Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ ингибирования репродукции вируса лейкоза коров генами антисмысловых РНК и трансактиватор-связывающим участком ДНК ВЛК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ ингибирования репродукции вируса лейкоза коров генами антисмысловых РНК и трансактиватор-связывающим участком ДНК ВЛК"

^ с

Л ^ V-РОССИЙСКАЯ АКАДЕМ4Я СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ^ ВНИИ СЕЛЬСЖОХСВДЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

N л

на правах рукописи

ШАЯХМЕТОВ ДмЗтряй Мударясович

АНАЛИЗ ИНШЕИРОВАНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ЕИРУСА ЛЕЙКОЗА КОРОВ ГЕНАШ АШИСШСЛОНК РНК И ТРАНСАКТИВАТОР-СВЯВЫВА1ЩЫ УЧАСТКОМ ДНК ВЛК

(специальность 03. 00. 03. - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стелена кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно - исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАСХН Тихоненко Т.К.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

Завриев С.К. - кандидат биологических наук Крикун В.А.

Ведущая организация - Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится " "_;_1995г.

в _час. на заседании Специализированного совета Д 020.40.01

при ВНИИ Сельскохозяйтвенной Биотехнологии. РАСХН (127550, Москва, ул. Тимирязевская, д.42.)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной 0иотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "_1995г.

Ученый секретарь специализированного совета.

кандидат биологических наук

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

М ту арность _щюблемы. Отсутствие значительного прогресса в терапии важнейших вирусных и онкологических заболеваний стимулирует интенсивный поиск новых подходов к борьбе с этими недугами, к числу которых безусловно относится группа комплементарно - адресованных полинуклеотидов, куда входят антисмысловые РНК (асРНК), олигодезоксинуклеотида и рибозимы. Отсутствие выраженной токсичности, высокая эффективность и специфичность действия, делают их использование крайне привлекательным для направленного ингибирования экспрессии различных вирусных генов и создания на их основе так называемого неприродного информационного противовирусного иммунитета.

Возможности современной генной инженерии позволяют создавать гены асРНК, направленные против практически любого известного вируса, а эффективные промоторные системы способны обеспечивать высокий уровень их экспрессии в зараженных клетках. Вместе с тем, изучение молекулярно-биологических особенностей различных вирусов открывает новые возможности для разработки более надежных и совершенных методов защиты организма от вирусных инфекций. Именно поэтому представляется достаточно актуальным не только создание генов противовирусных асРНК для достижения максимальных и стабильных эффетов ингибирования вирусной репродукции, но и продолжение поиска альтернативных противовирусных агентов, которые бы способствовали избирательному подавлению экспресии вирусных генов и не затрагивали бы экспрессии нормальных клеточных генов.

Пе®_0_залачи_исследованид' Целями настоящей работы являлись поиск оптимальных мишеней в геноме вируса лейкоза коров (ВЛК) для

действия асРНК и промоторных систем для их. эффективной экспрессии, изучение возможностей использования собственного вирусного промотора для контроля транскрипции генов анти-ВЛК асРНК, а также поиск принципиально новых способов ннгибирования вирусной инфекции, связанных с утилизацией вирусных трансактиваторных белков. Для этой цели, в частности, планировалось испытание участка промотора U3 области LTR ВЖ в качестве возможного специфического ингибитора транскрипционной активности вирусного промотора в клеточных культурах.

Для достижения выбранных целей, мы разделили работу на три части, при выполнении каждой из которых предстояло решить следушие задачи:

1. Создать серию генно-инженерных конструкций, несущих гены анти-ВЛК асРНК, направленные на различные функционально значимые области вирусного генома и находящиеся под контролем промоторов генов ТК HSV-I, VAI ENA Ad5 и промотора из U3 области LTR ВПК; испытать транскрипционную активность выбранных промоторов и оценить.антивирусное действие полученных генов асРНК в культуре клеток линии CC8I.

2. Выявить особенности противовирусного действия генов асРНК, контролируемых собственным вирусным промотором.

3. Исследовать возможность использования транскрипционно неактивных энхансерных участков ДНК промотора ВЛК для ннгибирования транскрипционной активности вирусного промотора в культуре клеток.

Н2Хтаая_ношзна_и_ШШ™неская_знащмость. в настоящей работе впервые исследовались эффекты противовирусных асРНК, гены которых контролируются собственным вирусным промотором.

Кроме того, впервые показана возможность ннгибирования в

культурах клеток как транскрипционной активности вирусного промотора, так и вирусной репродукции, транскрипциошю неактивными двухцепочечными участками ДНК, содержащими области связывания вирусного трансактиваторного белка.

Первая часть работы посвящена созданию серии плазмидннх конструкций с генами анти-ВЛК acFHK, направлешшх против R, R-U5 и 5'~gag областей вирусного генома под контролем трех различных промоторов. В клетках линии CC8I, методом защиты от РНКаз, проведен сравнительный анализ эффективности транскрипции полученных генов асРНК, и установлено, что в данных условиях, наибольшей активностью обладал промотор гена VAI RNA Ad5. Далее был проведен анализ противовирусного действия генов асРНК, на основании чего был сделан вывод, что наиболее эффективной, из всех исследованных, мишенью для действия асРНК в геноме BJK является донорный сайт сплайсинга, локализованный в R области вирусного генома. При 5-ти кратном молярном отношении ДНК плазмиды с геном асРНК по отношению к прогеномной вирусной ДНК максимальный ингибирущий эффект составил 99%. ,

Во второй части работы было детально исследовано противовирусное действие гена асРНК, находящегося под контролем собственного вирусного промотора из U3 области LTR EJEK. Оказалось, что ингибирущий эффект таких асРНК нелинейно зависит от увеличения молярного избытка плазмиды с геном асРНК над прогеномной вирусной ДНК, что свидетельствует о возникновении сопряженной экспрессии вирусных генов и генов асРНК,

находящихся под контролем одного и того ¡ке промотора.

В третьей части работы оценивалось снижение транскрипционной активности интактного вирусного промотора в присутствие транскрипциошю неактивных участков ДНК, содержащих

сайты для связывания вирусного трансактиваторного белка p38tax, и доказан механизм конкуренции, лежащий в основе наблодаемых эффектов.

Работа представляет не только теоретический, но и практический интерес, так как плазииды с генами асРНК, обладающими высокой антивирусной активностью могут быть использованы для получения трансгенных животных, устойчивых к вирусу ВЛК, а обнаруженный феномен ингибирования вирусной репродукции участками ДНК, связывапцими регуляторные транскрипционные факторы, возможно, станет основой для появления нового класса ингибиторов генной экспрессии, обладающих устойчивой двухспиральной структурой и не требупцнх транскрипции.

Апробация_рабоз;ы. Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании отдела генной инженерш ВНИИ Сельскохозяйственной биотехнологии и на I Евро-Азиатском Симпозиуме по современный достижениям в биотехнологии (Анкара, октябрь 1995).

По материалам дисссертацни опубликовано 4 печатные работы и одна принята к печати.

Объем и структура диссертации. Диссертационная - работа состоит из: введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, вклшапцего 106 библиографичесских ссылок. Работа изложена на 120 машинописных страницах, вклшая 2 таблицы и 18 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Использование асРНК в качестве противовирусных агентов является перспективным научным направлением в современных молекулярно-биодопиеCKIDC исследованиях. Задача создания генов асРНК складывается из двух компонентов: I) выбор оптимальной мишени для их действия в вирусном геноме и 2) подбор эффективной промоторной системы для экспрессии этих генов. По данным многих авторов показанно, что только оптимальный выбор как промотора так и мишени для действия асРНК, способен обеспечить получение значительного шгибирования вирусной репродукции внутри клеток. Выбор оптимальной промоторной системы осложняется тем, что различные, даяе "конститутивные" промоторы, обладают разной эффективностью экспрессии в разных типах клеток и тканей. В связи с этим, предсказание эффективности действия того или иного промотора в одной системе, по данным его действия, полученым в другой, представляется проблематичным. Таким образом, выбор адекватной модельной системы In vitro ( приближенной по возможности к In vivo ) для изучения ингибнрущего действия асРНК, является важным компонентом подобных исследований. Подбор оптимальной мишени для действия асРНК в вирусном геноме, в настоящее время достаточно систематизирован. Наиболее часто, в качестве мишеней для действия асРНК, используют сайты сплайсинга вирусных мРНК, районы мРНК, прилегашие к инициа торному кодону рамки трансляции или кэп-сайту. Однако для выбора оптимального участка-мишени в вирусном геноме для шгибирования репродукции данного вируса, требуется проведение специальных экспериментов.

I.I Конструирование рекомбинантных плазмид с генами- асРНК против функционально значимых областей генома ВЛК с использованием различных промоторов.

На начальном этапе нашей работы мы сконструировали серии генов асРНК, экспрессирупцих короткие молекулы РНК, перекрывапцие последовательности стыкующихся областей LTR BLV ( "антисмысловая прогулка", рис.1) для выявления наиболее чуствительных к их действию участков генома по уровню ингибирупцего эффекта различных генов асРНК, находящихся под контролем одного промотора. В качестве мишеней для действия различных генов асРНК, ыы использовали 5' район вирусного генома, в котором сосредоточены последовательности, наиболее важные для репродукции всех ретровирусов, а именно: участок R области, перекрывающий донорный сайт сплайсинга для всех субгеномных вирусных мРНК, участок R-U5 области, перекрывающий сигнал упаковки вирусных РНК, сайт инициации обратной транскрипции, и несовершенные инвертированные повторы, играпцие вааную роль в дкмеризацин геномных РНК и инициации сборки вирусного нуклеокапсида, а тагаге 5' -нетранслируемую область гена gag, прилегающую- к его шшциаторюму кодону AUG.

Для поиска оптимальной промоторной системы для экспрессии генов асРНК, были сконструированы гены, направленные к одному сайту в геноме ВЛК, но контролируемые различными промоторами. Использование промотора гена ТК ESV1 ( конструкции pTR и pTG) обусловлено тем, что ранее уте была показана эффективная экспрессия генов асРНК, контролируемых этим промотором, но они были направленны на другие участки генома ВЛК. Енбор промотора VA1 RNA Ad h5 для экспрессии генов асРНК, основан на том, что этот

5'- район геномной РНК ВЛК

R

U5

gao

САР

-PBS

I—I г

SD

AUG

ü> И

pvn

pVU

pVG

рШ

£> Ha

pLIJ

2EH

pLG

рТП

pTQ

V/URÜAM3

Ж

-U3LTRCLV

TKK3V-4

Рис. I. Схемы сконструированных плазмид с генами асРНК под контролем промоторов ТК HSV-I, VAI OTA Ad5, U3 области LTR ВЛК и их направленность на различные участки генома ВЛК.

промотор является специфическим для эукариотической РНК полимеразы 3 типа. По даным литературы, промоторы, узнаваемые этой РНК полимеразой, обладают конститутивностыэ и высоким уровнем экспрессии независимо от типа клеток и тканей, используемых в эксперименте. Необходимость изучения механизмов ингибирования и основных принципов действия асРНК, в данном случае, определила создание вектора pLT, несущего промотор из U3 области LTR BLV и генов асРНК, контролируемых этим промотором. В частности, мы впервые исследовали возможность ингибирования вирусной репродукции с помощью генов асРНК, находящихся под контролем собственного вирусного промотора. Таким образом, весь комплекс полученных генноинженерных конструкций составил основу для последующего разностороннего изучения ингийирувдего действия асРНК против ВЛК в выбранной модельной системе, а так Ее характера экспрессии их генов , контролируемых промоториымн элементами РНК полнмераз эукариот 2 и 3 типов.

1.2 Анализ транскрипции полученных генов асРНК, направленных против R и R-U5 областей генома ВЛК в клеточной линии CC8I.

Как показал сравнительнвй анализ транскрипции сконструированных наш генов асРНК в клетках линии CC8I методом защиты от РНКаз, наибольшей эффективностью экспрессии обладали гены асРНК, находящиеся под контролем промотора гена VAI RNA Ad h5 (рис.2). При этом, значительная экспрессия была выявлена как для гена асРНК, направленного на R область (плазмида pVR), так и для гена асРНК, направленного на R-U5 область вирусного генома (нлазшада pVU). Полученные данные хорош согласуются с результатами, полученными ранее другими авторши, согласно

А. 1 2

3 4 5

Рис.2. Транскрипция полученных генов асРНК в клетках линии CC8I.

А.-транскрипция генов асРНК против R области вирусного генома под контролем промоторов ТК HSV-I - трек 3, VAI RNA - трек 4 и LTR BLV - трек 5, трек I - маркер мол.весов.

Б.-транскрипция генов асРНК против R-U5 области вирусного генома под контролем промоторов ТК HSV-I - трек 3, VAI RNA - трек 4 и LTR BLV - трек 5, трек I - маркер мол.весов.

Транскрипт генов асРНК указан стрелкой.

которым, промотор гена VAI RNA обладает высокой транскрипционной активностью в* различных типах клеток и тканей. Используя этот метод анализа, нам не удалось достоверно детектировать наличие экспрессии генов асРНК, контролируемых как промотором гена ТК ESV-I, так и промотором U3 области LTR ВЛК.- В настоящее время К. Rittner с соавторами установлено, что сам по себе промотор гена ТК HSV-I обладает

невысокой транскрипционной активностью, поэтому уровень экспрессии генов асРНК, контролируемых этим промотором, в клетках линии CC8I, может быть ниже порога чувствительности метода защиты от РНКаз.

Известно [44], что промотор U3 области LTR ВЛК обладает крайне незначительной базовой транскрипционой активностью в зараженных лимфоцитах, однако при появлении в клетках вирусного специфического трансактиваторного белка p38tax, она увеличивается в десятки раз. В наших экспериментах мы действительно показали, что в присутствие белка p38tax, в клетках линии CC8I, уровень экспрессии генов асРНК, контролируемых этим промотором значительно возрастал и достоверно детектировался методом защиты от РНКаз, что также хорош согласуется с множеством данных полученных ранее.

1.3 Анализ противовирусной активности полученных генов асРНК в клетках линии CC8I.

Анализ противовирусного действия сконструированных генов асРНК, котрансфицированных совместно с прогеномной ДНК ВЛК в различных весовых соотношениях, показал, что гены асРНК, направленные к 5' - нетранслируемой области гена gag, не проявляли ингибирупдего действия на репродукцию ВЛК независимо от

типа промотора направлявшего синтез антисмысловых транскриптов.

Более того, ген асРНК, направленный к R области вирусного генома под контролем промотора гена ТК HSV-I (из плазмиды pTR), так же не оказывал какого либо ингибирупцего действия на репродукцию вируса. Эти результаты вполне объяснимы, так как и на уровне РНК мы не смогли обнаружить экспрессию генов асРНК, контролируемых промотором ТК ESV-I. Очевидно, что если уровень экспрессии гена асРНК крайне низок, то понятно отсутствие какого-либо антивирусного эффекта in vitro.

Исследование противовирусного действия генов асРНК, направленных против R и R-U5 областей вирусного генома показало, что R-U5 область является достаточно чуствительной к действию асРНК. В частности, асРНК, транскрибируемая с гена асРНК (в плазмнде pVU), под контролем промотора VAI RNA Ad h5 ингибировала репродукцию ВЛК на 40%, при 10-ти кратном весовом избытке плазмидной ДНК над ДНК вирусного прогенома (табл.1). Более того, при использовании 5-ти кратного избытка плазмиды рШ, в которой ген асРНК находится под контролем собственного вирусного промотора, по данным реакции синцитиеобразования, наблюдался 75%-й уровень ингибирования вирусной репродукции (табл.2). Шесте с тем, наибольшее ингибирование вирусной репродукции (-99%) мы обнаружили при использовании плазмиды pLR, с геном асРНК под контролем промотора LTR ВЛК, не против R-U5, а против R области вирусного генома. Этот участок R области, величиной 97 ют, перекрывает донорный сайт сплайсинга для всех субгеномных вирусных мРНК, и, вероятно, именно за счет нарушения процесса сплайсинга мы наблюдали практически полное ингибирование вирусной репродукции. Полученные данные подтвержают данные, полученные ранее, согласно которым, сайты сплайсинга мРНК являются достаточно чуствительными

Таблица I. Антивирусная активность генов -асРНК,

направленных против R, R-U5 и 5'-gag областей генома ВЛК, под контролем промотора VAI RNA Adh5.

Котрансфецируемая Мишень в Количество Количество Ингибиро-ДНК геноме вносимой ДНК синцитиев вание

ВЛК мкг на чашку3^ на чашку %

p(JA4 + ДНК ВЛК - 10/1 713 + 57 -

pVR + ДИК ВЛК R 10/1 698 + 61 0

pVTJ + ДНК ВЛК R-U5 10/1 430 + 60 40

pVG + ДНК ВЛК 5'-gag 10/1 720 + 77 0

Примечание, а) Указано в числителе количество трансфицированной плазмидной ДНК, в знаменателе - количество трансфицированной ДНК ВЛК.

к действию асРНК. Таким образом, можно сделать заключение, что именно й область генома ВЛК является, из исследованых, наиболее чуствительной к действию асРНК.

Отсутствие противовирусного эффекта гена асРНК, находящегося под контролем промотора гена УА1 ИНА Ай и направленного против И области вирусного генома оказалось для нас достаточно неожиданным, поскольку мы ранее ясно продемонстрировали эффективную экспрессию генов асРНК, контролируемых этим промотором в клетках линии СС81 (рис.2). Более того, как уже отмечалось, противовирусный эффект асРНК, направленных к й области вирусного генома оказался очень высоким, даже при незначительных молярных избытках ДИК плазмид с генами асРНК над вирусной прогеномной ДНК. Как отмечалось ранее радом авторов, [36, 85]. на величину

Таблица 2. Антивирусная активность генов асРНК, направленных против R, R-U5 и 5'-gag областей генома ВЛК, под контролем промотора U3 области LTR ВЛК.

Котрансфецируемая Мишень Количество Количество Ингибирование ДНК в геноме вносимой ДНК синцитиев %

ВЛК мкг/чашса8^ на чашку специф. неспец

ДНК ВЛК - O/I 440 - 42 - -

pLT + ДНК ВЛК - 1/1 396 - 32 - 0

pLR + ДНК ВЛК R 1/1 91 ± 10 75

pLU + ДНК ВЛК R-U5 1/1 207 ± 35 50

pLG + ДНК ВЛК 5'-gag 1/1 458 ± 55 0

pLT + ДНК ВЛК - 3/1 306 - 33 - 30

pLR + ДНК ВЛК R 3/1 4± 2 98

pLU + ДНК ВЛК R-U5 3/1 75 ± 20 75

pLG + ДНК ВЛК 5'-gag 3/1 308 - 77 0

Примечание, а) Указано в числителе количество трансфицированной плазмвдной ДНК, в знаменателе - количество трансфицированной ДНК ВЛК.

ингибирупцего действия асРНК оказывают больше влияние особенности вторичной структур! конкретных молекул. Поскольку промотор гена VAI RNA, в отличие от промотора U3 области LTR ВЛК является "внутренним" и транскрибируется РНК-полшеразой III в

составе общего антисмыслового транскрипта, то,, достаточно очевидно, что реальные вторичные структуры молекул асРНК, даже если они направленны на один участок вирусного генома, будут существенно отличаться, а значит и противовирусное действие таких молекул асРНК может быть различным.

2. Динамика ингибирования репродукци ВЛК геном асРНК против Н-115 области ВЛК под контролем собственного вирусного промотора.

Множество данных полученных ранее свидетельствуют о том, что для существенного ингибирования репродукции вирусов в культуре клеток требуются, при конститутивном характере экспрессии генов асРНК, значительные 50-100- кратные молярные избытки молекул асРНК по отношению к РНК мишени. При этом было замечено, что степень молярного избытока ДНК плазмида с гене»« асРНК над вирусной прогеномной ДНК, определяла, как правило, и величину наблвдаемого ингибирупцего эффекта.

При анализе динамики ингибирования репродукции ЫК асРНК, против 11-115 области вирусного генома (из плазмида рЫЛ и щи анализе динамики экспрессии репортерной РНК гена р-галактозидазы, находящихся под контролем промотора МБ ВЛК (из плазмида рСЬ), мы установили, что при увеличении молярного избытка ДНК плазмида как с геном асРНК, так и с геном р-галактозидазы над вирусной прогеномной ДНК с 1/1 до 3/1, либо до 5/1 мы наблвдали значительное увеличение уровня транскрипционной активности промотора 1/ГО ВЛК (рис.3, 4), при этом уровень ингибирования вирусной репродукции возрастал до 50% и даже до 75%. Однако, в противоположность известным данным, при дальнейшем увеличении молярного избытка плазмид, несущих гены под контролем вирусного

промотора над прогеномной вирусной ДНК до 10/1 и вше, мы обнаружили, что его транскрипционная активность остается на неизменном уровне, а степень ингибирования вирусной репродукции значительно снижается (ряс.З ). Бресте с тем, было отмечено, что при котрансфекции с вирусной ДНК векторной плазмиды, не несущей гена асРНК, но содержащей последовательность промотора LTR ВЛК (pLT) при 10-ти и 20-ти кратных молярных избытках, количество образупцихся синцитиев также снижается почти на 60%.

2.1 Использование плазмиды с геном р-галактозидазы под контролем промотора U3 области LTE ВЛК в реакции вирусиндуцированного синцитийобразования.

Известно, что при трансфекции ДНК BLV в клетки линии CC8I,через 72 часа начинает образовываться синцитии многоядерные образования в монослое, продукт вирусиндуцированного слияния клеток. При котрансфекции вирусной ДНК с плазмидой pGL, содержащей ген р-галактозидазы под контролем промотора LTR BLV, мы обнаружили, что во всех вариантах опыта при нанесении in situ хро;<гагенного субстрата X-gal, все образовавшиеся синцитии имели ярко-синш окраску на фоне бесцветного монослоя (рис.5). Кроме того, в одних и тех же вариантах опыта, количество синцитиев шявленных после специфической окраски клеток на наличие экспрессии р-галактозидазы было идентично количеству синцитиев, полученному после неспецифического окрашивания монослоя раствором толуидинового синего. В контрольном эксперименте при котрансфекции с вирусной ДНК плазшда pEQ176, в которой ген р-галактозидазы находится под контролем конститутивного промотора предранних генов CMV, только единичные синцитии имели голубую

600г

? т I х

о

ы

г

500

400

300

200

100

-о-о-

0 5 10 15 20

Молярное соотношение: плазмидная ДНК/ДНК ВПК

о

ч

2

3

Рис. 3. Динамика снижения количества образующихся синцитиев при котрансфакции с прогеномной вирусной ДНК плазмидных ДНК в различных молярных соотношениях. Линия I - прогеномная вирусная ' ДНК, трансфецированная в клетки СС81, линия 2 - прогеномная вирусная ДНК, трансфецированная совместно с плазмидой рЬТ, несущей промоторный район ВЛК, линия 3 - прогеномная вирусная ДНК, трансфецированная совместно с плазмидой рьи, экспрессируадей ген асРНК против И~и5 области генома ВЛК под контролем вирусного промотора.

и.

1 2 3 4 5 6

311 249

200

151 140

Рис.4. Транскрипция гена р-галактозидазы под контролем промотора 1/ГО ВЛК из, плазмвды рбЬ, при ее трансфекции с прогеномной вирусной ДНК в различных молярных соотношениях. Трек 2 - РНК из клеток линии СС81, трансфецированных вирусной прогеномной ДНК, транскрипция гена р-галактозидазы при соотношении ДНК плазмиды рСЯ. с прогеномной вирусной ДНК 1/1 -трек 3, 3/1 - трек 4, 6/1 - трек 5 и 10/1 - трек 6. Трек I -маркер мол.весов рСЖЗг/НраП. Транскрипт гена р-галактозидазы обозначен стрелкой.

Рис. 5. Специфическое окрашивание 1п з1Ш вирусиндуцированных синцитиев при котрансфекции в клетки линии СС81 прогеномной вирусной ДНК совместно с ДНК плазшды рвЬ, экспрессирукцей ген р-галактозидазы под контролем промотора ЬТИ ЕПК. Увеличение 400х.

окраску. Обнаруженное дифференциальное окрашивание синцитиев, образувдихся в результате вирусной репродукции значительно облегчает анализ результатов опытов, где используется реакция образования синцитиев е качестве метода оценки ингибирупцих эффектов различных противовирусных препаратэв.

3. Новый принцип ингибирования репродукции ВЛК, основанный на связывании вирусного трансактиватора.

Полученные данные по динамике ингибирования репродукции ВЛК геном асРНК под контролем собственного вирусного промотора являются весьма неожиданными, поскольку при повышении количества генов асРНК мы наблвдали, вначале, увеличение, а затем значительное снижение уровня ингибирования вирусной репродукции.

Рабочая гипотеза, разработанная нами для объяснения наблвдаешх фактов состоит в предположении о том, что количество белков, способных инициировать эффективную транскрипцию с промотора 1ЛТ1 ВЛК в клетке ограничено, следовательно, появление большого числа промоторных последовательностей, контролирующих синтез каких либо других, не виру сток, генов, способно, по механизму конкуретного связывания, снижать транскрипционную активность функционального вирусного промотора, а значит и экспрессию различных вирусных генов.

Поскольку, в настоящее время установлена точная локализация участков связывания активаторных транскрипционных факторов в промоторе ВЛК, для проверки нашей гипотезы, мы далее сконструировали плазмвду рЕБ, несущую участок вирусного промотора (рис.6), и исследовали способен ли участок промотора, не несущий ТАТА-бокса, и не обладающий транскрипционной активностью

Рголкйэг 113 ЦГО В1У

I--в-1 рЬТ

ЕсоШ 1- I ' 8шв I

Азл I

Еоога

Абп| Н1пс II

ЕсоГО РЙ1 Н5пс II гкРГ"

•<--в" §" В В 1 В " В роо

Еоога Х1ю1

031ЛК В1У А ТАТМюк

в а в § рЕЕ

Р&1 ХЬо1

ю, РЕ0176

>0ю1

Рб41 СМУргопюгзг

Ре11 ХЬо1

ЦЗ1ЛТ* С1-У А ТАТА4НЯ

Рис.6 Схема конструирования плазмид рЕЗ и рСВ с участком вирусного прс&йтора без ТАТАнЗокса.

ингабировать репродукцию ВЛК.

3.1 Ингибирование репродукции ВЛК плазмидой рЕБ, несущей промотор ВЛК с делецией ТАТА-бокса в клетках линии СС81.

Как оказалось, плазмида, несущая участок промотора из ИЗ области ЬТИ ВЛК, котрансфицированная в клетки линии СС81 совмесно с вирусной прогеномной ДИК в различных молярных соотношениях, действительно, способна ингабировать репродукцию ВЛК, причем как по данным реакции синцитиеобразования, так и по прямому тестированию количества вирусных РНК в зараженных клетках (рис. 7 а, б).

Более того, поставив модельный эксперимент для выяснения молекулярного механизма наблюдаемого явления, мы установили, что при котрансфекцяи одинаковых количеств плазмиды, экспрессирупцей трансактиваторный белок ВЛК p38tax под контролем промотора ранних генов ¡5У40, и плазмиды экспрессирупцей репортерный ген р-галактозидазы под контролем интактного промотора ЬТИ ВЛК с возрастатаиш количествами плазмиды, несущей участок вирусного промотора без ТАТА-бокса, уровень транскрипционной активности интактного вирусного промотора действительно снижается (рис.8). Полученные результаты ясно доказывают существование конкуренции за транскрипционные (клеточные), и трансактиваторный (вирусный p38tax) факторы как реального механизма, ответственного за обнаруженный феномен.

Таким образом можно сделать заключение о том, что щлтенеие про?.ютора ИЗ области ЬТЙ ВЛК для создания генов асРНК, направленных против РНК ВЛК, обеспечивает сопряженную экспрессию асРНК и вирусных мРНК, гены асРНК под контролем этого промотора

Молярное соотношение: плазмидная ДИК / ДНК ВПК

Рис. 7. Ингибирование репродукции ВЛК в клетках линии CC8I при котрансфекции с прогеномной вирусной ДНК плазмида pES,

несущей участок вирусного промотора без ТАТА-бокса.

А. - количество образующихся синцитиев при трансакции с прогеномной вирусной ДНК плазмида pES в различных молярных соотношениях.

Б. - снижение количества вирусной геномной РНК в клетках линии CC8I при котрансфекции с ДНК ВЛК плазмида pES в молярных соотношениях: I/O - трек 3, 1/10 - трек 4, 1/20 - трек Б, и 1/30 - трек G. Трек I - маркер молекулярных весов.

I

I ,3

311 «йэ

249 «ЙЭ

200

159

3 4 5 6 «»» С© ' "

Рис.8. Транскрипция гена р-галактозидазы под контролем промотора ЬТН ВЛК в присутствие вирусного трансактиваторного белка р381ах и возрастащих количеств плазмиды рЕВ, с участком вирусного промотора без ТАТА-бокса. Трек 2 - РНК из клеток линии СС81, трансфзцировашшх плазиидой рЕБ н плазиадой рШ;ах экспрессирувдей трансактиваторный белок ВЛК р^ах, трек 3 -транскрипция гена р-галактозидазы под контролем промотора ЬТЙ ВЛК в отсутствие вирусного трансактиваторюго белка, транскрипция гена р-галактозндазы под контролен прсаютора ЬТИ ВЛК (из плазнвды рйЬ) в присутствии равного количества трансактиватора р381ах и при 10-ти (трек 4), 20-ти (трек 5) и 30-ти кратных (трек 6) молярных избытках плазмиды рЕЗ.

проявляют высокую противовирусную активность в культуре клеток, и, более того, наличие в клетках в момент заражения, определенного количества промоторшх последовательностей ДИК, несущих участки связывания вирусного трансактиваторного белка р^ах, 'способно существенно снизить транскрипционную активность вирусного промотора, а значит повысить концентрационный барьер для развития продуктивной вирусной инфекции.

Особо хотелось бы отметить, что до настоящего времени, в литературе не описаны случаи использования не требующих транскрипции двухцепочечных молекул ДНК, в качестве ингибиторов вирусных инфекций. Участки промоторов, чуствительных к вирусным факторза активации транскрипции, очевидно, могут представлять собой новый класс противовирусных агентов, выгодно отличапщхся от изученных ранее, так как, при интеграции в клеточный геном, они не способны вызвать нежелательную или избыточную экспрессию клеточных генов, в частности онкогенов. Кроме того, такие последовательности невелики по размеру (достаточно 100-150 пн) и обладают высокой специфичностью по отношению к взаимодействующий! с шзш факторами. Широкое распространение регуляции экспрессии вирусных генов посредством вирусспецифнческих регуляторных факторов, действующих ин-транс, позволяет надеятся, что этот подход предотвращения вирусной инфекции может найти самое широкое применение в будущем.

выводы

1. Создана серия плазмидных конструкций, содержащих гены ас-РНК против функционально значимых областей генома ВЛК под контролем промоторов ТК HSV-I, VAI RNA Ad5 и U3 области LTR ВЛК.

2. Показано, что наиболее эффективной мишенью для действия асРНК в геноме ВЛК является участок R области, перекрывающий донорный сайт сплайсинга для всех вирусных субгеномных РНК.

3. Впервые показана возможность использования собственного промотора U3 области LTR ВЛК для контроля экспрессии противовирусных асРНК в клеточных культурах. При 5-ти кратном молярном избытке плазмвд с генами асРНК над прогеномной вирусной ДНК был достигнут 99%-ый уровень ингибирования вирусной репродукции.

4. Изучение противовирусной активности генов асРНК, под контролем промотора U3 области LTR ВЛК выявило наличие нелинейной зависимости уровня их ингибирупцего действия от молярного избытка ДНК плазмиды с геном асРНК над вирусной прогеномной ДНК.

5. Используя сконструированную плазмиду pES, несущую область . промотора ВЛК без ТАТА-бокса, впервые обнаружена способность промоторных - энхансерных последовательностей ДНК ВЛК ингибировать репродукцию вируса ВЛК в культуре клеток, в условиях не требующих их транскрипции.

6. Впервые показано подавления транскрипционной активности промотора U3 области LTR ВЛК, обусловленное конкуренцией за связывание вирусного трансактиваторного белка p38tax, в присутствие 20-ти - 30-ти кратных молярных избытков плазмиды, несушей энхансерные области вирусного промотора.

7. Получена рекомбинантная плазмида, несущая ' ген ß-галактозпдазы под контролем прея.»тора U3 области LTR ВЛК, существенно улучшащая тест-систему, на основе клеточной линии CC8I, для определения уровня вирусной репродукции по реакции синцитиеобразования.

Список работ, опубликованных по тале диссертации:

1. Борисенко A.C., Шаяхметов Д.М., Герзилова А.Г., Тихонетсо Т.И.. Использование промотора U3 области LTR вируса лейкоза'коров для экспрессии генов противовирусных антнсмысловых РНК в клеточных культурах. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1994, Но 3, стр. 16-20.

2. Шаяхметов Д.М., Герзилова А.Г., Борисенко A.C. Тихоненко Т.И.. Исследование транскрипционной активности промотора из U3 области LTR вируса лейкоза коров и его способность контролировать экспрессии генов противовирусных антнсмысловых РНК в клеточных культурах. // в сб. "Еиоинженерные и трансгенные сельскохозяйственные животные", 1995, т. I, стр. 367-378.

3. Герзилова А.Г., Борисенко A.C., Шаяхметов Д.М., Зеливянский C.B., Тихоненко Т.И.. Сравнительный анализ эффективности ингибирования репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота антисашсловыми РНК и немодифицированными олигодезоксинуклеотидама в клеточных культурах.. // в сб. "Биоинкенеркые в трансгенные сельскохозяйственные животные", 1995, т. I, стр. 329-340.

4. Barisenko A., Shayakhmetov D., Gerzilova A., Arslan А., Tikohanenko T.I.. Investigation of antiviral activity of different complementary-addressed polynucleotides (antisense ENA, ontisense ША and ribozyme) on bovine leukaemia virus infeotion in cell cultures.// Euroasian Symposium on Current Trends in Biotechnology: gene diagnostics, gene therapy, and informational iismmity. (Ankara, October, 1995).

5. Tikahmanko T.I., Borissenko A.S., Ponomareva T.I.,

Baurln V.V., Shayakhmetov D.M.. Creating of artifitial Informational immunity against retroviruses based on encoding complementary adressed pollnucleotides (CAP).// Euroasian Symposium on Current Trends in Biotechnology: gene diagnostics, gene therapy, and Informational immunity. (Ankara, October, 1995).

6. Shayakhmetov D.M., Borlsenko A.S., Gerzilova A.G., Tikchonenko T.I.. The use of the LTR U3 promoter of Bovine Leukaemia Virus for expressing antisense antiviral RIJAs and competitive Inh-ibition of viral Infection In cell cultures.// Virus Research, 1995, in press.

Подписано в печать 1С. (¡£~ Формат 60x84/16 Заказ

Усл. печ. л. 5 Тираж

Типография Россельхозакадемии 115598, Москва, ул. Ягодная, 12.