Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ У СВИНЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПО КОНСТРУКЦИИ WAP-HGH.

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ У СВИНЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПО КОНСТРУКЦИИ WAP-HGH."

Л - Мб-?*/

российская академия сельскохозяйственных наук

всероссийский научно-исследовательский институт животноводства

На правах рукописи

і

ПОЛТАВЦЕВА РИММА АЛЕКСЕЕВНА

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ У СВИНЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПО КОНСТРУКЦИИ

\VAP- ЬЄН.

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКОВСКАЯ ОБЛАСТЬ, п. ДУ6РОВИЦЫ 1997 год

Работа выполнена в период с 1993 по 1997 год в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Научные рукшнідіггели - Вице-президент РАСХН, академик Л.К. ЭРНСТ,

- кандидат биологических наук, ВИЖ В.М. АФАНАСЬЕВ

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, ВИЖ

, Н.С. МАРЗАНОВ

- кандидат биологических наук, ВНИИФБнП В. П. РЯБЫХ

Ведупк* учреждение - Биотехцентр РАСХН

Защита диссертации состоится " " и*ОНХ-_1997 г.

я " І0" часов на заседании диссертационного совета Д 020.16.02 при Всероссийском научно - исследовательском институте животноводства.

Адрес института; 142012, Московская область. Подольский район, п. Дубров и цы

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института. Автореферат разослан " /С - Мал*_1997 г.

Ученый секретарь - >'

диссертационного со»е}«

доктор с.-х. наук - Н.В.Груздев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Современная биотехнология является новейшей отраслью биологии и в настоящее время интенсивно развивается во всем мире.

Одним из наиболее актуальных направлений биотехнологической науки является изменение генома з у кари от ( в том числе сельскохозяйственных животных ) методами генетической инженерии с целью придания им нужных качеств.

В последнее десятилетие развернут широкий фронт исследований по созданию трансгенных животных с конечной целью повышения продуктивности, использования их, как продуцентов биологически-активных веществ, получения трансгениых животных с повышенной устойчивостью к инфекционным заболеваниям, применения этих животных в качестве биомоделей в медицине, а также для ксенотрансплантации органов и тканей {Л.К.Эрнст, Г993; K.Ward, 1991).

Наступает совершенно новый этап в развитии животноводства, когда традиционный ассортимент продуктов животноводства будет постепенно расширяться за счет продуктов биотехнологии,

. Новым важным направлением генетической инженерии является получение сельскохозяйственных животных-продуцентов биологи чески-активных веществ, необходимых в медицине, ветеринарии и технологии переработки продуктов животноводства.

Многочисленные успешные работы ряда исследователей по получению трансгенных животных, как лабораторных (в основном мышей), так и сельскохозяйственных животных, продемонстрировали широчайшие возможности использования метода генетической трансформации генома организма (Palmiter, R.,1986: Gordon К.. 1987: Brem G,,1989).

Применение такого подхода сделало возможным изучение влияния различных регуляторных элементов на уровень и тканеспецкфнчность экспрессии генов и выяснение влияния экспрессии интегрированных генноинженерных конструкций на организм животного.

Совместными усилиями российско-германских ученых были созданы свиньи, трансгенные по конструкции WAP-hGH и по конструкции mMTI-hGRF. Конструкция WAP-hGH состоит из структурной часта гена гормона роста человека (human growth hormon, hGH) и промотора гена кислого белка сыворотки молока мышей

(whey acidic protein.

Ц^гі ГРАЛЬНАЯ HAyw-iftfl 6ЧГ,Л:-0ТЕКА

генная конструкция

иіМТІ-ЬОіи3 содержит структурную часть гена рнлизинг фактора гормона роста человека (ЫЗЯР) к металлотнонеи новый промотор! мыши (тМТІ).

Получение этих животных выдвинуло на первый план необходимость изучения особенностей физиолого-био химических процессов у трансгенных животных, как у родоначальников (Ро), так и у их потомков (Рл),и выяснен и я, происходит ли при специфической экспрессии в молочной железе синтез протеина в крови и других тканях. и оказывает ли протеин в результате этого влияние на организм трансгенного животного.

Цель и задачи исследований:

Целью наших исследований было выявление особенностей физиолого-биохимических процессов в организме свиней, с интегрированной в геном рекомби-нантнон генной конструкцией \VAP-hGI I.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Получить потомков от хряка, трансгенного по рекомбинантной генной конструкции \VAP-hGH н определить их трацсгенкость в ряде поколений методом полимер азной цепной реакции (ПЦР).

2) Получить м оно клепальные антитела (МКА), специфичные к ИОН и разработать на их основе тест-систему для определения гормона роста человека в биологи^чески-активных жидкостях н тканях.

3) Определить уровень экспрессии гена гормона роста человека в организме трансгенных свиней, с помощью полученных МКА, специфичных к ЬСН, методам» иммумофермеитного и иммуногистохимического анализа.

4) Выявить особенности физ и олого-биохи ми ческих процессов в организме трансгенных свиней, определить активность дегидрогеназ лимфоцитов и лизосо-мально-кзтионных белков нейтрофилов,

5) Проанализировать хозяйственно-полезные признаки полученных потомков.

Ряд исследований выполнен*, на свиньях, трансгенных по двум конструкциям *

\УЛР-ЬСНитМТІ-ІіС11Р,

Научная новизна работы.

Впервые выявлены особенности физиолого-биохимических процессов в орга* низме свиней, с интегрирован пой в геном конструкцией, содержащей структурную часть гена гормона роста человека с промотором гена кислого белка сыворотки молока мышей. • -

Показана потенциальная возможность использования {молочной желеэы^сель-скохоэяйственных животных, в частности свиней, в качестве продуцентов бнологнче-

ски-активных веществ. Установлено, что свиньи, трансгенные по рекомбинантной генной конструкции ШАР-ЬОН, продуцируют с молоком гормон роста человека в концентрации от 30 до 85 нг/мл.

Экспрессия генноинженерной конструкции \VAP-hGH. интегрированной в геном свиней, не носит строго тканеепецифического характера. Наряду с клетками молочной железы экспрессия данной - конструкции наблюдается в клетках поджелудочной и слюнных желез.

Интегрированная генной и женерная конструкция \VAP-hGH экспрессирует в гипофизе трансгснных свиней, вызывая секрецию гормона роста человека в кровь свиней до уровня 12 - 30 нг/мл.

Секреция гормона роста человека в кровь трансгенных свиней способствовала снижению возраста достижения живой массы 100 кг в сравнении с контролем, что свидетельствует об отсутствии абсолютной видовой специфичности гормона роста человека по биологическому действию на организм свиней.

В организме свиней, трансгенных по конструкции \VAP-hGH. происходит изменение метаболических процессов в сторону снижения лилогенеза, отмечена тенденция к снижению толщины шпика в сравнении с контрольными животными.

Получены МКА к ЬСН, пригодные в качестве универсальных реагентов для определения содержания гормона роста человека. На их основе разработана тест-система для определения концентрации гормона роста человека в биологически-активных жидкостях в организме человека и трансгенных по гену гормона роста человека свиней. Тест- система пригодна для использования в методах иммунофер-мемтного анализа (ИФА).

Определены иммунобиологические особенности трансгенных свиней, путем анализа ферментной активности дегидрогенаэ лимфоцитов н лиэосомально - катион-ных белков нейтрофилов.

Практическая значимость работы:

1) Определены биологические особенности развития трансгенных свиней.

2) Установлены особенности гематологических и цитохимических показателей крови трансгенных свиней.

3) Полученные моноклональные антитела к гормону роста человека, позволяют определять его концентрацию в организме человека н трансгенных по этому гену свиней.

4) Предложен тест-набор для определения содержания гормона роста человека в биологически-активных жидкостях и экстрактах тканей.

5) С использованием тест-набора проведено определение концентрации гормона роста у пациентов в клинике Меяицииской академии последипломного образования (г. Санкт-Петербург). Имеется акт о внедрении разработанной тест- системы в практику.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на заседании отдела биотехнологии ВИЖа, на годичном отчете по биотехнологии в РАСХН, на II международной конференции "Молекулярно-генетеческне маркеры животных", Киев ,1996 .

По материалам диссертации опубликовано две работы.

Структура и обьем работы:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы. Объем диссертации.....

страниц машинописи, включает 14 таблиц и 12 рисунков. Список литературы включает 221 источник, в том числе 146 на иностранных языках.

2. Материалы и методы исследований.

Работа выполнена в период с 1993 по 1997 год в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Краткая схема исследований;

I. Получение потомков хряка, трансгенного по конструкции WAP-hGH.

II. Идентификация трансгена в ряде поколений.

III. Получение моноклон ал ьиых антител к гормону роста человека.

IV. Выявление экспрессии генной конструкции WAP - hGH:

1. Иммунофермеитным методом с помощью МКАх hGH.

2. Иммуногистохимическим методом с помощью MICA к hGH.

V. Изучение физиолого-бнохимических параметров, в том в числе:

исследование метаболизма: I) на тканевом уровне;

2) на клеточном уровне;

VI. Хозяйственно-полезные признаки трансгенных свиней.

Исследования проводились на помесных свиньях (крупная белая х ландрас) в экспериментальном хозяйстве ВИЖа "Кленово-Чегодаево".

Первое поколение (Fi), трансгенных ло конструкции WAP-hGH свиней, было получено в результате искусственного осеменения нетрансгенных ремонтных свинок семенем трансгенного хряка N 6660, с интегрированной генноинженерной конструкцией WAP-hGH. Семя животного было предоставлено проф. Г. Бремом. Австрия.

Для получения И поколения (Fj), трансгенных свинок (Fi) осеменяли семенем хряка N 31, трансгенного по конструкции mMTl-hGRF.

При получении III поколения (Fi), использовали семя хряка N 117 (Fi), содержащего в геноме две конструкции - WAP-hGH и mMTl-hGRF.

Трансгенных свиней IV поколения (Fj ) получали путем осеменения свинок, трансгенных по конструкции WAP-hGH или по двум конструкциям -WAP-hGH и »rfHTl-hGRF, хряками (полусибсамн), с интегрированной в геном рекомбинантной конструкцией mMTl-hGRF.

Трансгенность потомков определяли методом ПЦР.

Содержание и кормление свиней осуществляли согласно технологии, принятой в экспериментальном хозяйстве ВИЖа "Кленово-Чегодаево".

На всех этапах исследований в качестве контроля использовали нетрансгенных свиней, которых отбирали по принципу аналогов (порода, возраст, масса тела, общее развитие).

Для целенаправленной экспрессии гена гормона роста человека в клетках молочной железы, в конструкции WAP-hGH структурная часть гена hGH была сцеплена с 5 *- кониевой последовательностью, длиной 2,6 кЬ промотора гена сывороточного кислого белка молока мышей (WAP).

Определение, тканеспеиифичной экспрессии трансгена в молочной железе, проводили методом иммуноферментного и иммуногистохимического анализа. Для выполнения этих экспериментов получили моноклональные антитела, специфичные к гормону роста человека.

Для получения моноклональных антител использовали гибридому, полученную в отделе биотехнологии ВИЖа.

В нашей работе мы применяли способ получения МКА in vivo - путем выращи* вания асцитных опухолей у мышей линии Balb/C.

Выделение МКА из асцнтной жидкости проводили с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией.

Для определения эффективности экспрессии рекомбинантной генной конструкции WAP-hGH и двух конструкций-WAP-hGH и mMTl-hGRF у трансгенных лак-тирующих свиноматок Ш поколения проводили отбор проб молока , крови, слюны,

внутренних органов (сердце, печень, легкие, почки), мышц, а также молочной, поджелудочной и слюнных желез.

Уровень экспрессии трансгена в молоке, крови, слюне н экстрактах тканей определяли с помощью твердофазного нммуноферментного метода (ELISA) на основе моноклон альных антител, специфичных к гормону роста человека*. При помощн-стандартного тест-набора (производство фирмы "Монсанта") определяли концентрацию свиного гормона роста в крови трансгенных и контрольных свиней.

Биохимические показатели в сыворотке крови, в длиннейшей мышце спины н в ткани печени: общий азот, общие липиды, фосфолипкды, холестерин определяли по общепринятым методикам (Кондрахин И. П., Курило в Н.В.. Малахова И. Г. и др., 1985).

В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, определяли лейкограмму крови.

Для характеристики состояния процессов энергетического метаболизма в организме свиней определяли активность внутриклеточных ферментных систем: сукци-иатдегилрогеназы (1.3.99.1), СДГ; а-глииерофосфатдегидрогеназы гиалоплазмагической (1.1,1,8), се - ГФДП( г): а-глнцерофосфатдегцдрогеназы митохондрнальной (1,1.99.5), а -ГФДГ (м): глюкозо-б -фосфатдегцдрогеназы (1.1.1.49), Г-6-ФДГ; НАДН-дегидрогеназы (1.6.99.3) и НАДФ'Н-дегидрогеназы (1.6.99,1) лимфоцитов периферической крови количественным цитохимическим методом (по методике Нарциссова Р.П.. 1988).

После проведения цитохимической реакции, в мазке крови в 50 лимфоцитах. подечнтывалн количество гранул формазана - продукта п-н«1ротетразолия фиолетового и определяли среднюю арифметическую активность клеточной популяции ( гранул/лимфоцит).

В кейтрофилах крови определяли лмзосомалыю-катионные белки, тест основан : на использовании анионов ого красителя прочного зеленого, обеспечивающего суммарное цитохимическое выявление катионных белков: миелопероксидазы, катепенна С, лактоферрина, эластазы, дифенсииа, лизоцима ( по методике Пи гарев ского В.Е., 1989). В качестве статистического показателя использовали средний цитохимический коэффициент ( СЦК ).

Для числового контроля за качеством цитохимических реакций использовали два параллельных препарата.

Из хозяйственно-полезных признаков ( при жизни ) оценивали по общепринятым методикам: живую массу, прирост живой массы, возраст достижения живой мае-

сы 100 кг (в днях); среднесуточный прирост' (г) с момента рождения до достижения живой массы 100 кг; среднесуточный прирост (г) с 2 месяцев-до достижения живой массы 100 кг, длину туши ( см >; толщину'шпик а (мм) над i-7 грудными позвонками при достижении живой массы 100 кг.

Данные обработаны биометрически на персональном компьютере IBM PC в программе "КАРАТ". ,

3. Результаты собственных исследований ,

3.1. Получение потомства'и идентификация трансгенностн в ряде поколений.

Трансгенные животные представляют определенную ценность и могут быть использованы в практике животноводства лишь в том случае, если они стабильно передают интегрированный ген потомству. В связи с этим, и исходя га поставленных задач, в процессе проведения работы были получены и проанализированы на транс-генностъ 4 поколения трансгенных свиней: 1) по рекомбинантной конструкции WAP-hGH; 2) по конструкции mMTl- hGRF; 3) по двум конструкциям - WAP-hGH н mMTI-hGRF;.

Для анализа трансгенностн потомков, использовали метод ПЦР.

Для амплификации конструкции WAP-hGH использовали следующие праймеры: hGH-FW: 5*-G AAG GGGAGGGAG G AAAATGAA-3'; hGH- RV:5'-TGGGGAG-GGGTCACAGGGAT-3' ( прай меры предоставлены проф. Г.Бремом, Австрия).

Для амплификации рекомбинантной конструкции mMTl-hGRF использовали следующие праймеры: RCS1-5*- GCTATCTTCACTAACTCTTACCG-3*i RCS2: 5*-TGССACTCATCGCAGTACTGTTGT-3' ( праймеры предоставлены Г.А. Дворянчи-■совым (ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных).

Из 199 проанализированных свиней (F|-F<), у 144 в результате амплификации геномной ДНК синтезировался один или оба, соответствующей длины, фрагмент ДНК, то есть эти свиньи были трансгенными. Трансмиссия трансгена в поколениях (Fi-Fj) представлена в таблице t.

Результат одного электрофоретического анализа продуктов амплификации геномной ДНК новорожденных поросят III поколения (и = 6), тестируемых на присутствие генной конструкции WAP-hGH (фрагмент гена гормона роста человека длиной 318 Ьр) в геном представлен на рис. I.

Рис. І. ПЦР • анализ на наличие в геноме исследуемых поросят, рекомбннант-ной генной конструкции №"АР-(іСП. 4 '

12 3 4 5 6 7 8

1 - ДНК нетрансгенного животного: 2- 6-ДНКтрансгенных животных; 7- отрицательный контроль, ДНК заведомо нетрансгенного животного; 8 - положительный контроль, ДНК заведомо трансгенного животного;

Наличие данного фрагмента ДНК (318 Ьр) в злектрофореграмме, позволяет судить о присутствии в геноме исследуемых поросят, генной конструкции №АР-НСН.

3.1.1. Получение трансгенных потомков. Первое поколение (Ні), трансгенных по конструкции \VAP-hGH свиней, было получено в результате искусственного осеменения нетрансгенных свинок семенем трансгенного хряка N 6660, с интегрированной генноннженерной конструкцией \VAP-hGH. Плодотворным осеменение было у 2 свинок.

В результате осеменения было получено 9 животных (3 хрячка и б свинок), все свинки (100 %) были трансгенными по \УАР-ИОН (66,6 % от числа родившихся потомков), а хрячки не содержали в геноме данную генную конструкцию (табл.1).

Для получения II поколения (Рг), трансгенные по конструкции \VAP-hGH свинки N7 и N 10 были спарены с хряком N 31, трансгенным по конструкции гпМТІ-ЬйКР. В результате этого осеменения было получено 12 потомков^ 4 хрячка н 8 свинок), нз них 11 были трзнсгеннымн (91,7%); конструкция WAP•hGH была выявлена у двух свинок (25 % от общего числа свинок и 16.6 % от общего числа полученных поросят). Конструкция тМТЫКЖРбыла обнаружена у 6 животных. По двум генам трансгенными были 3 поросенка, две свинки н один хрячок N 117. который в дальнейшем был использован для получения III поколения.

Для получения III поколения (Рі), семенем хряка N 117, трансгенного по двум конструкциям - \VAP-hGH и тМТІ-ІіСКР, была осеменена 21 ремонтная нетранс-генная свинка. Получено 12 опоросов - 130 поросят. По данным ПЦР-аналнза из 130, трансгенными были 89 поросят (68,5 %), из них 56 свинок, а том числе 32 были

трансгенкыми по конструкции ЛУАР-1ЮН (32,8 % от общего числа свинок: 16,2 */. от общего поголовья поросят).

Таблица I

Трансмиссия трансгена в поколениях.

Группы животных Число животных, гол. Из них трансгенных по конструкции:

\VAP-ltGn, гол. % ШАР-ЬСНи тМТЬЬСКР, гол. У. тМТІ-ЬСИР. гол. %

I поколение

Хрячки 3 - - - - - -

Свинки 6 6 100.0 > - -

Всего 9 6 66,6 - - - -

11 поколение

Хрячки 4 - - . 1 25,0 3 75.0

Свинки 8 2 25.0 2 25.0 3 37.5

Всего 12 2 16,7 3 25,0 6 50,0

III поколение

Хрячки 66 - - - - 33 50,0

Свинки 64 32 50,0 21 32.8 3 4.68

Всего 130 32 24,6 21 16.2 36 27,7

IV поколение

Хрячки 28 3 10,7 14 50.0 6 21.4

Свинки 20 2 10.0 8 40,0 5 25.0

Всего 48 5 10,4 22 45.8 11 22.9

Хрячков, трансгенных по рекомбинантной генной конструкции \УАР-ЬОН или по двум конструкциям - \VAP-hGH и тМТІ-ЬСІїР получено не было, как и в I поколении. Хрячки, трансгенные ПО конструкции тМТІ-ЬСйР составили 50% отобшего числа хрячков.

Для получения IV поколения (Рі), свинки, трансгенные по конструкции WAP• ЬСН илн по двум конструкциям - \VAP-hGH и тМТІ- ЬОЇ*Р были осеменены трансгенными хряками (полуенбеами), с генной конструкцией тМТ1-ЬСПР. Было получек но 45 поросят, в том числе трансгенных - 38 поросят (79,1 %).

При этом по конструкции \VAP-hGH выявили 5 голов, в том числе 3 хрячка (10,7 % от общего числа хрячков) и 2 свинки (10 % от обшего числа свинок), что составило 6.3 % и 4 % от обшего поголовья потомков соответственно. По двум конструкциям -У/ЛР-ЬСН м тМТЫЮКР трансгенными были 22 поросенка , из них 14 хрячков (50 % от общего числа хрячков) и 8 свинок (40 % от общего поголовья свинок), 29,1 "/о и 16,1 % от всего поголовья соответственно.

Таким образом, нами была определена способность трансгенных родоначальников, а затем потомков передавать трансген по наследству.

3.2. Выя&ленпе жспрсоснн гага гормона роста человека » организме трансгенных свиней мммуноферментным и иммуношстохимическим методами.

Использование трансгенных животных в биотехнологнческих целях представляется перспективным, если интегрированная генная конструкция эффективно экс-премирует.

Тканеспецифическую экспрессию в мояочной железе определяли методом им-муноферментного ц и м мунотстохи мн ческого анализа. Для этого были получены моноклон ал ьные антитела, специфичные к гормону роста человека, используя имеющуюся в отделе биотехнологии ВИЖа гибридому,

3.2И. Получение, очистка и характеристика моноклональных антител, специфичных к гормону роста человека. .

Для получения асцнтнык препаратов, мышам линии Ва1Ь/С внутрнбрюшннно инокулировалн взвесь гибридоидных клеток в концентрации 1,0-1,5*101/мя. Предварительно, за 10*14 суток мышам вводили 0,5 мл пристана.

Специфичность лсцигных н культуральных препаратов моноклональных антител к гормону роста человека определяли специально отработанным методом твердофазного иммуноферментного анализа типа "сэндвич". Результаты опытов по получению асиитны* препаратов МКА приведены в таблице2.

- Таблица 2

Получение ясцнтных препаратов н титр моноклональных антител к гормону роста человека.

Название Количество Срок образования Объем Максималь-

клона мышей, асцита, сутки асцита, мл ный титр

гнбридомы взятых для антител

получения первичное перевивка

асшіта введение

клон-1 10 13-14 10-11 3.5-5 5*105

кпон-2 10 12-14 10-12 4-6 1*10«

Лсцнтные опухоли образовывались у мышей в течение 12-14 суток после инъекции клеток, причем образование опухолей отмечалось у 100 % привитых животных. Количество асцитной жидкости составило в среднем 4-5 мл от одной мыши. Все клоны обладали способностью перевиваться от мыши к мыши, при этом в первом же пассаже формирование асиитных опухолей ускорилось до 10 суток.

Максимальный титр МКА в асцитиой жидкости достигал 5 *10s {клон N 1) и 1*10* (клон N 2). Титры спеедфич' «их антител в асцитнык жидкостях являлись качественной характеристикой гибридомных клонов н не менялись в зависимости от кратности пассажей.

Мо но к локальные антитела к hGH выделяли, проводя осаждение сульфатом аммония с последующей ионнообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

3.2.2. Определение экспрессии гормона роста человека в молоке, cmotie н экстрактах тканей траисгенпмх » контрольных свиней.

Тка неспецифическую экспрессию в молочной железе изучали у л актирующих свиноматок, трансгенных по конструкции WAP-hGH <Fj> к у трансгенных по двум конструкциям - WAP-hGIt н mMTl-hGRHfj).

Уровень экспрессии гормона роста человека в молоке определяли методом им-муноферментного анализа типа "сэндвич", на основе моноклон ал ьных антител, специфичных к гормону роста человека, используя 96-ти луночные м нкропл а ншеты из полистирола фирмы "Coslar"(ClIIA), согласно разработанной нами методике.

Для калибровки тестовой системы использовали гормон роста человека, производство МПО " Фермент" г. Вильнюс.

Пробы молока отбирались с момента опороса ( первое доение ) н в течение 42 дней до отъема поросят с периодичностью 7 дней ( всего 7 доений ). Как показал и м му коферменте ый анализ, содержание hGH в молоке трансгенных свиней в течение лактации варьировало от 30 иг/мл до 85 нг/мл (табл.3).

Таблица 3

Концентрация гормона роста человека в молоке трансгенных и нетрансгенных свиноматок III поколения (n= 10). нг/мл, (М +_ т).

Кг пробы (день лактации) Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи

WAP-hGH WAP-hGH и mMTI-hGRF

1(1-й день)- 26,4 + 3,6 20.3 + 2,6 0

2(7 "-") 41,4 + 5,8* 28.0 ±2.3 0

3(14"-") 53,8 + 7,7** 34,3 +1,9 0

4(21"—") 63,6 + 4,9* 42,3 + 2,6 0

5(28 "-") 78,6 + 7.3* 47,3+4,8 0

6(35"-") 55,8 + 6,6* 40,3 + 3,9 0

7(42"-я) 46,0 + 4,1** 31,6+ 2,1 0

*Р< 0.05; **Р < 0,01-в сравнении' трансгенных свиней между собой.

Анализируя полученные данные, мы установили, что концентрация гормона роста человека в молоке свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH, была минимальной в первый день лактации, составив в среднем - 26,4 нгУмл и постепенно возрастала, достигая концентрации 73,6 нг/мл к 28 дню, затем происходило снижение концентрации до 35 нг/мл к 42 дню.

При сравнении уровня концентрации гормона роста человека в молоке свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH и по двум конструкциям - WAP-hGH и mMTI-hGRF, мы отметили, что он был значительно ниже у свиноматок, трансгенных по двум конструкциям, так максимальная концентрация гормона роста человека у них составила 54 иг/мл против 78.6 нг/мл у свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH.

В качестве отрицательного контроля использовали молоко нетранстенных свиноматок, в котором гормон роста человека не был обнаружен. Положительным контролем служила лекарственная форма гормона роста человека ( производство фирмы МПО "Фермент"). Для получения достоверных данных все анализы проводили с 3-х кратным повтором,

С помощью твердофазного ИФА с использованием MICA к hOH проводили исследование слюны и экстрактов тканей трансгенных и нетрансгенных свиней.

Исследовались следующие ткани: сердце, печень, почки, легкие, мышцы, фуи-дальная часть желудка, щитовидная, поджелудочная и слюнные железы.

В результате проведенного анализа, достоверных данных о наличие гормона роста человека в экстр а «пах исследованных тканей трансгенных свиней получено не было. Из вышеизложенного можно высказать следующее предположение: если гормон роста человека и содержится в исследуемых образцах тканей, то его концентрация выходит за рамки чувствительности примененного метода.

Уровень экспрессии гормона роста человека в слюне составил 5-7 нг/мл.

3.2.3. Определение гормона роста человека и гормона роста свиньи в крови траисгсиных и нетрансгенных свиней.

Определение наличия гормона роста человека (hGH) и гормона роста свиньи (pGH) в крови лактируюших и нелактирующих трансгенных свиней проводили методом иммуноферментного анализа типа ™ сэндвич" .

Для определения содержания гормона роста человека использовали разработанную нами тест* систему. Калибровочную кривую строили, используя лекарственную форму гормона роста человека, производство МПО " Фермент" г. Вильнюс.

Концентрация гормона роста человека у лактируюших свиней, трансгенных ло конструкции \VAP-liGH составила 20,4 нг/мл и была в 2 раза выше, в сравнении со свиньями, трансгеннымн по двум конструкциям - У/АР-ЪСН и тМП-ЬСШл у которых она была 9,5" нг/мл (табл.4).У нелактирующих свиней концентрация гормона роста человека была значительно ниже и составила 15,6 нг/мл н Ю^ нг/мл соответтвенно.

Таблица 4

Концентрация гормона роста человека и гормона роста свиньи в крови трансгенных и нетрансгенных свиноматок III поколения, нг/мл, (М ±_ т).

(п=10),

№ пробы Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные

\VAP-hGH \VAP-hGH н шМТ1-ПСКР свиньи

ИйН рСН КСН рвН (ЮН рЄН

1 (л актирующие) 20,4+1,5 8,6+0.£ 9,5+0,96 14,5+0,8** 0,0 8.3+1,9

2( нел актирующие) 15,6+0,8 8,4+0,97 10,5+0,8 13.4±0.63*** 0,0 7.28±0,8

**Р< 0,01;***Р < 00)1-в сравнении с контролем.

В крови нетрансгенных свиней гормон роста человека не был обнаружен, а

концентрация гормона роста свиньи была почти на одном уровне в сравнении со и

свиньями, трансгеными по конструкции WAP•llGH и ниже в сравнении со свиньями, трансгенными по двум конструкциям - \VAP-hGH н тМТЫЮНЕ.

ЭЛЛ. Пммунопктохммическое исследование экспрессии с помощью МКА. Иммуиогистохимическая окраска срезов ткани-молочной железы л актирующих свиней подтверждает присутствие гормона роста человека во всех частях секреторных клеток, окрашиваемых тканей. 4

На гистологических препаратах у трансгеных свиней обращает на себя внимание протокован ткань поджелудочной и слюнных желез, а также ткань гипофиза, в которых наблюдается положительная реакция на гормон роста человека. В железах окрашивание в основном наблюдается в просвете протока и по апикальному краю железистых клеток.

V нетрансгенных животных признаки положительной реакции на гормон роста человека не наблюдали, что свидетельствует об очевидном присутствии гормона рое. .та человека у трансгенных свиней и его отсутствии у контрольных.

В образцах тканей внутренних органов (сердце, печень, почки, легкие) и мышц трансгеннык свиней присутствие гормона роста человека ие было обнаружено.

3.3. Физиологические и биохимические процессы в организме трансгенных и контрольных свиней.

Важным разделом исследований по изучению трансгенных свиней является выявление особенностей физиолого-биохимических процессов у этих свиней.

Анализируя биохимические параметры крови трансгенных и иетрансгенных свиней, следует отметить, что они находились в пределах физиологической нормы. Вместе с тем, основной целью изучения биохимических показателей крови, является выявление даже незначительных сдвигов в обмене веществ, происходящих в пределах физиологических границ изучаемых показателей, в связи с уникальностью исследуемых животных.

У свиней, трансгенных по конструкции \VAP-tiGH содержание общих лкпидов было снижено на 13,7 % в сравнении с контролем и на 8 % в сравнении с трансгенными по двум конструкциям - ШАР-ЬОН и тЫТЧ-ЬСЯР животными, содержание фосфолипкдов было на одном уровне в обеих группах трансгенных животных, а в сравнении с контролем ниже на 15,6 % (табл. 5).

Таблица 5

Биохимические показатели лнлихшого обмена в крови трансгенных и иетрансгенных свиней Ш поколения. (М +. ш) __(п=10)__

Показатели, мг% Трансгенные свиньи по конструкции: Негра нсгенные свиньи

\VAP-hGH \VAP-hGHHmMTI-ІіСІІР

Общие лип иды 200.2+ 15,3 2(6,7+18,0 231,8 + 16.6

Фосфолипкды 77,5 ± 3.5 77.5 + 3.5 91,8 ± 9,3

Холестерин .72,5 + 1,6 73.7 + 1.7 80,6 ± 4.9

Содержание холестерина у трансгенных по конструкции 1Л^АР-1ЮН свиней в фа вмени и с контролем было ниже на 10 %. а у свиней, трансгенных по двум конструкциям -\VAP-hGH и тМТЫЮКР на 8.6 %, между собой трансгенные животные отличались на 1,7 %.

Для изучения специфичности процессов метаболизма, а также для определения биохимических показателей был произведен убой 4-х контрольных и 4-х трансгенных свинок (две с конструкцией WAP-hGH и две с конструкция ми-WAP-hGH и mMTl-hGRF). Анализ проводился в образцах длиннейшей мышцы спины и тканях печени {табл.6).

Таблица 6

Биохимические показатели липидного обмена в длиннейшей мышце спины и тканях печени у трансгенных и нетрансгенных свиней 111 поколения,.

(М+т)

Показатели. мг% Трансгенные свиньи по конструкции: Петра нсгениые

WAP-hGH WAP-IiGH и mMTl-KGRF СВИНЬИ

Длиннейшая мышца спины

Общие липиды Фосфолипиды Холестерин 168.8 ± 11,3 194,2±13.8 57,5 ±1.2 76,2 ±1,8 56,0 ± 1.4 70,0 + 2,3 Печень 266,6 + 18,2 115.0+ 1,4 94,0 + 8,5

Общие липиды Фосфолипиды Холестерин 741.4 ±28.1 361.5 ±48.0 264,7 ±18.1 749,6 + 33,1 392.5 ± 35.3 265,0 + 21.2 772.9±24,6 402.9±50,7 2бЗ,0±17.5

Анализируя результаты биохимических показателей липидного обмена в длиннейшей мышие спины и ткани печени, отметили тенденцию к снижению липканых фракций у трансгенных свиней в сравнении с нетрансгеннымн.

Содержание обших липидов, фосфояипидов и холестерина в длиннейшей мышце спины у трансгенных по конструкции №АР-ЬСН свиней, было ниже, чем 8 контроле на 36,7 %, 50,0 % н 40,5 % соответственно, а у свиней, трансгенных по двум конструкциям- \VAP-hGH и П)МТЫ)СКР ниже на 27 %, 34 % и 25,5 % соответственно.

В печени у трансгенных свиней также отмечается тенденция к снижению уровня общих липидов, фосфолнпидов н холестерина.

Достоверность не определяли в связи с малочисленностью животных в группе убоя (п=2).

Полученные данные по содержанию общего азота в тканях свидетельствуют о том, что в крови трансгенных по конструкции \№АР-1)СН свиней (п=10), содержание общего азота повышено на (5 % , а у свиней, трансгенных по двум конструкциям-\VAP-hGH и тМТ1-ЬСКР* — ^-на 18%, в сравнении с контролем (табл.7).

Общепризнанно, что повышенный уровень общего азота в кров» указывает на склонность животных к интенсивному росту. Отмечена положительная корреляция г= 0,8776 (Р<0,01) между среднесуточным приростом с 2 месяцев до возраста достижения живой массы 100 кг и содержанием обшего азота в крови свиней, трансгенных по конструкции \VAP-hGH.

Таблица 7

Содержание обшего азота в тканях трансгенных н нетрансгенных свиней Ш поколения, мг%(М ±_т>.

Показатели, ткань Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи

\VAP-hGH ШАР-ЬвН и тМТ1-ЬРРО

В крови 3590,3± 108.2* 3670,1±105,7*** 3120,5*116,4

В печени 4024.3*37,4 3982,2±40.8 3635,2±38,9

В длиннейшей

мышце спины 3129,1± 41,2 3080,4*6!,2 2864,3±56.4

' * Р< 0.05; **• Р< 0,001 в сравнении с контролем.

При анализе показателей общего азота в длиннейшей мышце спины и в тканях печени, отмечалась тенденция к повышению его уровня, выявить достоверность приведенных данных не представлялось возможным, в связи с ограниченным числом животных при убое.

3.3,1. Изучение ферментного статуса лимфоцитов н люосомалыю-катионных белков нейтрофилов.

Одним из способов оценки активности внутриклеточных процессов является цитохимический анализ ферментных систем крови, позволяющий изучать метаболизм животных на клеточном уровне.

Обращает на себя внимание снижение доли клеток нейтрофильного ряда ( Р < 0,05 ) у трансгенных по двум конструкциям -\VAP-hGH и тМТЬЪСКР особей по сравнению с этим показателем у контрольных свиней (табл.8).

Согласно данным Ко кряков а В.Е. (1988), антимикробные белки и ло ли пептиды лизосомального аппарата клетки, выявляемые в нейтроф и л ах с помощью лнзосо-мально-катионного теста, представляют молекулярную основу защитных реакций организма. Максимальное количество лизосомально-катионных белков выявлено нами в нейтрофилах у контрольных свиней ( табл.9 ).

Пигаревскнй В.Е. н соавторы <1989) установили временный переходящий дефицит антимикробных белков нейтрофилов, который может составлять причину функциональной неполноценности фагоцитов, тем самым способствуя развитию инфекционных заболеваний и септических осложнений.

Таблица 8

Лейкоцитарная формула кровн трансгенных и нетрансгенных свиней Ш поколения,(М ±,г|) _(*•*)__

Форменные элементы крови Траисгснные свиньи по конструкции; Ifeipa негенные свиньи

WAP-hCH WAP-hGH и mMTl-hGRF

Базофилы 0,4 + 0,21 0.2 + 0,20

Эозинофклы 0,4+.0,22 I.0+.0.21 1.0 + 0.21

Нейтрофилы:

- миелоциты 0,2 +0.17 - -

• юные 0,6 +0.21 1,0+0,21 0.8 + 0,33

• лалочкоядерные 2,2 +0.17 1,4 + 0.45 2.2 + 0.98

• сегментоядерные 33,4+1,28 31.2 + 0.59* 37,4+.1.65

Лимфоциты 60,8+1,01* 62,4+ 1,07* 55.0 + 1,91

Моноциты 2,0 +0,48 3,0 ±0,48 3,0 + 0,28

*Р<0,05 в сравнении с контролем.

Наряду с увеличением доли лимфоидных клеток в лейкограмме (табл. 8), мы наблюдали достоверное ( Р < 0.05 ) изменение активности отдельных дегидрогеназ. Ферменты контрольных животных расположены по степени их активности, у трансгенных животных этот порядок (ферментный профиль) несколько изменился (табл.9).

Обращает на себя внимание и то, что у трансгенных по конструкции \VAP-hGH свиней, снижена активность только гиалоплазмагических ферментов а -ГФДГ (г) и Г-бФДГ.

Гиалоплаз магическая а-ГФДГ наряду с митохондриальной а-ГФДГ участвуют в глицерофосфатов м челночном механизме, обеспечивающем перенос водорода внутрь митохондрий, а катализируемый а-ГФДГ(г) продукт реакции (глицеро-3-- фосфат) является ключевь/компонентом синтеза трмглицеридов.

Фермент Г-6-ФДГ играет важную роль в метаболизме Сахаров, от этого фермента зав ней ^подвергнется ли глюкоза гликолизу,иян будет утилизироваться через пентоэный шунт.

Следует отметить, что свиньи, трансгеиные по конструкции \VAP-hGH и конструкциям \VAP-hGH и тМЛ-ЬОЛЕ, отличались от контрольных достоверно толь-

ко по двум показателям активности дегидрогенаэ, в то же время, между собой трансгенные животные этих групп различались по четырем (табл. 9).

^ Таблица 9

Активность внутриклеточных ферментных систем лимфоцитов и лиэосомально • катнонных белков иейтрофилов у трансгенных и контрольных свиней III покален ия(М ±_ т).

^>5")_

Показатели Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи

\VAP-hGH \VAP-hGH и тМТІ-

Лейкоцитарный цитохимический тест

Активность фер-

ментов, число гра-

нул / лимфоцит:

сдг 9,7+0,42 8,9+0,14»» 10,5±0,28

НАДН-

дегидрогенаэа 10,5+0.49 10.140,46 9,5+0,46

а-ГФДГ(м) 8,2 + 0,58 6,9+0,49« 7,8+0,36

а-ГДФЦг) 4.3 +_0,42*' 6,6+0,ЗЗ" 7.0+0,63

НАДФН-

дегидрогеназа 6,2 ±0,53 4,7±0,40** 6.6+0.51

Г-бФДГ 3,8 ¿0,10*» 4,7+0.34 *•> 5,4+0,33

Лизосомально-катиониый тест

Средний

цитохи м и ческий

коэффициент 0,64±0,04 0,54±0,04 0,93±0,08

*Р<0,05: а-при сравнении с контролем; Ь- при сравнении трансгенных свиней между

собой.

Снижение некоторых показателей внутриклеточного метаболизма клеток иммунной системы у трансгенных животных в сравнении с контрольными позволя ет сделать заключение о том, что уровень нормы, применяемый для характеристики нетрансгенных животных, вряд ли может быть использован для характеристики трансгенных животных.

Введение в практику обследования трансгенных животных показателей имму< -нологаческой активности дегидрогенаэ позволит установить индивидуальные особенности действия чужеродных генов, как в процессе роста и развития, так и при различных функциональных нагрузках, и при ксенотрансплантации органов и тканей.

3.4. Хозяйственно-полезные признаки.

Анализ хозяйственно-полезных признаков у трансгенных и нетрансгенных свиней показал', что при рождении живая масса поросят, трансгенных по генной кон-

струкции \VAP-hGH , была выше на 7,6 У», а по двум конструкциям - \VAP-hGII и тМП-ЬОЯР на-11,8/- %, соответственно, и составила 1,27 и 1,32 кг против кг в сравнении с контрольными аналогами. На протяжении всего периода выращивания мы наблюдали более высокие темпы роста свиней, трансгенных, как по конструкции 1ДГАР-!»СН, так и по двум конструкциям - \VAP-hGH и тМЛ-ЬСИК Более высокая скорость роста трансгенных свиней связана с воздействием гормона роста человека на белковый обмен, что проявляется в усилении анаболизма белков и,как следствие, стимуляции процесса роста организма свиней/тлБ'л. №),

Таблица 10

Динамика живой массы и среднесуточные приросты трансгенных и нетрансгенных свиней 111 поколения, М + ш,

Показатели Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи'

WAP-hGH WAP-hGH и roMTl-hGRF

Живая масса, кг

в возрасте, дн:

при рождении 1,27+0,05 1,32+0.08 1,18+0,02

60 16,1+0,5 15,6+0,7 15,5+0,4

120 42.6+0,8 42.5+0,9 39.8+0,9

180 80,0+1,2 78.9+U 67,1+1,4

240 111,4+1,6 112,6+1,7 100.7+1.5

Среднесуточный прирост живой массы, г

за период, дн:

60-120 442+23,2 447+21,7 403 +19.3

12Ы80 633+35,3*** 617±32,5*** 463+22,5

181-240 532+28,2 571+27,1 569+30,7

***Р< 0,001 в сравнении с контролем«

Однако, необходимо отметить, что трансгенность мало влияет скорость роста поросят на ранних этапах развития. И,как показал анализ полученных данных, трансгенные животные с возрастом в большей степени проявляют специфические особенности, не свойственные нетрансгенным сверстникам. Это проявляется прежде всего, в значительном увеличении среднесуточного прироста у трансгенных животных по сравнению с контрольными.

Наибольшее увеличение живой массы у трансгенных свиней наблюдалось в возрасте 180 дней. Так. у поросят, трансгенных по генной конструкции WAP-hGH живая масса составила -80 кг н была выше на 19.1 % , а у молодняка, трансгенного

по двум конструкциям - 78.9 кг, т.е. на 17,5 Vt больше по сравнению с нетраисгенны-ми аналогами.

По показателям среднесуточного прироста трансгенные животные также превосходили контрольных. Наибольший прирост живой массы у трансгенных свиней наблюдался в возрастном периоде 121 - 180 дней. У свиней, трансгенных по конструкции WAP-hGH он составил 633 г, у животных с двумя конструкциями - WAP • hGH и mMTI - hGRF- 617 г. против 463 г у нетрансгенных свиней, и был выше соответственно на 36,7 и 33,2 % по сравнению с контролем.

Результаты изучения хозяйственно-полезных признаков показали, что трансгенные ло конструкции WAP-hGH животные достигали живой массы 100 кг на 27 дней раньше, чем нетрансгенные, а свиньи, трансгенные по конструкциям - WAP- * hGH и mMTI-hGRF на 32 дня раньше. Данные высоко достоверны ( Р< 0,001 ).

Уровень среднесуточного прироста с момента рождения до возраста достижения живой массы 100 кг у трансгенных свиней по конструкции WAP-hGH и по двум конструкциям WAP-hGH н mMTVhGRF был также высоко достоверен ( Р < 0, 001), и был выше на 13,2% ,и на 14,3 % соответственно, по сравнению с контрольными животными.

Ло среднесуточным приростам с 2-х месяцев до возраста достижения живой массы 100 кг трансгенные свиньи по конструкции WAP-hGH и конструкциям WAP-hGH и mMTI-hGRF, также высоко достоверно опережали нетрансгенных, и их прирост был выше на 15,3% и 20.S V» .соответственно (табл. 11).

Использование методов биотехнологии для увеличения скорости роста животных и улучшения состава туши откормочного поголовья, как полагают многие исследователи, будет играть важную роль в программах разведения свиней. Убедительны данные, показывающие положительное влияние трансгеиности на снижение возраста достижения живой массы 100 кг, более высокие среднесуточные приросты живой массы.

Интересные результаты были получены по снижению толщины шпика. При достижении живой массы 100 кг у свиней .трансгенных по конструкции WAP-hGH толщина шпика составила -24,5 мм, по двум конструкциям >27,0 мм, а у контрольных животных была на уровне 32,1 мм, т.е. была на 23,7 % и на 15,9 %. соответственно ниже по сравнению с нетрансгенными животным и (табл. 11).

Проведенный анализ особенностей физиолого-биохимических процессов у свиней, трансгенных по рекомбинантной конструкции WAP-hGH и двум конструкциям --WAP-hGH и mMTI-GRF позволяет констатировать, что интеграция данных кон-

струкций в геном, не оказывает отрицательного воздействия на организм свиней и все проанализированные важнейшие параметры жизнедеятельности организма находились в пределах допустимых физиологических норм.

Таблица 11

Откормочные и мясные показатели трансгенных и нетран стенных свиней III поколения. М±т,

Показатели Трансгенные свиньи по конструкции: Нетрансгенные свиньи

WAP-hGH WAP-hGH и mMTI-hGRF

Число животных, гол. 14 11 10

Живая масса в 2-мес.

возрасте, кг 16.0+0,8 17,3+0,9 15.7+0,6

Возраст достижения:

живой массы 100 кг,

дней 212,4+5,2*** 207,4+6,2*** 239,9+3,8

Среди есуточный

прирост: со дня

рождения до 100 кг, г 468,5±tl,5*** 473.1+12,4*** 413,7+6,3

с2мес. до 100 кг, г 543,2±21,5*** 567,6+16,2*** 470,8+11,5

Длина туловища

в 100 кг, см 137,3 + 2,3 137,3+1,3 137,3±2,3

Толщина шпика

в 100 кг, мм 24,5*3,5 27,012.5 32,1+2,3

***р< 0,001 - в сравнении с контролем.

Следует отметить, что интеграция вышеуказанных конструкций в геном, оказывает влияние на генотип особи, изменяя установившиеся в процессе эволюции взаимосвязи развития организма. В этом смысле трансгенез можно сравнивать с образованием точечных мутаций, однако эта мутация является "управляемой", и превно-симый ген обуславливает характер изменения признака. И если, внедренная реком-бинаитная конструкция будет так же стойко наследоваться в дальнейших поколениях, можно ожидать (при условии использования направленной селекции) получения линий животных с уникальными хозяйственно-полезными качествами.

В организме трансгенных свиней обменные процессы проходят интенсивнее, прослеживается тенденция изменения метаболических процессов в сторону снижения липогенеэа, отмечена тенденция к снижению толщины шпика. Полученные данные также позволяют сделать вывод с высоким уровнем достоверности о более высоких среднесуточных приростах у трансгенных свиней по сравнению с контрольными.

Выявлены тенденции в изменении хозяйственно-полезных признаков у трансгенных потомков, что позволяет определить селекционные критерии для работы с трансгенными животными и выявить перспективы для их дальнейшей селекции.

Выводы:

1. Свиньи, трансгенные но рекомбинантной генной конструкции, включающей последовательности гена гормона роста человека под промотором гена кислого белка сыворотки молока мышей (\VAP-hGH), продуцируют с молоком гормон роста человека в концентрации от 30 до 85 нг/мл.

2. Экспрессия генноннженерной конструкции \VAP-hGH, интегрированной в геном свиней, не носит строго тканеспецифическн^ характер . Наряду с клетками молочной .железы, экспрессия данной конструкции наблюдается в клетках поджелудочной н слюнных желез. При этом уровень экспрессии трансгена в слюнных железах составил 5-7 нг/мл.

3. Установлено, что интегрированная генноинженерная конструкция \VAP-1ЮН экспресспрует в гипофизе трансгенных свиней, вызывая секрецию гормона роста человека в кровь свиней до уровня 12-30нг/мл.

4. Установлено, что секреция гормоиа роста человека в кровь *трансгенных свиней способствовала снижению возраста достижения живой массы 100 кг (Р < 0,001), а также повышению уровня среднесуточных приростов (Р < 0,001) по сравнению с контрольными, что свидетельствует об отсутствии абсолютной видовой специфичности гормона роста человека по биологическому действию на организм свиней.

5. С целью анализа уровня экспрессии трансгена в крови, молоке и экстрактах тканей трансгенных свиней, на основе использования моноклональных антител предложе на тест- система для количественного определения уровня гормона роста человека. Оптимальная концентрация сорбированных МКА 4 мкг/мл и конъюгата 2,5 мкг/мл; чувствительность тест-системы 0,5 нг/мл.

6. Для анализа экспрессии трансгена в тканях различных органов трансгенных свиней разработана тест-система на основе иммуногистохимического метода и полученных МКА, с помощью которой было установлено присутствие гормона роста человека в клетках молочной, в протоках поджелудочной и слюнных желез.

7. В организме свиней, трансгенных по конструкции \VAP-I]ОН происходит изменение метаболических процессов в сторону снижения липогеиеза, отмечена тенденция к снижению толщины шпика по сравнению с контрольными животными.

8. Установлено, что у трансгенных свиней снижен процент сегмеитоедерных нейтрофилов и увеличен процент лимфоцитов в лейкограмме. Определено снижение ферментного профиля активности дегидрогеназ лимфоцитов, а также снижение уровня лизосомально - катионных белков нейтрофилов у трансгенных свиней..

Практические предложения:

[.Свиней, трансгенных по конструкции \VAP-hGH можно использовать в качестве продуцентов гормона роста человека.

2. Предложенная тест-система для определения гормона роста человека, может |ть использована в медицинской практике, где она прошла апробацию н получила

ложнтельное экспертное заключение комиссии Медицинской академии последипломного образования (Ы 83/2, от 3 июля 1996 года).

3. Учитывая простоту, скорость и информативность тестов определения активности дегидро ген аз лимфоцитов и л из осо мал ь но-катнон ных белков нейтрофнлов, рекомендовать их определение, как удобный и надежный инструмент для контроля за иммунологическими процессами в организме трансгенных свиней.

(. Полтавцева P.A., Эрнст Л.К., Мясников Ю.В., Супрун А.П., Тогонидзе Т.М. /Ферментный статус лейкоцитов свиней, трансгенных по генам гормона роста и ри-лшинг-ф актора гормона роста человека // Сельскохозяйственная биология.- 1996.-N. 4.-С. 43-47.

2. Эрнст Л.К.. Полтавцева P.A., Мясников Ю.В., Супрун А.П7 Ферментный статус лимфоцитов и лиэосомально-катнонных белков нейтрофнлов свиней, трансгенных по генам гормона роста и рилизинг-фзктора гормона роста человека // Тезисы докладов II международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных". Киев1996С. 45.

Опубликованные работы;

Подписано в печать 2K.V4.97 г. Формат издания 60*9(1 1/16 _Усл. печ. л. 1,5. Тираж - ЮТ. Заказ №756_

Отпечатано в печатном цехе ГП УСЗ Минсельхозпрода России 107139, Москва, Орликов пер., 1/11