Разработка ассоциированной вакцины и иммуноферментных тест-систем на основе антигенов парво-, рео-, герпесвирусов и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота

Ефимова, Марина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка ассоциированной вакцины и иммуноферментных тест-систем на основе антигенов парво-, рео-, герпесвирусов и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка ассоциированной вакцины и иммуноферментных тест-систем на основе антигенов парво-, рео-, герпесвирусов и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота"

На правах рукописи

ЕФИМОВА МАРИНА АНАТОЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ И ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АНТИГЕНОВ ПАРВО-, PEO-, ГЕРПЕСВИРУСОВ И ВИРУСА ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 8 АВГ 2014

Казань - 2014

005551957

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») г. Казань

Научный консультант: Гаффаров Харис Зарнпович - доктор

ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ

Официальные оппоненты: Ильинская Ольга Николаевна - доктор

биологических наук, профессор, академик АН РТ, заведующая кафедрой микробиологии института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета;

Алимов Азат Миргаснмовнч — доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой биологической и неорганической химии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана;

Петрянкин Федор Петрович — доктор ветеринарных наук, профессор, старший научный сотрудник лаборатории бионано-технологии Чувашской государственной сельскохозяйственной академии (г. Чебоксары).

Ведущее учреждение: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ ВНИТИБП), г. Щелково

Защита состоится «т^>> О&ТМШИ2014 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.0И2.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок-2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Текст объявления о защите размещен на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru; полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного консультанта - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru. л

Автореферат разослан

Учёный секретарь

диссертационного совета /У / Степанов Владимир Иванович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Современное животноводство характеризуется широким внедрением интенсивных форм производства. Специфика сложившейся технологии содержания и кормления животных существенно изменили их среду обитания. Большая концентрация животных на ограниченных площадях, поступающих из различных в эпизоотическом отношении регионов, широкий обмен животными внутри страны и завоз из-за рубежа высокопродуктивного племенного скота, трудности организации непрерывного производства, полноценного кормления и обеспечения оптимального микроклимата создают благоприятные условия для возникновения массовых инфекционных болезней [10, 5, 13].

Известно, что в структуре этих заболеваний основная этиологическая роль принадлежит герпесвирусу типа I, возбудителю вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС), вирусу парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальному вирусу (PC), аденовирусам КРС 1 и II подгрупп. Значение их в инфекционной патологии связано с широким, а по мнению многих авторов, повсеместным распространением, многообразием клинических проявлений, способностью к латенции, тяжестью течения инфекций и экономическим ущербом [2, 8, 14]. При этом немаловажную роль играют также патогенные виды хламидий, микоплазм, бактерий и их ассоциации. В этой ситуации заболеваемость телят достигает 80-100 %, сопровождается частыми рецидивами и гибелью от 20-30 до 50 % больных животных [4, 12,7].

Однако среди этой обширной группы возбудителей инфекционных заболеваний долгие годы малоизвестными и неизученными в нашей стране оставались парвовирусы и реовирусы крупного рогатого скота, обладающие, безусловно определенной патогенной потенцией. Инфекционный процесс усугубляется тем, что эти вирусы в комбинации друг с другом вызывают смешанную инфекцию, приводящую к более тяжелому заболеванию и чаще с летальным исходом [9,16].

Степень разработанности проблемы. В зарубежной литературе достаточно полно раскрыта природа и степень распространенности парвовирусной и реовирусной инфекций, вызываемых вирусами первого серотипов среди различных возрастных групп КРС. Во многих странах Европы созданы средства иммунопрофилактики, обладающие широким спектром специфической защиты. Немецкая компания «Hoecht Veterinär GmbH» производит вакцины ассоциированные «Lactovac», «Bovigrip», «Bovigrip plus», содержащие инактивированные антигены парво-, реовирусов I серотипа, для активной иммунизации скота по различным программам в зависимости от эпизоотической ситуации [17].

Отечественными исследователями [15] разработаны иммуноферментные тест-системы, предназначенные для индикации антигена и выявления антител к парвовирусу крупного рогатого скота Ш-го серотипа, отличающегося в антигенном отношении от парвовируса 1-го серотипа. .

В РФ до настоящего времени изучению парвовирусной и реовирусной инфекций 1-го серотипа не уделялось достаточного внимания как к потенциальным этиологическим агентам в патологии крупного рогатого скота, что сдерживало разработку средств лабораторной диагностики и специфической профилактики. Существующие moho-, би- и поливалентные вакцины против ИРТ, ПГ-3, ВД-БС и PC-инфекций не решают проблему сохранности молодняка, хотя при их использовании заболеваемость уменьшается, но все же решительного перелома не достигается, и пока нет таких вакцин, обеспечивающих полную защиту [1,11].

Таким образом, решение таких вопросов, как изучение особенностей эпизоотологии болезней, постинфекционного иммунитета, разработка методов и средств лабораторной диагностики и специфической профилактики парвовирусной и реовирусной инфекций является актуальной задачей.

Цели и задачи. Целью исследований явилась разработка технологии изготовления иммуноферментных тест-систем, предназначенных для серологической диагностики парвовирусной и реовирусной инфекций крупного рогатого скота и ассоциированной вакцины для специфической профилактики парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространенность парвовирусной и реовирусной инфекций крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Приволжского федерального округа и ряда регионов РФ.

2. Изучить биологические, физико-химические свойства штамма «Parvo 32459» парвовируса типа I и штамма «Reo I Lang» реовируса типа I.

3. Разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител, и стандартизировать условия проведения реакции.

4. Разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета, и стандартизировать условия проведения реакции.

5. Разработать технологию изготовления и контроля ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной.

6. Изучить иммунобиологические свойства моно- и ассоциированных вакцин против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи — болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в лабораторных и производственных условиях.

7. Разработать нормативно-техническую документацию по изготовлению и контролю вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной,

герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи — болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной.

Научная новизна исследований. На основе результатов серо-иммунологического мониторинга впервые представлены данные о степени распространения парвовирусной и реовирусной инфекций крупного рогатого скота в хозяйствах Приволжского федерального округа и ряда регионов РФ.

Изучением иммунобиологических свойств штаммов «Parvo 32459» парвовируса типа I, «Reo I Lang» реовируса типа I обоснован их выбор в качестве производственных, определены параметры культивирования, очистки и концентрирования.

Впервые в РФ разработана:

- технология изготовления «Тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител» (Патент РФ на изобретение №2461008 от 10.09.2012г.);

- технология изготовления «Иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» (Патент РФ на изобретение №2488117 от 20.07.2013г.). Оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови животных, взятых в одном и в четырех разведениях;

- технология изготовления «Вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» (Патент РФ на изобретение №2452512 от 10.06.2012г.).

В результате проведенных исследований определены оптимальные соотношения антигенов и адьюванта, входящих в состав инактивированной ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной, а также дозы и схемы введения биопрепарата. Доказана безвредность, ареакгогенность и высокая иммуногенность ассоциированной инактивированной вакцины при применении на крупном рогатом скоте.

Теоретическая и практическая значимость исследований. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как дополняют научные знания относительно роли парвовируса и реовируса в патологии крупного рогатого скота и расширяют арсенал отечественных диагностических и профилактических биопрепаратов.

Разработана и внедрена в практику ветеринарных лабораторий РФ «Тест-система ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител», (Регистрирована Россельхознадзором № ПВР-1-6.0/02620 от 30.08.10 г., Сертификат соответствия №РОСС RU.Bn01.H00282).

Разработана и утверждена нормативная и технологическая документация производства биопрепаратов:

- «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 10.12.2013г.);

- «Вакцина ассоциированная против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» (утверждена заместителем руководителя Россельхознадзора РФ Per. № ПВР-1-20.13/02940 от 21.08.13 г).

Методология и методы исследования. Для выполнения поставленных задач и достижения цели диссертационной работы применяли эпизоотоло-гические, клинические, патоморфологические, серологические, вирусологические, кулиуральные, молекулярно-биологические методы исследования и метод экспериментального заражения восприимчивых животных.

В экспериментах использовали прямые и косвенные методы лабораторной диагностики. Прямые методы: выделение и культивирование парвовируса, реовируса, герпесвируса типа I, вируса вирусной диареи на первичной и перевиваемых культурах клеток, обнаружение геномов парво-, реовируса методом ПЦР. Косвенные методы: серологические методы - РТГА, РН, ИФА для выявления антител к парво-, peo-, герпесвирусу и вирусу вирусной диареи крупного рогатого скота. Подробное описание методологии и методов проведенных исследований отражены в главе «Материалы и методы».

Положения, выносимые на защиту:

1. Серологический мониторинг крупного рогатого скота различных возрастных групп методом РТГА и ИФА в хозяйствах Приволжского федерального округа и ряда регионов РФ позволил выявить распространенность парвовирусной и реовирусной инфекций и их роль в этиопатогенезе респираторно-кишечных инфекций молодняка и нарушениях функций репродуктивных органов взрослого поголовья скота.

2. Биологические, физико-химические свойства парвовируса типа I (шт. «Parvo 32459») и реовируса типа I (шт. «Reo I Lang»), характеризующие их особенности.

3. Разработанные иммуноферментные тест>системы более эффективны по сравнению со стандартными методами (реакцией торможения гемагглютинации и реакцией вирусной нейтрализации) и позволяют диагностировать парвовирусную и реовирусную инфекции у крупного рогатого скота, а также контролировать напряженность поствакцинального иммунитета.

4. Разработана технология изготовления вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной, которая создает напряженный продолжительный иммунитет и предотвращает вирусемию.

5. На основе оптимизированного сочетания вирусных антигенных компонентов парвовируса типа I, реовируса типа I, герпесвируса типа I, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота и масляного адъюванта созданы экспериментальные серии моно- и ассоциированных вакцин, стимулирующих специфическое антителообразование у лабораторных и естественно восприимчивых животных в 1,3 раза более высокого уровня чем гидроокисьалюминиевые.

6. Испытание вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной в производственных условиях подтвердило ее эффективность: вакцина индуцирует высокий уровень специфических антител, обеспечивает надежную защиту молодняка, стельных коров, нетелей и быков от указанных выше вирусных инфекций.

Степень достоверности н апробация результатов. Статистическую обработку цифрового материала, полученного в трех сериях опытов, проводили методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel. Результаты считали достоверными при Р< 0,05 по критерию Стьюдента.

Основные результаты диссертации доложены на научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2006-2013гг., Всероссийских и Международных научных конференциях и симпозиумах (Казань, 2007, 2008, 2010, 2011, 2013; Покров, 2008; Харьков, 2013; Саратов, 2013; Москва, 2014; Прага, 2014),

Публикации. Основные результаты докторской диссертации опубликованы в 29 печатных работах, в т. ч. 16 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 9 статей в материалах конференций; получено 3 патента РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и включает введение, 4 главы, приложения и список литературы, состоящий из 484 источников, в том числе 300 иностранных. Диссертация содержит 47 таблиц и 17 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе (обзор литературы), состоящей из пяти разделов, приведен анализ отечественной и зарубежной литературы о наиболее значимых вирусных заболеваниях, вызывающих желудочно-кишечные, респираторные заболевания молодняка и патологии репродуктивных органов взрослого поголовья крупного рогатого скота.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в период с 2006 по 2013 гг. в лаборатории вирусологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» согласно тематическому плану НИР по заданию 3: "Биологическая безопасность"

(№ госрегистрации 01200202602). Производственные испытания проводились в Республиканской ветеринарной лаборатории (г. Казань) и в ряде сельскохозяйственных предприятий Республики Татарстан, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным заболеваниям молодняка и патологиям репродуктивных органов взрослого поголовья крупного рогатого скота.

2.1 Материалы

Вирусы. Исследования проводились с использованием следующих штаммов вирусов: референтный штамм «Parvo 32459» парвовируса типа I крупного рогатого скота и штамм «Reo I Lang» реовируса типа I; вакцинный штамм «ТК-А(ВИЭВ)-В2» герпесвируса типа I крупного рогатого скота и штамм «ВК-1» вируса ВД-БС крупного рогатого скота.

Культура клеток. Для репродукции и титрования вирусов использовали: первично-трипсинизированные культуры клеток ПЭК и ЛЭК, перевиваемые линии культур клеток MDBK, TR, ЛЭК, Vero, ПТ-80, РК-15, ВНК-21/13 с полностью сформированным монослоем.

Диагностические препараты. В исследованиях применяли следующие биопрепараты: «Набор для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом «ИРТ-СЕРОТЕСТ», (ООО «Ветбиохим», г. Москва); «Набор для иммуноферментной диагностики вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС) крупного рогатого скота», (ВИЭВ, г. Москва).

Животные. Для экспериментов использовали лабораторных и естественно восприимчивых животных: 300 белых мышей, 50 новорожденных мышат, 45 морских свинок, 150 кроликов, 10 кошек, 50 новорожденных котят, 210 глубокостельных коров, 210 телок случного периода, 3 быков, 215 телят 1020 сут возраста.

2.2 Методы исследований

Серологическому исследованию подвергнуто 1720 проб сывороток крови крупного рогатого скота из 60 сельскохозяйственных предприятий ряда областей и республик Приволжского федерального округа и прилегающих регионов, неблагополучных по инфекционным заболеваниям респираторного и желудочно-кишечного тракта молодняка и репродуктивного — взрослого поголовья. Эпизоотическую ситуацию неблагополучных хозяйств изучали согласно рекомендациям, разработанным Дудниковым С.А. (2004) [3].

Серологические реакции. В качестве серологических тестов для определения естественного иммунного фона у животных, динамики формирования гуморальных и молозивных антител после вакцинации у крупного рогатого скота различного возраста и уровня антител у подозрительных по заболеванию КРС использовали реакцию нейтрализации (РВН), реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения антител к парвовирусу и к реовирусу использовали РВН, РТГА и ИФА, к герпесвирусу типа I и к вирусу ВД-БС — ИФА.

РВН Титр вируснейтрализующих антител определяли в реакции вирусной нейтрализации, используя соответствующие культуры клеток по

общепринятой методике с разведением исследуемых сывороток и постоянной дозой вируса (100 ТЦЦ5о/см ).

РТГА Титр антигемагглютинирующих антител определяли микрометодом по общепринятой методике. Контрольные и испытуемые сыворотки перед исследованием прогревали в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин, обрабатывали 25 %-ной суспензией каолина. В реакции по определению антител к парвовирусу использовали антиген парвовируса 8 ГАЕ и 1 %-ную суспензию эритроцитов морской свинки, для определения антител к реовирусу использовали антиген реовируса 4 ГАЕ и 1 %-ную суспензию эритроцитов человека 0-группы.

Иммуноферментный анализ проводили по непрямому варианту на полистероловых планшетах, изготовленных на ПО ВНИИ медицинской техники (г. Москва). В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG (H+L) быка, меченные пероксидазой хрена, производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Читку реакции производили на микропланшетном спектрофометре «BioRad Model 680» при длине волны 490 нм.

Индикация парвовируса и реовируса в патологическом материале.

Для индикации парвовируса и реовируса типа I исследованию подвергнуто 12 проб клинического и патологического материалов (смывы из носовой полости, селезенка, лимфатические узлы, легкие, абортированные плоды, кишечник, сперма). Нуклеиновые кислоты выделяли из биологических образцов с использованием набора реагентов для выделения ДНК в соответствии с инструкцией к набору «Пробоподготовка универсальная».

Индикацию парвовируса типа I КРС проводили по схеме NESTED-PCR согласно методическим рекомендациям Кочеткова С.А. и др., (2010) [8].

Индикацию реовируса типа I проводили методом RT-PCR на фрагмент S2 и L3, для амплификации этих локусов использовали праймеры S2-26, S2-563 [21] и REOL3F, REOL3R [23], соответственно. Обратную транскрипцию проводили в одной реакции с ПЦР.

Для амплификации локуса S2 использовали следующий температурный режим: 37 °С - 45 мин; 94 °С - 4 мин (1 цикл); 94 °С - 15 мин; 50 °С - 1 мин; 72 С - 1 мин (40 циклов); 72 °С - 7 мин (1 цикл), для амплификации локуса L3 -37 °С - 45 мин; 94 °С - 4 мин (1 цикл); 94 °С - 30 сек; 55 °С - 1 мин; 72 °С - 30 сек (40 циклов); 72 °С - 7 мин (1 цикл).

Синтез олигонуклеотидных праймеров производился в ООО «Биотех-Индустрия» (г. Москва).

Амплификацию проводили в лаборатории биохимии и молекулярно-генетического анализа ФЦТРБ-ВНИВИ совместно с к.б.н. н.с. Хаммадовым Н.И. на программируемом термоцшсле «Терцнк». Результаты ПЦР регистрировали методом электрофореза в 2 % агарозном геле с бромистым этидием. Гели анализировали подсвечиванием их в ультрафиолетовом свете (А.=254 нм).

Получение антигенов парвовируса и реовируса для иммуноферментного анализа. Антиген из штамма «Parvo 32459» парвовируса типа I для ИФА получали тремя различными способами: концентрирование с помощью ПЭГ-6000 и очистка ультрацентрифугированием через 20 %-ный слой сахарозы (ПЭГ+УЦ); концентрирование и очистка через 30 %-ный слой сахарозы ультрацентрифугированием (УЦ+УЦ); непосредственное концентрирование зараженных клеток, разрушение их ультразвуком и очистка ультрацентрифугированием через 20 %-ный слой сахарозы (УЗ+УЦ).

Антиген из штамма «Reo I - Lang» реовируса типа I для ИФА получали следующими способами: концентрирование с помощью ПЭГ-6000 и очистка ультрацентрифугированием через 20 %-ный слой сахарозы (ПЭГ+УЦ/20 % сахарозы); разрушение зараженных клеток ультразвуком, концентрирование и очистка через 30 %-ный слой сахарозы ультрацентрифугированием (УЗ+УЦ/ЗО % сахарозы); разрушение зараженных клеток ультразвуком, концентрирование и очистка через градиент 10-40 %-ной плотности сахарозы ультрацентрифугированием (УЗ+УЦ/10-40 % сахарозы).

Полученные антигены стандартизировали по содержанию вирусного белка на спектрофотометре СФ-46. Специфичность антигенов определяли в перекрестных реакциях в ИФА с гомологичными и гетерологичными сыворотками крупного рогатого скота.

Контрольные положительные сыворотки против парвовируса и реовируса получали путем гипериммунизации теленка шестимесячного возраста очищенными инактивированными антигенами парвовируса и реовируса в возрастающих дозах в смеси с адъювантом Фрейнда. В качестве контрольной отрицательной сыворотки использовали сыворотку, не содержащую антител к антигенам парвовируса и реовируса.

Подбор оптимальных условий сорбции антигенов парво-, реовируса, контрольных сывороток и проведения ИФА осуществляли в зависимости показателей реакции от концентрации антигена, антител, влияния температуры и продолжительности сорбции антигена и времени взаимодействия антител с иммобилизированным антигеном.

Эффективность разработанных тест-систем оценивали по основным показателями качества тест-системы ИФА: чувствительность, специфичность и воспроизводимость.

Культивирование и накопление вирусной массы для изготовления ассоциированной вакцины проводили: парвовируса крупного рогатого скота (шт. «Parvo 32459») осуществляли на первичной культуре клеток почек эмбриона коров (ПЭК), реовируса (шт. «Reo 1 — Lang») - на перевиваемой культуре клеток почек африканской зеленой мартышки (Vero) и перевиваемой культуре клеток почек поросенка (PK-15), герпесвируса типа I (шт. «ТК-А(ВИЭВ)-В2») и вируса вирусной диареи (шт. «ВК-1») - на перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы (MDBK).

Инактивацию очищенных вируссодержащих суспензий осуществляли 1,2 — аминоэтилазиридином. Полноту инактивации вирусов проверяли путем

проведения 3-х последовательных пассажей на соответствующих чувствительных культурах клеток. Отсутствие цитопатических изменений в культуре клеток в течение 3-х пассажей подтверждало полноту инактивации.

Изготовление сорбированных форм инактивированных моно- и ассоциированной вакцин проводили из инактивированных антигенов парвовируса, реовируса, герпесвируса типа I и вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота с использованием 6 % гели гидроокиси алюминия (ГОА) (ФГУП «Щелковский биокомбинат»).

Изготовление эмульсионных форм инактивированных моно- и ассоциированной вакцин осуществляли с использованием концентрированных антигенов парвовируса, реовируса, герпесвируса типа I и вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, эмульгированных в масляном адьюванте в эффективном соотношении.

Для изготовления масляного адьюванта применяли синтетическое масло ПЭС-ЗМ (кремнеорганическая жидкость ГОСТ 13004-77) и ланолин безводный в соотношении 84:16 объемных частей.

Контроль сорбированных и эмульсионных форм экспериментальных серий вакцин осуществляли определением физических (однородность, стабильность эмульсии) и иммунобиологических свойств (безвредность, стерильность и антигенная активность).

Оценку иммунобиологических свойств «Вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и ВД-БС крупного рогатого скота инакгивированной эмульсионной» проводили после изготовления и через 6,12 мес хранения при температуре 2-8 °С.

Антигенную активность каждой серии вакцины определяли на кроликах, которым вводили 2,0 см3 вакцины внутримышечно, двукратно с интервалом 21 сут, а также на крупном рогатом скоте, которых иммунизировали внутримышечно в дозе с учетом их возрастной категории. Динамику появления и нарастания антител в сыворотках крови иммунизированных животных изучали к антигенам парвовируса типа I, реовируса типа I в РТГА и ИФА, герпесвируса типа I и вируса ВД-БС - в ИФА.

Определение оптимальной прививочной дозы проводили на кроликах и крупном рогатом скоте разной возрастной категории.

Изучение эффективности «Вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи крупного рогатого скота инакгивированной эмульсионной» проводили в условиях 6 хозяйств Республики Татарстан на крупном рогатом скоте разной возрастной категории.

Статистический анализ материала. Статистическую обработку результатов исследований проводили методом вариационной статистики с применением критериев достоверности по Стьюденту с использованием программы «Microsoft Office Excel».

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Этиологическая структура респираторно-кишечных вирусных инфекций молодняка и патологий репродуктивных органов маточного поголовья крупного рогатого скота на территории Приволжского федерального округа и прилегающих регионов

Серо-иммунологический мониторинг проводили в отношении парво-, peo-, герпесвирусной типа I инфекций, парагриппа-3, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в 57 современных молочных комплексах ряда областей и республик Приволжского федерального округа и в некоторых регионах РФ, в которых регистрировали клинические признаки желудочно-кишечных и респираторных инфекций телят, а также патологию репродуктивных органов маточного поголовья скота. В период с 2009 по 2013 гг. исследовано 1597 проб сывороток крови, полученных от невакцинированных против респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота. Результаты исследований отражены в таблице 1.

Таблица 1 - Процентное выражение положительно реагирующих проб сывороток крови крупного рогатого скота в отношении парво-, peo-, герпес-вирусной типа I инфекций, парагриппа-3 и ВД-БС крупного рогатого скота.

Республика, область Кол-во хозяйств Кол-во сыв-ток ПГ-3 Герпес-вирус ВД-БС Парво-вирус Рео-вирус

PITA ИФА ИФА РТГА РТГА

Республика Татарстан 38 1255 82,5 55,3 46,5 38,3 32,5

Республика Башкортостан 1 15 93,3 13,3 33,3 13,3 6,6

Республика Марий Эл 4 55 75,0 75,0 62,5 31,2 18,7

Республика Мордовия 2 58 67,2 69,0 69,0 70,6 32,7

Волгоградская область 1 26 100,0 57,7 19,2 23,0 11,5

Нижегородская область 3 46 76,0 63,0 76,0 43,5 30,4

Саратовская область 2 71 56,3 29,5 29,5 26,7 12,6

Самарская область 1 10 100,0 80,0 70,0 30,0 30,0

Тверская область 1 16 100,0 18,7 50,0 50,0 25,0

Ульяновская область 1 10 80,0 80,0 50,0 10,0 30,0

Челябинская область 3 35 65,7 54,2 42,8 17,7 28,5

Всего: 57 1597

из них положительных 1329 914 792 618 496

% 83,2 57,2 49,6 37,8 31,0

Из представленных в таблице 1 данных видно, что в пробах сывороток крови крупного рогатого скота установлена высокая серопозитивносгь животных к антигенам вирусов ПГ-3 (83,2 %), герпесвируса типа I (57,2 %), ВД-БС (49,6 %), парвовируса (37,8 %), реовируса (31 %). Положительно реагирующие животные к парвовирусу и реовирусу имелись в каждом с.-х. районе. Вариабельность превалентности антител в различных регионах,

возможно, зависит от разной плотности популяций скота и условий ведения хозяйства. Серопозитивность сывороток варьировала к парвовирусу от 10 % до

70.6 %, к реовирусу - от 6,6 % до 32,7 %, что указывает на факты циркуляции парвовируса и реовируса типа I среди обследованного поголовья животных.

Одновременное выявление их в тестируемых образцах сывороток крови у больных и переболевших животных позволяет считать, что они также участвуют в формировании смешанных вирусных инфекций телят и нарушении функций репродуктивных органов у коров и быков.

Результаты серо-иммунологического мониторинга явились научной предпосылкой для разработки современных методов и средств лабораторной диагностики и специфической профилактики парвовирусной и реовирусной инфекций крупного рогатого скота.

3.2 Иммунобиологические свойства парвовируса типа I и реовируса типа I

Одним из важных условий при разработке технологии изготовления эффективных диагностических тест-систем является использование штаммов вирусов со стабильной иммунобиологической активностью.

С целью изучения гемагглютинирующей активности вирусов использовали эритроциты: человека 0-группы, коровы, свиньи, барана, козы, собаки, кошки, морской свинки, кролика, петуха, крысы и белой мыши.

Изучением гемагглютинирующих свойств штамма «Parvo 32459» установлено, что он агглютинирует эритроциты морской свинки, человека (группы 0), крысы, барана, собаки, петуха. Гемагглютинация наблюдалась в более высоких титрах 1:512 - 1:1024 с эритроцитами морской свинки и человека при температуре 4 °С. Штамм «Reo I Lang» реовируса типа I агглютинировал эритроциты свиньи и человека 0-группы в титрах 1:32 - 1:64, эритроциты крысы, барана, собаки, петуха, кошки, белой мыши, коровы, козы, морской свинки — в титрах 1:2 - 1:4 при комнатной температуре.

Полученные результаты, касающиеся устойчивости парвовируса и реовируса типа I, согласуются с литературными: воздействие на них хлороформом, эфиром, 1 % трипсином, температурой при 56 °С в течение 30 мин не снижала инфекционную и ге м агглютинирую щу ю активность. Установлено, что при воздействии ультразвуком в течение 2 мин повышается гемагглютипирующая активность парвовируса, при этом инфекционная активность вируса снижается.

Патогенность штамма «Parvo 32459» парвовируса типа I КРС подтверждена нами путем экспериментального заражения теленка 28 сут возраста. Клинические признаки заболевания: повышение температуры тела до

40.7 °С, признаки диареи, регистрировали через 72 ч после внутривенного и перорального заражения. Кроме того, наличие инфекции было подтверждено обнаружением прироста титра гуморальных антител и реизоляцией вируса из клинического и патологического материалов.

В качестве лабораторной модели для изучения патогенности штамма реовируса типа I «Reo I Lang» использовали новорожденных мышат-сосунков и

котят. Экспериментально заболевание удалось воспроизвести у новорожденных мышат и котят после внутрибрюшинного, интрацеребрального и перорального заражения.

Изучением культурапьных свойств парвовируса установлено, что для стабильной репродукции вируса необходимо использовать первичные культуры клеток крупного рогатого скота: почек, легких, тестикул. Перевиваемые линии культур клеток MDBK, ЛЭК, TR не поддерживали вирусную репликацию при обычном заражении — в монослой. Удовлетворительные результаты удалось получить при заражении парвовирусом суспензию культур перевиваемых клеток ЛЭК без добавления сыворотки крови крупного рогатого скота в ростовую среду.

В отличие от парвовируса реовирус хорошо размножался и вызывал цитопатический эффект (ЦПЭ) на культурах многих видов домашних животных и приматов: MDBK, ПТ-80, РК-15, ВНК-21/13, Vero. Стимулирующее действие на репродукцию реовируса оказывало добавление фетальной сыворотки крупного рогатого скота в ростовую среду и трипсина 10-20 мкг/см3

— в поддерживающую.

Одним из ответственных этапов при создании диагносгикумов и инактивированных вакцин является выбор инактиватора. В наших исследованиях, формалин в концентрациях 0,2-0,5 % инактивировал инфекционность парвовируса и реовируса типа I, полностью разрушая гемагглютинин этих вирусов и значительно снижая антигенную активность.

Преимущество 1,2 — аминоэтилазиридина по сравнению с формалином, метилглиоксалем выявлена нами при инактивации парвовируса и реовируса. 1,2

— аминоэтилазиридин в оптимально подобранной концентрации 0,1 % при 37 °С в течение 24 ч для парвовируса и 0,075 % при 37 °С в течение 24 ч для реовируса, обладал выраженной вирулицидной активностью, сохраняя антигенные свойства вирусов, которые можно контролировать по титру гемагглютининов.

Установлено, что штаммы парвовируса и реовируса по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам соответствуют критериям характеристики семейства Parvoviridae и Reoviridae соответственно и определены в качестве производственных при разработке биологических препаратов.

3.3 Разработка технологии изготовления тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител

3.3.1 Подбор метода получения специфического антигена

При создании твердофазного варианта ИФА по выявлению антител важным этапом является подготовка антигена. Именно его качеством определяется чувствительность и специфичность иммуноферментной тест-системы. В связи с этим были отработаны режимы концентрирования и очистки парвовируса крупного рогатого скота.

Результаты сравнительного испытания антигенов, полученных тремя различными методами в ИФА с положительной и отрицательной сыворотками, показали, что наиболее специфичным оказался антиген, который подвергался обработке ультразвуком и очистке ультрацентрифугированием при 10000(^ в течение 60 мин через 20 %-ный слой сахарозы. Коэффициент его специфичности при концентрации антигена 3 мкг/см3 составил 7,8 (рис. 1).

■ Контрольный антиген ■ ПЭГ+УЦ и УЦ+УЦ ■ УЗ+УЦ

Рисунок 1 - Коэффициенты специфичности антигенов парвовируса, полученных разными способами

При проверке контрольного антигена, полученного из незараженных культур клеток, было установлено, что положительные и отрицательные контрольные сыворотки с ним не реагируют. Специфический антиген не реагировал с гетерологичными сыворотками, содержащими антитела против герпесвируса и вируса ПГ-3.

3.3.2 Подбор оптимальных условий проведения анализа тест-системой ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота

При конструировании тест-системы ИФА подобраны оптимальная концентрация антигена (3 мкг/см3) и разведение контрольных сывороток (1:400), определены условия экспозиции сывороток (2 ч при 37 °С) и конъюгата (1 ч при 37 °С), установлены допустимые величины показателей оптических плотностей отрицательных (0,08 - 0,12) и положительных (0,557 - 0,746) сывороток, выявлен позитивно-негативный порог (<25 ->35).

Диагностическая чувствительность разработанной тест-системы относительно РВН составляет 96,07 %; диагностическая специфичность - 93,82 %, совпадаемость результатов двух методов — 95,1 %. При исследовании сывороток крови в ИФА и РТГА, полученных от заведомо негативных (п=90) и заведомо позитивных животных (п=90), привитых ассоциированной вакциной, результаты исследований совпадали в 100 % случаях. Коэффициент вариации

знамений Ксв при исследовании отрицательных проб (п=12) тест-системой ИФА разных серий не превышала 6,72 %, а при исследовании положительных (п=10) - 7,91 %, что соответствует рекомендуемым параметрам.

Исследованиями через 3, 6, 12 и 24 мес 3 серий опытной партии диагностикума было установлено, что тест-система сохраняет активность в течение 24 мес со дня изготовления, в связи с этим срок годности тест-системы установлен в 12 мес со дня изготовления.

По результатам межлабораторной комиссионной апробации «Тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения поствакцинальных антител» было установлено, что разработанная тест-система ИФА по своим характеристикам соответствует своему назначению, сопоставима с методом аналогичной направленности и рекомендована для внедрения в ветеринарную практику.

3.4 Разработка технологии изготовления иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета

3.4.1 Подбор метода получения специфического антигена

В качестве исходного материала для изготовления антигена использовали реовирус типа I (шт. «Reo I Lang»), репродуцированный в культуре клеток Vero, с гемагглютинирующим титром 1:32. Для сравнительной оценки были испытаны антигены реовируса, полученные разными способами в ИФА с положительными и отрицательными контрольными сыворотками (рис. 2).

Концентрат!..----------------------

L ! 1«

1 2 8

?* 4

■ контрольный антиген ■ ПЭГ+УЦ/ 20% сахарозы

■ УЗ+УЦ/ 30% сахарозы ■ УЗ+УЦ/10-40% сахарозы

Рисунок 2 - Коэффициенты специфичности антигенов реовируса, полученных разными способами

Результаты этих исследований показали, что при концентрировании рео-вируса полиэтиленгликолем и очистке ультрацентрифугированием через 20 %-ный слой сахарозы удается получить антиген с более высоким содержанием вирусного белка и гемагглютинирующей активностью. Однако наиболее специфичным оказался антиген, который предварительно обрабатывали ультразвуком, концентрировали ультрацентрифугированием и очищали через градиент 10-40 %-ной плотности сахарозы при 100000g в течение 60 минут. Коэффициент его специфичности при концентрации антигена 5 мкг/см3 составил 8,5.

Контрольный антиген, полученный из незараженных культур клеток, не реагировал с положительной и отрицательной контрольными сыворотками, специфический антиген - с гетерологичными сыворотками, содержащими антитела против парвовируса, герпесвируса и вируса ПГ-3.

3.4.2 Подбор оптимальных условий проведения анализа тест-системой ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота

Подобрана оптимальная концентрация антигена 5 мкг/см3, обеспечивающая высокий уровень оптической плотности и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками в рабочем разведении 1:400.

Результаты изучения влияния температуры и времени экспозиции показали, что предпочтительнее использовать режим иммобилизации антигена в течение 2 ч при 37 °С или 24 ч при 4 °С, оптимальным временем экспозиции сывороток оказалась инкубация планшета в термостате в течение 2 ч, конъюгата— 1 часа.

Для получения достоверных результатов при исследовании сывороток в одном разведении установлены ПНП (<16 - >25) и допустимые значения ОП контрольных сывороток: для отрицательной - 0,09 - 0,15, для положительной -0,755 - 1,334.

Определение относительной чувствительности и специфичности разработанной тест-системы проводили по сравнению с РТГА. Испытания диагностических характеристик тест-системы показали, что диагностическая чувствительность тест-системы ИФА относительно РТГА составила 96,5 %; диагностическая специфичность - 93,1 %; совпадаемость результатов двух методов - 95,2 %. Показатель воспроизводимости тест-системы - коэффициент вариации не превышал 7,9 % при исследовании положительных проб и 6,72 % -при исследовании отрицательных проб. Коэффициент корреляции результатов, полученных с помощью разработанной тест-системы ИФА и РТГА, составил 0,92.

Проверка на длительность хранения компонентов тест-системы через 3, 6, 12 и 24 мес показала, что диагностический препарат сохраняет свою активность в течение 24 мес, в связи с этим срок годности тест-системы установлен в 12 мес со дня изготовления.

Итоги производственных испытаний по оценке эффективности разработанной тест-системы ИФА свидетельствуют, что она по своим характеристикам соответствует своему назначению, сопоставима с методом аналогичной направленности, является чувствительной, специфичной и воспроизводимой.

3.5 Критерии оценки результатов, полученных с использованием разработанных тест-систем ИФА

Обнаружение положительных проб сывороток крови в одном разведении (1:400), при обследовании животных, ранее не вакцинированных против парвовирусной и реовирусной инфекций КРС, свидетельствует о циркуляции в стаде возбудителей болезни.

При количественном учете результатов исследований сывороток крови в четырех разведениях (1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400) производят расчет коэффициента специфичности. Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1 и отрицательной, если ниже 2,1. При этом выявление динамики роста специфических антител в парных пробах сывороток, позволяет диагностировать парвовирусную и реовирусную инфекцию у исследованного поголовья.

Напряженность иммунитета определяют по результатам титрования сывороток в четырех разведениях через 2-3 недели после второй вакцинации путем деления количества проб с титром антител 1:400 и выше у вакцинированных телят 10-20 сут возраста, а у глубокостельных коров и телок случного возраста с титром антител 1:800 и выше, к общему количеству исследованных сывороток и выражают в процентах.

Животных считают иммунным, если у 80 % и более телят 10-20 сут возраста титр гуморальных антител достигает значения 1:400 и выше, у глубокостельных коров и телок случного возраста —1:800 и выше.

3.6 Степень распространения парвовирусной и реовирусной инфекций среди поголовья крупного рогатого скота

Серологический скрининг крупного рогатого скота в отношении парвовирусной и реовирусной инфекций проводился с применением разработанных нами тест-систем ИФА в 60 сельхозпредприятиях ряда областей и республик Приволжского федерального округа и прилегающих регионов, в которых регистрировали клинические признаки желудочно-кишечных и респираторных инфекций телят, а также патологии репродуктивных органов маточного поголовья. В период с 2009 - 2013 гг. исследовано 1720 проб сывороток крови, полученных от невакцинированных против респираторно-кишечных инфекций, крупного рогатого скота. Результаты исследований отражены в таблице 2.

Проведенный нами впервые в РФ серомониторинг в отношении парвовирусной и реовирусной инфекций, отчетливо демонстрирует, что из 1720 проб сывороток крови крупного рогатого скота специфические антитела к парво-вирусу типа I выявляются у 699 (40,6 %), к реовирусу типа I - у 571 (33,1 %)

животных, результаты исследований в ИФА согласуются с результатами, полученными в РТГА.

Таблица 2 - Процентное выражение положительно реагирующих проб сывороток крови крупного рогатого скота в отношении парвовируса и реовирусатипа I крупного рогатого скота в РТГА и ИФА.

Республика, область Кол-во хозяйств Кол-во сыв-ток Парвовирус, % Реовирус, %

РТГА ИФА РТГА ИФА

Республика Татарстан 38 1291 38,3 40,2 32,5 33,6

Республика Башкортостан 1 15 13,3 26,6 6,6 13,3

Республика Марий Эл 4 55 31,2 36,3 18,7 23,6

Республика Мордовия 2 58 70,6 72,4 32,7 36,2

Республика Чувашия 3 87 45,9 47,1 32,1 34,4

Волгоградская область 1 26 23,0 30,7 11,5 11,5

Нижегородская область 3 46 43,5 45,0 30,4 32,6

Самарская область I 10 30,0 40,0 30,0 30,0

Саратовская область 2 71 26,7 29,5 12,6 15,4

Тверская область 1 16 50,0 50,0 25,0 37,5

Ульяновская область 1 10 10,0 30,0 30,0 20,0

Челябинская область 3 35 17,7 20,0 28,5 31,4

Всего: 60 1720

из них положительных 658 699 524 571

% 38,2 40,6 30,4 33,1

Таким образом, разработанные тест-системы показали высокую эффективность при серологическом скрининге поголовья крупного рогатого скота в отношении парвовирусной и реовирусной инфекций и позволяют адекватно оценить эпизоотическую ситуацию.

Кроме того, с целью выявления геномов парвовируса типа I и реовируса типа I были испытаны пробы из пораженных органов больных и павших телят от желудочно-кишечной и респираторной инфекций, пробы органов абортированных плодов, полученные из 10 различных хозяйств, также были испытаны ЦПД-изоляты на уровне 1-3 пассажей на перевиваемой и первичной культурах клеток.

В результате постановки ЫЕ8ТЕО-РСЯ парвовирус типа I КРС обнаружен в 8 пробах из 5 хозяйств (рис. 3).

Следует отметить, что в сыворотке крови одного теленка выявлялись антигемагглютинины к антигену парвовируса в титре 1:320, у которого впоследствии в образцах органов методом ПЦР был так же обнаружен геном парвовируса типа I (рис. 3, треки 3 и 4).

М I 2 3 4 5 б .7 S 9 10 U 12 13 14

Рисунок 3 - Электрофореграмма продуктов амплификации парвовируса Обозначения: М - ДНК Маркер;

1 - 12 — испытуемые пробы;

13 - парвовирус типа I (положительный контроль);

14 - реовирус типа I (отрицательный контроль)

Результаты постановки ЯТ-РСЯ по выявлению реовируса в испытуемых пробах представлены на рисунках 4 и 5.

Рисунок 4 - Амплификация локуса S2 Рисунок 5 - Амплификация локуса L3

Обозначения: М-ДНК Маркер;

1 - 12-испытуемые пробы;

13 - парвовирус типа I (отрицательный контроль);

14 - реовирус типа I (положительный контроль)

На рисунке 4 и 5 видно, что проба №8 имеет полосу идентичной контролю молекулярной массы, следовательно, эта проба дала позитивную реакцию на наличие в образце искомого участка РНК, характеризующего присутствие реовируса типа I.

Полученные данные о серопозитивности крупного рогатого скота в отношении парво- и реовирусов, а также результаты индикации геномов указанных вирусов методом ПЦР в материале, полученном от больных и подозрительных по заболеванию животных, дает нам основание утверждать, что парвовирусная и реовирусная инфекции имеют определенное распространение среди поголовья крупного рогатого скота в регионах Приволжского федерального округа.

3.7 Разработка технологии изготовления ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота

Для изготовления экспериментальных серий вакцины парво-, peo-, герпесвирусы и вирус ВД-БС репродуцировали монослойным способом в

стационарных условиях в соответствующих культурах клеток. Культуру клеток заражали вируссодержащей культуральной суспензией в дозе 0,01 - 0,1 ТЦД5о/клетку инкубировали при температуре (37±0,5) °С в течение 48 - 96 ч до полного поражения монослоя. Вируссодержащие суспензии с инфекционной активностью не менее 4,0 - 7,0 lg ТЦД50/СМ3, свободные от бактериальной микрофлоры и грибковой контаминации, трехкратно замораживали при температуре -20 °С и оттаивали. Затем вируссодержащий материал очищали от клеточного детрита путем центрифугирования при 2000 g в течение 20 мин соблюдая стерильные условия.

Инактивацию очищенных вируссодержащих суспензий осуществляли 1,2 — аминоэтилазиридином при 37±0,5 °С в течение 24 ч при постоянном перемешивании.

3.7.1 Выбор формы инактивированной вакцины и изучение антигенной совместимости вирусных компонентов на лабораторных животных

С целью изучения взаимного влияния вирусных антигенов парво-, рео-герпесвирусов типа I и вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек на создаваемый иммунитет при их раздельном и совместном введении, изготовлены экспериментальные серии моно- и ассоциированных вакцин с использованием в качестве адъюванта ГОА и МА.

Антигенную активность и совместимость компонентов моно- и ассоциированных вакцин изучали на кроликах. Вакцинные препараты на основе ГОА вводили двукратно, подкожно с интервалом в 14 сут в дозе 1 см3 для моновакцин и 2 см3 для ассоциированной вакцины; опытные серии вакцин на основе МА вводили двукратно, внутримышечно с интервалом в 21 сут в дозе 1 см3 для моновакцин и 2 см3 для ассоциированной вакцины (рис. 6 и 7).

В Ассоциированная вакцина 3 Моиовакцняа

Рисунок 6 - Уровень антител в сыворотке крови кроликов, иммунизированных гидроокисьалюминиевыми моно- и ассоциированной вакцинами (М±т, п=5, р<0,05)

□ Ассоциированная вакцина в Моипвакцкна

Рисунок 7 - Уровень антител в сыворотке крови кроликов, иммунизированных эмульсионными моно- и ассоциированной вакцинами (М±т, п=5, р<0,05)

Из результатов, представленных на рисунке 6 и 7, следует, что вирусные антигены, входящие в состав ассоциированных вакцин как с ГОА, так и с МА адъювантом, не оказывают ингибирующего влияния друг на друга. Моновакцины и ассоциированные вакцины вызывали образование антител ко всем вирусным антигенам приблизительно на одном уровне, при этом разность в титрах статистически достоверно не отличалась (Р>0,05).

Сравнительный анализ испытания эмульсионных и сорбированных форм ассоциированных вакцин показал, что вакцина на основе масляного адъюванта индуцировала выработку в 1,28±0,01 (Р<0,05) раза более высокого уровня специфических антител в крови подопытных животных против парвовируса, реовируса, герпесвируса и вируса диареи, чем гидроокисьалюминиевая.

3.7.2 Определение оптимальной прививочной дозы ассоциированной эмульсионной вакцины на кроликах

Первоначально оптимальную прививочную дозу вакцины, определяли на кроликах, которым вакцину вводили двукратно с интервалом в 21 сут внутримышечно. Использовали 4 группы кроликов (п=5): животным I группы вакцину вводили в дозе 0,5 см3, животным II группы - в дозе 1 см3, животным III группы - в дозе 2 см3, животным IV группы - в дозе 3 см3. Контролем служили 5 не иммунизированных кроликов. Результаты исследований представлены на рисунке 8.

Установлено, что введение вакцины в различных дозах стимулирует образование антител в крови подопытных кроликов всех групп. При этом доза

доза вакцины, см3

вакцины 0,5 см3 индуцировала недостаточно высокий уровень специфических антител. Достаточно высокие титры антител были получены при иммунизации животных дозой 1 см3. Максимальный титр антител отмечен в группах, вакцинированных в дозах 2 и 3 см3, значение титров антител у животных этих групп ко всем вирусным антигенам находилось приблизительно на одном уровне.

| 12

< 10 е

К 8

И к парвовируеу О к реовнрусу И к герпесвирусу Н к вирусу диареи

Рисунок 8 - Динамика уровня антител в зависимости от дозы вакцины

Таким образом, на основании сравнительного анализа полученных результатов, оптимальными прививочными дозами выбраны дозы 1 и 2 см .

3.7.3 Изучение иммунобиологических свойств вакцины

Для эмульсионных инакгивированных вакцин важным моментом является сохранение физических и иммунобиологических свойств препарата в течение срока годности. Результаты по изучению иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и ВД-БС крупного рогатого скота показали, что антигенная активность вакцины, хранившейся при температуре 2-8 С в течение как 6, так и 12 мес, по сравнению с исходной не снизилась. В течение срока наблюдения вакцина оставалась стерильной, безвредной и стабильной. Полученные данные свидетельствует о сохранении антигенной активности разработанной ассоциированной вакцины в течение 12 мес хранения при температуре 2-8 °С. На основании полученных результатов был установлен срок годности биопрепарата, который составил 12 месяцев.

3.7.4 Выбор формы ассоциированной вакцины и определение оптимальной прививочной дозы на КРС различных возрастных групп

В производственных условиях, изучение антигенной активности и определение прививочной дозы экспериментальных серий ассоциированных вакцин проводилось на крупном рогатом скоте в одном из хозяйств Республики Татарстан. С этой целью были сформированы, на каждый вариант вакцины, по три группы животных разных возрастных групп по принципу аналога в количестве 45 голов, серонегативных или имеющих низкий уровень антител в

отношении парвовируса, реовируса, герпесвируса типа I и ВД-БС крупного рогатого скота. Вакцинировали три возрастные группы животных: телят 10-20 сут возраста, телок случного возраста, глубокостельных коров и нетелей. Для каждой возрастной группы испытывали три соответствующие дозы вакцин. Статистически обработанные результаты исследований представлены в таблицах 3 и 4.

Результаты сравнительного испытания экспериментальных образцов вакцины показали, что в сыворотке крови стельных коров, телок случного периода и телят после первой вакцинации наблюдалось достоверное повышение титров антител ко всем вирусным антигенам в сравнении с исходным (до вакцинации) (Р<0,05). Ревакцинация животных после первого введения вакцины как эмульсионной, так и гидроокисьалюминиевой в различных дозах сопровождалось повышением уровня антител в крови всех экспериментальных групп животных в 1,93±0,65 (Р<0,05) раза больше чем после первой.

Таблица 3 - Уровень гуморальных антител после двукратной иммунизации ассоциированной вакциной, (п=5; Р<0,05)

Группа Форма вакцины Доза, см" Тигр антител", М±ш

кпарвовирусу креовврусу кИРТ к ВД-БС

РТГА ИФА РТГА ИФА ИФА ИФА

Глубокосгелыше коровы и нетели МА I 672,0*199,2 1280,0*536,6 576,0*71,5 1280,0*219,0 960,0*178,8 720,0*89,4

2 736,0*262,9 2560,0*438,1 704,0*175,2 2400,0*565,6 2160,0*715,5 1920,0*357,7

3 832,0*214,6 2880,0*357,7 768,0*143,1 2560,0*438,1 2240,0*657,2 2080,0*536.6

Глубокостелыяые коровы н нетели ГОА 3 416,0±107,3 840,0*349,2 384,0*71,5 880,0*219,0 800,0*0,0 680,0*279,2

5 512,0*87,6 1760,0*438,1 448,0*87,6 1600,0*489,9 1440,0*178,8 1280,0*219,0

10 592,0*225,5 1920,0*357,7 576,0*71,5 1760,0*438,1 1600,0*489,9 1440,0*178,8

Телки случного МА 1 528,0*125,2 1120,0*219,0 480,0*113,1 1440,0*178,8 1200,0*565,6 1080,0*357,7

2 704,0*280,5 2400,0*565,6 672,0*199,2 2240,0*657,2 2080,0*536,6 1840,0*657,2

3 736,0*262,9 2560,0*438,1 704,0*175,2 2320,0*638,7 2240,0*438,1 1920,0*357,7

Телки случного периода ГОА 3 384,0*71,5 1040,0*268,3 352,0*87,6 1040,0*268,3 880,0*219,0 680,0*279,2

5 608,0*214,6 1600,0*0,0 480,0*113,1 1520,0*536,6 1520,0*536,6 1360,0*558,5

10 640,0*195,9 1760,0*438,1 544,0*107,3 1600,0*489,9 1600,0*489,9 1440,0*521,5

Телтга 10-20 сут возраста МА 0,5 320,0*0,0 1040,0*268,3 304,0*107,3 960,0*178,89 880,0*219,0 800,0*0,0

1 576,0*71,5 1360,0*268,3 480,0*113,1 1200,0*282,8 1040,0*268,3 960,0*178,8

2 640,0*0,0 1360,0*558,5 512,0*87,6 1280,0*219,0 1160,0*319,3 1040,0*268,3

Те.игта 10-20 сут возраста ГОА 2 336,0*99.6 640,0*109,5 288,0*35,7 600,0*141,4 480,0*89,4 560,0*109,5

3 448,0*87,6 1040,0*268,3 352,0*87,6 960,0*178,8 880,0*219,0 720,0*89,4

5 480,0*113,1 1120,0*219,0 384,0*71,5 1080,0*357,7 960,0*178,8 880,0*219,0

Примечание: х - приведена обратная величина среднеарифметического значения титров антител по группе животных

Таблица 4 - Уровень специфических антител в сыворотке молозива у коров после двукратной иммунизации ассоциированной вакциной, (п=5; Р<0,05)

ФорЫ! вакцины Дом, см"' Тигр антител", М±ш

к mpaoBHpvcv к peowpvcy «ИРТ г В/И,С

РТГА ИФА РТГА ИФА ИФА ИФА

Эмульсионная 1 384,0471,5 800,040,0 352,0487,6 720,0489,4 640,04109,5 520,04134,1

2 480.04113,1 1120.04219,0 448,0487,6 1040,04268,3 1120,04219,0 960,04178,8

3 512,0487,6 1200,04282,« 480,04113,1 1040,04268,3 1120,04219,0 960,04178,8

Сорбированная 3 192,0435,7 400,04122,4 128,0421,9 360,04130,3 320,0454,7 320,0454,7

5 384,0±71,5 720,0489,4 320,0497,9 640,04109,5 560,04109,5 520,04134,1

10 400,04120,0 760,04268,3 336,0±99,6 680,04134,1 600,04141,4 560,04164,3

Контроль «,045,48 20,00413,69 8,045,4 20,0413,6 40,0411,1 10,0411,1

Из представленных в таблицах 3 и 4 данных следует, что максимальный уровень антител отмечался в сыворотке крови и молозиве у глубокостельных коров и нетелей, привитых эмульсионной вакциной в дозе 2 и 3 см3, у телят — в дозе 1 и 2 см3 соответственно (Р<0,05). В то же время разница уровня специфических антител в сыворотках крови коров и нетелей, вакцинированных прививочной дозой 2 см3 и 3 см3, статистически достоверно не отличалась (Р>0,05). Показатели прививочной дозы вакцины для телят 1 см3 по уровню антител также оказались аналогичными дозе вакцины 2 см3.

При применении сорбированной вакцины наиболее выраженный иммунный ответ ко всем вирусным антигенам получен у коров, нетелей и телок, привитых в дозе 5 см3 и 10 см3, у телят - 3 см3 и 5 см (Р<0,05). При этом разность в титрах антител, индуцированных дозой 5 см3 и 10 см3 для взрослого поголовья, 3 см3 и 5 см3 для телят была незначительной и составила 112,0±39,1 и 84,0±27,9 (р<0,05) соответственно.

В результате проведенных исследований, были определены оптимальные прививочные дозы: ассоциированной вакцины, приготовленной на основе масляного адъюванта, для глубокостельных коров, нетелей и телок случного периода — 2 см3, для телят 10-20 сут возраста — 1 см3, ассоциированной гидроокисьалюминиевой вакцины для глубокостельных коров, нетелей и телок случного периода - 5 см3, для телят 10-20 сут возраста - 3 см3.

Таким образом, вакцина на основе масляного адъюванта индуцировала синтез специфических антител в крови и молозиве на 1,30±0,05 - 1,44±0,08 (Р<0,05) раз более высокого уровня, чем гидроокисьалюминиевая, что и определило выбор масляного адъюванта при конструировании ассоциированной вакцины.

3.7.5 Производственные испытания вакцины ассоциированной инактивированной эмульсионной

Изучение эффективности опытных серий вакцины проводили в условиях 6 хозяйств РТ. В каждом хозяйстве вакцинировали три возрастные группы

подопытных животных по 30 голов в каждой: телят 10-20 сут возраста в дозе 1 см3, телок случного возраста — 2 см3, глубокостельных коров и нетелей — 2 см3. Вакцину вводили внутримышечно в среднюю треть шеи двукратно с интервалом 21-30 суток. Динамику нарастания титров специфических антител в сыворотке крови определяли у всех групп животных до вакцинации, после первой, второй вакцинации и через 6, 9 и 12 мес после двукратной вакцинации (табл. 5 и 6).

Таблица 5 - Уровень специфических антител в сыворотке крови КРС через 30 сут после двукратной иммунизации, (п=30; Р<0,05)

Группа Титр антител" в ИФА, М±т

к парвовирусу к реовирусу к герпес-вирусу к ВД-БС

ООО «Кубня» Кайбицкий район РТ

Глубокосгельные коровы 2400,0*151,1 2426,6±158,3 2133,3±142,4 2026,6*149,7

Телки случного периода 2306,6*162,8 2466,6± 163,3 2186,6±145,6 2053,3*173,0

Телята 10-20 сут возраста 1306,6±110,2 1333,3*109,1 1293,3±113,2 1266,6*118,7

ООО «Тукаевский» Атнинский район РТ

Глубокостельные коровы 2093,3*167,4 2106,6±189,0 2013,3±181,4 1986,6*185,5

Телки случного периода 2160,0*169,6 2173,3±165,1 2134,0*157,8 2000,0*139,3

Телята 10-20 сут возраста 1400,0±102,7 1413,3±98,9 1373,3±72,1 1293,3*84,3

СХПК ПЗ «им. Ленина» Атнинский эайонРТ

Глубокостельные коровы 2260,0±188,9 2300,0*191,3 2040,0*212,2 1933,3*180,9

Телки случного периода 2160,0±208,8 2213,3*216,1 2020,0± 195,1 1920,0*221,0

Телята 10-20 сут возраста 1413,3±230,5 1426,6±231,3 1320,0*75,9 1173,3*75,3

ООО «Маяк» Балтасинский район РТ

Глубокостельные коровы 2293,3* 149,7 2346,6±150,7 2026,6± 149,7 1920,0*138,4

Телки случного периода 2306,6*162,8 2386,6±183,4 2080,0*138,4 1973,3*144,5

Телята 10-20 сут возраста 1353,3±141,9 1360,0*77,0 1280,0*81,3 1200,0*75,5

ООО «Игенче» Балтасинский район РТ

Глубокостельные коровы 2113,3±226,1 2253,3±161,4 2106,6±148,4 1986,6*143,9

Телки случного периода 2213,3*154,5 2270,0±200,7 2133,3*171,5 2006,6*156,8

Телята 10-20 сут возраста 1286,6±87,0 1293,3*77,2 1240,0*132,8 1186,6*109,4

ООО «Сосна» Балтасинский район РТ

Глубокостельные коровы 2146,6±174,7 2186,6±145,6 2133,3*157,6 1933,3*138,0

Телки случного периода 2106,6±163,1 2240,0*162,7 2126,6*177,3 1866,6*112,6

Телята 10-20 сут возраста 1306,6±110,2 1360,0*102,4 1280,0*74,0 1240,0*119,2

Таблица 6 - Уровень специфических антител в сыворотке молозива у коров, двукратно иммунизированных ассоциированной вакциной (п=30; Р<0,05)

Группа Тигр антител*, М±т

к парвовирусу к реовирусу кИРТ к ВД-БС

РТГА | ИФА РТГА | ИФА ИФА ИФА

СХПК ПЗ «им. Ленина» Атнинский район РТ

Опыт 653,3 ±67,5 2266,6 ±217,5 704,0 ±71,7 2326,6 ±214,9 2046,6 ±182,6 1953,3 ±166,0

Контроль 11,6±1,8 43,3±9,3 14,6±2,5 46,6±9,4 190,0±21,4 170,0±12,0

ООО «Сосна» Балтасинский район РТ

Опьгг 757,3 ±50,5 2320,0 ±157,7 853,3 ±63,0 2453,3 ±150,7 2293,3 ±149,7 2006,6 ±156,8

Контроль 35,3 ±3,7 133,3 ±25.0 24,6 ±2,7 123,3 ±23,2 226,6 ±22,8 186,6 ±18,0

ООО «Маяк» Балтасинский район РТ

Опыт 677,3 ±57,1 2313,3 ±177,6 725,3 ±56,1 2413,3 ±181,1 2280,0 ±185,9 2180,0 ±179,9

Контроль 40,3 ±5,0 126,6 ±11.8 35,3 ±4.4 143,3 ±9,3 260,6 ±42,9 216,6 ±14.7

ООО «Игенче» Балтасинский район РТ

Опыт 709,3 ±65,1 2333,3 ±195,1 720,0 ±74,3 2386,6 ±260,6 2213,3 ±81,6 2160,0 ±197,5

Контроль 27,0 ±3,0 100,0 ±9,7 38,6 ±4,9 156,6 ±23,2 206,6 ±21,7 183,3 ±13,8

ООО «Тукаевский» Атнинский район РТ

Опыт 682,6 ±67,5 2280,0 ±216,4 714,6 ±63,7 2320,0 ±221,0 2266,6 ±156,4 2053,3 ±173,0

Контроль 8,3±1,8 36,6±9,1 12,0±1,7 50,0±22,0 203,3±22,3 196,6±9,1

Эффективность вакцины определяли по снижению уровня заболеваемости и гибели телят от респираторных, желудочно-кишечных инфекций, у коров и нетелей по снижению процента проявления патологий репродуктивных органов, а также оценивали по уровню иммунного ответа у вакцинированных животных.

По результатам производственных испытаний было установлено, что заболеваемость новорожденных телят, полученных от вакцинированных глубокостельных коров и нетелей, составляла в пределах: 0 - 3,3 %, в контрольной группе - 10,7 - 18 %, гибель - 3,2 - 10 %. Среди вакцинированных телят 10 -20 сут возраста заболеваемость респираторно-кишечными инфекциями составила в пределах 3,3 - 6,6 %, а в контрольной группе заболеваемость составила 15 - 19 %, гибель и выбраковка - 9 - 11 %. У глубокостельных коров ассоциированная эмульсионная инактивированная вакцина каких-либо отклонений от физиологической нормы не вызывала. От всех вакцинированных

животных были получены здоровые, жизнеспособные телята. От коров контрольной группы получено телят на 4 - 8 % меньше.

Исследования сывороток крови вакцинированных животных в отдаленные сроки показали, что специфические антитела у них ко всем вирусным антигенам сохраняются в течение 6 мес на достаточно высоком уровне (рис. 9, 10).

Сроки исследования

Рисунок 9 - Напряженность иммунитета у коров и телок в отдаленные сроки; К- (контроль) не вакцинированные

< е

с.

Сроки исследования

■ антитела я антитела

антитела

■ антитела

к вирусу диареи к герпесвирусу к реовнрусу к парвовирусу

1 мес б мес „

9 мес 12 мес

Рисунок 10 - Напряженность иммунитета у телят 10-20 сут возраста в отдаленные сроки; К - (контроль) не вакцинированные

Значительное снижение титров антител установлено через 9 мес после двукратной вакцинации. Через 12 мес после двукратной вакцинации титры специфических антител в целом сохранялись и были выше, чем у животных

контрольной группы, однако эти показатели были ниже на 2-3 разведения по сравнению с титром антител выявленных через 6 месяцев.

Таким образом, напряженный иммунитет у двукратно вакцинированных животных вакциной ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной, сохраняется в течение б месяцев.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные в настоящей работе результаты исследований позволили установить роль парвовируса, реовируса типа I в инфекционной патологии крупного рогатого скота, участвующих в сочетании с герпесвирусом и вирусной диареей в смешанной инфекции, и явились научным обоснованием для разработки методов и средств лабораторной диагностики и ассоциированной вакцины. Изучение новых форм патологий крупного рогатого скота завершились разработкой технологии изготовления иммуноферментных тест-систем, ассоциированной вакцины и внедрением их в ветеринарную практику.

В соответствии с поставленными задачами были получены следующие результаты:

1. Клинико-эпизоотологический и серологический мониторинг животноводческих комплексов Приволжского федерального округа и ряда регионов РФ в отношении желудочно-кишечных и респираторных инфекций молодняка и репродуктивной патологии маточного поголовья показал высокую серопозитивность их к антигенам вирусов ПГ-3 (83,2 %), герпесвируса типа I (57,2 %), ВД-БС (49,6 %), парвовируса типа I (37,8 %) и реовируса типа I (31 %), что указывает на распространенность этих вирусов среди животных. Одновременное выявление геномов парвовируса и реовируса методом ПЦР в пробах, полученных от больных и подозрительных по заболеванию животных, позволяет утверждать об их участии в формировании смешанных вирусных инфекций.

2. Путем изучения влияния на инактивацию температуры, продолжительности экспозиции и концентрации 1,2-аминоэтилазиридина, установлено, что оптимальными для инактивации производственных штаммов парво-, реовирусов являются соответственно концентрация 0,01 % при 37 °С в течение 24 ч и концентрация 0,075 % при 37 °С в течение 24 ч, обеспечивающие получение качественных и безопасных биопрепаратов.

3. Разработанные впервые в РФ «Тест-система ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и оценки поствакцинального иммунитета» и «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета», являются эффективными средствами серологического скрининга и иммунологического

мониторинга поголовья крупного рогатого скота в отношении указанных инфекций.

4. Разработаны и научно-обоснованы принципы серологической диагностики парвовирусной и реовирусной инфекций КРС: выявление динамики роста специфических антител в парных пробах сывороток, при исследовании образцов в четырех разведениях, позволяет диагностировать реовирусную и парвовирусную инфекции у исследованного поголовья.

5. Определен критерий дифференциации положительных и отрицательных результатов исследования сывороток крови в одном разведении, полученных с помощью разработанных тест-систем ИФА. Величина ПНП тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции КРС составила < 25 % — > 35 %, а иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции КРС — <16 % — > 25 %. Обнаружение положительных проб сывороток крови в одном разведении к антигенам парво- и реовирусов, при серологическом скрининге поголовья, ранее не вакцинированного против реовирусной и парвовирусной инфекций крупного рогатого скота, свидетельствует о циркуляции в стаде указанных возбудителей болезни.

6. Для оценки напряженности группового иммунитета при вакцинации КРС против парвовирусной и реовирусной инфекций предложен метод титрования сывороток в четырех разведениях. Животных считают иммунным, если у 80 % и более телят 10-20 сут возраста титр гуморальных антител достигает значения 1:400 и выше, у глубокостельных коров и телок случного возраста —1:800 и выше.

7. Впервые разработана технология изготовления и контроля вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на основе эффективного соотношения концентрированных, инакгивированных 1,2 - аминоэтилазиридином вирусных антигенов и масляного адъюванта.

8. Изыскано оптимальное соотношение вирусных антигенов штаммов парвовируса КРС типа I, реовируса типа I, герпесвируса типа I и вируса ВД-БС КРС с инфекционной активностью 4,0-7,0 ^ ТЦЩо/см3, обладающих высокой биологической, антигенной активностью, отличающихся высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах. Экспериментально в лабораторных и производственных опытах подтверждена их совместимость, обеспечивающая формирование специфических противовирусных антител в высоких титрах в отношении компонентов вакцины.

9. Установлено, что экспериментальные и опытно-производственные серии вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота безвредны, антигенно активны, стабильны, в процессе хранения при 2 - 8 °С в течение 12 мес сохраняют исходную иммуногенную активность, обеспечивают формирование напряженного

иммунитета через 30 сут после двукратной вакцинации продолжительностью не менее 6 месяцев.

10. Производственными испытаниями доказана эффективность вакцины в хозяйствах, неблагополучных по респираторно-кишечным инфекциям молодняка и репродуктивной функции маточного поголовья скота. Вакцинация телят 10-20 сут возраста снижает заболеваемость респираторно-кишечными инфекциями на 11,7 - 12,4 % и сокращает гибель на 9 - 11 %. Вакцинация глубокостельных коров и нетелей позволяет получать на 4 - 8 % больше телят, а также снижает заболеваемость новорожденных телят на 10,7 - 14,7 %, и сокращает их гибель на 3,2 - 10 %.

11. Показана важная роль обширной группы вирусов в этиопатогенезе респираторно-кишечных инфекций молодняка и нарушениях функций репродуктивных органов взрослого поголовья скота. Изученные впервые в РФ парво- и реовирусы, объединенные сходством клинического течения, механизмом распространения, признаны потенциальными возбудителями указанных форм патологий и явились научной предпосылкой для разработки современных иммуноферментных тест-систем и средства их специфической профилактики.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

На основе проведенных исследований разработаны и предложены для внедрения в ветеринарную практику «Тест-система ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и оценки поствакцинального иммунитета», «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета», «Вакцина ассоциированная против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа 1 инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная».

Материалы исследований по разработке и применению иммуноферментных тест-систем и вакцины ассоциированной вошли в следующие нормативные документы:

- «Инструкция по применению тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител», утвержденная заместителем руководителя Россельхознадзора 30.08.2010г.;

- «Технические условия на тест систему ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител (ТУ 9384-012-00492374-2009)», утвержденные заместителем руководителя Россельхознадзора 30.08.2010г.;

- «Инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета», утвержденная

директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и согласованная начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ 20.04.2011г.;

- «Технические условия на иммуноферментную тест-систему для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета (ТУ 9388-01500492374-2011)», утвержденные директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 10.12.2013г.;

- «Инструкция по применению вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактиви-рованной эмульсионной», утвержденная заместителем руководителя Россельхознадзора 21,08.2013г.;

- «Стандарт организации на вакцину ассоциированную против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированную эмульсионную (СТО 00492374-0001-2013)», утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 21.08.2013г.

Обобщая результаты наших исследований, анализируя сведения, имеющиеся в отечественной и зарубежной литературе, можно отметить, что перспективным направлением для дальнейших научных исследований является совершенствование существующих и разработка новых подходов к проведению ПЦР, позволяющих проводить индикацию и дифференциальную межвидовую и внутривидовую диагностику парвовирусов и реовирусов крупного рогатого скота. Другим современным направлением в диагностике парво-, реовирусных инфекций может быть разработка ДНК-биочипов, которые способны улавливать и анализировать молекулы ДНК и РНК, существенно повышая точность и экспрессность получаемых результатов.

Достижения генной инженерии и биотехнологии создают принципиальную возможность для совершенствования ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота и разработки при других инфекциях вакцин, которые будут обладать целым рядом преимуществ перед традиционными вакцинами. Внедрение таких биопрепаратов в ветеринарную практику в будущем может иметь чрезвычайную важную роль в профилактике и защите поголовья скота от наиболее распространенных инфекций.

Список использованной литературы

1. Глотов, А.Г. Планирование программ вакцинации при вирусных респираторных болезнях крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, А. В. Нефедченко и др. // Рекомендации РАСХН, Сиб.- отд-ние, ГНУ ИЭВС и ДВ. - Новосибирск, 2006. - 36 с.

2. Гулюкин, МЛ. Система ветеринарно-санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней крупного рогатого

скота в хозяйствах Российской Федерации / М.И. Гулюкин, К.П. Юров, Ю.Д. Караваев и др. // ГНУ ВИЭВ, ФГУ «Центр ветеринарии». - M - 2007.-14 с.

3. Дудников, С.А. Количественная эпизоотология: основы прикладной эпидемиологии и биостатистики / С.А. Дудников. - Владимир: Демиург, 2004. -460 с.

4. Зароза, В.Г. Мероприятия по получению здоровых телят и профилактика их болезней / В.Г. Зароза, Г.А. Бурова, В.Г. Буров // Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2007. - № 9. - С. 9 - 17.

5. Иванов, A.B. Этиопатогенез респираторно-генитальных инфекций крупного рогатого скота, проблемы и перспективы их диагностики, профилактики и борьбы с ними / A.B. Иванов, Х.З. Гаффаров // Ветеринарный врач. - 2008. -№4. - С. 2 - 7.

6. Кочетков, С.А. Методические рекомендации по выявлению генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 типа с помощью полимеразной цепной реакции / С.А. Кочетков, Л.Б. Чупин, В.А. Прохватилова и др. // Владимир. - 2009. - 10 с.

7. Красиков, А.П. Ассоциативные инфекционные болезни телят: монография / А.П. Красиков, В.И. Афанасенко. - Омск: Изд-во ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2008. -275 с.

8. Матвеева, И.Н. Промышленные технологии изготовления компонентов моно-и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных: автореф. дис. ... докт. биол. наук: 03.00.23/ Ирина Николаевна Матвеева: -Щелково, 2008. - 53 с.

9. Мищенко, В.А. Особенности парвовирусной инфекции крупного рогатого скота / В.А. Мищенко, H.A. Яременко, A.A. Гусев, В.М. Захаров и др. // Ветеринария. - 2000. - № 5. - С. 19-21.

10. Непоклонов, Е.А. Совершенствование ветеринарно-диагностических мероприятий в Российской Федерации / Е.А. Непоклонов // Матер, междунар. научно-практич. конф. — Щелково, 2003. - С. 3 - 5.

11. Панин, А.Н. Анализ состояния российского рынка ветеринарных препаратов / А.Н. Панин, A.B. Гарбузов, В.И. Смоленский // Ветеринария. -2013.-№ 1.-С.З-5.

12. Печура, Е.В. Современные проблемы внутриутробных инфекций крупного рогатого скота в хозяйствах Свердловской области / Е.В. Печура, О.Г. Петрова, И.А. Рубинский // Био. - 2007. - № 3. - С. 45 - 47.

13. Самуйленко, АЛ. Современное состояние номенклатуры, терминологии и классификации инфекционных болезней / АЛ. Самуйленко, A.A. Евглевский // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. -№8. - С. 71 - 73.

14. Шабунин, C.B. Бактериальные и вирусные инфекции в патологии воспроизводительной функции у коров / C.B. Шабунин, А.Г. Шахов,

А.Г. Нежданов // Ветеринария. - 2012. - № 10. - С. 3 - 8.

15. Юров, К.П. Применение иммуноферментного анализа для выявления парвовируса крупного рогатого скота 3-го типа (штамм В-2) / К.П. Юров,

Т.Б. Щербакова // Всерос. НИИ эксперим. ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. -М., 1993. - 7 с.

16. Elscbner, M. Untersuchungen zur Diagnostik von bovinen Parvoviren in Kotproben von Kalbern / M. Elschner // Berl. u. munch, tierarztl. Wschr. - 1994. - Jg. 108. - H.7. - S. 256-260.

17. Muscillo, M. A new RT-PCR method for the identification of reoviruses in seawater samples / M. Muscillo, G. La Rosa, C. Marianeiii et al. // Wat. Res. — 2001. - Vol. 35. - No. 2. - P. 548-556.

18. Soulebot, J.P. Prophylaxie medicate des affections respiratoires des bovines d'origine virale (IBR, PL3, reovirus, maladie des muqueuses) / J.P. Soulebot // Ree. Med. veter. - 1985. - 161. - 12:1271-1275.

19. Spinner, M. L. and Di Giovannil G. D. Detection and Identification of Mammalian Reoviruses in Surface Water by Combined Cell Culture and Reverse Transcription-PCR / M.L. Spinner and G.D.Di Giovannil // Applied and Environmental Microbiology. - July, 2001. - P. 3016 - 3020.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в российских рецензируемых научных журналах из Перечня ВАК

1. Гаффаров, Х.З. Этиопатогенез и клинико-эпизоотологические аспекты некоторых вирусных инфекций у импортного поголовья крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, В.Г. Гумеров, М.А. Ефимова и др. // Ветеринарный врач. - 2007. - №3. - С. 11 - 15.

2. Гаффаров, Х.З. Иммуноферментный анализ в диагностике реовирусной инфекции крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, М.А. Ефимова, О.В. Москвичев //Ветеринарныйврач. -2011.- № 5. - С. 14 - 16.

3. Ефимова, М.А. Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител (ELISA Test System for Serological Diagnosis of Bovine Parvovirus Infection and Determination of Postvaccinal Antibody Level) / M.A. Ефимова, A.B. Иванов, X.3. Гаффаров, А.И. Яруллин // Доклады РАСХН. -2012.-№2.-48-51 с.

4. Гаффаров, Х.З. Серо-иммунологический мониторинг крупного рогатого скота в отношении парвовирусной инфекции / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, М.А. Ефимова, И.А. Яруллин, JI.1II. Дуплева // Ветеринария. - 2012. - №11. -С. 25-28.

5. Гаффаров, Х.З. Ассоциированная вакцина против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи — болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, М.А. Ефимова, И.А. Яруллин, Л.Ш. Дуплева // Ветеринария. - 2012. - №6. - С. 22 - 25.

6. Гаффаров, Х.З. Определение прививочной дозы ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота /

Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, М.А. Ефимова, Л.Ш. Дуплева, А.И. Яруллин, О.В. Москвичев // Ветеринарная патология. - 2012. - №2. - С. 44 - 47.

7. Ефимова, М.А. Иммунобиологические свойства ассоциированной вакцины против парвовирусной, герпесвирусной инфекции типа I и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек КРС / М.А. Ефимова, A.B. Иванов, Х.З. Гаффаров, Л.Ш. Дуплева // Ветеринария и кормление. - 2012. - №3. -С. 14-15.

8. Гаффаров, Х.З. Ретроспективный анализ респираторно-кишечных вирусов, циркулирующих среди поголовья крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья / Х.З. Гаффаров, М.А. Ефимова, Л.Ш. Дуплева и др. /7 Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -Казань, 2013. - Т. 216. - С. 78 - 84.

9. Ефимова, М.А., Иванов A.B., Гаффаров Х.З., Москвичев О.В. ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности иммунитета / М.А. Ефимова, A.B. Иванов, Х.З. Гаффаров, О.В. Москвичев // Ветеринария. - 2013. - №3. - С. 56 - 59.

10. Гаффаров, Х.З. Этиологическое значение реовирусов в патологии крупного рогатого скота (Обзор литературы) / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, М.А. Ефимова // Ветеринария. - 2013. - №10. - С. 22 - 27.

11. Ефимова, М.А. Индикация реовируса методом ПЦР / М.А. Ефимова, Х.З. Гаффаров, Т.Х. Фаизов, Н.И. Хаммадов // Международный вестник ветеринарии. - 2013. - №4. - С. 72 - 75.

12. Гаффаров, Х.З., Ефимова М.А. Биологические свойства парвовируса и его роль в патологии крупного рогатого скота (обзор) / Х.З. Гаффаров, М.А. Ефимова // Журнал Сельскохозяйственная биология. - 2013. - №6. -С. 16-26.

13. Гаффаров, Х.З. Реовирусы и их роль в экосистеме / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, М.А. Ефимова //Ветеринария. - 2013. - №12. - С. 22 - 26.

14. Ефимова, М. А. Иммунобиологические свойства реовируса типа I / М.А. Ефимова, A.B. Иванов, Х.З. Гаффаров, О.В. Москвичев // Доклады РАСХН. - 2014. -№1. - С. 65 - 68.

15. Ефимова, М.А. Изучение культуральных свойств парвовируса типа I крупного рогатого скота / М.А. Ефимова // Ветеринария и кормление. - 2014. -№2.-С. 19-20.

16. Ефимова, М.А. Выявление парвовируса типа I крупного рогатого скота методом ПЦР / М.А. Ефимова, Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, Т.Х. Фаизов, Н.И. Хаммадов //Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2014. - №2 (22). - С. 22 - 26.

Патенты РФ

17. Патент РФ №2452512. «Вакцина ассоциированная против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная»

/ Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, М.А. Ефимова, Л.Ш. Дуплева, А.И. Яруллин. -Заявлено 26.03.2010; опубликовано 10.06.2012; БИ № 16. - С. 22.

18. Патент РФ №2461008. «Тест-система ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител» / Х.З. Гаффаров, М.А. Ефимова, A.B. Иванов, Л.Ш. Дуплева, А.И. Яруллин. - Заявлено 27.08. 2010; опубликовано 10.09.2012; БИ № 25. - С. 20.

19. Патент РФ №2488117. «Иммуноферментная тест-система ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, М.А. Ефимова, Л. Ш. Дуплева, О.В. Москвичев. — Заявлено 04.10.2011; опубликовано 20.07.2013; БИ№ 20. - С. 18.

Монография

20. Гаффаров, Х.З. Решение проблемы защиты новорожденных телят и поросят от инфекционной диареи смешанной этиологии / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, Г.Н. Спиридонов, М.А. Ефимова. Слагаемые эффективного агробизнеса: обобщение опыта и рекомендации. Часть II Кормопроизводство и животноводство. - Казань.: Фолиант. - 2006. - С. 223 - 229.

Статьи в других периодических изданиях, в материалах конференций и сборниках научных трудов

21. Яруллин, А.И. Иммунобиологические свойства парвовируса крупного рогатого скота и методы серологической диагностики данного заболевания / А.И. Яруллин, М.А. Ефимова // Матер, научно-практич. конф. молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии». — Казань, 2007. -С. 145 -146.

22. Ефимова, М.А. Выявление и количественное определение антител к парвовирусу крупного рогатого скота в сыворотке крови тест-системой ИФА / М.А. Ефимова, А.И. Яруллин, Х.З. Гаффаров и др. // Труды Междунар. научно-практич. конф., посвящ. 50-летию ВНИИВВиМ «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными инфекционными болезнями животных». - Покров, 2008. - С. 132 - 134.

23. Ефимова, М.А. Антигенная активность вирусных компонентов ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота / М.А. Ефимова, Х.З. Гаффаров, Л.Ш. Дуплева и др. // Матер. Междунар. научно-практич. конф. «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность России», Казань, 2010. - С. 373 - 376.

24. Москвичев, О.В. Патоморфология реовирусной типа I инфекции у лабораторных животных / О.В. Москвичев, М.А. Ефимова, Х.З. Гаффаров // Матер. Междунар. научно-практич. конф. «Биотехнология: токсикологическая,

радиационная и биологическая безопасность России», Казань, 2010. - Казань, 2010.-С. 429-433.

25. Ефимова, М.А. Технологические аспекты создания ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота / М.А. Ефимова, A.B. Иванов, Х.З. Гаффаров и др. // Матер. XII Междунар. научно-практич. конф. «Экологически безопасные нанотехнологии в промышленности» 30 ноября - 2 декабря 2011, Казань, 2011. - С. 333 - 336.

26. Ефимова, М.А. Подбор чувствительной культуры клеток для репродукции реовируса типа I / М.А. Ефимова // М^жвгдочий тематичний нау-ковий збфник «Ветеринарна медицина», Харив, 2013. - випуск 97. - С. 520-521.

27. Ефимова, М.А. Иммунологическая диагностика парвовирусной инфекции крупного рогатого скота / М.А. Ефимова, Х.З. Гаффаров, А.И. Яруллин, JI.I1I. Дуплева // Матер. Междунар. научно-практич. конф. «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве», Саратов: КУБиК, 2013. - С. 53 - 54.

28. Гаффаров, Х.З. Тест-системы ИФА для серологической диагностики вирусных инфекций / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, М.А. Ефимова и др. // Матер. Междунар. научно-практич. конф. «Биотехнология и качество жизни» 18-20 марта 2014, Москва, 2014. - С. 283 - 284.

29. Eflmova, М. Bovine parvovirus: preparation of antigen and its diagnostic significance / M. Efimova, K. Gaffarov, A. Yarullin et al. // BioTech 2014 & 6th Czech-Swiss Symposium with Exhibition. Prague, June 11-14, Book of Abstracts: Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republic. - 2014. - P. 108 - 109.

Формат 60x84 1/16. Печл. 2,5

Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ № 628/07

Отпечатано в авторской редакции в типографии ООО «Печать-Сервис-XXI вех» 420073, г. Казань, ул. А. Кутуя, д. 88 (843) 295-14-48,260-88-09 E-mail: Gulaprint@mail.ru

Информация о работе

Ефимова, Марина Анатольевна
доктора биологических наук
Казань, 2014
ВАК 06.02.02

Автореферат

Разработка ассоциированной вакцины и иммуноферментных тест-систем на основе антигенов парво-, рео-, герпесвирусов и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота - тема автореферата по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы