Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Антигенные свойства вируса парагриппа-3 в составе ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Антигенные свойства вируса парагриппа-3 в составе ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят"

На правах рукописи

ДАРЬЮШ БЕХЗЛДПУР НАСРОЛЛАХ

Антигенные свойства вируса парагриппа-3 в составе ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят

06.02.02. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

5 ДЕК 2013

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва-2013 005542446

005542446

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Белоусова Раиса Васильевна

Официальные оппоненты: Юров Константин Павлович - доктор

ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко», лаборатория вирусологии, заведующий

Сухарев Олег Иванович - доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов, кафедра клинической ветеринарии, профессор

Ведущая организация: государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП)

Защита состоится «¿6у> _ _ 201^ г. в/££2часов на заседании

диссертационного совета Д 220.042.01 в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий имени К.И. Скрябина» (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23), тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан » 201^года

Ученый секретарь

диссертационного совета, профессор

Т.Н. Грязнева

На правах рукописи

ДАРЫОШ БЕХЗАДПУР НАСРОЛЛАХ

Антигенные свойства вируса парагриппа-3 в составе ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят

06.02.02. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва-2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Белоусова Раиса Васильевна

Официальные оппоненты: Юров Константин Павлович - доктор

ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко», лаборатория вирусологии, заведующий

Сухарев Олег Иванович - доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов, кафедра клинической ветеринарии, профессор

Ведущая организация: государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП)

Защита состоится «_»_201_ г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 220.042.01 в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий имени К.И. Скрябина» (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23), тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан «_»_201_года

Ученый секретарь

диссертационного совета, профессор

Т.Н. Грязнева

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Среди болезней крупного рогатого скота пневмоэнте-риты наносят огромный экономический ущерб животноводству. Борьба с этими болезнями затруднена, по причине их полиэтиологичпости. Возбудителями таких инфекций являются вирусы, относящиеся к различным семействам: вирус парагриппа-3 (ГТГ-3), вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирус диареи -болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусы, рота- и коронавирусы и другие. Кроме того в этой патологии активную роль играют предрасполагающие и осложняющие факторы: условно-патогенная микрофлора, стрессовые ситуации и экологическое состояние внешней среды (Л.Я. Самуйленко и др., 2006, П.А. Кра-сочко, 2008 и др.).

Величина экономического ущерба, складывающаяся из падежа телят, снижения мясной и молочной продуктивности, выбраковки животных, абортов, бесплодия, огромна, а терапевтические меры борьбы с уже возникшим заболеванием малоэффективны. Поэтому в комплексе противоэпизоотических мероприятий при этих инфекциях ведущее место занимает специфическая профилактика.

ПГ-3 крупного рогатого скота — острая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания. В естественных условиях вирус ПГ-3 вызывает заболевание, поражая до 90-100% животных, обуславливая в 20-25% случаев вспышки респираторных болезней (В.Н. Сюрин, 1998). Для профилактики ПГ-3 используются в основном живые вакцины, так как инактивированиые вакцины обладают слабой иммуногенностыо.

В арсенале биологической промышленности имеется большое количество препаратов, предназначенных для специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний телят, однако, ассоциированных вакцин против гшевмоэнтеритов телят недостаточно. Конструирование этих препаратов из различных антигенов является сложной задачей и предполагает получение вакцин, обладающих высокими антигенными и иммуногенными свойствами к каждому из компонентов. Учитывая широкое распространение вируса ПГ-3 КРС, включение его в состав ассоциированной вакцины актуально.

Цель и задачи исследований Цель работы. Изучение антигенных свойств вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в составе ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят. Для достижения поставленной цели надо было решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность различных перевиваемых линий клеток к вирусу ПГ-3 крупного рогатого скота и определить режим их культивирования.

2. Определить оптимальные условия инфицирования клеток вирусом ПГ-3 крупного рогатого скота.

3. Разработать технологию изготовления инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота.

4. Изучить антигенные свойства инактивированной концентрированной вакцины против Г1Г-3 крупного рогатого скота на крысах.

5. Изучить антигенную активность экспериментальных образцов ассоциированных вакцин при разных соотношениях монокомпонентов на крысах.

6. Определить срок хранения вакцин.

Научная новизна работы

1. Определены наиболее чувствительные перевиваемые линии клеток к вирусу ПГ-3 - ПТ-80 и Т-1.

2. Отработаны оптимальные параметры культивирования вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в перевиваемых культурах клеток. Посевная концентрация 250000 клеток/мл. Инфекционная доза вируса 0,1 ТЦД50/кл.

3. Предложена модифицированная методика получения концентрированного антигена вируса ПГ-3 крупного рогатого скота: концентрация антигена ПЭГ (8 %) с последующей обработкой ультразвуком и Твин-эфиром.

4. Изучена антигенная активность вирусного антигена ПГ-3 крупного рогатого скота с разными адъювантами. Установлено, что наиболее выраженными адыо-вантными свойствами обладает гидрооксид алюминия в 1,5% концентрации.

5. Разработана инактивированная концентрированная вакцина против ПГ-3 крупного рогатого скота.

6. Изучена антигенная активность антигена вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в составе ассоциированных ииактивированных концентрированных вакцин против вирусных пневмоэнгеритов телят.

Практическая значимость работы

Показана высокая антигенная активность и безвредность экспериментальных образцов моновакцины против ПГ-З крупного рогатого скота и ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят.

Результаты исследований вошли в нормативную техническую документацию: временная инструкция по изготовлению и контролю инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота, стандарт организации изготовления и контроля инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота, инструкция по применению инактивированной концентрированной вакцины против Г1Г-3 крупного рогатого скота.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по создаиию ассоциированных вакцин против вирусных пневмоэитеритов телят, механизмов и закономерностей формирования поствакцинального противовирусного иммунитета у крупного рогатого скота (КРС).

Полученные результаты используются в учебном процессе по дисциплине «Вирусология и биотехнология» для студентов ветеринарного и ветеринарно-биологического факультетов ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции «Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (2011); на шестой Иранской конференции по вирусологии (2012);_на отчетном заседании методической комиссии МГАВМиБ (2011, 2012), на Международной научно-практической конференции (г.Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, в т.ч. 4 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 96 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных

выводов, приложения. Список использованной литературы включает 101 источник. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 11 таблицами.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В выполнении отдельных этапов, связанных с культивированием, концентрированием вирусов и изготовлении экспериментальных образцов вакцин принимали участие к.б.н. Т.П. Лобова, доценты И.В. Третьякова, В.Е. Брылина, научный сотрудник Н.В. Тиганова, которым выражаем глубокую благодарность.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту

1. Результаты исследований по определению чувствительности перевиваемых линий клеток к вирусу Г1Г-3 крупного рогатого скота и оптимальных условий их инфицирования вирусом.

2. Технология концентрирования вируса ПГ-3 крупного рогатого скота и подбор адъювантов.

3. Условия приготовления экспериментальных серий моновакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота и ассоциированных вакцин и результаты изучения их антигенных свойств.

Собственные исследования Работа выполнена в период с 2009 по 2012 гг. на кафедре ветеринарной вирусологии ФГЮУ ВПО МГАВМиБ.

Материалы и методы исследовании В работе использовали вирус ПГ-3 КРС штамм «ЗКСМ», аденовирус Воуше-10, вирус диареи КРС штамм С^оп, вирус инфекционного ринотрахеита штамм 4016 .

Для культивирования вирусов использовали перевиваемые культуры клеток: - 1ТГ-80 - почка теленка, Таурус (Т-1) - почка теленка, ЛЭК - легкое эмбриона коровы, КСТ - клетки коронарных сосудов теленка. Культуры клеток получали на кафедре ветеринарной вирусологии им. В.Н. Сюрина.

Питательные среды и растворы: среда 199, среда Игла с двойным набором аминокислот, фетальная сыворотка крупного рогатого скота, 0,02% раствор вер-сена, химопсин, антибиотики.

Животные: белые крысы массой 280-300 г, белые мыши массой 18-20 г.

Матрасы культуральные емкостью от 50 до 1500 мл, 96-луночные планшеты.

Поддерживание перевиваемых клеток проводили путем периодических пассажей, использовали бесцентрифужный метод.

Вирусы титровали микрометодом на соответствующих видах культурах клеток по общепринятой методике.

Инактивацию культурального вируса проводили 40-%-ным раствором формалина в конечной концентрации 0,2 % при температуре 37°С в течение 72 часов при постоянном перемешивании. Полноту инактивации вирусов оценивали путём проведения трёх слепых пассажей на культуре клеток ПТ-80.

Для концентрирования вирусов использовали полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 Д (ПЭГ-6000). В качестве адыовантов применяли: гидроокись алюминия (ГЩБК), 1,0 % р-р глутамата хитозана (НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова), масло (ланолин и минеральное масло) (ВНИИЗЖ).

Экспериментальные образцы биопрепаратов проверяли на стерильность и безвредность общепринятыми методами.

Изучение антигенной активности вакцин проводили на белых крысах. Определение титра антител в сыворотке крови животных проводили в реакции нейтрализации (РН) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Оценку Т-клеточного иммунитета проводили в реакции торможения миграции лейкоцитов (PTMJ1) в модификации Дегтярева В.П., МакарянЭ.А. (2009) с неспецифическим митогеном 1\оА в концентрации 40 мкг/мл.

Математическую обработку результатов проводили с использованием программы для работы с электронными таблицами Microsoft Excel.

Результаты исследований Изучение чувствительности различных перевиваемых лнний клеток к вирусу ПГ-3 КРС и режима их культивирования

Основываясь на данных литературы, для определения чувствительности клеток к вирусу ПГ-3 КРС были выбраны перевиваемые культуры клеток ПТ-80, Т-1, ЛЭК и 1ССТ.

Результаты проведенных исследований показали, что культуры клеток формируют полный монослой при посевной концентрации 1 млн., 500 тыс., 250 тыс.

и 125 тыс. кл/мл: ПТ-80 - через 24. 24, 48 и 72 ч; КСТ - через 24, 24, 72 и 96 ч; ЛЭК - через 24, 24, 48 и 120 ч; и Т-1 - через 24, 72, 72 и 120 ч (соответственно).

Таким образом, установлено, что для исследуемых перевиваемых клеток (ПТ-80, КСТ, ЛЭК, Т-1) оптимальная посевная концентрация клеток 250 тыс. кл/мл, которая обеспечивает формирование полного монослоя в пределах 48-72 ч.

Вирус ПГ-3 ранее репродуцировали в первичных культурах клеток почки эмбриона коровы. Адаптация вируса ПГ-3 к перевиваемым линиям клеток показала, что на первых пассажах (до 3-х) вирус вызывал ЦПД только в клетках ПТ-80, ЛЭК и Т-1, инфекционный титр находился в пределах 4,0; 3,5, и 4,5 lg ТЦЦ50/МЛ, соответственно. Затем наиболее активная репродукция вируса была отмечена в культуре клеток ПТ-80 и Т-1. Разница в инфекционной активности вируса с 10-го пассажа составляла от 0,5 до 1,5 lg2 ТЦЦ5о/мл. Культура клеток КСТ оказалась не чувствительна к вирусу ПГ-3.

Титр вируса ПГ-3 на 16 пассаже в культурах клеток ПТ-80, ЛЭК и Т-1 был 6,25, 4,0 и 6,25 lg ТЦЦ50/мл, соответственно. Таким образом, наиболее эффективной для культивирования вируса ПГ-3 при изготовлении вакцин является перевиваемая культура клеток ПТ-80, так как она на двое суток раньше формирует монослой и менее прихотлива при её культивировании.

В результате проведенных исследований подобраны условия размножения вируса ПГ-3. Это позволяет решить один из самых насущных вопросов современной биотехнологии - отказаться от использования первичных культур клеток в вакцинологии и перейти на применение более доступного безопасного и стандартного биологического субстрата, которым являются стабильные перевиваемые линии клеток.

Определение оптимальных доз инфицирования клеток вирусом ПГ-3 КРС

Свежеприготовленные для посева суспензии клеток и сформировавшийся монослой клеток ПТ-80, Т-1 и ЛЭК инфицировали вирусом в дозах 0,1; 0,01; 0,001 ТЦД5о/кл. Культивирование вируса осуществляли в стационарном (в пластиковых культуральных флаконах) монослое клеток. Установлено, что при множественном заражении 0,1 и 0,01 ТЦЦ50/кл. в суспензии клеток максимальное наполнение вируса происходило на вторые сутки культивирования в ПТ-80

и Т-1 (титр вируса 5,5 - 5,25 и 6,0-5,75 ^ ТЦД50/мл, соответственно) и на 4-7 сутки в ЛЭК (титр 4,0-3,5 ^ ТЦД50/мл). Снижение дозы заражения до 0,001 ТЦДзс/кл. приводило к увеличению срока культивирования вируса от 3-х и 9 суток и к снижению тира вируса на 0,25 - 1,0 ^ ТЦДя/мл.

Максимальное накопление вируса в монослойных культурах при заражающих дозах 0,1 и 0,01 ТЩЬо/кл отмечено на 3-4 сутки в ПТ-80 и Т-1, на 6-9 сутки в ЛЭК. Инфекционная активность составляла 5,5-5,0; 6,0-5,0 и 4,0-3,25 ^ ТЦЦ50/МЛ,соответственно. При дозе заражения 0,001 ТЦЦ50/КЛ титр вируса снижался в культурах до 4,0; 5,0 и 2,0 ^ ТЦЦзо/мл (ЛЭК).

Результаты полученных данных позволяют сделать вывод, что наилучшее накопление вируса ПГ-3 КРС происходит в культурах клеток ПТ-80 и Т-1 при заражающей дозе 0,1 ТЦД5(,/кл. в течение 2 и 3 суток после инфицирования клеточных культур в суспензию и монослой (соответственно).

В дальнейшем в своих исследованиях использовали культуру клеток ПТ-80.

Отработка оптимальных условий инактивации вируса ПГ-3 КРС

В качестве инактиванта вируса использовали 40%-ный раствор формалина в конечной концентрации 0,1%, 0,2% и 0,3%. Полноту инактивации оценивали на культуре клеток ПТ-80 путем проведения трех слепых пассажей. Результаты опытов позволили сделать заключение, что для инактивации вируса ПГ-3 КРС концентрация формалина 0,1% недостаточна. При концентрации формалина 0,2% и 0,3% достигалась полная инактивация, в культуре клеток на протяжении трех пассажей не было зарегистрировано цитопатического действия вируса.

Антигенную активность инактивированного препарата определяли на 20 белых крысах. Кровь брали на 30 день после первого введения препаратов.

Титр нейтрализующих антител к вирусу ПГ-3 при концентрации формалина 0,3% был меньше, чем при концентрации 0,2% на 0,3 1о{>2 и на 0,4 в РТГА.

Разница в титрах антител к вирусу ПГ-3 КРС при использовании формалина в конечной концентрации, равной 0,3% и 0,2%, была незначительна, что позволило в дальнейшем для приготовления вакцинных препаратов использовать наименьшую концентрацию формалина, равную 0,2%.

Получение концентрированных вирусных антигенов и изучение их антигенных свойств

Инактивированный вируссодержащий материал концентрировали двумя способами: 1) осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ) и 2) осаждением ПЭГ и дополнительно обрабатывали твин-эфиром.

Культуральную инактивированную вируссодержащую жидкость разделили на 3 части. Первую часть оставили для приготовления культуральной вакцины, вторую концентрировали в 10 раз осаждением ПЭГ, третью часть концентрировали ПЭГ в 5 раз. Затем часть материала концентрированного в 10 и 5 раз дополнительно обрабатывали твин-эфиром и получали по две фракции антигена.

В предварительных опытах антигенную активность экспериментальных образцов инактивированного вируса ПГ-3, содержащих разную концентрацию гидрат окиси алюминию (ГОА) - 3, 2 и 1,5 %, изучали по уровню антител в сыворотках крови крыс в реакции нейтрализации. В результате установлена оптимальная концентрация ГОА, равная 1,5 %.

Антигенную активность семи полученных образцов вакцины испытывали на 65 белых крысах, которых разделили на 12 групп (по 5 голов в каждой). Животным 1-й и 2-й группы вводили культуральную вакцину в дозах 1,0 мл и 0,1 мл, животным 3-ей и 4-й группы вводили концентрированную ПЭГ вакцину в 10 раз в дозах 0,1 и 0,2 мл, животным 5-й, 6-й и 7-й группы вводили концентрированную ПЭГ вакцину в 10 раз и дополнительно обработанную твин-эфиром в дозах 0,1 мл и 0,2 мл. Животным 8-й и 9-й группы вводили концентрированную ПЭГ вакцину в 5 раз в дозах 0,1 мл и 0,2 мл; животным 10-й, 11-й и 12-й группы вводили концентрированную ПЭГ вакцину в 5 раз и дополнительно обработанную твин-эфиром в дозах 0,1 мл и 0,2 мл.

Препараты вводили дважды с интервалом 14 дней, кровь брали через 30 дней после начала вакцинации, сыворотки исследовали в РН и РТГА. Результаты исследований в таблице №1.

Результаты исследований показали, что вакцина, приготовленная из культу-рального антигена вируса ПГ-3 КРС, индуцировала низкий уровень антител при дозе 1,0 мл. Титр антител в РН - 4,33 и РТГА - 3,8 \og2- Антигенная актив-

ность концентрированных вакцин в 10 раз и 5 раз была достаточно высокой, титр антител был в пределах 7,6 - 8,8 log2 в РН, 7,0 - 11,2 log2 в РТГА и 6,2 - 8,8 log2 в РН, 9,0 - 11,2 log2 в РТГА соответственно.

Уровень антител у животных, иммунизированных концентрированными вакцинами в 10 раз и 5 раз, отличался незначительно (на 0,6 log2 в PI1). Разница в титрах антител при введении вакцин в дозах 0,1 мл и 0,2 мл составляла 0,2 - 0,6 log2 в РН.

Дополнительная обработка концентрированного ПЭГ антигена твин-эфиром не показала значительного повышения уровня антител в РН (разница в пределах 0,2 - 0.6 log2). Однако отмечена значительная разница в титрах антител в РТГА (до 2,0 log2). Антигенная активность вакцин, приготовленных из концентрированных антигенов 10 и 5 раз и обработанных твин-эфиром из первых фракций, была выше, чем из вторых фракций на 1,0 - 1,6 log2 в РН, и на 2,1 и 4,0 log2 в РТГА (соответственно).

Таким образом, концентрированные в 10 и 5 раз вакцины, введенные в дозах 0,1 мл и 0,2 мл, показали высокую антигенную активность, и титры антител отличались незначительно.

Дальнейшие опыты по изготовлению и испытанию экспериментальных серий ассоциированных вакцин против ПГ-3, вирусной диареи, инфек-циониого ринотрахеита и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота подтверждали, что для вирусного антигена ПГ-3 пятикратная концентрация наиболее оптимальная. Результаты представлены в таблице №1.

Таблица №1

Суммарные данные антигенной активности вирусного антигена ПГ-3 при

разных концентрациях

Концентрация антигена Кол-во опытов Кол-во животных Доза (мл) Титр антител в РН в log2 (р<0,002)

В 10 раз 6 37 0,1 6,4±1,57

37 0,2 6,85±1,32

В 5 раз 5 51 0,1 6,72±0,35

51 0,2 7,64±1,85

Из таблицы №1 видно, что титры антител в реакции нейтрализации у крыс, вакцинированных вакцинами, содержащие вирусный антиген ПГ-3, концентрированный в 10 раз и 5 раз колебался незначительно 6,4 и 6,85 log2 (разница составила 0,3 и 0,86 log:) соответственно. Однако наивысшей антигенной активностью обладала вакцина, содержащая вирусный антиген ПГ-3 концентрированный в 5 раз при дозах введения 0,2 мл, титр антител был выше на 0,8 log2.

Следовательно, для изготовления вакцины целесообразно применение 5-ти кратное концентрирование ПЭГ вирусного антигена, оно с точки зрения эффективности и экономичности является наиболее оптимальным.

При выборе способа концентрирования вакцинных препаратов были учтены следующие показатели: сохранность антигенной активности концентрированных препаратов, технологичности в применении, экономичности, а также тот факт, что ПЭГ применяется на биофабриках для концентрирования вирусов при изготовлении вакцин, а дополнительная обработка твин-эфиром лучше использовать в процессе приготовления диагностических препаратов. Поэтому в дальнейшей работе для концентрированного вирусного антигена в процессе конструирования вакцин мы использовали полиэтиленгликоль.

Подбор адъювантов для изготовления инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 КРС

Для повышения иммуногенности вакцин предложено добавлять адъюванты. Для вакцин, применяемых в ветеринарной практике, важно не только высокая иммуногенность, но и низкая стоимость препаратов.

Перспективными адыовантами для вакцин могут быть препараты на основе хитозана. Ранее было показано повышение иммуногенности и защитной эффективности при добавлении препаратов на основе хитозана к гриппозным и по-лиомиелитным вакцинам (Ю.Васильев, 2010; Ю. Гендон, 2010, 2011).

Следующим этапом нашей работы было изучение антигенной активности экспериментальных образцов вакцины, содержащих различные адъюванты.

В опыте для сравнения использовгиш три адъюванта: гидрат окиси алюминия - ГОА хитозан, масляной адъювант. Работу проводили па 35 белых крысах, которых разделили на 7 групп (по 5 голов в каждой). Кровь от привитых крыс

брали через 30 дней после первой вакцинации. Антигенную активность препаратов определяли по уровню гуморальных антител в РН и РТГА. Оценку Т-клеточного иммунитета проводили в РТМЛ. Результаты изучения антигенной активности образцов вакцин содержащих разные адъюванты в таблице №2.

Таблица №2

Сравнительная антигенная активность образцов вакцины с разными адыовантамн

Вакцина №№ груп -пы Доза, мл Титр антител, (р<0,001) Индекс миграции лейкоцитов (ИМЛ)

РН РТГА

Вакцина с адъю-вантом ГОА 1 0,1 9,8±0,32 8,6±0,48 0,53±0,04

2 0,2 10,2±0,32 10±0,48 0,35±0.02

Вакцина с адыовантом хитозан 3 0,1 7,6±0,48 9,4±1,12 0,95±0,52

4 0,2 10.6±0,48 9,6±0,48 0,74±0,37

Вакцина с масляным адъювантом 5 0,1 7,0±0,40 7,5±0,48 Н/иссл.

б 0.2 8,2±0,64 9,0±0,41 Н/иссл.

Контроль — культу ральная жидкость 7 0,2 <1,0 < 1,0 1,3±0,10

Как видно из таблицы № 2, у крыс всех групп обнаруживали высокий уровень антител к вирусу ПГ-3 КРС. Разница в титрах антител при дозе введения 0.2 мл у вакцин, содержащих ГОА и хитозан, была не значительна (в пределах 0,4 1ой как в РН, так и РТГА), а крыс, привитых вакциной с масляным адыовантом, уровень антител был ниже на 2,0 1о§з в РН. Кроме того необходимо отметить, что вакцина, содержащая адъювант ГОА обеспечивала высокую клеточную активность (индекс миграции лейкоцитов — 0,35+0,22 и 0,53+0,04), у вакцины с хитозаном индекс миграции лейкоцитов низкий (0,74+0,37 и 0,95+0,52).

Таким образом, наиболее эффективным для изготовления вакцины является адъювант ГОА при дозе введения препарата 0,2 мл.

Изготовление экспериментальных серии моио- и ассоциированных вакцин и сравнение их антигенных свойств Целью этого этапа работы было изучение антигеиной активности моновакцины против ПГ-3 и антигенных свойств вирусного антигена ПГ-3 в ассоциации с антигенами вируса диареи, инфекционного ринотрахеита и аденовируса КРС.

Таблица №3

Антигенная активность моно- н ассоциированных вакцин

Вакцина № группы Общий объем вакцины, мл Доза антигена вируса ПГ-3 в вакцине, мл Титр антител в РН, 1одг

ПГ-3 р<0,001 ВД р<0,001 ИРТ р<0,001 Адено р<0,001

Моно против ПГ-3 1 0,1 0,1 5,5±0,80 - - -

2 0,2 0,2 6,5±0,71 - - -

Моно против ВД 3 0,1 0,1 - 5,1±0,50 - -

4 0,2 0,2 - 6,5±0,71 - -

Монопро-тив ИРТ 5 0,1 0,1 - - 3,5±0,55 -

6 0.2 0,2 - - 3,8±0,58 -

Моно против Адено 7 0,1 0,1 - - - 8,2±0,81

8 0,2 0,2 - - - 8,6±0,50

Би (ПГ-3 +ВД) 9 0,4 0,2 6,8±0,32 5,5±0,80 - -

Би (ПГ-3+ИРТ) 10 0,4 0,2 6,5±9,8 - 3,0±0,58 -

Би (ПГ-3 +Адено) 11 0,4 0,2 5,8±0,71 - - 8,4±0,74

Три (ПГ-3+ВД+ИРТ) 12 0,6 0,2 7,5±0,75 7,0±0,50 5,0±0,84 -

Тетра (ПГ-3+ВД+ИРТ +Адено) 13 0,4 0,1 5,8±0,58 6,4±0,84 4,0±0,50 8,4±0,74

14 0,8 0,2 6,6±0,25 8,6±0,25 5,2±0,98 8,8±0,38

Комбинированная вирус-бактериальная 15 0,4 0,1 4,5±0,17 6,2±0,58 3,2±0,75 7,4±0,50

16 0,8 0,2 5,6±0,38 8,2±0,98 4,4±0,58 8,0±0,17

Контроль (культу-ральная жидкость +ГОА) 17 1,0 0,2 <1 <1 <1 <1

Вируссодержащую культурную жидкость вируса ПГ-3 КРС инактивировапи

формалином в конечной концентрации 0,2%, затем концентрировали ПЭГ в 5 раз и добавляли адъювант-ГОА в конечной концентрации 1,5 %. По соответствующим методикам изготовили моновакцину против ВД, ИРТ, аденовирусной инфекции. Полученные серии экспериментальных моновакцин проверили на

стерильность (методом посева на питательные среды МПА, МПБ, МППБ и Са-буро) и на безвредность на мышах, срок наблюдения в течение 10 дней.

Антигенную активность экспериментальных серий вакцины проверяли на 75 белых крысах, которые были разделены на 17 групп (по 5 голов в каждой). Препараты животным вводили дважды с интервалом 14 дней. Кровь брали тотально всех крыс через 30 дней после начала вакцинации, сыворотки исследовали в РН.

Результаты, приведенные в таблице №3, показали, что антигенная активность ассоциированных вакцин против ПГ-3, ВД, ИРТ и аденовирусной инфекции и моновакцины против ПГ-3 при одинаковых дозах (0,2 мл) введения достоверно не различалась. В составе ассоциированной тривакцииы (ПГ-З+ВД+ИРТ) титр антител к ПГ-3 был выше на 1,0 1ой, в составе тетровакцины (ПГ-3+ВД+ИРТ+Адено) на 0,1 а в комбинированной вакцине титр антител был на 0,9 1о^2 ниже. Следует отметить, что и другие компоненты в составе ассоциированных вакцин (ВД, ИРТ, Адено) также индуцировали в организме животных высокий уровень антител.

При испытании вирус-бактериальной вакцины, было установлено, что уровень антител к вирусам ПГ-3 был ниже на 0,9 1о§2; к Аденовирусу на 0,6 \og2~, в то же время к вирусу ИРТ и ВД был выше на 0,6 1о&г и 1,7 1о£2, соответственно. При проверке па кроликах бактериальных антигенов в составе комбинированной вакцины установлено: иммуногенная активность пастереллезного антигена составила 90 %; титры антител к некробактериозному антигену, определенные в РГА, были не менее 1:600 у всех подопытных животных. Результаты исследований показали, что входящие в состав ассоциированной вакцины пастереллезный и некробактериозный антигены не проявляют как конкурентного, так и синер-гического действия друг на друга.

Одновременно выборочно было исследовано влияние вакцин на Т-клеточный иммунитет в опытах на белых мышах в реакции торможения миграции лейкоцитов. Опыты показали, что ИМЛ на введение вирусных моновакцин (0,54±0,16; 0,52±0,13; 0,45±0,09) указывали на средний уровень специфической клеточно-опосредованной реакции организма. При этом моновакцина против ПГ-3 в большей степени вызывала активацию Т-клеточного иммунитета

(0,45±0,09). Ассоциированная вирусная вакцина обеспечивала практически такой же средний уровень ИМЛ (0,50±0,04), что особенно важно для развития полноценного противовирусного иммунитета. Полученные данные могут свидетельствовать об отсутствии взаимного угнетающего эффекта вирусных антигенов в ассоциированной вакцине.

Отработка соотношения монокомпонента антигена ПГ-3 в ассоциированной вакцине Следующей задачей наших исследований являлось определить наиболее оптимальное соотношение вирусных антигенов ПГ-3, ВД, Адено и ИРТ в ассоциированной вакцине.

Для этой цели были изготовлены экспериментальные образцы моновакцин по соответствующим методикам, затем объединяли их в разных пропорциях. В работе использовали три образца ассоциированной вакцины.

Таблица №4

Антигенная активность ассоциированной вакцины

№ образца Вакцина Доза (мл) Содержание в вакцине антигена вируса ПГ-3 (мл) Кол-во животных Титр антител в

В РН В РТГА

ВД р<0,001 Адено р<0,001 ИРТ р<0,001 ПГ-3 р<0,001 ПГ-3 р<0,001

1 Ассоциированная концентрированная инактивированная 1,0 0,1 14 6,1±1,09 7,9±1,28 4,9±0,32 6,9±1,2 8,3±1,04

2 1,0 0,2 14 8,7±0,50 9,0±0,6 5,3±0,69 8,5±1,2 9,0±0,67

3 1,0 0,25 14 8,7±0,68 9,1±0,63 6,3±1,32 8,6±0,98 9,5±1,06

Контроль 1,0 - 6 <1 <1 <1 <1 <1

Результаты исследования показали (см. таблицу №4), что все образцы вакцин индуцировали в организме крыс высокий уровень антител к четырем вирусным антигенам. Титры антител в РН находились в пределах: к ВД - 6,1 и 8,7 к Адено - 7,9 и 9,1 к вирусу ИРТ - 4,9 и 6,3 1о&; к вирусу ПГ-3 - 6,9 и 8,6 1о§2* В РТГА уровень антител к вирусу ПГ-3 был высоким - от 8,3 до 9,5 \ag2-

Титры антител у крыс, вакцинированных образцом № 2 и № 3, практически не различались (в пределе 0,1 1о§2), хотя к вирусу ИРТ титр был ниже на 1,0 ^2 при использовании образца № 2.

Таким образом, образец № 3 содержит оптимальное соотношение всех четырех монокомпонентов в ассоциированной вакцине и обеспечивает гуморальный иммунитет к ПГ-3, ИРТ, ВД и аденоинфекции на достаточно высоком уровне.

Антигенный свойства ассоциированной вакцины против ПГ-3, ВД, ИРТ, аденоинфекции КРС и моновакципы против ПГ-3 КРС проверяли на крысах после экспозиции препаратов при температуре 4°С в течение 18 месяцев. Результаты показали, что антигенная активность ассоциированных вакцин в процессе хранения оставалась па исходном уровне, а моновакцина против ПГ-3 снижала активность незначительно (на 0,6 в РН).

Выводы

1. Для перевиваемых линий клеток ПТ-80, КСТ, ЛЭК и Т-1 оптимальная посевная концентрация клеток составляет 250 тыс. клеток в 1,0 мл, которая обеспечивает формирование полного монослоя в пределах 48-72 часов.

2. Максимальное накопление вируса ПГ-3 КРС происходит в культурах клеток ПТ-80 и Т-1. Вирус к 16-ому пассажу в этих культурах имел стабильно титр 6,25 ТЦД50/мл. Инфекционная активность вируса в культуре клеток ЛЭК была ниже в 100 и более раз (титр вируса 4,0 ТЦД50/мл). Для изготовления вакцины целесообразнее использовать культуру клеток ПТ-80.

3. Наилучшее накопление вируса ПГ-3 КРС происходит в культурах клеток ПТ-80 при заражающей дозе 0,1 ТГЬо/кл в течение 2-4 суток после инфицирования клеточных культур в суспензию и монослой (соответственно).

4. Формалин в конечной концентрации, равной 0,2 % является оптимальным инактивантом для вируса ПГ-3 КРС при экспозиции 72 часа и температуре 37°С с концентрацией адыованта ГОА - 1,5%.

5. Способ концентрирования вируса ПГ-3 КРС в 5 раз ПЭГ (молекулярной массой 6000 в конечной концентрации равной 8 %) является оптимальным для получения вирусного антигена с высокой антигенной активностью.

6. Разработанная инактивироваиная концентрированная вакцина против ПГ-3 крупного рогатого скота в опытах на лабораторных животных оказалась безвредной, обладающей выраженной антигенной активностью в течение 18 месяцев (срок наблюдения), индуцируя синтез вируснейтрализующих антител у лабораторных животных в титре от 6,5 до 8,6 \og2-

7. Концентрированная ассоциированная вакцина против ПГ-3, вирусной диареи, инфекционного ринотрахеита и аденовирусной инфекции индуцировала синтез вируснейтрализующих антител у лабораторных животных в высоком титре: к вирусу ПГ-3 6,8 - 6,9 1о£2; к ВД 6,1- 8,7 к ИРТ 4,9 - 6,3 1о£2; к аденовирусу 7,9- 9,1 и в течение 18 месяцев сохраняла антигенную активность (срок наблюдения).

Практическое использование полученных научных результатов

Разработан проект нормативной документации на вакцину: «Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины инактивированной концентрированной против парагриппа-3 крупного рогатого скота», «Стандарт организации (СТО) вакцины инактивированной концентрированной против парагриппа-3 крупного рогатого скота», «Инструкция по применению вакцины инактивированной концентрированной против парагрипп-3 крупного рогатого скота», утвержденный ректором ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Результаты исследований используются в учебном процессе в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ по дисциплине «Ветеринарная вирусология».

Рекомендации по использованию научных выводов

1. После проведения широкомасштабных испытаний ассоциированная инак-тивированная концентрированная вакцина против ПГ-3, ИРТ, ВД и аденовирусной инфекции КРС рекомендуется для применения в скотоводстве.

2. Полученные результаты по концентрированию вирусов рекомендуются для использования в высших учебных заведениях по курсу дисциплин: вирусология, биотехнология и молекулярная биология вирусов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Рябнин, Н.С. Парагрипп крупного рогатого скота: эпизоотологическая ситуация и специфическая профилактика / Рябнин Н.С., Бехзадпур Дарьюш,

Третьякова И.В. // Вопросы ветеринарии ветеринарной биологии: Сб. науч.тр. ФГОУ ВПО МГАВМиБ. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ. - 2011. - С. 174-177.

2. Иммунологический мониторинг комбинированной и ассоциированной вакцин и их монокомпонентов / Брылина В.Е.,Третьякова И.В., Пе-рмякова К.С., Бехзадпур Д.//Ветеринарная медицина. - 2011.- № 3 - 4,- С. 42-45.

3. Бехзадпур, Д. Культивирование перевиваемых линий клеток животного происхождения / Бехзадпур Д., Белоусова Р.В. // Ветеринарная медицина. -

2012.-№ 1,-С. 33-34.

4. Бехзадпур, Д. Чувствительность перевиваемых культур клеток к вирусу ПГ-3 крупного рогатого скота / Бехзадпур Д., Белоусова Р.В. // Ветеринарная медицина. - 2012. - № 2. - С. 38-39.

5. Сравнительное исследование антигенной активности четырех инактивн-рованных культуральных моновакцин против аденовирусной инфекции, вирусной диареи, инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 крупного рогатого скота при разных доза введения / Третьякова И.В., Тиганова Н.В., Бехзадпур Дарь-юш, Белоусова Р.В. // Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: Сб. науч. тр. ФГБОУ ВПО МГАВМиБ - М.: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. - 2012. -С. 150-153.

6. Изучение антигенной активности ассоциировашплх инактивировапных вакцин против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3, аденовирусной инфекции крупного рогатого скота / Белоусова Р.В., Бехзадпур Дарьюш, Третьякова И.В., Тиганова Н.В. // Сб. науч. тр. VI иранского вирусологического конгресса. - Тегеран. - 2012- С. 21-23.

7. Бехзадпур, Д. Обоснование оптимальных для изготовления вакцин режимов культивирования вируса парагриппа- 3 на перевиваемых линиях клеток / Бехзадпур Д., Белоусова Р.В., Иванов И.В. // Военно-медицинский журнал. -

2013.-№4.-С. 27-31.

Отпечатано в типографии ООО «Мещёра», Московская область, г. Щёлково, ул. Свирская, д.8а Формат 84x60/16. Усл. пл.: 0,56. Печать цифровая. Гарнитура «Тайме». Тираж 100 экз. Заказ №168. 2013 год.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Дарьюш Бехзадпур Насроллах, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина»

04201451055

ДАРЬЮШ БЕХЗАДПУР НАСРОЛЛАХ

Антигенные свойства вируса парагриппа-3 в составе ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят

06.02.02. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных

наук.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный работник высшей школы РФ, Лауреат премии правительства РФ Белоусова Раиса Васильевна

Москва-2013

Содержание

Стр.

Список условных обозначений и сокращений 4

1. Введение 6

2. Обзор литературы 10

2.1. Вирусные респираторно-кишечные инфекции молодняка крупного рогатого скота и их экономический ущерб 10

2.2. Роль вируса ПГ-3 крупного рогатого скота при вирусных респи-раторно-кишечных заболеваниях. 15

2.3. Экономический ущерб, наносимый респираторными вирусными инфекциями 18

2.4. Таксономическое положение и основные биологические свойства вируса ПГ-3 КРС 20

2.5. Основные клинические признаки и патоморфологические изменения при ПГ-3 КРС 26

2.6. Иммунитет при ПГ-3 КРС 28

2.7. Диагностика ПГ-3 КРС 32

2.8. Вакцинопрофилактика 34

3. Собственные исследования 39

3.1. Материалы 39

3.2. Методы 40

3.2.1. Получение культуры перевиваемых линий клеток 40

3.2.2. Культивирование вируса 41

3.2.3. Титрование вируса в культуре клеток 41

3.2.4. Инактивация вируса 42

3.2.5. Концентрирование вирусного антигена 43

3.2.6. Подбор адъювантов 44

3.2.7. Определение антигенной активности вирусного антигена на крысах. Определение уровня антител в РН и РТГА 44

4. Результаты собственных исследований 46

4.1. Изучение чувствительности различных перевиваемых линий клеток к вирусу ПГ-3 КРС и режима их культивирования 46

4.2. Определение оптимальных условий инфицирования клеток и способов культивирования вируса 54

4.3. Разработка технологии изготовления инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 КРС 56

4.3.1. Определение оптимальных условий инактивации вируса ПГ-3 56 КРС

4.3.2. Сравнение различных способов концентрированного вируса 59

4.3.3. Изучение влияния различных адъювантов на антигенную активность вирусного антигена ПГ-3 КРС 64

4.3.4. Изучение антигенной активности экспериментальных образцов инактивированных концентрированных моно- и ассоциированных вакцин на крысах 67

4.3.5. Отработка соотношения монокомпонента - антигена вируса ПГ-3

в ассоциированной вакцине 72

4.3.6. Влияние срока хранения на антигенную активность моно- и ассоциированных инактивированных концентрированных вакцин против ПГ-3 74

5. Обсуждение результатов 77

6. Выводы 84

7. Практическое использование полученных научных результатов 85

8. Рекомендации по исследованию научных выводов 85

9. Список литературы 86

10. Приложения 97

Список условных обозначений и сокращений

АГ - антиген

АТ - антитело

Адено- - аденовирус

ВД - вирусная диарея

ВПГ-3 - вирус парагриппа - 3

ВИРТ - вирус инфекционного ринотрахеита

ГОА - гидроокись алюминия

ИМЛ - индекс миграции лейкоцитов

КРС - крупный рогатый скот

КСТ - перевиваемая культура клеток эпителия коронарных сосудов теленка

ЛЭК - легкое эмбриона коровы

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

МППБ - мясо-пептонный печеночный бульон

ПГ-3 - парагрипп-3

ПТ-80 - почка теленка

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РДП - реакция диффузионной преципитации

РН - реакция нейтрализации

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РТМЛ - реакция торможения миграции лейкоцитов

Т-1- Таурус-1 - перевиваемая культура клеток почки теленка

ТЦД - тканевая цитопатическая доза

ЦПА - цитопатогенный агент

ЦПД - цитопатическое действие

ЦПЭ - цитопатический эффект

- десятичный логарифм ГЩБК — Государственный Щелковский биокомбинат ВНИИЗЖ - Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных

1. Введение

В этиологической структуре вирусных заболеваний крупного рогатого скота одно из первых мест отводится вирусу парагриппа-3 (ПГ-3 КРС). Парагрипп-3 зарегистрирован в странах Европы, Северной и Южной Америке, Африке, Азии, островах Британии, России и СНГ [56, 87, 101, 70, 91, 41, 56, 29]. Таким образом, это заболевание является убиквитарным. В СССР заболевание впервые было зарегистрировано в 1968 г. [13, 14, 37]. Вирус ПГ-3 КРС был выделен и изучен Сюриным В.Н., Гуненковым В.В., Крюковым H.H. и др.

Парагрипп-3 крупного рогатого скота (транспортная лихорадка крупного рогатого скота, параинфлюэнца-3, инфекционный бронхит, бронхопневмония крупного рогатого скота, острый катар верхних дыхательных путей) - остропротекающая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания [6, 28, 46].

Экономический ущерб при ПГ-3 складывается из недополучения потомства, снижения мясной и молочной продуктивности, выбраковки животных и затрат на проведение ветеринарных мероприятий [3, 24, 60].

Принимая во внимание очень широкое распространение заболевания и причиняемый им экономический ущерб кроме того и малоэффективные терапевтические меры борьбы с уже возникшими заболеваниями, проблема специфической профилактики парагриппа-3 стала одной из важных для современного животноводства.

Очень"важно отметить7что вирус ПГ-З КРС чаще всего участвует в развитии респираторно-кишечной патологии телят в ассоциации с другими вирусами и бактериями и как моноинфекция проявляется в хозяйствах гораздо реже. Кроме того в этой патологии активную роль играют предрасполагающие и осложняющие факторы: условно-патогенная микрофлора,

стрессовые ситуации и экологическое состояние внешней среды [10, 23, 29, 40, 46]. Особенно тяжело болеют животные, когда в инфекционный процесс вовлекается 2 и более вирусов, или вирусы и бактерии, то есть возникает смешанная или ассоциативная инфекция.

В ветеринарной практике против вирусных пневмоэнтеритов телят используют как моно- так и ассоциированные вакцины [1, 4, 9, 29].

В арсенале биологической промышленности имеется большое количество препаратов, предназначенных для специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний телят, однако, ассоциированных инактивированных вакцин против пневмноэнтерита телят недостаточно. Конструирование этих препаратов из различных антигенов является сложной задачей и предполагает получение вакцин, обладающей высокими антигенными и иммуногенными свойствами к каждому из компонентов. Учитывая широкое распространение вируса ПГ-3 КРС, включение его в состав ассоциированной вакцины актуально.

Цель и задачи исследований

Цель работы. Изучение антигенных свойств вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в составе ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят.

Для достижения поставленной цели надо было решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность различных перевиваемых линий клеток к вирусу ПГ-3 крупного рогатого скота и определить режим их культивирования.

2. Определить оптимальные условия инфицирования клеток вирусом ПГ-3 крупного рогатого скота.

3. Разработать технологию изготовления инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота.

4. Изучить антигенные свойства инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота на крысах.

5. Изучить антигенную активность экспериментальных образцов ассоциированных вакцин при разных соотношениях монокомпонентов на крысах.

6. Определить срок хранения вакцин.

Научная новизна работы

1. Определены наиболее чувствительные перевиваемые линии клеток к вирусу ПГ-3 - ПТ-80 и Т-1.

2. Отработаны оптимальные параметры культивирования вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в перевиваемых культурах клеток. Посевная концентрация 250 ООО клеток/мл. Инфекционная доза вируса 0,1 ТЦД5о/кл.

3. Предложена модифицированная методика получения концентрированного антигена вируса ПГ-3 крупного рогатого скота: концентрация антигена ПЭГ (8 %) с последующей обработкой ультразвуком и твин-эфиром.

4. Изучена антигенная активность вирусного антигена ПГ-3 крупного рогатого скота с разными адъювантами. Установлено, что наиболее выраженными адъювантными свойствами обладает гидроокись алюминия в 1,5 % концентрации.

5. Разработана инактивированная концентрированная вакцина против ПГ-3 крупного рогатого скота.

6. Изучена антигенная активность антигена вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в составе ассоциированных инактивированных концентрированных вакцин против вирусных пневмоэнтеритов телят.

Практическая значимость работы

Показана высокая антигенная активность и безвредность экспериментальных образцов моновакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота и ассоциированных вакцин против пневмоэнтеритов телят.

Результаты исследований вошли в нормативную техническую документацию: временная инструкция по изготовлению и контролю инактиви-рованной концентрированной вакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота, стандарт организации изготовления и контроля инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота, инструкция по применению инактивированной концентрированной вакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по созданию ассоциированных вакцин против вирусных пневмоэнтеритов телят, механизмов и закономерностей формирования поствакцинального противовирусного иммунитета у крупного рогатого скота.

Полученные результаты используются в учебном процессе по дисциплине «Вирусология и биотехнология» для студентов ветеринарного и ветеринарно-биологического факультетов ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции «Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (2011); на шестой Иранской конференции по вирусологии (2012); на отчетном заседании методической комиссии МГАВМиБ (2011, 2012), на Международной научно-практической конференции (г. Москва, 2012)._________ —

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, в т.ч. 4 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В выполнении отдельных этапов, связанных с культивированием, концентрированием вирусов и изготовлении экспериментальных об-

9

разцов вакцин принимали участие к.б.н. Т.П. Лобова, доценты И.В. Третьякова, В.Е. Брылина, научный сотрудник Н.В. Тиганова, которым выражаем глубокую благодарность.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту

• Результаты исследований по определению чувствительности перевиваемых линий клеток к вирусу ПГ-3 крупного рогатого скота и оптимальных условий их инфицирования вирусом.

• Технология концентрирования вируса ПГ-3 крупного рогатого скота и подбор адъювантов.

• Условия приготовления экспериментальных серий моновакцины против ПГ-3 крупного рогатого скота и ассоциированных вакцин и результаты изучения их антигенных свойств.

2. Обзор литературы 2.1. Вирусные респираторно-кишечные инфекции молодняка крупного рогатого скота и их экономический ущерб

Среди болезней крупного рогатого скота пневмоэнтериты телят наносят огромный экономический ущерб.

Интенсификация животноводства на промышленной основе с определенными технологическими процессами с одной стороны сопровождается экономическими преимуществами, но параллельно создаются проблемы ветеринарно-санитарного порядка. Концентрация поголовья на небольших площадях сопровождается быстрым распространением инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта, репродуктивных и респираторных органов различных возрастных групп животных.

До сих пор борьба с вирусными пневмоэнтеритами затруднена, главным образом, по причине малой изученности этой патологии. Причина

ю

пневмоэнтеритов телят комплексная. Можно выделить несколько основных факторов, которые влияют на возникновение этих заболеваний.

Это - полиэтиологичность: возбудителями таких инфекций являются вирусы, относящиеся к различным семействам: герпесвирусов (вирус инфекционного ринотрахеита), парамиксовирусов (вирус ПГ-3 и респиратор-но-синцитиальный вирус), флавивирусов (вирус диареи - болезни слизистых), аденовирусы, рота - и коронавирусы и другие. Кроме того, в этой патологии принимают участие и возбудители бактериальной природы -пастереллы, сальмонеллы, стафилококки, хламидии, микоплазмы.

Важно отметить, что велика роль и предрасполагающих факторов в массовых вспышках респираторных болезней (состояние иммунной системы телят, условия их содержания и кормления, стрессовые ситуации, экологическое состояние внешней среды). Все это приводит к снижению резистентности организма и иммунному дефициту. У животных с нормальным функционированием иммунной системы эти инфекции чаще протекают без ярко выраженных клинических признаков. Особенно тяжело болеют животные, когда в патологический процесс вовлекаются 2 или более вирусов или вирусные бактерии, т.е. возникает ассоциативная или смешанная инфекция.

На исход болезни влияют многие предрасполагающие и осложняющие стрессовые факторы и вирулентность циркулирующих штаммов вирусов.

Затрудняющим фактором в изучении этих инфекций является то, что в естественных условиях у взрослых животных болезнь, как правило, не сопровождается симптомами респираторно-кишечного заболевания, но они являются вирусоносителями, которые в стрессовых условиях могут быть вирусовыделителями, заражая молодняк [6, 32, 46, 72, 76].

Определенные затруднения в изучении вирусных пневмоэнтеритов

заключаются в том, что в экспериментальных условиях воспроизвести яр?

кую клиническую картину с поражением органов респираторного и кишечного тракта у телят очень сложно [6].

Респираторные и желудочно-кишечные болезни телят протекают в основном по типу ассоциированных инфекций, и проявление их происходит при кумулятивном действии возбудителей.

Основными инфекционными агентами, вызывающими заболевания у телят, являются вирусы: ИРТ, ПГ-3, РС, ВД, рота-, корона- и аденовирусы, а осложняют течение заболевания различные бактериальные агенты -сальмонеллы, стафилококки, стрептококки, клебсиеллы и др. Это приводит к развитию вторичного иммунодефицита у животных, с одной стороны, а также к активизации условно-патогенной микрофлоры, размножающейся на пораженных клетках верхних дыхательных путей и легких, - с другой [10, 23,29,38].

К стрессовым ситуациям можно отнести грубые нарушения в кормлении и содержании как стельных коров, так и новорожденного молодня-

I

ка, и нарушение в технологии получения и выращивания новорожденных телят [16,29].

В условиях промышленной технологии к снижению естественной резистентности и иммунологической реактивности приводят:

- длительная транспортировка молодняка из хозяйств - поставщиков,

- нарушение принципа «пусто - занято» при заполнении помещений новыми телятами,

- резкое изменение условий содержания и кормления,

- длительное комплектование групп на фермах и комплексах,

- скученное содержание телят на ограниченной площади,

- малый фронт кормления телят,

- комплектование групп животных сборными телятами без учета инфицированности хозяйств — поставщиков,

- содержание в одном помещении разновозрастных животных с различным иммунологическим состоянием.

При интенсивном ведении животноводства на промышленной основе предусматривается концентрация значительного количества поголовья на ограниченных площадях, что влечет за собой ряд существенных изменений в закономерности эпизоотического процесса и вносит поправки в нозологический профиль заразных болезней. В последнее время в инфекционной патологии всё большую роль играют ассоциированные вирусные инфекции, обусловленные двумя или несколькими вирусными агентами. Ведущую роль в этой патологии животных приобретают вирусные болезни, удельный вес которых возрастает по мере снижения и ликвидации бактериальных, протозойных заболеваний и заболеваний, вызываемых грибами [23, 54].

Очень важной особенностью этих инфекций является то, что их возбудители сами по себе в большинстве случаев не способны вызвать заболевание с ярко выраженными клиническими признаками. Обычно проявляют они себя в сочетании с другими вирусами и бактериями и только в таких случаях они становятся опасными в тяжело протекающих заболеваниях.

Ассоциированные вирусные инфекции у КРС, вызываемые вирусами ИРТ, ВД, ПГ-3, PC, Адено-, рота- и коронавирусами, постоянно и широко регистрируются в различных странах мира. При этом вышеуказанные вирусы в виде ассоциаций вызывают у КРС различных половозрастных групп респираторные заболевани�