экспрессирует в гипофизе трансгенных свиней, вызывая секрецию гормона ро ста человека в кровь свиней до уровня 12-30 нг/мл.

4. Установлено, что секреция гормона роста человека в кровь трансгенны свиней способствовала снижению возраста достижения живой массы 100 кг (Р ■ 0,001), а также повышению уровня среднесуточных приростов (Р < 0,001) по сравне нию с контрольными, что свидетельствует об отсутствии абсолютной видовой спе цифичности гормона роста человека по биологическому действию на организм сви ней.

5. С целью анализа уровня экспрессии трансгена в крови, молоке и экстракта: тканей трансгенных свиней, на основе использования моноклональных антите. предложе на тест- система для количественного определения уровня гормона рост; человека. Оптимальная концентрация сорбированных МКА 4 мкг/мл и конъюгат. 2,5 мкг/мл; чувствительность тест-системы 0,5 нг/мл.

6. Для анализа экспрессии трансгена в тканях различных органов трансгенны: свиней разработана тест-система на основе иммуногистохимического метода и по лученных МКА, с помощью которой было установлено присутствие гормона рост: человека в клетках молочной, в протоках поджелудочной и слюнных желез.

7. В организме свиней, трансгенных по конструкции \VAP-hGH происходи-изменение метаболических процессов в сторону снижения липогенеза, отмечен; тенденция к снижению толщины шпика по сравнению с контрольными животными.

8. Установлено, что у трансгенных свиней снижен процент сегментоядериы; нейтрофилов и увеличен процент лимфоцитов в лейкограмме. Определено сниженш ферментного профиля активности дегидрогеназ лимфоцитов, а также сниженж уровня лизосомально - катионных белков нейтрофилов у трансгенных свиней.

Практические предложения:

1.Свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH можно использовать в качестве продуцентов гормона роста человека.

2. Предложенная тест-система для определения гормона роста человека, может быть использована в медицинской практике, где она прошла апробацию и получила положительное экспертное заключение комиссии Медицинской академии последипломного образования (N 83/2, от 3 июля 1996 года).

3. Учитывая простоту, скорость и информативность тестов определения активности дегндрогеназ лимфоцитов и лизосомально-катионных белков нейтрофилов, рекомендовать их определение, как удобный и надежный инструмент для контроля за иммунологическими процессами в организме трансгенных свиней.

Опубликованные работы:

1. Полтавцева P.A., Эрнст Л.К., Мясников Ю.В., Супрун А.П., Тогонидзе Т.М. /Ферментный статус лейкоцитов свиней, трансгенных по генам гормона роста и ри-лизинг-фактора гормона роста человека // Сельскохозяйственная биология.- 1996.-N. 4.-С. 43 - 47.

2. Эрнст Л.К., Полтавцева P.A., Мясников Ю.В., Супрун А.П./ Ферментный статус лимфоцитов и лизосомально-катионных белков нейтрофилов свиней, трансгенных но генам гормона роста и рилизинг-фактора гормона роста человека // Тезисы докладов II международной конференции "Молекулярно-генегические маркеры животных". Киев . - 1996 . - С. 45.