Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование технологии промышленного производства и обеспечение качества поливалентных сывороток крови животных

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование технологии промышленного производства и обеспечение качества поливалентных сывороток крови животных"

На правах рукописи

Сусский Евгений Владимирович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА И ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ПОЛИВАЛЕНТНЫХ СЫВОРОТОК КРОВИ ЖИВОТНЫХ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Щелково - 2014

Работа выполнена в ФКП «Армавирская биофабрика» и ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт биологической промышленности» Российской академии наук.

Научный консультант: академик РАН, академик НААН Украины, доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной и Правительственной премий РФ, Заслуженный деятель науки РФ Анатолий Яковлевич Самуйленко

Официальные оппоненты:

Вячеслав Михайлович Безгин - доктор биологических наук, профессор, ФКП «Курская биофабрика-фирма «БИОК», директор

Сергей Григорьевич Юрков - доктор биологических наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии», заведующий лабораторией биотехнологии

Александр Алексеевич Шевченко - доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный работник сельского хозяйства РФ, лауреат Премии правительства РФ, ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», заведующий кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина».

Защита состоится 2014 г. В часов на заседании

диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук во «Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности» РАН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината д. 17, ВНИИТИБП, e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности».

Автореферат разослан « » CLP/Lt/ 2014 г.

Автореферат 4 июля 2014 г. размещен на сайте ГНУ ВНИТИБП www.vnitibp.com и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.eov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Фролов Юрий Дмитриевич

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Респираторно-кишечные и желудочно-кишечные инфекции занимают ведущее место в патологии крупного рогатого скота, на долю которых приходится от 55 - 70 до 100 % заболеваний новорожденных телят. Решающую роль в снижении естественной резистентности животных играют нарушения условий содержания, кормления и санитарно-гигиенических норм, скученное содержание на ограниченной территории, возникновение стрессов, завоз инфицированных животных, а также несвоевременная выпойка молозива новорожденными телятам, что отражено в работах Горбань Н.И., 1981; Федоров Ю.Н. и соавт., 1982; Атамась В.А. и соавт., 1986; Карпуть И.М., 1993; Красочко Г1.А. и соавт., 1999; Машеро В.А., 2006.

Ведущую роль в этиологии респираторно - кишечных и желудочно -кишечных инфекциях новорожденных телят занимают вирусы парагрипна-3, инфекционного рипотрахеита, диареи - болезни слизистых оболочек, ротавирусы, короновирусы, аденовирусы и возбудители пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза и других инфекций, дифференциальная диагностика которых затруднена в условиях производства. Заболевания телят протекают, в основном, по типу ассоциативных инфекций, а пусковым механизмом острых заболеваний считают вирусы, которые разрушают эпителий респираторного и желудочно-кишечного трактов и создают благоприятные условия для размножения микроорганизмов, по данным Урбана В.Н. и соавт., 1984; Сюрина В.Н. и соавт., 1988; Федорова Ю.Н. и соавт., 1996; Caldow GL. et al., 1998; Басовой Н.Ю, 2002; Глотова А.Г. и соавт., 2005; Куриленко А.Н. и соавт., 2006.

Для профилактики и лечения РКИ новорожденных телят практикой рекомендуется вакцинация стельных коров, применение антибиотиков, иммуноглобулинов, моно- и поливалентных сывороток крови животных. Специфическая профилактика новорожденных телят малоэффективна, поэтому для защиты животных от заражения в первые часы после рождения применяют молозиво, антибактериальные препараты, а при подтвержденном диагнозе -моновалентные СК. Однако для экстренной профилактики и лечения ассоциативной инфекции наиболее перспективны поливалентные СК животных.

В последние годы разработан целый ряд поливалентных СК против пневмоэнтеритов КРС, которые серийно не производятся и не применяются в ветеринарной практике (Шегидевич Э.А. и соавт., 1992; Гаффаров Х.З. и соавт., 2000; Гуненков В.В. и соавт., 2010). Поэтому исследования, направленные на разработку и стандартизацию технологии серийного производства и обеспечения качества поливалентных СК для профилактики и лечения пневмоэнтеритов КРС являются весьма актуальными и востребованными практикой.

1.2. Степень разработанности проблемы. Изучению вопросов разработки, производства, контроля и применения гипериммуиных СК посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных авторов (Бургасов П.Н., 1978; Медведев A.1I., Вербицкий А. А., 2001; Русанов В.М., Левин И., 2004; Краснопольский Ю.М., Борщевская М.И., 2004; Медведев А.П., 2007).

Биологическая промышленность Российской Федерации на данном этапе готовит более 16 видов моно- и поливалентных СК животных и иммуноглобулинов, технология производства которых достаточно трудоемка и не соответствует требованиям национальных и международных стандартов. Наиболее значимыми

элементом повышения качества и эффективности производства лечебных СК животных является «Система обеспечения качества», осуществляемая в соответствии с требованиями правил GMP и ГОСТ Р 52249-2009.

Недостаточно изученными остается широкий круг проблем, связанных с оснащением производства современным оборудованием, производственными помещениями высокого класса чистоты, совершенствованием ТП изготовления и методов контроля качества лечебных СК животных. Практического решения требуют вопросы подбора и паспортизации штаммов бактерий и вирусов, изготовления и стандартизации гидролизатных питательных сред, оптимизации условий периодического культивирования различных видов микроорганизмов, технологии изготовления и контроля животных и инактивированных антигенов, а также схемы гипериммунизации и эксплуатации животных-продуцентов. Необходимо также механизировать и автоматизировать ТП получения, обработки, фасовки, укупорки и этикетировки, контроля качества и доставки промышленных серий СК потребителю в системе «Холодовой цепи».

При организации серийного производства поливалентных СК согласно требования ГОСТ ИСО 9001-2011 особое внимание следует уделять разработке системного подхода «Системы обеспечения качества» и «Системы посевных материалов» (Seed Lot System) и методов обеспечения их качества. Системный подход в производственной практике не получил широкого применения при изготовлении лечебных сывороток, поэтому его реализация на практике является актуальной. Решение указанных проблем требует также подбора современного оборудования и технологических решений, позволяющих существенно повысить активность и конкурентоспособность, а также снизить себестоимость промышленных серий поливалентных СК животных.

Поливалентные СК против РКИ и вирусных пневмоэнтеритов телят в РФ не производились соответственно до 2003 и 2009 годов, но были востребованы практикой, что послужило основанием для разработки и серийного производства оригинальных по составу и технологии изготовления «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят», а также «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных». При реализации этих задач предусматривалось решение целого ряда научных и технологических проблем, в том числе повышение качества, эффективности и конкурентоспособности лечебных препаратов на отечественном и международном рынках. Внедрение в практику указанных инноваций при серийном производстве и поливалентных СК является приоритетной задачей биопредприятия.

1.3. Цель и задачи исследований. Цель работы - разработка и усовершенствование технологии промышленного производства, обеспечение качества и эффективности поливалентных сывороток против респираторно-кишечных инфекций КРС и эшерихиоза сельскохозяйственных животных и разработке современных средств и методов изготовления нового препарата для профилактики и терапии вирусных пневмоэнтеритов телят в соответствии с требованиями СМР.

Для достижения поставленной цели решились следующие задачи:

анализ традиционных технологий промышленного сывороточного производства;

- разработка технологических и аппаратурно-технологических схем получения исходных материалов и поливалентных сывороток;

- реинжиринг производства согласно требованиям GMP;

- научное обоснование выбора штаммов, методов изготовления и контроля активности живых и инактивированных бактериальных и вирусных антигенов;

- определение условий гидролиза белоксодержащих материалов и методов изготовления гидролизатных питательных сред с учетом метаболизма микроорганизмов;

масштабирование процессов периодического культивирования микроорганизмов;

- научное обоснование выбора культуральных моделей для серийного производства вирусных антигенов методом проточной цитометрии (ПЦ);

- разработка технологии производства, методов обеспечения качества и эффективности «Адгезивной антитоксической сыворотки против эшерихиоза сельскохозяйственных животных»;

- разработка технологии производства, методов обеспечения качества и эффективности «Иммуносерум - сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят»;

- разработка технологии производства, методов обеспечения качества и эффективности поливалентной сыворотки против ассоциативных респираторно-кишечных инфекций телят вирусной и бактериальной этиологии;

- усовершенствование системы хранения и транспортировки лечебных и иммунобиологических препаратов в «Системе холодовой цепи»;

- разработка нормативной документации и организация серийного производства поливалентных сывороток крови животных.

1.4. Научная новизна. Научно - обоснован единый подход к разработке и усовершенствованию технологических процессов производства, обеспечению качества трех видов поливалентных СК с учетом требований стандартов ИСО серии 9000, правил СМР и ГОСТ 52249-2009.

Усовершенствована технология очистки воды водопроводной с использованием современного высокопроизводительного оборудования, обеспечивающего производство промышленных объемов ВО и ВИ, отвечающих требованиям национальных и международных стандартов.

Научно обоснован дифференцированный подход к условиям и длительности ферментативного гидролиза различных белоксодержащих материалов с учетом метаболизма пастерелл, сальмонелл и эшерихий.

Определены параметры периодического культивирования микроорганизмов, позволяющие интенсифицировать кинетические процессы размножения, сократить время, многократно повысить уровень накопления и жизнеспособность пастерелл, сальмонелл и эшерихий.

Впервые методом ПЦ отобрана, аттестована культуральная модель (MDBK-Е), отвечающая требованиям отечественных и международных стандартов, для серийного производства и контроля активности вирусов нарагриппа-3 (ПГ-3) и инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота.

Научно обоснованы требования к штаммам, технологии производства и контролю качества бактериальных и вирусных антигенов. Проведен скрининг

изолятов, эталонных и производственных штаммов и отобраны возбудители вирусов, пастереллеза, сальмонеллеза и эшерихиоза с полным набором факторов патогенности, на основе которых разработаны комплексные препараты с выраженными антигенными свойствами. В процессе гипериммунизации не выявлено конкуренции антигенов и аллергизации животных-доноров.

Впервые разработаны технология производства, система обеспечения качества и эффективная схема применения «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят». Оригинальность и новизна способа получения препарата защищены патентом РФ №2407543.

Впервые разработаны технологическая схема производства и система обеспечения качества более эффективной «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных», обеспечивающая защиту животных от широкого спектра вирулентных штаммов с полным набором факторов патогенности.

Усовершенствована технология производства, система обеспечения качества «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота».

1.5. Практическая значимость работы.

• Экспериментально и экономически обосновано применение разработанных технологических решений при серийном производстве высокоэффективных поливалентных сывороток крови для профилактики и лечения заболеваний вирусной и бактериальной этиологии сельскохозяйственных животных.

• Проведено масштабирование технологии производства поливалентных сывороток крови животных.

• Созданы и внедрены технологические линии для комплексной очистки воды водопроводной, определены общие требования к условиям и длительности ферментативного гидролиза белоксодержащих материалов с учетом требований метаболизма микроорганизмов.

• Определены условия серийного производства и требования к качеству бактериальных и вирусных антигенов.

• Внедрена в производство «Система обеспечения качества» лечебных сывороток в соответствии с требованиями стандартов ГОСТ ИСО 9001-2011, правил GLP, GMP и ГОСТ Р 52249-2009.

• Созданы и реализованы на практике «Система посевных материалов» (Seed Lot System) микроорганизмов, вирусов и клеточных культур.

• Разработана и внедрена в условиях биопредприятия «Система менеджмента качества» производства гипериммунных СК животных на основе стандартов ИСО серии 9000:2000.

• Разработана и внедрена «Система управления качеством» на основе статистических методов контроля соответствия активности лечебных сывороток и технологических процессов производства стандартным показателям.

• Создана и успешно функционирует «Система холодовой цепи», позволяющая осуществлять регламентированное хранение и своевременную доставку лечебных и иммунобиологических препаратов потребителю.

• Разработаны и утверждены в установленном порядке комплекты нормативных документов на производство, контроль и применение поливалентных

сывороток. Организовано серийное производство «Сыворотки против настсреллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», «Сыворотки антиадгезивной, антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» и «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят».

1.6. Положения диссертации, выносимые на защиту:

- отбор и паспортизация штаммов микроорганизмов, обладающих полным набором факторов патогенности;

- использование метода ПЦ для отбора и паспортизации перевиваемых линий клеток, предназначенных для изготовления и контроля вирусных антигенов;

- методы получения и контроля посевного материала для серийного производства бактериальных и вирусных антигенов и перевиваемой линии клеток;

- условия периодического культивирования микроорганизмов;

- технологические линии по производству ВО и ВИ, ГПС, вирусных и бактериальных антигенов и поливалентных СК животных;

- усовершенствование схем гипериммуиизации и эксплуатации животных-продуцентов при производстве поливалентных сывороток крови;

система управления качеством, предусматривающая применение статистических методов контроля исходного сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, постоянный мониторинг показателей ТП и их коррекция при производстве поливалентных СК животных.

1.7. Внедрение результатов. На биопредприятии внедрены разработанные технологии серийного производства «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», «Сыворотки антиадгезивпой, антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» и «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики пневмоэнтеритов телят», которые успешно реализуются и применяются в ветеринарной практике. Рекламаций па качество поливалентных сывороток в период 2006-2013 гг. не поступало. Годовой экономический эффект от внедрения в практику указанных инноваций составил 737835,62 рублей.

1.8. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены па:

XVIII, XIX, XX, XXI, XXII Международных конференциях и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» - Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2010-2014 гг;

Международной конференции, посвященной 80-летию организации ВГНКИ «Лекарственные препараты для животных: разработка, производство, эффективность и качество», Москва, 2011;

Международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечение качества биологических препаратов АПК», Щелково, 2012;

Международном симпозиуме, посвященном 80-летию Аграрного университета Молдова - Кишенев, 2013;

Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию РУП «Института Экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского -Минск, 2013.

1.9. Публикация научных исследований. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 41 научных работах, в том числе 1

монография и 13 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получены 3 Патента РФ.

1.10. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 426 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих: материалы и методы, результаты исследований, заключение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения на 5 страницах. Диссертация иллюстрирована 68 таблицами и 32 рисунками. Список литературы включает 615 источников, из которых 434 отечественных и 181 зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.

1.11. Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автором лично сформулирована проблема, постановка цели и задач исследований и их реализация в условиях производства. Осуществлен подбор современного оборудования и на их основе созданы и апробированы технологические линии по изготовлению и контролю ВО и ВИ, ГПС и стандартных бактериальных антигенов с использованием современных биореакторов и периодического метода культивирования микроорганизмов. Лично автором или под его руководством подобраны штаммы, схемы гипериммунизации и эксплуатации ВП, оптимизированы условия и технология производства СК, хранения и транспортировки лечебных препаратов в «Системе холодовой цепи».

Для решения этих задач автором на предприятии создан «Отдел контроля качества» (ОКК), внедрены статистические методы контроля и «Система обеспечения качества», что позволило проводить валидацию и коррекцию ТП производства на всех этапах технологического цикла и повысить стабильность и активность поливалентных СК животных. Отдельные этапы работы проводились совместно со специалистами ВНИИТИБП и ВГНКИ. Все материалы диссертации проанализированы и обобщены лично автором. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

1.12. Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту - директору ВНИТИБП, доктору ветеринарных паук, профессору, академику РАН А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь доктор биологических наук В.И. Еремец, доктор биологических наук Т.А. Скотникова, доктор биологических наук В.И. Смоленский, доктор ветеринарных наук М.К. Пирожков, заведующий лабораторией «ИБХ им. М.М. Шемякина и IO.A. Овчинникова» C.B. Хайдуков, заместитель директора РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.II. Вышелесского» П.А. Красочко, за что приносим им сердечную благодарность.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в ФКП «Армавирская биофабрика» и в отделе противобактерийных препаратов ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии по программе РК 01.200201567 (ИК 02.2.00603501). Опытно -промышленные серии препаратов испытывали в животноводческих хозяйствах Краснодарского края.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследованиях были изучены штаммы эшерихий, пастерелл и сальмонелл, полученные из различных источников, селекционированные по способности продуцировать факторы патогенности (токсины, адгезины, гемолизины) (таблица 1), а также диагностические сыворотки отечественных и зарубежных производителей.

Таблица 1

Перечень штаммов, использованных в работе

№ п/п Наименование или номер штамма Источник поступления штамма Источник выделения

1 2 3 4

Производственные штаммы Е.соН:

1. 1230 (08:К43) виэв теленок

2. 320 (078:К80) виэв теленок

3. 39/2 (055:К59) виэв теленок

4. 733 (ОП9:К69) виэв теленок

5. 857 (086:К61) виэв теленок

6. 899 (015:К14) виэв теленок

7. 1308 (026:К60) виэв теленок

8. 1370 (020) виэв теленок

9. 1463 (ОП7:К62) виэв теленок

10. 115/2(0115) Институт им. Мечникова теленок

II. 660(041) НИИ пушного звероводства и кролиководства норка

12. 1330 (О9:К30) Центр референции эшерихий (Польша) теленок

13. 723 (0138:К81) —11 — поросенок (отъем.)

14. 1084 (0139:К82) — II — поросенок (отъем.)

15. 724 (0141 :К85:К88) — II — поросенок (подсосн.)

16. 1092 (0147:К89:К88) —11 — поросенок (подсосн.)

17. 1111 (0149:К91:К88) — И — поросенок (подсосн.)

18. 727 (0141 :К87:К88) — II — поросенок (подсосн.)

1 2 3 4

19. 1407 (0101 :К99) — II — теленок

20. 3149 (0157.-Н7) Центр по пищевой гигиене и зоонозам (Германия) человек

21. 1271 (0157-.Н-) —- II — человек

22. 904 (0157:Н7) — XI — поросенок

23. 161 (0157:Н7) — II — теленок

24. 43890 (0157:Н7) АТСС, Атланта (США) теленок

25. 43894 (0157:Н7) — II — человек

26. 43895 (0157:Н7) — II — человек

27. 43888 (0157:Н7) — II — человек

28. 43889 (0157:Н7) — II — человек

29. 35150 (0157:Н7) АТСС, Атланта (США) человек

30. 51657 (0157:Н7) — 11 — человек

31. 51658 (0!57:Н7) — II — человек

32. 51659 (0157:Н7) — II — человек

33. 454-37/ 17 (СН41:К99) ВГНКИ поросенок (подсосн.)

34. 453-37/17 (ОП5:К88) — II — поросенок (подсосн.)

35. 397-37/14(09:К103:987Р) — II — поросенок (подсосн.)

36. 398-37/14 (ОЮ1:К99) — II — поросенок (подсосн.)

37. 8а1.етег111с)18 виэв поросенок

38. $а1.сЬо1егае$1щ виэв поросенок

39. ЗаЫиЬНп виэв ягненок

40. 8а1дурЫтигшт виэв теленок

41. Р. шultocida ТИП А виэв

42. Р. пиШос^а ТИП В виэв

43. Р. тикоаёа ТИП Д виэв

В качестве культуральных моделей (КМ) использовались сублинии клеток почки теленка (МОВК-Вов Гаигия), полученные из ВНИИВВиМ (МОВК-Е) и ВНИИЗЖ (МЭВК-В), прошедшие соответственно 30 и 48 пассажей. Тест-культуры (ТК) аттестовывались по культуральным, цитоморфологическим и кариологическим показателям в соответствии с требованиями отечественных и международных стандартов и методом проточной цитометрии - ГГЦ (Мораска Л., Эрба Э„ 1989; Полетаев А.И., 1989). Индикацию микоплазм-контаминантов (МК) в ТК осуществляли микробиологическим и цитохимическим методами и в ПЦР, а очистка образцов ПЖ проводилась при помощи «Энрофлона-К» в течение 10 пассажей в дозе 10 мкг/см1.

Вакцинные штаммы ПТК 45/8 и ТК-А/ВИЭВ вирусов парагриппа-3 (ПГ-3) и инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота (КРС) культивировались в ТК клеток МОВК стационарным и роллерным методами. Активность вирусов оценивали методом микротитрования в ТК клеток МОВК, а гемагглютинирующую активность вируса ПГ-3 контролировали в РГА с 0,5%-ной суспензией эритроцитов морской свинки.

10

Разработка, изготовление и контроль посевных материалов (SLS) главного (MS) и рабочих (WS) банков микроорганизмов, вирусов и клеточных культур осуществлялись в соответствии с требованиями ГОСТ Р 52249-2009 и правил GMP.

Культивирование пастерелл, сальмонелл и эшерихий осуществляли стационарным методом в стеклянных бутылях объемом 0,5, 5,0 и 20 л, модернизированных химических реакторах объемом 600 и 1000 л и биореакторе «Торнадо» объемом 200 л. Реакторы заполняли на 2/3 объема БХ, затем вносили посевной материал (ПМ) микроорганизмов из расчета 5-г10% к объему ПС и выращивали в течение 10 -г 12 ч при постоянном перемешивании (100-150 мин"'), температуре (36±0,5)°С и рабочем давлении 0,3 мПа. Концентрацию микроорганизмов оценивали по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича или турбидиметрически на фотоэлектроколориметре КФК-1-XJI-42, морфологию -микроскопией мазков, окрашенных по Грамму.

Ростовой потенциал ПС и физиологическую активность бактерий оценивали графическим методом по продолжительности фаз приспособления (t;lal) и логарифмического роста (t;lol), максимальной удельной скорости роста (max) бактерий и времени одной генерации (gM„„) в процессе периодического культивирования и уровню накопления микроорганизмов (Исаева З.А. и др., 1980).

Оценивали эффективность серийного производства воды очищенной (ВО) традиционным методом дистилляции и с использованием современного оборудования (установок Водопад МЖ 5.5-1-8/14 и УВОИ-МФ 8040-6) и воды для инъекции (ВИ) на установках SuperS и УВОИ 4040, в соответствии с требованиями ФС 42-2619-97, ФС 42-2620-97, а на наличие бактериального эндотоксина (БЭ-липополисахарида) на кроликах по ОФС 42-0002-00 и методом ЛАЛ-теста (МУ 78113).

Для серийного изготовления гидролизатных ПС использовали фарш говядины или конины, а также отходы (форменные элементы крови, фибрин, отварной фарш) сывороточного производства. Ферментативный гидролиз белоксодержащих материалов осуществляли при температуре (40±2) °С и рН 7,88,0 в течение 3-4 и 5-6 суток в зависимости от метаболизма микроорганизмов. Биохимические показатели перевара (FIX) и бульона (БХ) Хоттингера, рН, содержание общего, белкового и аминного азота, аминокислот, пептона, аммиака, триптофана, фосфора, сахара оценивали с использованием общепринятых методов (Караваев Б.Е.и др., 1989; Доссоп Р. и др., 1991); суммарное содержание пептидов -по биуретовой реакции (Телишевская Л.Я., 2000); пептидных фракций - методом гельфильтрации (ГФ) в геле сефадекса G-15 на колонках 60x2,6 см и ультрафильтрации (УФ) на установке «Амикон», оснащенной ультрафильтрами с разрешением 5000 и 1000 D (Телишевская Л.Я., 19950.

Совершенствование технологии производства осуществлялось с учетом требований системы менеджмента качества (СМК) и правил GMP.

При решении этих задач были разработаны методы отбора ВГ1 с высокой иммунореактивностмо, оптимизированы условия содержания, кормления и

11

профилактики инфекционных заболеваний животных-доноров. Усовершенствованы методы изготовления, состав и активность антигенов, схемы подготовки, гипериммунизации и эксплуатации продуцентов СК. С использованием современного оборудования были определены ТП изготовления, фасовки, укупорки, этикетировки и контроля активности поливалентных СК в соответствии с требованиями отечественных и международных стандартов. Оптимизировались условия хранения и доставки лечебных сывороток потребителю в системе «Холодовой цепи».

«Сыворотка антиадгезивная антитоксическая против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» (I), «Сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота» (II) и «Иммуносерум - сыворотка для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят» (III) должны быть стерильными, безвредными, активными, не содержать контаминантов, обладать выраженным лечебным и профилактическим эффектом. Контроль указанных показателей осуществляется в соответствии с требованиями СТО 00482849-0020-2007 (I), ТУ 9388-001-004828492007 (II) и СТО 00482849-0018-2007 (III), а серийное производство поливалентных СК - в соответствии с требованиями промышленных регламентов ПР-00482849-011-09 (I), ПР-00482849-013-09 (II) и ПР-00482849-015-09 (III).

Состав поливалентных СК анализирован методом электрофореза (ЭФ) в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГЭ), который широко используется в практике (Майрер Г., 1971; Остерман Л.А.,1981).

Стабильность ТП производства поливалентных СК животных оценивали с помощью контрольных карт Шухарта типа X для средних значений (ГОСТ Р 5077942-99; Сакато Сиро, 1980; Михайлова Н.В., 1988). Оценку точности и стабильности ТП производства СК осуществляли с использованием программ ЕХРО-32 (Beckman-Coulter, USA) и Multi Cycle (Phoenis Flow Systems, USA).

Результаты экспериментальной и производственной работы подвергали статистической обработке с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m) и достоверность разницы (р) между средними величинами по методу Стьюдента-Фишера. Отличие сравниваемых показателей считали достоверными, если уровень вероятности не превышал р<0,05 (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962; Лакин Г.Ф.,1990; Венедягин Г.В., 1973).

Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем - с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010.

Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3. Совершенствование технологии производства и обеспечение качества исходных материалов для изготовления лечебных сывороток (СК) животных

3.1. Разработка технологической схемы производства поливалентных сывороток крови животных. Современный подход к разработке и совершенствованию технологии изготовления СК животных предусматривает оптимизацию и стандартизацию технологической схемы и технологических параметров серийного производства целевого продукта в соответствии с требованиями вМР. На рисунке 2 представлена унифицированная технологическая схема производства СК животных.

Рис. 2. Унифицированная технологическая схема производства сывороток крови животных

3.2. Разработка аппарату рно-технологической схемы производства сывороток крови животных. После создания технологической схемы производства разработана аппаратурно-технологическая схема промышленного производства СК животных. На рисунке 3 представлен перечень необходимого оборудования для производства поливалентных СК животных.

Рис. 3. Аппярятурно-технологнческяя схем я промышленного производства сывороток кровн животных

1-реактор-гидролизагор; 2-реактор для хранения осветленного гидролиэата; 3-реактор для приготовления питательной среды; 4-мсмбранный фильтр; 5-реактор для стерилизации питательной среды; 6-биореактор (ферментер) для культивирования; 7-ампула с лиофильно высушенным штаммом; 8-штамм выращенный на скошенном агаре; 9-штамм выращенный в жидкой питательной среде; 10-штамм засеянный во флаконы 450мл; 11-выращивание штамма во флаконах 450 мл на шутгель-аппарате в термостатируеммом помещение; 12-лабораторный ферментер для инокулята; 13-емкость для инактивации; 14-смкость для получения антигенна; 15- карантин животных; 16-животиые продуценты. 17- кровяной сепаратор; 18- дефибринатор; 19- реактор для отстоя; 20-грубая фильтрация; 21- стерилизующая фильтрация; 22-установка для фасовки во флаконы; 23-полуавтоматическая линия укупорки, закатки флаконов, этикетировки; 24-упаковочная линия в коробки и этикетировки коробок; 25-упаковочная линия в гофротару.

3.2.1. Рсинжнринг производства СК животных. Вступление России в ВТО повышает требования к конкурентоспособности отечественной продукции, что делает необходимым реконструкцию (реинжиринг) предприятий биологической, химической и пищевой промышленности и разработку новых или усовершенствование традиционных технологий производства препаратов. На рисунке 4 представлена схема реинжиринга ФКП «Армавирская биофабрика» при серийном производстве поливалентных СК животных.

Рис. 4. Реинжиринг предприятия ФКП «Армавирская биофабрика»

3.3. Разработка методов изготовления и контроля качества исходных материалов для производства поливалентных СК животных

3.3.1. Совершенствование технологии производства и обеспечение качества воды очищенной и воды для инъекций. Современная схема производства лечебных СК и ИБП невозможна без использования высококачественных материалов, в т.ч. воды различной степени очистки. При решении этой задачи было подобрано современное оборудование и на его основе созданы две технологические линии А и В (рис. 5).

Замена процесса дистилляции на метод комплексной очистки воды водопроводной (ВВ) на установке «Водопад» дает возможность повысить выход и снизить себестоимость 1 т целевого продукта в 3,6 раза. Дальнейшая очистка воды осуществляется на установке УВОИ-МФ-8040-6 производительностью 8000 л/ч. Полученная ВО соответствовала требованиям ФС 42-2619-97, а уровень рН среды и удельной электропроводности (УЭ) был на уровне 5,0-7,0 и 2,87±0,14 мкСм/см и не превышал 4,3 мкСм/см. За пятилетний период на предприятии было изготовлено 1428 серий ВО объемом 24990 т, которая соответствовала требованиям НД и успешно применялась для изготовления растворов, бактериологических ПС, в том числе БХ, мойки посуды и технологического оборудования.

it

Рис. 5. Схема подготовки воды очищенной (ВО) и воды дли инъекций (H1I) с использованием парового конденсата (А) н установки «Водопад» (В)

УВОИ 8040 - установка для получения ВО производительностью 8 м^/ч; УВОИ 4040 - установки для получения ВИ производительностью 0,5 м^ /ч; Водопад МЖ 5.5-1-8/4-4 - установка для очистки ВВ;

Millipore Super Q Plus - установка для получения ВИ производительностью 0,7 м^/ч;

ПК - накопители воды;

I, 2, 3, 4, 5 - точки отбора ВО.

Дополнительная очистка пермеата на установке Super-Q и УВОИ 4040 была эффективной, но не приводила к достоверному изменению рН среды, однако показатель УЭ воды для инъекций снижался до уровня 0,35±0,01 мкСм/см и не превышал 1,1 мкСм/см. Для контроля пирогенности ВО и БХ на биопредприятии наряду с кроликами внедрен равноценный по чувствительности аналитический метод контроля - Лал-тест (ОФС 42-0002-00). Брак по пирогенности воды в период 2004-20014 г.г. уменьшился в 3 раза до 0,31%, что достигнуто за счет модернизации процессов получения и дополнительного пропуска ВО и ВИ через фильтр

Нола водопровод

(BD)

УВОИ -н 4040 (ВО)

Millipore Supcr-Q (ВИ)

УВОИ

R040

(ВО)

«8рна(тех». Для предотвращения контаминации и образования устойчивых форм микроорганизмов 1 раз в неделю осуществляли профилактическую обработку поверхностей оборудования, промывку трубопроводов и баков сменяющимися дезинфектантами «Ди-хлор» и «Неосептал П15».

Таблица 2

Характеристика физико-химических показателей качества воды

Показатели качества воды Обозначение показателей Данные Значение шзию-химических показателей качества воды

Вода питьевая (водопроводная) Паровой конденсат После установки «Водопад» Вода очищенная (ВО) Вода для инъекций (ВИ)

Общая жесткость (ГОСТ 4151-72) мг/экв/л ЭД НП 3,3±0,2 Не более 7,0-8,0 0,053± 0,002 0,5 0,027±0,00 6 0,02±0,025

Содержание хлоридов (ГОСТ 4245-72) мг/л ЭД НП 127,0±1,7 3 Не более 350 2,0±0,1 До 6,5 6,5±0,9 До 10,0 - -

рН среды ЭД НП 7,7±0,04 7,6-8,0 5,1±0,1 4,5-6,4 6,1±0,1 5,0-5,5 5,6±0,06 5,0-7,0 5,6±0,3 5,0-7,0

Удельная электропроводность (УЭ) мкСм/см ЭД НП 2,9±0,14 Не более 4,3 0,4±0,01 Не более 1,1

Концентрация микроорганизмов КОЕ/мл ЭД НП 87 <100 0,05-0,1 <0,1

Бактериальные эндотоксины (ГФ XI, стр. 183) Ш/мл ЭД НП Менее 0,25 Не более 0,25 Менее 0,25 Не более 0,25

Себестоимость производства 1 т воды руб./т ЭД 9,66 696,30 191,30 298,43 465,55

Обозначения: ЭД — экспериментальные данные НП — нормативные показатели

Таким образом, на биопредприятии разработана и функционирует в течение многих лет технологическая линия по производству ВО и ВИ с годовым объемом 10700 т. Постоянный контроль показателей ТП производства и своевременные корректирующие действия обеспечили серийный выпуск стандартного по качеству продукта и получение среднегодового экономического эффекта в сумме 3042,3 тыс. рублей.

3.3.2. Совершенствование технологических процессов производства гидролизатных питательных сред

Известно, что состав и ростовые свойства гидролизатов определяет качество исходного сырья, активность и специфичность протеолитических ферментов, первичная структура белоксодержащих материалов (БСМ), степени их денатурированности, а также времени и условий гидролиза (Телишевская Л.Я., 2000).

Установлено, что промышленные серии гидролизатов нестандартны по составу и ростовому потенциалу, что послужило основанием для совершенствования технологии их производства. Анализ состава 150 производственных серий ПХ показал, что они существенно отличаются по составу и содержат в среднем 1100-1200 мг% общего азота, 700-900 мг% аминного азота (АА), 3,5-4,5% пептона, 150-200 мг% триптофана, 7,2 % аминокислот и пептидные фракции с ММ более 1000, 500 - 1000 и 300 - 500 D в количестве 49,44 и 7%. Гндролизаты, изготовленные из отходов сывороточного производства (фибрина, отварного фарша, крови доноров) существенно не отличались по физико-химическими показателям, но имели более высокое содержание пептидов с ММ выше 1000 D (55%) и 350-400 D (17%), содержали более низкую концентрацию микроэлементов и Сахаров, являющихся источником энергии для большинства микроорганизмов.

Большинство патогенных микроорганизмов, в том числе пастереллы, сальмонеллы и эшерихии гетеротрофны и удовлетворяют свои потребности в строго регламентированных количествах органического азота, пептидов и незаменимых аминокислот (Телишевская Л.Я., 2000). В сравнительном аспекте изучено влияние концентрации АА, пептона и триптофана па накопление микроорганизмов в биорсакторах (табл.3).

Таблица 3

Влияние состава бульона Хоттингера на накопление пастерелл,

сальмонелл и эшерихий глубинным методом в реакторе «Торнадо»

Наименование микроорганизма Наименование показателей БХ Накопление бактерий млрд/см1

Аминный азот мг% Пептон % Триптофан мг%

P. multocida Т80 186,5-199,2 200.4-204,4 205.5-215,0 1,48-1,50 1,48-1,52 1,50-1,59 59,0-62,0 53,0-63,0 61,0-63,0 19,6±0,68 20,0±0,71 21,8±0,92

S. dublin 373 228,4-230,1 231,0-249,7 252,7-259,1 1,30-1,41 1,48-1,50 1,60-1,90 50,0-51,0 50,0-55,0 51,0-54,3 45,6±0,87 49,8±0,49 51,8±0,80

Е. coli 320 228,6-232,6 240,0-249,1 250,2-254,1 1,20-1,48 1,44-1,58 1,71-1,96 50,0-61,0 51,0-55,0 60,0-64,0 44,4± 1,69 50,0±0,0 53,8±1,07

Установлена прямая зависимость уровня накопления пастерелл и эшерихий от концентрации АА бульона Хоттингера. Максимальное накопление S. Dublin 373 (49,8±0,49-51,8*0,80 млрд/см'1) и E.coli 320 (50,0±0,0-53,8±1,07 млрд/см1) регистрировали в образцах БХ, содержащих не менее 250 мг% АА. Уменьшение концентрации АА ниже 230 мг% сопровождалось достоверным (р<0,01-0,003)

снижением уровня накопления сальмонелл и эшерихий соответственно на 6,2 и 9,4 млрд/см1 Аналогичной закономерности при производстве пастереллезного антигена не выявлено. Однако, при увеличении АА выше 200 мг% накопление пастерелл было более стабильным. Показано также, что пептон и триптофан в изученных концентрациях не оказывали существенного влияния на накопление пастерелл, сальмонелл и эшерихий. Анализ полученных данных и результаты производственной деятельности предприятия свидетельствует о важности и необходимости выбора качественных серий БХ, содержащих не менее 200 мг% АА, что оправдано и экономически обосновано.

3.3.3. Совершенствование и масштабирование процессов периодического культивирования пастерелл, сальмонелл и эшерихий

При серийном производстве лечебных СК требуются большие объемы бактериальных антигенов. Для этих целей использовали традиционный метод культивирования микроорганизмов, который малоэффективен, не технологичен и трудоемок. На Армавирской биофабрике применяют ферментеры, с эффективными параметрами глубинного периодического культивирования микроорганизмов.

Таблица 4

Накопление микробных тел при культивирования пастерелл, сальмонелл и эшерихий

Наименование показателей Наименование микроорганизмов

РавСеигеПа ти1(ос1(1а Т-80 8а1топе11а СурЫтипит 371 ЕясЬепсЫа соИ 320

Доза заражения (млрд./см') 0,5 1,0 1,0

Длительность культивирования (час) 8-9 10-12 10-12

Накопление бактерий (млрд./см ')

Биореактор «Торнадо» 23,6±0,60 51,0± 1,00 50,2±0,66

Модернизированный реактор (объемом 1000 л) 9,3±0,30 51,2±0,58 50,4±0,81

Бутыли (объемом 20 л) 2,9±0,19 13,8±0,58 9,14±0,34

Жизнеспособность (%) микроорганизмов 90±5,0 95±5,0 95±5,0

Показано, что поддержание оптимальных ТП периодического культивирования микроорганизмов в биореакторе «Торнадо» обеспечивает максимальное накопление штаммов пастерелл (22,6±1,6 млрд/см3), сальмонелл (51,2±0,6 млрд/см3) и эшерихий (50,4±0,8 млрд/см3) при сохранении ими исходных ростовых, морфологических и биохимических показателей. Замена стационарного на глубинный метод культивирования позволила сократить длительность роста пастерелл, сальмонелл и эшерихий на 10-12 ч, повысить накопление бакмассы соответственно в 8, 3,6 и 5,2 раза, уменьшить потребность в БХ и 2,5-3 раза и снизить затраты на производство стандартных антигенов (табл.4).

Таблица 5

Показатели роста пастерелл, сальмонелл и эшерихий при периодическом культивировании микроорганизмов

Наименование микроорганизмов Наименование показателей

Максимальная удельная скорость роста (Цтах), 1/ЧаС Минимальное время генерации (Бшт), час Продолжительность логарифмической фазы роста (1„о, ), час Продолжительность фазы приспособлени я (I,шг), час

Р. гтШоЫйа Т-80 0,35 1,97 3,6 Практически отсутствует

БЛурЫтигшт 371 2,11 0,33 3,0 0,2

Е. соН 320 2,04 0,34 3,1 0,2

Показано также (табл.5), что предложенная технология периодического культивирования микроорганизмов достаточно эффективна и позволяет минимизировать фазы приспособления (1лаг) и время одной генерации повысить удельную скорость роста (цта*) и длительность фазы экспоненциального роста (1т,г) бактерий. Полученные результаты указывают на высокий ростовой потенциал ПХ и БХ, оптимальность ТП периодического культивирования микроорганизмов и производства активных антигенов.

Установлена возможность использования ГПС из отходов сывороточного производства для культивирования микроорганизмов. Показано, что клетки пастерелл, сальмонелл и эшерихий имели типичную морфологию, культуральные и биохимические показатели, обладали выраженными ростовыми свойствами и характеризовались высокой жизнеспособностью. Однако, максимальное накопление пастерелл, сальмонелл и эшерихий регистрировали в ПС на основе БХ с добавлением (10%) гидролизата форменных элементов крови (20,0 ± 0,7; 51,0 ± 0,4 и 50,2 ± 1,5 млрд/см5 ) и нативной СК КРС (21,2 ± 0,4; 51,0 ± 0,4 и 53,8 ± 1,4млрд/см3 ). Экономический эффект от внедрения в практику гидролизатов из отходов сывороточного производства составил в год до 20-25% от стоимости БХ.

В целях масштабирования, оптимизации и стандартизации промышленного производства БА была разработана, смонтирована и запущена в эксплуатацию технологическая линия, оспащснная биореакторами различного объема, емкостями для изготовления растворов и антигенов, сепараторами для концентрирования и трубопроводами из нержавеющей стали для подачи и хранения ВО и ВИ, растворов и антигенов. Предусмотрено разделение людских и материальных потоков и обеспечение стерильности производства антигенов, растворов, безопасность сотрудников и окружающей среды. Статистический контроль и валидация показателей, приборов и ТГ1 обеспечили серийное производство в 3,6-8 раз более активных антигенов. Пригодность и перспективность полученных антигенов подтверждена на биопредприятии при изготовлении вакцин и 3-х видов лечебных СК животных. Внедрение в практику технологических линий обеспечило более высокий уровень механизации и автоматизации ТП и получение стандартных по активности БА, снижение себестоимости продукции и повышение производительности труда.

3.4. Разработка и стандартизация технологических процессов производства и методов контроля активности вирусных антигенов

3.4.1. Паспортизация сублиний клеток MDBK-субстратов производства вирусов ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота

В сравнительном аспекте изучены и паспортизированы 2 сублинии клеток MDBK в соответствии с требованиями ВОЗ № 848 и РД 42-28-10-89. Показано, что ТК MDBK-E представлена мелкими эпителиоподобными клетками с четко выраженными границами, не зернистой цитоплазмой, а интерфазные ядра округлой формы содержат 1-4 ядрышка. Напротив клетки сублинии MDBK-B были более крупными, зернистыми с незначительной вакуолизацией цитоплазмы. Цитопатических изменений в монослойиых ТК не выявлено. Число хромосом в клетках сублиний MDBK-E и MDBK-B колеблется соответственно от 43 до 58 и от 49 до 104, а модальное число представлено 51 и 52 хромосомами, составляющими в популяции 30 и 58%. Для сублиний клеток также характерны робертсоновские транслокации гетеролитического типа [Султанова З.Д. и др., 1968; Дьяконов Л.П., 2009], приводящие к изменению морфологии и числа хромосом. В кариотипе сублинии клеток MDBK-E кроме того, выявлены 2 маркерные хромосомы -большой мегацентрик и большая субмегацентрическая хромосома. Микоплазменная инфекция и контаминация вирусом BVD установлена в клетках сублинии MDBK-B. Напротив клетки сублинии MDBK-E не содержали контаминантов, характеризовались выраженным ростовым потенциалом, сохраняли исходную морфологию и были наиболее перспективным субстратом для производства антигенов вирусов ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота.

В целях повышения эффективности производства вирусных антигенов и снижения уровня апоптоза клеток в культуре были подготовлены и аттестованы эталонный (Master seed - 20 ампул) и рабочий (Working seed - 150 ампул) банки сублинии клеток MDBK-E, сохраняемые в криобанке. Выживаемость клеток после размораживания составила 87-94%. Полученные клетки были стерильными, характеризовались удовлетворительными адгезивными и ростовыми свойствами и не содержали контамипатов. Морфологические и культуральные свойства ТК восстанавливались после криоконсервирования через 2-3 пассажа и в течение 3-х лет хранения и сохраняли чувствительность к вирусам ПГ-3 и ИРТ. Объемы аттестованных клеток рабочего банка обеспечивали производство и контроль антигенов ПГ-3 и ИРТ стандартным клеточным субстратом в течение 10 лет (срок наблюдения).

3.4.2 Цитометрический анализ сублиний клеток MDBK

Проточная цитометрия (ПЦ) и сортировка - это современный метод анализа структурных компонентов (ДНК, РНК, белка), параметров клеточного цикла, морфологической характеристики клеток и других показателей, что послужило основанием для сравнительной оценки и паспортизации сублиний клеток MDBK-E и MDBK-B (Мораска Л. и др., 1989; Полетаев А.И., 1989; Chápiro N.M., 1995).

Тест-культуры были охарактеризованы методом ПЦ по размерам клеток, гранулярности, фазам клеточного цикла и программированной клеточной гибели -апоптозу. Показано, что клетки сублиний MDBK-E и MDBK-B варьируют по

величине и имеют среднестатистические размеры (18±3,65) и (21,3±4,53) мкм соответственно, что характерно для ПЛК почек телят на стадии становления.

Показатель гранулярности (МЕАМ) характеризует состояние внутренней структуры клеток, соотношение ядра и цитоплазмы, а также свидетельствует о наличии в популяции аномальных и апоптотических клеток. Установлено, что изолированные клетки сублиний MDBK существенно различались по показателю МЕАМ: более гранулярными были клетки MDBK-B (444); для клеток MDBK-E это показатель не превышал 387, что свидетельствует о неадекватных условиях поддержания, нарушениях процесса деления и появления в популяции сублинии MDBK-B аномальных клеток.

Распределение ДНК по фазам клеточного цикла определяли путем анализа популяции клеток, полученных в период активного роста и обработанных интеркалирующим красителем йодитом пропидия, в интегральном канале флуоресценции «Лазерного проточного цитофлуориметра-сортера EPICS «ELITE» (USA) с использованием барьерных фильтров 488 ВК, 488 ВГ и 655 BP. Анализ полученных гистограмм распределения клеток по фазам клеточного цикла показывает, что сублиния клеток MDBK-E является более перспективным субстратом для культивирования вирусов. Это обусловлено низкими значениями размеров, гранулярности и более высокими показателями пролиферирующих клеток в фазах G2+M (17,5%), S+G2+M (63,8%) и оптимальным соотношением G2/G1 равным 1,96, что указывает на практическое отсутствие в популяции клеток с измененным количеством ДНК.

Программированная (физиологическая) гибель клеток - апоптоз характеризуется сморщиванием клеток, межнуклеосомной фрагментацией ДНК с последующей дезинтеграцией мембран и образованием апоптотических телец (AT). Содержание апоптотических клеток в популяции ТК оценивали по распределению клеток окрашенных иодитом пропидия в логарифмическом канале флюоресценции с использованием барьерных фильтров 488 ВК, 488 BP и 625 BP. Клетки, содержащие ДНК меньше 2 п считали апоптотическими. Показатели апоптоза исследуемых сублиний MDBK-E и MDBK-B не превышали нормативных (14-19%) значений и находились соответственно на уровне 3,9 и 6,8%. Высокий ростовой потенциал, отсутствие контаминации и нормальные показатели клеточного цикла и апоптоза дают основание рекомендовать сублинию клеток MDBK-E в качестве субстрата для производства и контроля активности вирусов.

3.4.3. Оптимизация условий промышленного культивирования вирусов ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота

Увеличение объемов серийного производства вирусных антигенов и их активности представляет для практики несомненный интерес. Штаммы НТК 45/86 и ТК-АУВИЭВ вирусов ПГ-З и ИРТ культивировали стационарным и роллерным методами в ТК клеток MDBK-E и MDBK-B (контроль) при оптимальных технологических параметрах.

Показано, что ТК клеток MDBK-E обладает более высокой чувствительностью и стационарным методом обеспечивает максимальное накопление штамма TK-A/ВИЭВ (7,43±0,08 Ig ТЦЦ50/™'1). В тоже время испытанные ТК MDBK-E (7,I7±0,12 Ig ТЦД,,,^1) и MDBK-B (7,11±0,14 Ig ТЦДтм3) оказались практически равноценными но уровню накопления вируса ПГ-3. Напротив роллерпый метод культивирования оказался более эффективным и

по сравнению с контролем (стационарным способом) обеспечивал достоверно (р<0,05) более высокое накопление не только штамма ТК-А/ВИЭВ вируса ИРТ (7,60±0,04 ^ ТЦДдасм'), но и штамма ПТК 45/86 вируса ПГ-3 (7,47±0,06 ^ ТЦДдо/см1). Показано также, что доза заражения (Д) оказывает заметное влияние на результативность культивирования вирусов. Максимальное накопление штаммов ПТК 45/86 (7,5+0,05 \% ТЦД50,СМ3) и ТК-А/ВИЭВ (7,63±0,11 ^ ТЦДш/«,3) вирусов ПГ-3 и ИРТ наблюдали через 72-76 и 48 часов культивирования при инфицирующей дозе 5,0 ^ ТЦД50 на мл клеточной суспензии. Уменьшение Д сопровождалось достоверным (р<0,001) снижением уровня накопления вирусов.

В последние годы для предотвращения контаминации ТК бактериями и микоплазмами успешно используются препараты фторхинолонового ряда, в том числе «Энрофлон-К», (Моисее .1.М., 1988; Ночевный В.Т. и др., 2002). В наших экспериментах «Энрофлон-К» в дозе 5-10 мкг не оказывал отрицательного влияния на культуральные, морфологические свойства, на уровень и сроки накопления вирусов ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота.

Преимущества роллерного метода культивирования и постоянное использование стандартных по качеству ПС, аттестованной линии клеток (МЭВК-Е), оптимальной дозы заражения и антибактериального препарата «Энрофлон-К» явились основой эффективного производства активных антигенов, пригодных для серийного производства поливалентных СК животных.

3.5. Система менеджмента качества - основа эффективного производства и стандартизации лечебных сывороток крови

На Армавирской биофабрике проведен комплекс мероприятий по созданию на предприятии высокоэффективного производства поливалентных СК животных. Реализация указанных задач предполагает переход предприятия на более высокий уровень организации труда, контроля и эффективного управления качеством продукции, повышения рентабельности и конкурентоспособности производства гипериммунных СК животных на внешнем рынке, а также инвестиционной привлекательности предприятия путем внедрения «Системы менеджмента качества» (СМК).

Внутренний аудит производственной деятельности предприятия показал, что условия производства и качество поливалентных СК не соответствовали требованиям вМР, поэтому была принято решение разработать и внедрить на предприятии СМК. При решении этой задачи основное внимание было направлено на пересмотр методологической базы в области управления производством и повышение качества готовой продукции посредством организационных и управленческих мероприятий, а также современных технологических решений. В результате проведенной работы на биопредприятии были внедрены в производство следующие разработки:

- создана иерархическая структура, определяющая «Политику в области качества», модернизацию производства, методы оценки (ОБТК, ОКК) и результаты контроля качества, а также принятия аргументированных решений о продолжении, коррекции ТП или прекращении производства серий СК;

- разработаны и утверждены в установленном порядке 245 нормативных документов (НД) I, II и III уровня по изготовлению, контролю и применению СК, а также инструкции различного назначения, СОПы, маршрутные карты (МК),

спецификации на различные материалы, положения по управлению документооборотом, программы перспективного развития производства, валидационным испытаниям ТП, контрольно-измерительным приборам и другим методикам;

- организовано постоянное обучение и аттестация кадров;

- в соответствии с требованиями ГОСТ Р 52538-2006, ГОСТ Р ИСО 146/44-04 и СНиП построены новые и реконструированы существующие помещения различного класса чистоты общей площадью 2500 м2;

- чистые помещения (ЧГ1) класса В и Д оснащены современными приборами и оборудованием, которые обеспечивают регистрацию показателей и автоматическое управление ТП, на основе которых созданы технологические линии для производства ВО и ВИ, ПС, растворов, культивирования микроорганизмов и вирусов, изготовления комплексных антигенов, а также подготовки, гипериммунизации и эксплуатации ВП и процессов получения, обработки и контроля качества СК животных;

- для дезинфекции ЧП, оборудования и предотвращения образования устойчивых форм микроорганизмов проводится еженедельная смена дезосредств «Элатинола» и ПВК и постоянное применение «Установки озонирующей переносной ОП-4» - Микросан;

- изготовлены и паспортизированы эталонные и рабочие банки посевного материала (ПМ) микроорганизмов, вирусов и перевиваемой линии клеток MDBK;

- определены критические точки риска ТП, организован их мониторинг и валидация, определены методы их коррекции с учетом объективных документированных факторов при культивировании микроорганизмов, изготовлении антигенов и производстве лечебных СК.

Реализация указанных мероприятий на практике позволила минимизировать риски перекрестного заражения материалов, выявить и устранить ошибки в ТП производства, обеспечить комфортные условия и работоспособность персонала и, как результат, исключить брак и существенно повысить выход, активность и стандартность поливалентных СК животных.

3.6. Разработка технологии производства и обеспечение качества «Иммуносерум - сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят»

Вирусные пневмоэитериты (ВПЭ) телят имеют чрезвычайно широкое распространение и наносят животноводству огромный экономический ущерб. Основными возбудителями пневмоэнтеритов КРС считают вирусы ПГ-3, ИРТ, ВД-БС, рота- (РВ), корона (КВ) и аденовирусы (АД) в различных сочетаниях. Для профилактики острых вспышек ВПЭ телят предложен широкий спектр моно- и ассоциированных вакцин, которые успешно применяются в ветеринарной практике. Несмотря на это проблема сохранности новорожденных телят (Н'Г) остается актуальной. Для защиты новорожденных от респираторио-кишсчпых инфекций (РКИ) наиболее широко используются молозиво и гипернммунные СК, многие из которых разработаны, по не производятся биопромышленностыо. Поэтому исследования направленные на разработку и серийное производство СК против РКИ являются весьма актуальными и востребованными практикой (Осидзе

Д.Ф., 1981; Сюрин В.Н. и соавт., 1988; Федоров Ю.Н. и соавт., 1996; Красочко П.А. и еоавт., 1997; Гаффаров Х.З., 2000; Басова Н.Ю., 2002; Сергеев В.А. и соавт., 2007).

Технологию изготовления поливалентной СК против ВПЭ телят совместно разрабатывала группа авторов под руководством В.В. Гуненкова. В качестве поливалентных антигенов использовались очищенные и сконцентрированные штампы вирусов, аттестованные в ВГНКИ и репродуцированные в первичных и перевиваемых культурах клеток, а так же коммерческие вакцины против 6 видов ВПЭ телят. Донорами СК служили ВП красной степной породы массой не менее 400 кг.

Рабочая схема гипериммунизации включает 4-х кратное введение комплексных антигенов с интервалом 14 суток в/м и п/к в области шеи.

В качестве культуральных моделей (КМ) были подобраны и аттестованы первичные (ПЭК, Г1Т, ТБ) и перевиваемые (МЭВК, СПЭВ, ПЭК, Таурус-2) тест-культуры и штаммы вирусов РВ (РП-82), ИРТ (МВА-80/15), ВД-БС (ВК-В1), КВ (КП-23), ПГ-3 (МВА-77/14) и АР (В-10), определены чувствительность КМ, оптимальные условия стационарного и роллерного культивирования и контроля активности полученных антигенов. Показано, что по сравнению с первичными ТК ПЛК являются более чувствительными КМ и роллерным методом обеспечивали максимальное накопление вирусов РВ(7,0±0,60), ИРТ (7,5±0,43), ВД-БС (6,5±0,18), КВ (7,0±0,35, Г1Г-3 (7,5±0,60) и АД(6,5±0,57) ^ТП/и,,«1. В первичных ТК накопление вирусов было достоверно ниже (р<0,05) на 0,7-1,0 1§ТЦДу1/си\

Очистку и концентрирование вирусных антигенов осуществляли традиционным методом с использованием сульфата бария, а элюцию вирусов с сорбента проводили при помощи 0,2-0,25 М раствора лимоннокислого натрия. Культуральный антиген АД вируса инактивировали формальдегидом и сорбировали на гидроокиси алюминия. Раздельно полученные антигены вирусов смешивали в равных объемах и использовали для гипериммунизации ВП.

Сравнительные испытания показали, что уровень накопления антител в СК доноров зависит от активности культуральных антигенов (КА). Четырехкратное введение комплексных антигенов, изготовленных в ПЛК, сопровождалось более высоким накоплением антител против РВ (1:32-1:64), ИРТ (1:64-1:128), ВД-БС (1:64-1:128) в РН; КВ (1:64-1:128), ПГ-3 (1:256-1:512) и АД (1:128-1:256) в РТГА. Было также отмечено, что дальнейшее повышение активности, доз и кратности введения (5 и 6) комплексных антигенов не приводило к существенному увеличению активности лечебных СК.

Высокая себестоимость и трудоемкость серийного производства культуральных антигенов и контаминация ПЛК микоплазмами послужили основанием для поиска альтернативных вирусных антигенов. При решении данной проблемы для гипериммунизации ВП были испытаны коммерческие вакцины.

Сравнительные испытания показали (табл. 6), что концентрированные антигены (КА), более активны, чем коммерческие вакцины и характеризуются выраженными антигенными свойствами. При их применении наблюдается более стабильное накопление специфических антител. В тоже время достоверных различий (р<0,05) в активности поливалентных СК, изготовленных с использованием культуральных антигенов и коммерческих вакцин не установлено. Полученный результат достигнут за счет предварительного 2-х кратного группирования ВП вакцинами против ВПЭ в период карантинирования. Таким образом, предложенный и апробированный нами набор антигенов и рациональная

схема гипериммунизации и эксплуатации ВП позволили получить практически равноценные по активности и эффективности лечебные сыворотки с широким спектром действия против 6 возбудителей вирусных пневмоэнтеритов КРС. Процесс фундирования и последующий цикл гипериммунизации и эксплуатации ВП коммерческими вакцинами были чрезвычайно эффективными и экономически оправданными и позволили стабилизировать производство и повысить активность промышленных серий СК против ВПЭ телят до максимальных значений.

За период 2010-2013 гг. было изготовлено и реализовано 38 серий поливалентной СК против ВПЭ телят в объеме 17762 л, которые по физико-химическим свойствам и активности соответствовали требованиям СТО 004828490018-2007. Замена культурального антигена на коммерческие вакцины в период 2012-2013 гг. позволила повысить рентабельность производства с 10,4% до 121% и прибыль с 5409 до 31460 рублей за 1 т/доз СК. Активность компонентов 38 производственных серии поливалентной СК были в основном стандартными (РВ - 5,6±0,10; ИРТ - 6,6±0,2; ВД-БС - 4,7±0,1 в РН; КВ - 5,6±0,1; ПГ-3 - 7,8±0,1; АД - 6,6±0,1 1о^2 в РТГА) и обеспечивали на практике защиту и сохранность новорожденных телят от заражения вирулентными возбудителями ВПЭ крупного рогатого скота.

Стабильность серийного производства поливалентной СК подтверждена при помощи контрольных карт Шухарта типа X. Показано, что показатели активности компонентов поливалентной СК, изготовленные за 4-х летний период находились в пределах статистических границ ±3з, что указывает на стабильность ТП производства. Препарат сохранял активность на исходном уровне при температуре (2±8) С в течение 18 месяцев (срок наблюдения).

Две производственные серии поливалентной СК (3 и 8, изготовленные в 2012 г. были испытаны в племзаводе ООО «Наша родина» (I) и совхозе «Прикубанский» (II) Краснодарского края. С лечебной целью СК вводили двукратно в/м в дозе 25-40 см3 с интервалом 24 ч. Для профилактики СК применяли двукратно в дозе 15-20 см3 через 2-4 ч. После рождения телят СК добавляли в молозиво (молоко) в объеме 25-30 см3.

Серотерапия и серопрофилактика оказались эффективными и не вызывали изменений в общем состоянии организма животных. Сохранность новорожденных телят в I и II хозяйствах в результате лечения и профилактики составила соответственно 92,9 и 92,8%, 96,7 и 96,2%. Серологические исследования, проведенные в указанных хозяйствах показали, что в крови 57 и 73% животных содержится комплекс антител, соответственно к вирусам ИРТ, КВ, ВД-БС и ПГ-3, ВД-БС, КВ, что указывает на их этиологическую значимость в патогенезе заболеваний новорожденных телят вирусными пневмоэнтеритами.

Производственные испытания поливалентной СК были проведены также в ООО «Наша родина» и племзаводе «Кубань», содержащих соответственно 2546 и 686 голов КРС, в том числе по 168 и 178 голов новорожденных телят, среди которых периодически наблюдались вспышки заболеваний животных ВПЭ. Серотерапия и серопрофилактика новорожденных телят оказалась эффективной и обеспечила 100% защиту от возбудителей вирусных пневмоэнтеритов.

Таблица 6. Схема и эффективность гипериммунизации волов-продуцентов при производстве «Иммуносерум — сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят»

Вариант комплексного антигена Характеристика комплексного антигена Состав комплексных антигенов Дозы антигена, мл. Дни иммунизации, сутки Активность компонентов СК,

Метод контроля

РН РТГА

РВ ИТР ВД-БС КВ АД ПГ-3

I Культурный концентрированный очищенный антиген Производственный - Армавирская биофабрика РВ 15-30-30-30 1 2.0-3,0 2,0-3,0 2,0-3,0 3,040 2,0-3,0 2.0-3,0

ИРТ

14 3,0-5,0 4.0-5,0 3.0-4,0 4,0-6,0 4,0-5,0 4,0-6,0

ВД-БС

кв 28 5,0-6,0 6,0-7,0 5,0-6,0 6,0-7,0 6,0-7,0 7,0-8,0

ПГ-3

42 6.0-7,0 7,0-8,0 6,0-7,0 7,0-8,0 7,0-8.0 8.0-10,0

АД 5-10-10-10

Активность серий (п=5) поливалентной СК (т+т) 5,8±0,37 6,6±0,24 6.0±0,32 7,0±0,32 6,8±0,32 8,0±0.37

П Вакцина против ротавирусной, корона-вирусной инфекции и вирусной диареи КРС эмульсионная инактивированная СТО 00495527-0160-2010 Производитель - ВНИИЗЖ РВ КВ ВД-БС 10-20-20-20 1 1.0-2,0 1,0-2,0 1,0-2,0 2,0-3,0 1,0-2,0 1,0-3,0

14 2.0-3,0 2,0-3,0 3,040 3,0-4,0 2,0-3,0 3.0-4,0

Вакцина против паратриппа-3, инфекционного ринятрахеита КРС сухая культуралъная ассоциированная СТО 00482861-0016-2006 Производитель Ставропольская биофабрика ПГ-3 ИРТ 5-10-10-10

28 4,0-5,0 4.0-5,0 4,0-6,0 5,0-6,0 4,0-5,0 5,0 -6,0

Купьтуральный инаетивированный антиген из штамма В-10 аденовируса КРС Производитель - Армавирская биофабрика АД 5-10-10-10 42 6.0 -7,0 6,0-7,0 5,0-7,0 6,5-7,0 6,0-7,0 7,0-9,0

Активность серий (п=5) поливалентной СК (га±т) 6,2+0,37 5,8±0,37 6,4±0,24 6,8±0,38 6,2+0.36 8,4±0,24

Таким образом, в результате исследований впервые разработана технология изготовления, система обеспечения качества и организовано серийное производство «Иммуносерум - сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят». Поливалентная сыворотка характеризуется безвредностью, высокой активностью, выраженным лечебным и профилактическим эффектом, востребована практикой и содержит в своем составе широкий спектр специфических антител, способных нейтрализовать патогенетическое действие 6 видов возбудителей вирусных пневмоэнеритов КРС. Приоритет и новизна «Способа получения поливалентной СК против вирусных пневмоэнеритов телят» защищены патентом Российской Федерации за № 2407543. Среднегодовой экономический эффект от внедрения в практику разработанных инноваций составил 3126100 рублей.

3.7. Совершенствование технологии производства и обеспечения качества

«Сыворотки аитиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных»

Возбудители эшерихиоза сельскохозяйственных животных представлены 170 серогруппами и более 10000 серологическими вариантами. Однако заболевание животных вызывают лишь серовары эшерихий, обладающие факторами патогенности: адгезивными антигенами (АА), термостабильными (ТС) и термолабильными (ТЛ) энтеротоксинами. Специфическая профилактика эшерихиоза новорожденных животных малоэффективна, поэтому их защита от инфекции реализуется за счет своевременной дачи молозива или при помощи лечебных СК животных.

При создании лечебных СК в качестве антигена использовались штаммы эшерихий с широким спектром факторов патогенности. Для производства поливалентного антигена из 36 производственных и музейных штаммов были отобраны совместно с Пирожковым М.К. бактериальные клетки (БК) эшерихий 3-х серогрупп 09, 078 и 0141 - основных возбудителей эшерихиоза сельскохозяйственных животных, полисахаридные капсульные антигены К30, К80 и К87, белковые АА К88, К99, 987Р и Ь41 в фосфатно-мочевинном буфере (ФМБ), а также ТС, ТЛ и веротоксины (УТ).

Штаммы 305-37/11, 334-37/12 и 355-37/13, рекомендуемые в качестве поливалентных капсульных антигенов (078:К80, 0141:К87:К88 и 09:К30) характеризовались стабильностью биологических свойств, высокой вирулентностью и агглютинировались гомологичными сыворотками.

Штаммы 453-37/17, 454-37/17, 397-37/14 и 398-37/14 продуценты АА К88, К99, 987Р и И 41 с активностью 1:8-1:16 в РДП с МкАт представляют собой филаментозные образования на поверхности БК, отделение которых осуществляли путем тепловой обработки бакмассы в ФМБ. Предлагаемые штаммы эшерихий вирулентные для белых мышей (1Л)5о = 265-295 млн. Мт) не образуют гемолизины, но синтезируют ТЛ и ТС энтеротоксины с активностью в РДП на уровне 1:8-1:16. АА введены в состав поливалентного антигена с целью синтеза и накопления в составе СК волов-продуцентов антиадгезивных антител, препятствующих прикреплению энтеропатогенных эшерихий к эпителию тонкого отдела кишечника животных.

Штамм E.coli 904 является активным продуцентом VT, который стабильно накапливается в БХ в титре 1:4-1:8 (в РДП) в процессе глубинного культивирования микроорганизма. ТС, TJI и VT токсины использовали в поливалентном антигене для синтеза и накопления в СК доноров антитоксических антител, нейтрализующих энтеротоксическое действие энтеропатогенных возбудителей эшерихиоза.

Отобранные штаммы были депонированы в коллекции микроорганизмов ВГНКИ, на их основе изготовлены MS и WS банки посевных материалов. Показано также, что более 30 пассажей через лабораторных животных, сублимационная сушка и длительное культивирование на искусственных ПС не оказывали негативного влияния на продукцию штаммами факторов патогенности, которые сохраняются на исходном уровне, на протяжении многолетних наблюдений.

Изготовление эшерихиозных антигенов осуществляли стационарным способом и в биореакторах. Замена стационарного на периодический метод культивирования в биорсакторе «Торнадо» позволила повысить уровень накопления эшерихий в 5,9 раза и сократить сроки изготовления бакмассы в 2 раза.

При получении соматических и полисахаридных капсульных антигенов штаммы 305-37/11 и 355-37/13 культивировали вместе ([вариант), а штамм 334-37/12 (II вариант) выращивали в отдельном биореакторе. Надосадок утилизировали, а бакмассу вариантов объединяли в соотношении 2:1, а затем ресуспендировали в супсрнатанте, содержащем TJ1, ТС и VT токсины до концентрации 12,5-13 млрд Мк/см3 и инактивировали формалином (0,3%) в течение 16 суток при температуре (37-г38)°С. Соответствующий требованиям ИД антиген использовался для гипериммунизации ВП.

Продуценты АА выращивали глубинным методом. Бакмассу осаждали центрифугированием при 7-8 тыс. об/мин в течение 30 мин, а надосадок использовали в качестве TJ1 и ТС токсинов с активностью 1:4-М:8 в РДП, а осадок клеток ресуспендировали в ФМБ до 100-120 млрд/см1 и прогревали при 60°С в течение 20 мин. Сунернатанты штаммов АА отделяли от бакмассы цстрифугированием, объединяли в равных объемах, контролировали активность в РДП и использовали в качестве компонента поливалентного антигена с активностью не ниже 1:8-г1:16.

При изготовлении VT бакмассу штамма 904 (0157: Н7), осаждали центрифугированием, надосадок утилизировали, а осадок микроорганизмов ресуспендировали в физрастворе, содержащем 5000 сд/см1 нолимиксина В, до 100 млрд. Мк/см3 и экстрагировали токсин в течение 30 мин при температуре 37°С. Бакмассу осаждали центрифугированием и утилизировали, а активность VT в надосадке достигала 1:4ч-1:8 в РДП. Сунернатанты антигенов TJ1, ТС и VT токсинов инактивировали формалином (0,3%), объединяли в равных объемах и использовали для ресуспепдирования бактериальных клеток-продуцентов соматических и полисахаридных капсульных антигенов.

Изготовленные антигены контролировали на стерильность, безвредность на белых мышах, остаточное содержание формалина и рН среды. Адгезивные антигены в объеме 240^320 см3, соматические и полисахаридиые капсулыше антигены, содержащие в своем составе ТЛ, ТС и VT в количестве 760-Н580 см3, соответствующие требованиям СТО 00482849-0020-2007 объединяли вместе, фасовали в стеклянные бутыли и использовали для гипериммунизации доноров.

Срок годности поливалентного эшерихиозного антигена при температуре (2+8)°С 6 месяцев (срок наблюдения).

Волов, предназначенных для гипериммунизации, карантинировали, подвергали исследованию и необходимой обработке согласно действующей НД. К эксплуатации допускали животных 2,5-г8-летнего возраста и массой не менее 400 кг.

Схема гипериммунизации ВП предусматривала 10 инъекций в области шеи, верхней части туловища. Агглютинирующую и преципитирующую активность образцов СК контролировали РА и РДП. Результаты изменений активности СК в процессе гипериммунизации представлены в таблице 7.

Таблица 7

Динамика антителообразования у волов-продуцентов к протектнвным антигенам эшерихий

№ инъекции Сроки введения антигена, сут. Дозы антигена, м3 Титр антител в сыворотке крови волов-продуцентов к антигену:

09: КЭО 078: К80 0141: К80 К88 К99 987Р Р41 ТЛ-токсин ТС-токсин УТ-токсин

РА РА РДП РА РДП РА РДП РА РДП РДП

1 1 10

2 4 20 1:25 1:25 1:25 1:25 - 1:20 - 1:20 - 1:25 - - - -

3 8 30 1:50 1:50 1:25 1:50 - 1:40 - 1:20 - 1:50 - - - -

4 12 40 1:100 1:100 1:50 1:100 - 1:80 - 1:40 - 1:100 - - - -

5 18 60 1:200 1:400 1:100 1: 200 следы 1: 160 следы 1:80 следы 1:200 след ы следы - -

6 22 80 1:400 1:800 1:200 1: 400 1:1 1: 320 1:1 1:160 следы 1:400 1:1 следы следы следы

7 26 100 1:400 1:800 1:400 1: 800 1:2 1: 640 1:2 1:320 1:1 1:800 1:2 1:1 следы следы

8 30 120 1:800 1: 1600 1:800 1: 1600 1:4 1: 640 1:2 1:640 1:2 1: 1600 1:4 1:2 1:1 1:1

9 35 140 1: 1600 1: 3200 1: 1600 1: 3200 1:8 1: 1280 1:4 1: 1280 1:4 1: 1600 1:4 1:4 1:2 1:2

10 40 160 1: 3200 1: 3200 1: 3200 1: 3200 1:8 1: 1280 1:4 1: 1280 1:4 1: 3200 1:8 1:4 1:2 1:2

Показано, что поливалентный антиген (ПА) характеризуется выраженными антигенными свойствами и уже через 4 суток с момента первой инъекции в СК животных-продуцентов в РА выявляются антитела к соматическим, полисахаридным капсульным и АА соответственно в титрах 1:25 и 1:20. Следы антител к энтеротоксинам в СК обнаруживаются в РДП лишь на 18-22 сутки наблюдения после 5-6-кратного введения антигена и достигают максимальной активности (1:2ч-1:4) к окончанию цикла гипериммунизации ВП. С увеличением количества инъекций и доз вводимого ПА происходит максимальный прирост антител, в основном, к соматическим и полисахаридным капсульным и адгезивным антигенам после 9-кратной иммунизации соответственно до уровня 1:3200 и 1:1280-1:3200 в РА и 1:4-М:8 в РДП активность которых существенно не меняется в процессе дальнейшей гипериммунизации и

эксплуатации ВП. Предложенная схема введения ПА по сравнению с прототипом («Сывороткой поливалентной против колибактериоэа (эшерихиоэа) сельскохозяйственных животных») позволила сократить количество инъекций с 12 до 10, а сроки гипериммунизации - с 50 до 40 суток. Производственные серии поливалентной С К по сравнению с прототипом содержали более высокие титры антител к соматическим и полисахаридным калсульным антигенам - 1600:6400 против 1:50-1:400; к адгезивным антигенам К88 и К99 - 1:640- 1:6400 против 1:501:200 в РА и 1:4-1:16 против 1:1 в РДП и к ТЛ токсину - 1:2-1:4 против 1:1. В предлагаемой сыворотке, кроме того, выявлены высокие титры антител к адгезивным антигенам 987Р и Р41, ТС и УТ токсинам (табл.8).

Таблица 8

Оценка содержания антител к соматическим, полисахаридным капсульным, адгезивным антигенам, ТЛ, ТС и УТ токсинам в промышленных образцах лечебной сыворотки.

Антиген эшерихий Сыворотка антиадгезивная и антитоксическая против эшерихиоза сельскохозяйственных животных Сыворотка поливалентная против колибактериоэа (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных

Титр антител в РА Титр антител в РДП Титр антител в РА Титр антител в РДП

09:К30 078:К80 1:1600-1:6400 1:3200-1:6400 Не тестируется 1:100-1:400 1:100-1:400 Не тестируется

0141 :К87 1:1600-1:6400 1:50-1:200

К12:К88 1:1600-1:6400 1:8-1:16 1:100-1:200 1:1

К12:К99 1:640-1:2560 1:4-1:8 1:500-1:100 1:1

К12:987Р 1:640-1:2560 1:4-1:8 - -

К12:Р41 1:320-1:1280 1:2-1:4 - -

'ГЛ-токсин ТС-токсин Не тестируется 1:2-1:4 1:2-1:4 Не тестируется 1:1

УТ-токсип 1:2 -

Лечебные дозы (30-40 см3) поливалентной сыворотки против эшерихиоза новорожденным телятам вводили в 2-3 приема с интервалом 3-4 часа, что обеспечивает лучший терапевтический эффект. При тяжелом течении болезни сыворотку вводили повторно через 1-3 дня в аналогичных дозах в/б. С профилактической целью сыворотки выпаивали новорожденным телятам с молозивом при первых выпойках по 10-15 см3.

Сравнительная оценка лечебной эффективности поливалентного препарата и сыворогки-протогипа осуществлена в неблагополучных но эшерихиозу хозяйствах Краснодарского края. Результаты производственных испытаний свидетельствуют о том, что предлагаемая сыворотка обладает более высоким терапевтическим эффектом и повышает сохранность телят и поросят на 6,3-г7,0 %.

В эксперименте на новорожденных поросятах показано, что ИДу) поливалентной СК против эшерихиоза не превышает 3,25 см3, при использовании

сыворотки-прототипа профилактическая доза возрастает до 8,57 см\ что в 2,5 раза ниже, чем в контроле.

Установлена динамика изменения гематологических и биохимических показателей и катаболизм специфических антител поливалентной СК в организме привитых телят: уровень специфических антител в СК телят па 14 сутки наблюдения снижался в 2-8 раз, что свидетельствует об их использовании на нейтрализацию возбудителей эшерихиоза.

Таким образом, в результате исследований разработан оригинальный способ получения и организовано серийное производство эффективной и востребованной практикой «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против сельскохозяйственных животных». На способ получения сыворотки подана заявка на патента РФ. Показано, что сыворотка содержит широкий спектр специфических антител, способных полностью нейтрализовать патогенетическое действие энтеропатогенных эшерихий и обеспечить сохранность новорожденных телят. Рекламаций на качество лечебного препарата от потребителей в период 2006-2012 гг. не поступало. Среднегодовой экономический эффект от внедрения в производство разработанных технологических решений составил 94136,6 рублей

3.8. Технология производства поливалентной сыворотки против респираторно-кишечных инфекций КРС

Наиболее острой проблемой промышленного животноводства являются респираторно-кишечные заболевания КРС, которые протекают по типу АИ и обусловлены комплексом патогенных и условно-патогенных возбудителей вирусной и бактериальной этиологии. Процесс получения поливалентных СК, предназначенных для профилактики и терапии ассоциативных инфекций КРС, предусматривает отбор и селекцию штаммов бактерий и вирусов с выраженными антигенными свойствами, оптимизацию состава комплексного антигена и его эффективность при гипериммунизации ВП.

При выборе штаммов пастерелл, сальмонелл и эшерихий учитывали результаты многолетнего использования большого числа аналогичных возбудителей с выраженными антигенными свойствами при производстве лечебных и иммунобиологических препаратов.

В результате сравнительного изучения и анализа литературных данных из 43 исследованных микроорганизмов совместно с М.К. Пирожковым были отобраны и дополнительно изучены штаммы Р.ти11оЫс1а 8683 (серотипа А), 656 (В), Т80 (Д) и М.Ьаето1иуса 169 (А1), а также штаммы БЛурЫтипит 371 и 8,(1иЫт 373 морфология, антигенная структура, гемолитические свойства и вирулентность которых были типичными и соответствовали их видовому происхождению. Кульгуральные свойства штаммов пастерелл и сальмонелл также существенно пе различались и были типичными как на жидких, так и на плотных ПС.

При отборе штаммов эшерихий учитывались факторы патогенности и токсикогенности. Были предложены и аттестованы штаммы Е.соП 355-37/13 (09:К30); 305-37/11 (0,78:К80); 115/2 (0115)-проду центы соматических и полисахаридных капсульных антигенов и штаммы 334-37/12 (0141 :К87:К88); 453-37/17 (0115:К88); 454-37/17 (0141:К99); 397-37/14 (09:К103:987) и 398-37/14 (0101:И41) - продуценты АА (К 88, К 99, 987 Р, Р 41) в фосфатно-мочевинном

буфере. Штаммы E.coli ВГНКИ 334-37/12, ВГНКИ 397-37/14, ВГНКИ 453-37/17 и ВГШСИ 454-37/17 являются активными продуцентами соответственно ТС и TJ1 токсинов. Изучена возможность использования «Вакцины против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота сухой культуральной ассоциированной» и штаммов ПГК-45/8 и ТК-А/ВИЭВ вирусов ПГ-3 и ИРГ, выращенных стационарным и роллерным методами в культуре клеток MDBK в качестве антигенов.

Экспериментально доказано, что поливалентные антигены пастерелл, сальмонелл и эшерихий, вирусвакцина и культуральные вирусы ПГ-3 и ИРТ обладают выраженными антигенными свойствами и были использованы для производства поливалентной СК против ресгшраторно-кишечных инфекций КРС.

Изготовление бакмассы пастерелл, сальмонелл и эшерихий осуществляли в модернизированном химическом реакторе и биореакторе «Торнадо» при оптимальных технологических параметрах и контролировали на стерильность (по ГОСТ 28085), безвредность и активность в соответствии с требованиями Г1Р-00482849012-09. В результате исследований была разработана технологическая схема производства и определены общие требования к качеству инактивированных антигенов пастерелл, сальмонелл и эшерихий. Кроме того, были определены оптимальные концентрации и соотношение штаммов микроорганизмов в составе комплексных антигенов, подобраны инактивант и режимы инактивации, условия и длительность хранения поливалентного антигена (табл.9).

Для получения и контроля активности вирусных антигенов ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота в качестве клеточного субстрата изучена и предложена из коллекции ВНИИВВиМ аттестованная сублиния клеток ночки быка MDBK-E. Максимальное накопление вирусов ПГ-3 (7,47±0,06 lg ТЩ^о/«,3) и ИРТ (7,60±0,04 lg ТЦДш/см1) регистрировали соответственно через 72 и 48 часов культивирования. Постоянное использование стандартных по качеству ПС Игла MEM, клеточного субстрата и оптимальной дозы заражения явилось основой для эффективного производства активных антигенов. При решении данной проблемы были дополнительно изготовлены и аттестованы эталонный (по 50 ампул - Master seed) и рабочий (по 250 ампул - Working Seed) банки 'ГК и вирусов в жидком азоте. Это позволило стабилизировать воспроизводство промышленных объемов бактериальных и вирусных антигенов, исключить возможность их контаминации и повысить активность и стандартность конечного продукта.

Отбор ВП основывался на результатах 2-х кратного подкожного введения антигенов пастерелл, сальмонелл и эшерихий, содержащих соответственно 20 и 10 млрд. МТ и вирусов ПГ-3 и ИРТ с активностью 7,0-г7,5 lg Т1Щ<;и/М1| в объеме 4 мл с интервалом 21 сутки. Пригодными для практического применения считали ЖД, содержащих в СК через 15 секунд после повторной иммунизации титры антител против пастерелл, сальмонелл и эшерихий, Г1Г-3 и ИРТ на уровне 1:8, 1:10; 1:20-^1:25 и 1:8-1:16. Отмечено также, что процесс грундиммунизации обеспечивает в дальнейшем более интенсивный синтез специфических антител.

Рабочая схема гипериммупизации В11 бактериальными антигенами включает 10 внутримышечных инъекций в возрастающих дозах с интервалом 4 суток. Дополнительное введение вирусных антигенов с активностью не ниже 7,0 ^ТЦДздл:,,'1 в объеме 4 мл с интервалом 4 (I вариант) и 8 (II вариант) суток. Второй вариант гипериммупизации оказался более эффективным и обеспечивал достоверное увеличение активности СК против ПГ-3 и ИРТ до 7,0 и 6,0 log2 и не

оказывал ингибирующего влияния на синтез антибактериальных антител.

Напротив, титры антител против ПГ-3 и ИРТ, полученные от ВП привитых

вирусвакциной с активностью не выше 5,5 ^ ТЦД5о;сМ3 не превышали соответственно 4,54±0,04 и 3,34±0,06 1о£2.

Таблица 9

Показатели технологических операций изготовления бактериальных антигенов для гипериммуниэации ВП при производстве гиперйммунной сыворотки крови

Технологические операции Наименование микроорганизмов

Пасте реллы Сальмонеллы Эшерихии

Соматические антигены Адгезивные антигены

Производственные штаммы Р. ми11оЫ(1а - 8683 (А) - 656 (В) - Т80(Д) М. ЬаетоШуса - 169 (А1) 1урЫтигшт -371 8. с!иЫт -373 Е. coli 115/2 (0115) 305-37/11 (078:К80), 355-37/13 (0,9:К30) Е. coli К88 К99 987Р F41

Накопление антигенов, млрд/см3: - бутыли (20л) - реактор (1000л) - биореактор «Торнадо» Техно 2,9±0,19 9,3±0,30 22,6± 1,59 логические провес 13,8±0,58 44,7±2,56 51,2±0,58 сы подготовки й 9,14±0,34 47,58±1,14 50,4±0,81 нтигенов

Объединение антигенов В равных объемах

Осаждение микробов Сепарирование при 7-8 тыс. об/мин

Утилизация супернатанта При (130± 1 )°С в течение 2-х часов

Ресуспендирование осадка Физиологическим раствором ФМБ

Рабочая концентрация микробов, млрд/см3 20 10 10 80-120 Сепарирование

Объект инактивации Соматические антигены клеток бактерий Супернатант*

Инакгиватор Формалин (0,3% формальдегида)

Сроки инактивации при (39±1)°С, сут. 2 14-16** 14-16 14-16

Контроль антигенов: - стерильность - безвредность для БМ С Б С Б С Б С Б

Сроки хранения антигенов при (4-6°)С не более, мес. 3 6 6 6

* - эшерихиозный антиген содержит соматические и адгезивные антигены в соотношении 2:1; ** - к инактивированному антигену добавляют О, I % квасцов, О, I % СаС1;, рН доводят 10% N3011 до 7,3-7,5 и выдерживают дополнительно при (39±1 )"С 24 часа.

Десятикратный цикл гипериммунизации ВП возрастающими дозами бактериальных и постоянной дозой вирусных антигенов обеспечили устойчивый рост антител в СК ВП против пастерелл (1:512 в РИГА), сальмонелл (1:400 - 1:800) и эшерихий (1:3200) в РА. Выявлены антитела к адгезивным антигенам К 88 (1:6000+1:6400), К99 и К987 (1:640^-2560) и Я41 (1:320^-1:1280), а также к термолабильным (ТЛ) и термостабильным (ТС) токсинам эшерихий в титре 1:2т-1:4). Кроме того было установлено, что в процессе длительной эксплуатации ВП титры противовирусных и антибактериальных антител существенно не изменялись (табл.10).

Таблица 10

Результаты гипериммунизации волов-продуцентов антигенами пастереллеза, сальмонеллеза и эшерихиоза, ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота

№ п/п Дни инъекций антигенов Наименование антигенов

Пастереллез М. ЬаешоШуса Сальмонеллеэ Эшерихиоз ПГ-3 ИРТ

Д см1 ТА в РИГА Д см' ТА в РАс АГ типа Д, и В* Д см1 ТА в РА к АА* Д см1 ТА в РТГА 1оё2 Д см3 ТА в РН

1 1 2 4 4 - 4 10 4 1,0 4 1,0

2 5 4 8 8 - 8 20

3 9 6 16 12 - 12 25 4 3,0 4 2,0

4 13 8 16 16 12,5 16 50

5 17 10 32 20 25 20 100 4 4,0 4 3,0

6 21 12 64 24 50 24 200

7 25 15 128 30 100 30 400 4 5,0 4 4,5

8 29 20 256 40 200 40 800

9 33 25 512 50 400 50 800 4 6,0 4 6,0

10 37 30 512 60 800 60 1600 7,5-8,0 6,5-7,0

Результативность 132 512 264 800 264 1600 20 7,5-8,0 20 6,5-7,0

*- обратная величина разведения СК в РА

За период 2004-2013 гг. было изготовлено и реализовано 125 серий поливалентной СК объемом 12995 л, которые соответствовали требованиям стандарта. Стабильность серийного производства лечебного препарата, была подтверждена при помощи контрольной карты Шухарта типа X.

Производственные серии «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеига крупного рогатого скога» характеризовались выраженным лечебным и профилактическим эффектом. Пятидесятипроцентная иммунизирующая доза (ИД50) 19 и 135 серии СК составила 20 см1. Эффективность препарата была подтверждена результатами оценки фракционного состава производственных серий СК методом электрофореза в полиакриламидном геле. На элекгрофореграмме образцов СК выявлены фракции

36

легких (24-25 кДа) и тяжелых (48-50 кДа) цепей ^Ц которые отсутствуют в контроле, что указывает на высокий уровень реакций 2 типа у ВГ1 и гиперпродукцию иммуноглобулинов класса С1

Лечебную эффективность поливалентной СК (серия 19) оценивали также в сравнении с моновалентными препаратами в течение 3-х суток на телятах в хозяйствах Краснодарского края. Диагностика заболеваний телят проводилась на базе Армавирской ветбаклаборатории. Лечебные дозы СК для новорожденных телят 1-5 суточного возраста составляли 20-30 и 40-60 мл. Препарат вводили дробно в/м в 2-3 приема, что обеспечивало в итоге более выраженное терапевтическое действие. Результаты испытаний показали, что поливалентная СК характеризуется выраженным терапевтическим эффектом, незначительно уступает по активности моновалентным СК, но существенно превосходит их по широте спектра лечебного действия в отношении возбудителей ассоциативных инфекций (табл.10).

Лечебно-профилактическую эффективность 3-х серий поливалентной СК оценивали в совхозе «Прикубанский» Новокубанского района Краснодарского края, где было установлено инфицирование 60-62% телят возбудителями пастсреллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, ПГ-3 и ИРТ КРС в виде моно-и ассоциативных инфекций с выбраковкой 20-т30 % животных. Из 94 подвергнутых серотерапии телят выздоровело 76 или 80,1 % животных. С профилактической целью гипериммунную СК применяли однократно п/к в дозе 20-г30 мл. Из 125 привитых телят заболели и погибли 18 голов или 14,4 % животных. Полученные результаты свидетельствуют о пригодности и перспективности препарата для профилактики и лечения респираторно-кишечных инфекций КРС.

Параллельно были изучены механизм действия и динамика изменения гематологических, биохимических показателей и катаболизм специфических антител в организме инфицированных животных, привитых поливалентной СК.

Показано, что применение лечебного препарата сопровождалось улучшением общего состояния телят 1 и 2 группы: температура, пульс и интенсивность дыхания снизились до верхних границ нормы. У телят контрольной группы указанные показатели были выше границ нормы, а 4 животных пали. У телят опытных групп в течение первых 7 суток отмечено снижение количества лейкоцитов (8,4±0,42х10ч/л), повышение Г-лимфоцитов (4,4 ±0,11), В-лимфоцитов (3.5±0,16). эритроцитов (7,23±0,41) и содержания гемоглобина (122±0,18), в контроле показатели крови были на минимальном уровне в течение всего периода наблюдения, количество лейкоцитов не опускалось ниже верхней границы нормы (10,5±0,6). В СК телят опытных групп к 7 суткам отмечено увеличение концентрации альбумина до 20,9±0,32 -г 22,2±0,15 % и незначительное снижение показателя к 14 суткам наблюдения до 18,5±0.27 %. В контроле напротив установлено достоверное снижение показателя до 11,2±0,12 % за счет перераспределения белковых фракций в сторону увеличения у- глобулинов.

Таблица 11

Результаты контроля терапевтической эффективности моно- и поливалентной СК на новорожденных телятах

Фракции Показатели Результаты Наименование моновалентных СК

полива- контроля СК контроля Контроль

лентной СК животных поли- Пасте- Сальмо Эшери- ПГ-3 ИРТ

валентной реллез неллез хиоз

СК

Пастереллез Заболело 58 48

Метод РИГА РИГА

диагностики

Пало 4 2

Сохранность^) 93,1 95.8

Сальмо- Заболело 71 73

неллез Метод РА РА

диагностики

Пало 6 5

Сохранность (%) 91,6 93.2

Эшерихиоэ Заболело 213 198

Метод РА РА

диагностики

Пало 10 6

Сохранность (%) 95.3 96,9

ПГ-Э КРС Заболело 68 68

Метод РТГА РТГА

диагностики

Пало 17 14

Сохранность (%) 75 79,5

ИРТ КРС Заболело 43 58

Метод РН РН

диагностики

Пало 14 11

Сохранность (%) 67,5 81.3

1 - сыворотка против пастереллеза. салъмонеллеза и эшерихиоза. ПГ-.Я и ИРТ КРС:

2 - сыворотка против пастереллеза КРС. овец и свиней:

Л - сыворотка поливалентная антитоксическая против сальмонеллеза телят, поросят, ягнят, овец и птиц:

4 - ангиадгезивная антитоксическая сыворотка против эшерихиоза сельскохозяйственных животных:

5 - сыворотка против ГТГ-3 КРС;

6 - сыворотка против ИРТ КРС;

7 - выделение и идентификация возбудстсля.

Катаболизм вводимых антител в СК опытных и контрольных телят оценивали в динамике в РН, РИГА и РА. Установлен выраженный лечебно-профилактический эффект гипериммунной СК против респираторно-кишечных инфекций КРС. Это связано с тем, что в организме инфицированных телят динамика снижения активности специфических антител более выражена, чем в контроле, что указывает на нейтрализацию возбудителей РКИ крупного рогатого скота и эффективность терапии животных. Среднегодовой экономический эффект от внедрения в производство модернизированной технологии производства поливалентной СК против РКИ составил 612438,3 рублей.

3.9. Совершенствование технологии производства и оценка экономической эффективности серийного выпуска поливалентных сывороток крови животных

Реинженеринг промышленного производства поливалентных СК животных был реализован за счет использования современного оборудования и создания на их основе технологических линий, оснащенных микропроцессорами с автоматическим регулированием и контролем ТП производства ВО и ВИ, ГПС, культивирования микроорганизмов, изготовления живых и ииактивированных антигенов, получения крови, плазмы, сыворотки, стерилизации, фасовке, укупорке, этикетировке, контролю качества и хранению конечного продукта. Реализация указанных мероприятий и анализ серийного производства гипериммунных СК позволил на всех 9 этапах технологического цикла выявить 32 критические контрольные точки (ККТ) риска и предложить эффективные методы по их коррекции с использованием статистических методов контроля ТП, осуществить постоянный мониторинг и определить средства и методы борьбы с контаминацией воздуха, материалов, оборудования, помещений и обслуживающего персонала.

Внедрение указанных мероприятий позволило разработать «Технологическую схему промышленного производства и контроля качества гипериммунных СК крови животных» (рис. 6), а также повысить результативность и конкурентоспособность серийного изготовления и снизить себестоимость конечного продукта.

Комплексное решение поставленных задач позволило в период 2003-2013 гг изготовить и реализовать потребителю соответственно 96. 103 и 283 серии «Сыворотки аитиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных», «Иммуносерум — сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэптеритов телят» и «Сыворотки против пастереллеза, сальмонсллеза, эшерихиоза, ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота» объемом 97411, 102751 и 259318 л. При этом удалось полностью исключить брак лечебных СК по стерильности, безвредности и активности, а также разработать и утвердить комплект НД и аттестовать серийное производство лечебных СК в соответствии с общепринятыми требованиями.

Внедрение в практику правил СМР, разработанных инноваций и технологических решений, а также сертификация ТП производства и жесткие требования к указанным процедурам со стороны контролирующих органов способствовали создинию на Армавирской биофабрике «Системы управления качеством» с обязательным использованием статистических методов контроля, что гарантирует стабильность и экономичность серийного производства, экологическую безопасность, высокую активность, лечебную и профилактическую эффективность поливалентных СК в ветеринарной практике.

Рис. 6. Технологическая схема производства и контроля гипериммунных сывороток крови животных

Годовой экономический эффект от внедрения в практику разработанных нами технологических решений при серийном производстве «Антиадгезивной антитоксической сыворотки против эшерихиоза сельскохозяйственных животных», «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скот» и «Иммуносерум -сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят» составил 3832674,62 рублей.

3.10. Транспортировка и хранение лечебных и иммунобиологических препаратов в системе «Холодовой цепи»

Проблема сохранности качества лечебных и иммунобиологических (ИБП) препаратов, предназначенных для медицинской и ветеринарной практики чрезвычайно актуальна. В настоящее время в соответствии с требованиями ОМР определены общие требования к условиям хранения и доставки препаратов потребителям в системе «Холодовой цепи», которые внедряются на биопредприятиях России.

При реализации указанных проблем решены вопросы модернизации складских помещений, подбора оборудования и транспортных средств, подготовки кадров, а также контроля качества, условий хранения и доставки препаратов потребителю в системе «Холодовой цепи».

На предприятии реконструировано складское помещение площадью 1070 м2, оснащено холодильными установками 4Н124/4СС-9.2 СТЕ 291 МОЕО производства ООО «Ариадна-Ю» (Россия) и проточно-вытяжной вентиляцией. Хранение готовой продукции осуществляется на 2-х ярусных стеллажах в коробках из гофрированного картона при температуре (10±2)°С. Температурный режим поддерживается автоматически и регистрируется при помощи термографов, электронных датчиков и диспетчерской службой.

Согласно действующему законодательству транспортировка лечебных и ИБП осуществляется специальными авторефрижераторами, самолетами или железнодорожным транспортом с использованием специальных контейнеров ТМ 52 и ТМ 35. Выбор транспортного средства осуществляется с учетом эпизоотической ситуации в хозяйстве заказчика, экономических показателей, технологических возможностей используемого оборудования, объема партии ЛС, региона, сроков доставки и сезона года.

Для обеспечения сельскохозяйственных предприятий ЛС и ИБП на базе Армавирской биофабрики создан «Отдел авторефрижераторных перевозок» (ОАП), который осуществляет доставку препаратов потребителям в системе «Холодовой цепи». Авторефрижераторы оснащены климатическим, контрольным и

41

регистрирующим оборудованием, что позволяет получить, сохранить и передать объективную информацию изготовителям и заказчикам об условиях транспортировки каждой партии продукции. Организованы подготовка и аттестация кадров, ремонт и техническое обслуживание авторефрижераторов, приборов и оборудования только на сервисных предприятиях завода-изготовителя России и зарубежных стран. География поставок лечебных, иммунобиологических и диагностических препаратов в системе «Холодовой цепи» охватывает более 20 регионов РФ и стран СНГ. Альтернативная доставка грузов реализуется лишь в отдаленные регионы Сибири и Дальнего Востока, а также в тех случаях, когда экономически оправдана транспортировка препаратов самолетами и поездами без ущерба их активности. Многолетний опыт работы свидетельствует о том, что транспортировка биопрепаратов авторефрижераторами в системе «Холодовой цепи» является более прогрессивным и 5-10 раз более экономичным способом.

За 2006-2009 годы заказчикам авторефрижераторами в системе «Холодовой цепи» доставлено 595000 упаковок продукции, в том числе 22564969 доз вакцин и СК для профилактики и лечения заболеваний животных возбудителями вирусной и бактериальной этиологии. За период 2009-2013 г потребителям также доставлено 264007 л вакцин, СК и лекарственных средств и 4633702 доз лиофилизированных биопрепаратов. Экономический эффект от реализации указанных мероприятий составил 51206 тыс. рублей. Рекламаций на несвоевременность доставки и активность препаратов на биопредприятие не поступало. При возникновении эпизоотий в очаги инфекций и угрожаемые регионы осуществляется экстренная доставка авторефрижераторами средств диагностики, профилактики и лечения животных. При этом водители и сопровождающие их лица руководствуются «Санитарно-эпидемиолог ическими правилами» СП 1.3.2322-08 и СП 1.3.1285-03.

Таким образом, в результате многолетней работы на базе «Армавирской биофабрики» создан современный «Отдел авторефрижераторных перевозок», который отвечает требованиям системы «Холодовой цепи», оснащен современным оборудованием, имеет высококвалифицированный персонал, который гарантирует успешную доставку и сохранность лечебных и ИБП и как результат эпизоотическое благополучие животноводства страны по инфекционным заболеваниям.

4. ВЫВОДЫ

1. Научно обоснован единый подход к разработке, совершенствованию и стандартизации технологических процессов изготовления и контроля поливалентных сывороток для лечения и профилактики респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота. Серийное производство и обеспечение качества лечебных сывороток осуществляется в соответствии с требованиями «Системы менеджмента качества» на основе стандартов ИСО серии 9000, правил вМР и ГОСТ Р 52249-2009 с использованием современного оборудования, технологических линий и валидированных методов контроля на всех этапах изготовления целевого продукта.

2. Разработана и внедрена в практику система управления качеством на основе статистических методов контроля соответствия активности поливалентных сывороток и технологических процессов производства стандартным показателям и своевременных корректирующих воздействий на обеспечение выпуска стандартных препаратов надлежащего качества.

3. Созданы и функционируют 2 технологические линии для комплексной очистки воды водопроводной (ВВ). Очистка ВВ на установке «Водопад» признана более эффективной, чем метод дистилляции. Этот прием дает возможность повысить выход и снизить себестоимость 1 т целевого продукта в 3,6 раза. Дальнейшая очистка воды на установке УВОИ-МФ-8040-6 позволяет стабилизировать рН среды и удельную электропроводность (УЭ) воды очищенной (ВО) соответственно на уровне 5,0-7,0 и 2,87±0,14 мкСм/см. Дополнительная очистка пермеата на установке вирет-О или УВОИ 4040 позволяет снизить показатель УЭ воды для инъекций (ВИ) до 0,35±0,1 мкСм/см и не превышать 1,1 мкСм/см.

4. Разработан дифференцированный подход к условиям и длительности ферментативного гидролиза белоксодержащих материалов. Установлены предельно допустимые физико-химические показатели бульона Хоттингера, отвечающие потребностям и метаболизму различных видов микроорганизмов. Максимальное накопление штаммов пастерелл (20,0±0,7-г21,8±0,9 млрд/см3), сальмонелл (49,8±0,5-г51,8±0,8 млрд/см3) и эшерихий (50,0±0,0г53,8±1,1 млрд./см3) регистрировали в бульоне Хоттингера, содержащим соответственно 185-200, 200-250 и 220-250 мг% аминного азота.

5. Определены оптимальные условия серийного производства бактериальных антигенов. Метод периодического культивирования позволяет интенсифицировать кинетические показатели процессов размножения микроорганизмов и по сравнению со стационарным способом сократить время максимального накопления бакмассы минимум в 2 раза, повысить жизнеспособность клеток до 92-г97 % и уровень накопления пастерелл, сальмонелл, эшерихий соответственно в 8,13; 3,75 и 5,88 раза.

6. Методом проточной цитометрии отобрана, аттестована кулыуральная модель -перевиваемая линия клеток МОВК (Е) - с высоким ростовым потенциалом и пе содержащая контаминантов. Определены оптимальные условия максимального накопления штаммов НТК 45/86 (7,47±0,06 ^ ТЦДЧ1М) и ТК/А ВИЭВ (7,60±0,04 1е ТЦДяммл) вирусов парагриппа-3 и инфекционного ринограхеита крупного рогатого скота роллерным методом.

7. Впервые разработана технология изготовления и методы обеспечения качества «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных». Определены состав и условия изготовления комплексного антигена из бактериальных клеток эшерихий трех серогрупп 09, 078 и

43

0141, полисахаридных капсульных антигенов КЗО, К80 и К87, белковых адгезивных антигенов К88, К99 и 987Р, L4I, термостабильного, термолабильного и вероанатоксинов. Оптимизирована схема гипериммунизации и эксплуатации волов-продуцентов. Продолжительность цикла гипериммунизации доноров и количество инъекций сокращены на 10 дней и 2 введения поливалентного антигена. В сыворотке крови выявлены высокие титры антител к адгезивным антигенам 987Р и F41; ТС и VT токсинам, которые отсутствуют в сыворотке-прототипе. Сыворотка безвредна, обладает выраженным лечебным и профилактическим эффектом против эшерихиоза (колидиареи, колисепсиса, колиэпетротоксемии) сельскохозяйственных животных.

8. Впервые разработаны технология производства и система обеспечения качества «Сыворотки против пастереллеэа, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и ИРТ крупного рогатого скота». Отобраны и аттестованы штаммы микроорганизмов и вирусов, с полным набором факторов патогенности и антигенности. Определен состав, условия хранения и контроля активности инакгивированного бактериального и культурального вирусного антигенов. Оптимизирована схема гипериммунизации и эксплуатации волов-продуцентов. Одновременное введение комплексных антигенов не вызывает интерференции между штаммами возбудителей вирусных и бактериальных инфекций и повышения реактогенности организмов животных-доноров. Усовершенствована схема изготовления и метод контроля качества лечебной сыворотки.

9. Применение поливалентной сыворотки против респираторно-кишечных инфекций безопасно, эффективно и экономически оправдано. Однократное введение препарата с профилактической целью в дозе 20-30 мл обеспечивает сохранность не менее 85,6 % телят. Лечебная эффективность препарата в дозе 40-60 мл составляет от 80,1 до 95,3%.

10. Впервые разработана технология производства и система обеспечения качества «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэптеритов телят». Отобраны и паспоршзированы штаммы вирусов и оптимизированы условия изготовления комплексных антигенов, схема гипериммунизации, эксплуатации ВГ1 и контроля активности лечебного препарата.

11. Профилактическая эффективность поливалентной сыворотки «Иммуносерум» па новорожденных телятах в хозяйствах, неблагополучных по вирусным пневмоэнтеритам составила от 96,2 до 100%. Двукратное применение препарата с лечебной целью обеспечивало сохранность 92,8-100% животных.

12. Разработаны и внедрены в практику поливалентные сыворотки крови животных против респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота. Комплекс технологических решений позволил сократить затраты труда, средств и времени и обеспечить серийное производство стандартных по активности, лечебной и профилактической эффективности производственных серий сывороток, отвечающих требованиям потребителя. Среднегодовой экономический эффект от внедрения в практику современных технологических решений при изготовлении трех видов лечебных препаратов составил 3832674,62 рублей.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования разработаны и утверждены следующие нормативные документы:

- Промышленный регламент на производство «Иммуносерум - сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят» ПР-0042849-015-09;

Промышленный регламент на производство «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота» ПР- 00482849-013-09;

- Промышленный регламент на производство «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» ПР-00482849-011-09;

- Стандарт ФГУП «Армавирская биофабрика» «Иммуносерум - сыворотка для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят». Технические условия СТО 00482849-0018-2007. Утвержден Россельхознадзором 03.03.2008 г.;

- Стандарт ФГУП «Армавирская биофабрика» «Сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота» Технические условия СТО 9388-00100482849-2007. Утвержден Россельхознадзором 03.03.2008 г.;

- Стандарт ФГУП «Армавирская биофабрика» «Сыворотка антиадгезивная антитоксическая против эшерихиоза сельскохозяйственных животных». Технические условия СТО 00482849- 0020-2007. Утвержден Россельхознадзором 15.10.2008 г.;

- Сертификат соответствия № РОСС ГШ ФВ01.Н25748 «Иммуносерум -сыворотка для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят». Утверждена органом по сертификации РОСС 1Ш. 0001.11ФВ01 ФГУ «ВГНКИ» за № 0971018. Срок действия по 03.03.2013 г.;

- Сертификат соответствия № РОСС ГШ ФВ01.Н26231 «Сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота». Утверждена органом по сертификации РОСС 1Ш. 0001. 11ФВ01 ФГУ «ВГНКИ» за №0971179. Срок действия с 02.10.2012 по 01.01.2013 г.;

- Сертификат соответствия № РОСС 1Ш ФВ01.Н23792 «Сыворотка антиадгезивная антитоксическая против эшерихиоза сельскохозяйственных животных».Утверждена органом по сертификации РОСС ГШ. 0001.11ФВ01 ФГУ «ВГНКИ» за № 0411783. Срок действия с 03.08.2011 по 02.02.2013 г.;

Инструкция по применению сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Утверждена Россельхознадзором 11.07.2011 г.;

- Инструкция по применению сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных Утверждена Россельхознадзором 11.07.2011 г.;

- Инструкция по применению Иммуносерум - сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят. Утверждена Россельхознадзором 11.09.2012 г.;

6. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

6Л. Список научных публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК

1. Сусский Е.В Совершенствование и стандартизация технологии производства, методов контроля и управления качеством воды очищенной /Е.В. Сусский, В.Т. Ночевпый, Н.К. Еремец, Н.В. Еремец // Ветеринарная медицина - 2011,- №1 - C.I8-22.

2. Сусский Е.В. Профилактическая и терапевтическая активность сыворотки против пастереллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота / Е.В. Сусский, М.К. Пирожков, Е.В. Викторова и др. //Ветеринарный врач. - 2011. - №5 - .С.21-24.

3. Сусский Е.В Сравнительная характеристика гидролизатных питательных сред из отходов сывороточного производства / Е.В. Сусский, Л.Я. Телишевская, В.Т. Ночевный и др. // Ветеринарная медицина. - 2011. №3-4 - С.23-26.

4. Сусский Е.В. Сравнительная оценка эффективности производства гипериммунной сыворотки против рожи свиней на свиньях- и волах-продуцентах //Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. - №1(34). -С. 190-193.

5. Сусский Е.В. Система «Холодовой цепи» при хранении и транспортировке лечебных и иммунобиологических препаратов // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. - №1(34). - С.201-204.

6. Сусский Е.В. Совершенствование и стандартизация технологии производства бактериальных антигенов / Сусский Е.В., Раевский A.A., Ночевный В.Т. // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. №1(34). - С. 179-183.

7. Сусский Е.В. Система менеджмента качества - основа эффективного производства сыворотки крови против респираторно-кишечпых инфекций крупного рогатого скота / Е.В. Сусский, В.Т. Ночевный, И.В. Бобровская, Н.К. Еремец //Ветеринарный врач. - 2012. - №2. - С. 13-16.

8. Сусский Е.В. Оптимизация технологических процессов производства лечебных и иммунобиологических препаратов против рожи свиней / Е.В. Сусский, В.Т. Ночевпый, A.A. Раевский, И.В. Бобровская // Ветеринарный врач. - 2012. - №5. -С.24-28.

9. Сусский Е.В. Оптимизация и стандартизация условий производства ангиадгезивпой антитоксической сыворотки против эшерихиоза сельскохозяйственных животных /Сусский Е.В., Пирожков М.К. // Вестник. Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии. - 2012. - №2(18). -С.60-64.

10. Сусский Е.В. Система обеспечения качества лечебных сывороток на Армавирскрй биофабрике / Е.В. Сусский, Т.А. Скотникова, В.Т. Ночевный, И.В. Бобровская // Ветеринарная патология. - 2013 - № 2.-С. 112-117.

11. Сусский Е.В. Система посевных материалов - фактор стабильности серийного производства антигенов и гипериммунных сывороток крови животных / Е.В. Сусский, В.И. Смоленский, Т.В. Почевпая // Ветеринарная патология. - 2013. - №3. - С. 43-49.

12. Сусский E.B. Разработка технологии производства и обеспечение качества поливалентной сыворотки против вирусных пневмоэнтеритов телят /Сусский Е.В., Басова Н.Ю. // Ветеринарная патология. - 2013. - № 4. - С. 89-97.

13. Сусский Е.В. 90 лет Армавирской Биофабрике //Ветеринария - 2011-№ 7. -С.5-8.

6.2. Список патентов

14. Патент № 2407543. Российская Федерация. МПК А61К 39/12. - Способ получения сыворотки для лечения и профилактики вирусных и кишечных респираторных болезней телят. / В.В. Гуненков, Л.И. Шевцова, Е.С. Майстренко, Е.В. Сусский, С.Н. Ярцев. - ФГУ ВГНКИ - Бюлл. №2009126043/15, заявл. 09.07.2009; опубл. 27.10.2012.

15. Патент № 2030915. Российская Федерация. - Вакцина против лептоспироэа животных. / Ю.А. Малахов, Г.Л. Соболева, В.И. Белоусов, Е.В. Сусский, В.И. Ситьков, В.Н. Заерко, А.П. Сурмило, Н.Г. Орел. - ФГУ ВГНКИ - заявл. 31.10.1990.

16. Патент № 2043771. Российская Федерация. - Вакцина против эшерихиоза животных. / М.К. Пирожков, O.A. Тугаринов, Ю.А. Малахов, Е.В. Сусский. - ФГУ ВГНКИ - заявл. 20.07.1996.

12.3. Монография

17. Сусский Е.В. Сывороточные и вакцинные препараты для профилактики и терапии инфекционных заболеваний животных: монография / Е.В. Сусский, П.А. Красочко. А.П. Медведев. A.A. Вербицкий. - Армавир, 2013.-338с.

12.4. Список научных публикаций в других изданиях

18. Сусский Е.В. Система менеджмента качества - основа эффективного производства и стандартизации лечебных сывороток крови животных / Сусский Е.В., Алиферова Э.В., Пирожков М.К. // Экология и животный мир. - Минск, 2010. - № 1. - С.46-51.

19. Сусский Е.В. Оптимизация и стандартизация технологических процессов производства и контроля качества бактериальных антигенов / Сусский Е.В., Телишевская Л.Я., Ночевный В.Т. // Минск: Экология и животный мир. - 2010. -№1. - С.52-58.

20. Сусский Е.В. Оптимизация и стандартизация технологических процессов производства и контроля качества бактериальных антигенов / Сусский Е.В., Пирожков М.К. Оптимизация и стандартизация технологических процессов производства и контроля качества бактериальных антигенов // Труды XV111 Международной конф. и дискуссионного научного клуба. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии - Украина: Крым, Ялта-Гурзуф, 2010. -Т.2. - С. 120-122.

21. Сусский Е.В. Проточная цитометрия - экспресс-метод оценки качества перевиваемых линий клеток /Сусский Е.В., Ночевный В.Т., Нагиева Ф.Г. // Труды Международной конф. и дискуссионного научного клуба. Новые информационные

технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. - Украина: Крым, Ялта-Гурзуф, 2011. -С. 143-145.

22. Сусский Е.В. Антиадгезивная антитоксическая сыворотка против эшерихиоза сельскохозяйственных животных / Сусский Е.В., Пирожков М.К. // Лекарственные препараты для животных: разработка, производство, эффективность и качество -конф., посвящ. 80-летию организации ВГНКИ. -М., 2011. -С.50-51.

23. Сусский Е.В. Стандартизация производства и обеспечение качества поливалентной сыворотки крови против респираторно-кишечных инфекций животных / Сусский Е.В., Ночевпый В.Т. // Труды XX Международной конф. и дискуссионного научного клуба. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. - Украина: Крым, Ялта-Гурзуф, 2012. - С.86-88.

24. Соломахина О.Ф. Обеспечение качества лекарственных средств для животных на ФГУП «Армавирская биофабрика»/ Соломахина О.Ф., Сусский Е.В. // Научные основы производства и обеспечение качества биологических препаратов АПК: материалы международной научно-практ. конф. - Щелково, 2012. -С.54-59.

25. Сусский Е.В. Стабильность производства и обеспечение качества гипериммунных сывороток крови животных / Сусский Е.В., Ночевный В.Т. // Труды XXI Международной конф. и дискуссионного научного клуба. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. -Украина: Крым, Ялта-Гурзуф, 2013. - С. 84-85.

26. Телишевская Л.Я. Использование белковых гидролизатов в составе питательных сред для эффективного производства бактериальных антигенов / Л.Я. Телишевская, A.A. Комаров, Е.В. Сусский, В.Т. Ночевный // Труды XXI Международной конф. и дискуссионного научного клуба. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. - Украина: Крым, Ялта-Гурзуф, 2013. - С. 186188.

27. Сусский Е.В. Оценка сублиний клеток MDBK для культивирования вирусов парагринпа-З и инфекционного ринотрахаита крупного рогатого скота / Сусский Е.В., Красочко H.A. // Основные направления развития ветеринарной пауки: материалы Международ, научно-практич. конф. - Минск, 2013. - С.238-245.

28. Сусский Е.В. Характеристика штаммов бактерий и вирусов, используемых для изготовления поливалентной сыворотки против респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота // Основные направления развития ветеринарной науки: материалы Международ, научно-практич. конф. - Минск, 2013. - С.57-63.

29. Сусский Е.В. Разработка и внедрение технологии транспортировки и хранения лечебных и иммуно-биологических препаратов в системе «Холодовой цепи» в условиях биофабричного производства // Lucrari sliintifice Vol. 34: zoolehnie si biotehnologii - Chisinau, Moldova, 2013. -C. 321-324.

30. Сусский E.B., Ночевный В.Т. Паспортизация и стандартизация культуральных моделей - субстрата производства вирусных антигенов// Труды XXII Международной конф. и дискуссионного научного клуба. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. - Украина: Крым, Ялта-Гурзуф, 2014. - С. 47-50.

31. Испытания безбелковой среды для культивирования лептоспир / В.И. Белоусов, Э.Я.Сазонова, Т.Я. Шкварук, А.К. Елисеев, Г.Л. Соболева, Е.В. Сусский, В.И. Усольцев // Научные основы технологического промышленного производства вет. биол. препаратов. -М., 1991.-С. 143-146.

32. Сусский E.B. Вакцина против лептоспироза животных концентрированная (изготовление, контроль и применение): автореф. дис. ... канд.вет.наук / Е.В. Сусский - М., 1997.-27с.

33. Сусский Е.В., Шишкин K.M. Разработка контроля активности вакцины против хламидиоза животных иммуноферментным методом // Сборник докладов межд.конф. Научные основы производства вет.биол.препаратов. - Щелково, 2001. -С. 155-156.

34. Сусский Е.В., Белоусов В.И. Разработка режима управляемого культивирования лептоспир в биореакторах // Лептоспироз. Мат. 10-ой Всерос. науч. - практ. конф. по лептоспирозу. - Анапа, 2003. -С. 118-120.

35. Белоусов В.И., Сусский Е.В. Вакцина против лептоспироза животных // Лептоспироз. Мат. междун. научн. - практ. конф. - Анапа, 2003. - С. 123-126.

36. Шорохов В.В., Сусский Е.В., Абарцумян Г.И. Меры борьбы и профилактики сальмонеллеза домашних голубей // Сборник научн. трудов ВГНКИ. - М., 2005. - Т. 65.-С. 137-140.

37. Сусский Е.В. Фабрика будущего // Кубанское качество. - 2006. - № 4 (29). -С.30-31.

38. Ярцев С.Н. Псевдомоноз животных. Этиология и эпизоотология / С.Н. Ярцев, Е.В. Сусский, А.К. Васильев, C.B. Пруцаков, И.А. Болоцкий, В.И. Семенцов // Мат. юбилейной науч.-практ. конф. посвящ. 110-летию Курской биофабрики и агробиол. промышленности России. - Курск, 2006. - С. 240-243.

39. Ярцев С.Н. Экспериментальное испытание поливалентной вакцины против псевдомоноза животных / С.Н. Ярцев, Е.В. Сусский, А.К. Васильев, C.B. Пруцаков, И.А. Болоцкий, В.И. Семенцов // Мат. юбилейной науч. - практ. конф. посвящ. 110-летию Курской биофабрики и агробиол. промышленности России. - Курск, 2006. -С. 243-245.

40. Сусский Е.В. Вакцинация свиней против лептоспироза внутрикожным методом /Е.В. Сусский, С.Н. Ярцев, И.А. Болоцкий, В.И. Семенцов, А.К. Васильев, C.B. Пруцаков // Мат. юбилейной науч. - практ. конф. посвящ. 110-летию Курской биофабрики и агробиол. промышленности России. - Курск, 2006. - С. 198-200.

41. Сусский Е.В. Традиции, опыт, надежность // Arpo Промышленный Комплекс России (Кубань). - 2009. - № 4. - С.7-12.

Условные сокращения

АА - аминный азот

БА - бактериальные антигены

БХ - бульон Хоттингера

ВИ - вода для инъекций

ВО - вода очищенная

ВОЗ - Всемирная торговая организация

ВП - волы продуценты СК

ВГНКИ - Всероссийский Государственный центр качества и стандартизации лекарственных

средств для животных и кормов ВСМ - внруссодержащий материал BP - вспомогательные работы ГА - гемагглютинин ГАЕ - гемагглютинирующая единица Д - доза заражения ИФА - иммуноферментный анализ ИБП - иммунобиологические препараты Mil - индекс пролиферации ИРТ - инфекционный ринотрахеит ККТ - критические контрольные точки MDBK - перевиваемая линия почки телят МК - микоплазмы-контамиианты ММ - микробиологический метод НД- нормативная документация ПЛК - перевиваемая линия клеток ПМ - посевной материал ПР - подготовительные работы ПС - питательная среда

ПКГ - программированная клеточная гибель - апоптоз

ПЦ - проточная цитометрия

ПЭГ - полнэтиленгликоль

ПХ - перевар Хоттингера

ПГ-Э - парагрипп-3 КРС

РН - реакция нейтрализации

РГА - реакция гамагглютинации

РТГА (РЗГА) - реакция торможения (задержки) гамагглютинации

РП - регламент производства

РДП - реакция диффузной преципитации

СК - сыворотка крови

СМК - система менеджмента качества

СТО - стандарт организации

ТК - тест-культура клеток

ТП - технологические процессы

ТУ - технические условия

УФ - ультрафильтрация

УК - урожаи клеток

ФБР - фосфатно-буферный раствор

ФХЛ - фгорхинолоны

ЦПД - цитопатогенное действие

ЦХМ - цитохимический метод

ЭФ - метод электрофореза

GMP- Goog manufucturing praclice (надлежащая производственная практика) GLP-Goog Luboratory Practice (надлежащая лабораторная прастика) LDjo/cm3 - 50%-ная летальная доза M.S. - Musier Seed (главный посевной материал) W.S. - Working Seed (рабочий посевной материал) P.S. - Production Seed (производственный посевной материал) SL.S. - Seed Lot System (система посевных материалов)

Подписано в печать 11.08.2014 г.

Усл.п.л. - 2.5 Заказ № 22542 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр. 12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

14-1064?

2014159634