Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Информирование репродукции парвовируса свиней

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Информирование репродукции парвовируса свиней"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК. ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

На правах рукойисн

Воскресенская Елена Петровна

(оз.оо.оз - молекулярная околотая ) ИНГИбИРОВАНИЕ РЕПРОДУКЦИИ.. ПАРВОВИРУСА . СВИНШ АНГИСШагОВЬМИ РНК.

АВТОРЕФЕРАТ . Диссертации на ' соискан и е ученой степени кандидата биологических: наук.

МОСКВА 1993 г;

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии хивои отдела генной, инженерш ВНИИ сельскохозяйственной биотехноло! РАСЖН.

Научные руководители : доктор биологиче сюта.. еец

Проф., ЧЛ,- корр. РАСХН Тихоненко Т.И.

Консультанты: кандидат биологически! на!

Понамарева Т.И. , Официальные оппоненты: доктор биологических науи

проф. Шемякин М.Ф. . доктор биологических нау«

проф. Орлянкин Б.Г. Ведущая, организация - Биологический факультет Московско Государственного Университета им. И.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится " " ^_ 1993 г.

в _ час. на заседании Специализированного Сове

д.020.-40.01. при ВИКИ оельокохоа& твенной биотехнологии. РАСХН :

С' диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВН сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан 1999 г.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук <■Меликова С^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.Актуальность проблемы.

Одним из перспективных путей борьбы с вирусными. заболеваниями является создание искусственного антивирусного иммунитета с помощью антиедаеловых (ас) >

полинуклеотидов,которые представляют собой или ао РНК, как природного так и неприродного генеза, или синтезированные химически ас олигоде зоксинуклоотида (ас ДНК), которые возможно использовать в качестве химиотерапе втиче ских антивирусных агентов. Хотя мы по традиции будем широко использовать термины ас РНК и ас ДНК» но для полноты, картины следует отметить, что на самоы деда эта группа антивирусных агентов включает наряду <; поли- и олигонуклеотидами комплементарными вирусным таформациовним' мРНК (ас РНК в узком смысле слова) также и агенты комплементарные (-) цепям вирусных геноме® » ;.зк>мополимеры ас ДНК, способные формировать тройное спирали в вирусных ДНК, рибозимы и олигонуклеотидчц способные связывать определенные регуляторныэ оаяки 'и трансактиваторы вирусного происхождения- Вся ата группа веществ,' включая и ас РНК в узком смысле »того слова носит название комплементарных адресованной антивирусных полинуклеогадов.

исследования последних лет. показали эффективность Использования йятисмысловых РНК для подавления репродукции разлцчнцх вирусов. Открытие ас РНК дает совершенно новый способ рерушш генной экспрессии в клетках. Кроме того.

■ они потенциально мощный инструмент в медицинской практике и ветеринарии, т.к. могут сить использованы в генной терапии, а тамге дают реальную возмокноотъ для создания пород

трансгенных животных , устойчивых к одной или даже нескольким вирусным инфекциям.

2.Цели и задачи исследования.

Для изучения влияния ас РНК на-репродукцию парвовируса свиней бил., сконструированы плазмщш , зкспрессирущие ас РНК против неструктурного белка парвовируса свиней (ПВС).

Для решения поставленной перед нами задачи ном предстояло:

1 .Создать. гекно-инженэрныэ конструкции способные продуцировать ас РНК против неструктурного (НС) белка ПВС под контролем индуцибельногй т талло тионе инового промотора мыши (ИХ-1).

2.Получить на основе клеточной линии щитовидной железы свиньи , пермиссивной для ИБС .*чнии, содержаще в геноме данную конструкцию и продуцирующие ас РНК к НС области генома ПВС.

3.Истштрть антивирусное действие полученных конструкций с генами ас РНК в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и

•в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).

3.Научная новизна и практическая значимость. В процессе работы созданы вектора , несущие под контролем МТ-1 промотора мыши ген ас РНК против НС области генома ПВС и испытана антивирусная активность данных плазмид в отношении репродукции^. ПВС в 1 етках щитовидной железы свиньи,

пермисспвшх в отношении ГОС. Максимальный уровень ингиоирования составил 9Ъ% по данным РИГА и РНИФ.Таким образом впервые покаайне епоооонсогь ао РНК подавлять репродукций ШС в клеточной культуре. В экспериментах- tn ■ vivo при попытке получения трансгенных мышей показана токсичность данной антисшсловой конструкции для эмбрионов на ранних стадиях эмбриогенеза.

Работа представляет не только научный, но и практический интерес, так кок плазмида с генами асРНК, обладающие высокой антивирусной активностью могут быть использованы для получения трансгенных свиней, устойчивых к гос. - '

Апробация работы. Материалы., диссертации доложены и обсуздены на Конференциях 'молодых ученых и специалистов ВНШСБ в 1989-1992 г.г., на VIII Международном Вирусологическом Конгрессе ( Берлин, август 1990 ), на втором Конгрессе Европейского Общества Ветеринарной Вирусологии ( Uppsula, Sw&den, сентябрь, 1991).

Публикации. Основные результата диссертации стракены в трех печатных' работах, список которых приводится в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения , глав ". Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 107 библиографических ссылок. Работа изложена на 104 страницах машинописного, текста, включая 2 таблицы и 9 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В работе были использованы лабораторные штаммы Е. coll DH1, DH5, Л109 и XL1-blue.

При клонировании фрагментов парвовирусного генома использовались стандартные клонирующие плазмидные векторы - риС19, pSV2neo, а так же вектор рыт, любезно предостаг _шшй О.И. Мирошниченко, плазмида pPVi 91, любезно предоставленная лабораторией молекулярной биологии и биохимии БИЭВ PACXHWI.

Для выращивания бактерий применяли среду ьв (Luria-Bertani)» состав (г/л) - бакто-триптон Ю, дрожжевой экстракт Б, NaCl 10, рН7,Б._

В работе использовалась клеточная линия: щитовидной железы свиньи, любезно предоставленная ВИЭВ РАСХНШ1.

В исследованиях был использован PPV - штаммм И-32, к перевиваемой культуре щитор,-''шой железы свиньи. Титр вируса по реаакцаи гемагглктыации составил 10 ГАЕ, что

о

соответствует 10 ТЦД^ .

Методы. Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным протоколам изложенным в Manlatls и др.

Клеточная лиши выращивалась на минимальной среде MEM, модифицированной Дальбеко (ДШгМ) с добавлением 10Ж сыворотки эмбрионов коров (FBS), 100 ед/мл пеницилина и 1 (Ю мг/мл стрептомицина соответственно при 37°С и при 5% СО,.

Криоконсервавдю стандартных и вновь подученных клеточных ланий проводили с применением глицерина (Serra). Хранение клеток осуществляли при температуре - 196° С.

Перенос чужеродных генов в клетки млекопитающих • осуществлялся методом Са-фоофатной преципитации цо Wlgler С 4-03.

Селекция клеток щитовидной железы свинья на среде с неомицином проводили до . инструкции фирмы Gibco при ■концентрации G-418 400 мкг/мл среда.

Для блот-гибрвдиэацин ДНК-ДНК внэхромосомную ДНК та клеток выделяли то методу Хйрта После рестрикционного гидролиза я электрофорезе пробы переносили по Са'уээрну на нейлоновые фшьтры которые _ подвергали прегибридизации и Гибридизации с ДНК- зондом, меченным Р^2 . Далее $ильтры сушили и авторадиогра$ировали.

*Блот - гибридизацию РНК-РНК осуществляли следующим

образом. Клеточную РНК выделяли по методу Chbmczynski et

al (2). После этого препараты РНК (20 мкг) наносили на

1 ,Б% агерозиыЯ гель о 1,1% формальдегида. Разделяла2,Б

часа в MOPS электрофорезном буфере при 70' V. Перенос РНК тй

на Ну bond N мембрану проводили в. Vacuum-blotting device После UV фиксации фальтры прегиоридизовали. Гибридизацию ' осуществляли о Р3 -меченными PBtl-SphI фрагментом из ПВО. Фильтр высушивали и экспонировали о экраном при -70°С.

Определение накопления ПВС в полученных клеточных линиях проводили в РИГА и в РНИФ (по стандартным протоколам ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1 .Ингибирование репродукции ПВС антисмысловыш РНК, направленными против области, кодирующей NS белок.

Интерес к парвовирусам, как объектам исследования обусловлен рядом причин. В естественных условия^ дарвовирусы патогенны для млекопитающих, птиц, а также человека. Болезни, вызываемые ими наносят существенный эномичесгай ущерб животноводству многих стран. При возникновении заболевания в ранее благополучных хозяйствах рождение поросят на одну свиноматку в год снижается на 50-60?, в стационарно неблагополучных хозяйствах - на 10-Й0Х. Серологическими исследованиями болезнь установлена в 80-1 OOS обследованных хозяйств США, Великобритании, Франции и Австралии (79,81). В Дании из 73 обследованных хозяйств, бла. ополучных по инфекционным оолезшш, только в 7 не был выявлен парвовирус. В СССР наличие ШС Было установлено в 1982 году путем выделения вируса из шгодов абортировавших свиноматок. Из '31 обследованного хозяйства более чем 20 областей и краев страны „в 27 (87%) обнаружены положительно реагирующие животные.

Специфическая профилактика ПВС в ряде стран осуществляется с помощью инактивированных вакцин,

обладающих, недостаточной эффективностью и слабо предохраняющих свиноматок от заболевания и трансплацентаряой передачи вируса плодам.

В 1989 году мы начали работу по ингибированию -репродукции ПВО с помощью ас РНК, направленных против неструктурного белка данного вируса. Ингибируккий эффект достигал 958. Данные по згой работе были опубликоващ в 1990 году на IX Всемирном конгрессе по вирусологии в Берлине и на II конгрессе Европейского общества Ветеринарной Вирусологии в Швеции, в 1991 г. Независимо от наших исследований в Испании в 1990 году была получена антисмысловая конструкция, содержащая ген ас РНК против неструктурного белка НС-1 мелкого п'арвовируса мышей (МТМр) с целью ингибирования вирусной инфекции в пермиссивных мышиных фибробластах А9. НС-1 специфическая область ЮТр генома бала клонирована в антисмысловой ориентации под контролем НБУТК прмотора и котрансфецирована с плазмидой рЭТ2пео в мышиные фибробласты. Анализ нео-устойчивых клонов, экспрессирукцнх в различных количествах ас РНК НС-1 показал колеблющуюся, но значительную устойчивость к вирусному действии. ИнпЮирукаий 'эффект в среднем достигал 70%.

1.1 .Конструирование рекомбинантных плазмид, содераащих ген ас РНН против № области генома ПВО.

РЗТ-БРШ фрагмент ПВО из плазмида- рРУ191, любезно предоставленной лабораторией молекулярной биологии и биохимии ВМЭВ, с координата;,и 260-1360' Ьр

Hind Ш

EcoRl

MT-pr

Рис. Л. Структура ве гора рМТ рРУ для экспрессии гена " ле.РНК против участка ПВС.

предварительно клонировали в ' векторе рШ19 для фланкирования сайтом РЭП. Затем этот участок вырезали по РБТ1 и помещали под контроль МТ-1 прмотора мыши в вектор рМТ (Рис. -{). рМТ содержит Есог1 и BglII фрагмент с МТ-1 промотором мили из плазмида рМК-рТО , Есог1-Рт£1 фрагмент рВН322 и участок полиаденилирования гена ГК из плазмида рАСбО. Б вектор встроен участок полилинкёра по РЗГ1 сайту ■ которого помещали фрагмент ПВО в обратной ориентации по отношению к промотору. Полученная плазмида обозначена рМЗрРУ.

1.2.Получение стабильных линий клеток щитовидной гелезы свиньи с геном ас РНК против N3 области ПВО.

В перевиваемую клеточную линию цитовидной железы свиньи методом Са-фосфатной трансфекции по вводили конструкции рМГрРУ с геном аа РНК и плазмиду с геном устойчивости к 0418-р5У2пео в качестве контроля. Клетки щитовидной железы свиньи были получены из института экспериментальной ветеринарии (Москва). В качестве среда роста брал:! Д.ЕМ с ' 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 ед./мл. 'пенициллина и 100 мг./мл. стрэпто:лшшна. Для получения линий клеток с гопом ас РНК гсном-рМТрРУ и плазмида с геном " устойчивости к С410-р372пео. Соотношение плазмид было 10 к 1, соответственно .рОТрРУ к рБУ2г.ео. Трансфекщпа клеток ДНК плазшщами выполняли в лабораторных

с

пробирках. На пробирку высаживали по 10 клеток, так чтобы к - моменту трансфекции монослой достигал 50-70%.

Время адсорбции преципитата 4 часа. Затем клетки дважды ополаскивали средой МЕМ и обрабатывали 15% раствором глицерина на Hebse ph 7,0. После чего клетки повторно дважды отмывали средой МЕМ и заливали среду роста. Через 24 часа после трансфекции клетки рассеивали по 104 на 50 см3 флаконы с селективной средой ( ДМЕМ, 102 ' фетальной телячьей сыворотки , 400 мг./мл. G418 (Glbco)). 1оза G418 необходимая .для селекции была подобрана предварительно. Через 10-14 дней после постановки эксперимента появлялись устойчивые к G418 " колонии, которые переносили на отдельные флаконы.

После трансфекции клетки 8 течение 3-х пассажей культивировались в селективной ростовой среде ДМЕМ, содержащей 400 мг/мл G-418 (Glbco). В результате было получено 11 клеточных линий на основе щитовидной железы свиньи, устойчивых- к неомицину и предположительно содержащих трансфецированные последовательности.

1=3. Анализ пслуч с ^ нх клег-очшх. линш на присутствие генов ас РНК.

Полученные клеточные линии анализировались на наличие г ...¿мед с генами ас' РНК и контрольной плазмиды pSV2neo. Для этого из клеточных популяций выделяли внехромосомную ДНК по методу Hirt (37) и подвергали блот-гибридизации по Саузерну (87). Использовали мембраны Hybond11 (Amereham). В качества зонда использовали меченный (32Р) ник-трансляцией PST1-SPH1 фрагмент ПВО. Как следует из Рис.2. в 10 линиях тестируются' полосы, гибридизации, с меченным ПВО

1 2 2 4 5.6 7 8 ' 9 10 11 К?/ K1

Рис.X 2. Анализ ДНК клеток щитовидной нзлези свиньи, котрансфецированных' плазмкдами pMTpPV и p-SV2neo.

Тотальную ¡щеточную ДНК выделяли из клеток и анализировали методом олоттинг-гиоридизашш. ()..'• ,

к1 ,к2 - плазмида pMTpPV, 10 и 1 pg, соответственно. 1-11 - клеточные линии, котрансфецированные pMTpPV, p5V2neo. ДНК из проб подвергали гидролизу-по Pstl. В качестве зонда использовали Pstl-SphI фрагмент ПБС.

фрагментом.- Однако фрагмент, по подвижности соответствующий встроенному ПВС участку (1245 н.п.) обнаружен только в 6 линиях. Причем эти линии' значительно отличаются по количеству копий гена ас РНК, которое оценивалось при денситометрии радаоавтограмда и составляет от 8-10 в линиях S и 7, и до 1 в линиях 4 и 5. В свят» с тем, что эффективность генов ас РНК зависит от количества экопрессирования ас РНК, т.е. молярного соотношения ас РНК к мРНК мишени, мы в последушщх экспериментах использовали линии 6 и 7, содержащие максимальное количество копий ас РНК гена. Обе линии имели одинаковые характеристики в последукщих экспериментах, поэтому мы приводим данные по одной из них да).

1.4. Анализ экспрессии асРНК в полученных клеточных линиях.

Экспрзссия асРКК в клетках wuuSih л«-» подтверждена в эксперименте по Nothern анализу. Контрольные клетки с интегрированным геном pSV2neo и клетки линии JE6 накапливали, часть из них подвергали предварительно индукции - внесением в среду инкубации CdClg. Из всех этих клеток выделяли суммарную РНК, разделяли ее в агарозном геле о формальдегидом и подвергали блот-гибридизации. Из результатов представленных на Рис.з. следует, что в клетках несущих гены асРНК синтезируются собственно асРНК. Причем, согласно результатам денситоме тричэ ского

f 3 f

.

№

18S

-ас РНК

tsv

Ü

ь ■£*,

1 2 3 4 5

Рио.ЛЗ. Анализ тотальной РНК, выделенной. из клеток, трансфецироьанных ас РНК.

1,2 - линии с интегрированным геном ас РНК, соответственно неиндуцированше и индуцированные odCL^.

3 - контрольная линия, трэнсфгцировчнные pSV2neo.

4 и 5. - плазмида pMTpPV, гидролизоььнная PstI, ю и 100 pg. Стрелками указаны миграционные позиции 28S' рРНК и 163 рРНК

(3,2 т.н. и 1,7 т.н.) соответственно.

анализа количество экспрессирушцейся асРНК в случае линии Лй, активированной Сс1С12 несколько больше, чем в веактжвированной. Как и ожидалось, экспрессии асРНК с контрольной векторной плазйиды не происходило.

1.5. Эффективность подавления репликации ПВО асРНК в полученных клеточных линиях.

Следующим этапом нашей работы по ингибированию репродукции ПВО с помощью асРНК являлось исследование устойчивости клеточных линий, несущих плазмиду рМТрРУ. -Для этого уровень репродукции в клетках тестировали в реакции непрямой гемагглютинайии (РИГА) и в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РШФ), используя штамм И-82 парвовируса свиней.

. 1.5.1. Анализ экспрессии ас РНК в полученных линиях клеток, щитовидной железы . свиньи в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА).

Известно, что для размножения иарвовирусов. необходимы компоненты ДНК-синтезирувдего аппарата клетки хозяина, в частности а и 7 ДНК-полимеразы, которые синтезируются, в Э фазе клеточного цикла. Поэтому да успеха эксперимента кслательна культура клеток с высокой митотичесхой активностью. В связи с этим нами была подобрана доза клеток при которой иследуемые линии достигали монослоя не ранее третьего дня после посева. Для данных клеточных линий она составила 2*1 (^/см? К моменту заражения (в этом случае

24 часа после посева) мовослой составил 50-70Ж.

о

Исследуемые культуры выращивали на 50 см флаконах и ' через каждые 24 часа после заражения брали .аликвоты культуральной яидкости для определения накопления ПВО.в РИГА. Титр вируса по РИГА составил Ю^ГАЕ, что соответствует 105ТВД5о.Результаты по РИГА приведены на • Рис.7 При заражении вышеназванных линий ПВС в линии *6 с геном асРКН в течение срока наблюдения (6 суток) не было значительного накопления гемагглютининов. В контрольной культуре заметное нарастание титра гемагглютининов стало нг^людатъся к третьему дню. Титр составил 256ГАЕ. Максимального значения титр достиг в конце срока наблюдения и составил 2048ГАЕ. Поскольку изучаемая конструкция рМТрР"У содержала промотор МТ-1 мы проводили его активацию СйС12 .На графике (Рис.'*) отражены результата этого эксперимента. Если к окончанию эксперимента в контрольной культуре титр вируса составлял 1024 ГАЕ, в трансфецированной, но не активированной СйС12 32 ГАЕ, то в трансфецированной, и активированной СйС^ культуре титр вируса был- 8ГАЕ. Таким образом, мы отмечали усиление ингибирующего эффекта в среднем на 2056. Одновременно с количественным определением накопления ПВС мы наблюдали за развитием^ „цитопатического эффекта в зараженных культурах. Как видно из Рис.4 цитопатичесКое действие вируса в контрольной культуре наблюдали на 4-Б сутки опыта. К этому времени монослой достигал 80-90$. В клетках, содержащих плазмиду рМТрР7 с геном асРНК, ЦГЩ

ПЛиянд с рКТрРУ. □ Линия. □ Контрольная ЕЗ Контрольная

ахтявяровавсая содержаная линия янпяя.

СйСТ.2 рНТрРУ ппазииау " ахтявирооаннг

СйС12

Рис.' N и. Продукция ПБС в клеточных линия: щитовидной железы свиньи в РГА.

: N 5. Чувствительность культуры клеток щитовидной железы свиньи к ППС.

не наблюдали до конца эксперимента. Таким образом, ингибирущий аффект на 6 сутки, достигал максимума.

1.5.2.Анализ экспрессии ас РНК в полученных линиях клеток щитовидной железы , свиньи в реакции ненрямой иымунофлуоре сценцяи (РНИФ).

Как и для РИГА нами была подобрана доза клеток (2*103/см2) при которой исследуемые линии к моменту заражения находились в Б фазе клеточного цикла. Вирус вносили в культуральную среду через 24 часа после посева. Исследуемые культуры выращивали на шести 250 см3 флаконах и через каждые 24 часа трипсинизировали по одному флакону в течение 6 суток. Отцентрифугированные препараты клеточной культуры фиксировали в ацетоне (+4°С) 15 мин. и обрабатывали исследуемой сывороткой в разведении 1:128 и антикролкчьим глобулином, меченнным ФИТЦ "в разведении 1:256. При заражении исследуемых линий ПВО б линии Ло с геном ас РНК в течение срока наблюдения (6 суток) отмечалась слабая флуоресценция на-3 сутки, незначительно усиливающаяся к 6 суткам (Рис.№5). В контрольной культуре сильное свечение ядра и цитоплазмы проявлялось через 18 часов после заражения (Рис.Л6.). ш 5-6 сутки после заражения, в контрольной, культуре мы наблюдали округление пикнотичность и распад . клеток с высвобождением флуоресцирующего вируса и вирусного антигена. Таким образом, ингибирущий эффект не , 5-6 сутки опыта достигал максимума, что

го

fr

-ЬГ'Ж

■VC?:*

MC-..-. - - "

ftic.JSS. Состояние клот очного монослоя э реакции не прямей иммунофлуоресценции на III сутки опыта.

I. Линия щитовидной железы свиньи, трансфецированная pMTpPV.

II. Линия щитовидной железы свиньи, трансфчштрованная pSV2neo.

соответствует результатам полученным в РИГА.

. 1.5.3.Перенос рМТрРУ конструкции в мышиные зиготы

методом микроинъекции.

В дальнейшем работа проводилась ~совместно с лабораторией профессора Брема в Мюнхенском Университете

им. Людвига Максимиллиана. Были проведены инъекции

<

рМТрРУ конструкции в мышиные зигота. Опыты показали, что нам де удалось получить ни кивотных, ни эмбрионов, несущих в своем геноме витисмаеловой ген к парвовирусу свиней.' Оценка присутствия микроинъекцированной ДНК в эмбриональном геноме осуществлялась методом РСН • с использованием специфических праймеров. Детальная картина результатов приведена в Т.#4. Как видно из таблицы, наличие антисмыслового . фрагмента было обнаружено только у дегенирировавших эмбрионов на стадии зиготы (в шести.независимых экспериментах), не способных к дальнейшему развитию. Все остальные инъецированные одноклеточныедвуклеточные и многоклеточные эмбрионы, а ' также полученные животные дали негативный ответ. Таким образом, развивались только эмбрионы и животные в которых был элиминирован антисмысловой фрагмент. Видимо, микроинъецйр^вание данной конструкции в живые клетки в отличие от соматических систем , вызывает токсический эффект и эмбрионы, * включившие ее не развиваются, возможно из-за специфического воздействия генетической информации, содержащейся в длинном фрагменте. В связи с

Т.Ж. PCR - анализ после микроинъекций ас РНК ПВО в пронуклеус мышиных зигот..

Гибридизация с ПВО Ii PCR фрагментом.

Контроли ' ' 1 ! ' ~

Раствор для 3 + ■ +

микроинЪекций (позитивный контроль) Геномная РНК мышей .3 -

(негативный контроль) Зиготы (после микроинЪекций) ДегенЕрированные зиготы (6 проб) 2-клеточные эмбрионы 4-8-клеточные эмбрионы Иорула Бластоциста

Животные 9

13

14 10

12 10

1

этим возникла необходимость в создании новой, укороченно! конструкции. Мы надеемся, что измененная конструкции позволит нам избежать эффект токсичности на ранних стада® эмбриогенеза и получить животных, несущих гены ас РНК, фенотилическим выражением которых является искусственны! антивирусный иммунитет к парвовирусу свиней.

ВЫВОДЫ

1 .Создана генно-инженерная конструкция, содержащая гены а РНК против NS области парвовируса евшей под контролем МТ-промолтора мыши.•

2.Получена трансформированная линия щитовидной желез свиньи, содержащая pMTpPV генноинкенерную конструкцию несущую под ЫТ-1 промотором мыши ген ас РНК про та неструктурного белка ПВС.

3.Впервые показана возможность ингибирования репродукци парвовируса свиней с помощью ас РНК In vitro, достигнута уровень составил 97%. Кроме того, продемонстрировано 2С усиление ингибирукцего эффекта при активации рМТр! конструкции CdCl2.

4.Однако в' экспериментах 1л vivo при попытке получеш трансгенных мышей обнаружено блокирующее действие даннс антисмысловой конструкции на нормальное развитие эмбрионог

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В ВДУЩИХ РАБОТАХ - .

1 .Miroahnichenlco O.I., Ponamareva T.I., Borisenko A.S., • .Baurin V.V., Voskresenskaya E.T., Tlkchonenkfl T.I.. Inhibition oi viral reproduction by antisense RNA.// Vlllth International Congress Virology, Berlin, 1990, Abstracts, p.324.

2.Tlkchonenko T.I., Mlroshnichento O.I., Ponomareva T.I., Borisenko A.S., VosKresenskaya . E.P., Ernst L.K.. Prospects оt antiviral immunity in farm animals based on antisense RNA genes.// II Congress or the European Society tor Veterinary Virology., TJppsula, 1991, Abstracts.

3.Воскресенская Е.П., Мирошниченко О.И., Понамарева Т.К., Савич О.М., Гихонэнко Т.И. Подавление репликации парвовируса свиней антисмиеловыми РНК против HS гена PFV в клетки щитовидной железы свиньи. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1993 г., *1, стр.27-31.