Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментально-теоретическое обоснование принципов создания новых вакцин против лептоспироза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментально-теоретическое обоснование принципов создания новых вакцин против лептоспироза"

На правах рукописи

ЯГОВКИН ЭДУАРД АЛЕКСАНДРОВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИНЦИПОВ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ ЛЕПТОСПИРОЗА

03.00.07 - микробиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учит;!"! ст..тн:ни доктора мслицинсиих наук

Ростов-на-Дону, 1995г.

- г -

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону Государственном Н микробиологии и паразитологии Госсанэпиднадзора Российской Фед

чл. -корр. Академии Естествознания РФ, заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор А.П.Шепелев

действительный член РАМН и РАЕН, доктор биологических наук, доктор медицинских наук, профессор И.В.Домарадский

чл. -корр. Технологической Академии РФ доктор медицинских наук, профессор А.К.Адамов

доктор медицинских наук, профессор Т.Н.Анисимова

Российский университет Дружбы народоЕ

Защита диссертации состоится 1995 г. в _____

____ на! заседании диссертацисжного совета Д 074.32

по защите диссертаций на соискэлйе -ученой степени доктора, нг при Российском научно-исследовательском противочумном инстит} "Микроб" Госкомсанэпиднадзора РФ (410005, г. Саратов, ул. Униве ситетская 46/ .

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке инстит} "Микроб". . - ^ ' ' '

Автореферат разослан ¡СОЛ-дрЛ 1995 г.

Ученый секретарь ' диссертационного совета ■: ■ доктор биологических наук,. профессор . Г. А.Корн!

рации

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, лептоспироз относится наиболее значимым болезням среди групп природноочаговых зоо-эзных инфекций.

Пушогтпппаыио atrrunuuv ппиплпны» и яитплпупгииргии» пиягпп ЭПТОСПИрОЭЯ Н5 Т9р°ИТ0рИИ Н^Й гтраиы и nTiiaunoiiigü р ппгпопиио

эды рост заболеваемости ладей иктергемморагическим лептоспиро-ом, отличающимся тяжестью клинического течения н высокой ле-альностыэ, вызывает необходимость совершенствования методов и пособов профилактики, диагностики и лечения лептоспирозов.

В Российской Федерации с цель» специфической профилактики рименяется поливалентная убитая корпускулярная вакцина, которая ызывает недостаточно напряженный иммунитет (Чернуха Ю. Г., Бары-ев П.М., 1978), что требует повышения ее протективных войств (Чернуха D. Г.. 5 983).

Технология получения вакцины по BiC 42-144 ВС-88 не обеспе-ивает очистку вакцины от примесей кроличьего белка, что повыша-т ее реактогекность и ограничивает применение, в частности, для ммунизации доноров с цельо получения специфического лечебного ммуноглобулина взамен применяемого противолептоспирозного гчму-оглобулина из сыворотки волов.

На современном этапе создание иммунобиологических препарата необходимо проводить с учетом достижений биохимии, нммунохи-1ии и биотехнологии.

В отношении многих, возбудителей на основе изучения их имму- ' юхимии и молекулярной биологии с применением новых технологи-¡еских подходов получены или разрабатываются принципиально новые ¡ысокоэффективные иммунобиологические препараты, в том числе и вакцины.

Лэптоспиры в этом плане изучены крайне недостаточно. Имеется I значительное отставание от исследований, проводяацосся за рубе-гам (Майскова Т. С., Анисимова Т. И.. 1993).

Таким образом, исследования по создании новых иммунобиоло-•ических препаратов для профилактики и лечения лептоспироза с 'четом биологических и иммунохимических свойств лептоспир с ис-

пользованием современных биотехнологических подходов является актуальной задачей и имеет важное народнохозяйственное значение..

Цель исследования. Целью работы явилось решение проблемы совершенствования лептоспирозной вакцины и оценка перспективы развития биотехнологий получения иммунобиологических лептоспи-розных прэпаратов на основе экспериментального изучения иммунохимии, биологии лептоспир и противолептоспироэного иммунитета.

Основные задачи исследования.

- Выделить, изучить и отобрать для использования в качестве производственных новые природные штаммы патогенных лептоспир .

- Уточнить особенности энергетического обмена у лептоспир и разработать оптимальные питательные среды для накопления биомассы лептоспир.

- Выяснить иммунохимические особенности антигенного состава патогенного штамма лептоспир серогруппы 1с1егойаеаоггйав]ае и сапрофитного штамма лептоспир.

- Разработать новые технологии получения концентрированной и очищенной от кроличьего белка биомассы лептоспир. •

- Разработать технологию получения концентрированной очищенной вакцины против иктерогеморрагического лептоспироза и изучить ее иммуногенность, безвредность в опытах на экспериментальных животных и добровольцах.

- Разработать подходы получения мембранных структур и очищенных антигенов лептоспир, изучить их иммунохимические» биологические свойства и определить возможности создания бесклеточных вакцин.

. - Исследовать и оценить перспективность молёкуЛярно-биологичес-ких подходов для создания иммунобиологических препаратов для лечения и профилактики лептоспироза. 4?

Научная новизна результатов:

1. Доказано, что возбудитель лептоспироза способен диссими-лировать углеводы по пути Эмбдена-Мейергофа с участием гексозо-монофосфатного шунта, но метаболизм углеводов у лептоспир происходит в 10 раз менее интенсивно, чем у кишечной палочки.

2. Сконструирована новая полусинтетическая среда, которая обеспечивает возможность накопления биомассы лептоспир без применения чужеродного кроличьего белка, определены параметры, необходимые для ее использования в производстве вакцин и получения

биомассы для биотехнологическмх г.еш-.

3. Показана высокая эффективность концентрирования и очистки биомассы лептоспир с использованием этапов культивирования лшпоср.кр на новой лолусинтетической среде и новых методов мембранной Фильтрации на полых полиамидных волокнах. Новая технология запатентована и находится в реестре патентов России (патент № 1480354).

4. оинымш ссс&;п:аст:? гууоряпкнпгп и клеточного звена иммунитета при ЫдКЦШЩИ» ЦСЛМ^ТГ'Т™«"-'»« м*к«ин<ши ЗиСИйрИНСН тальных животных и добровольцев. Показана более высокая эффективность очищенной концентрированной вакцины при низкой степени реактогенности.

5. Разработана методика выделения и очистки функционально активных мембранных структур лептоспир из лизоцииных сфероплас-тов. Установлено, что образование сферопластов у лептоспир происходит дискретно по всей поверхности клетки.

Выявлены особенности химического состава мембран патогенных и сапрофитных штаммов лептоспир.

Выделены и охарактеризованы группоспгцифические и общеродо-пые антигены из мембран патогенного шташа лептоспир.

Установлено, что протективными свойствами обладают оболочки только патогенных лептоспир.

6. Выявлено, что лептоспиры при культивировании выделяют в среду культивирования специфические антигенные компоненты. Из среды культивирования выделен и' охарактеризован специфический антиген белково-полисахаридной природы.

Предложена универсальная схема выделения структурных компонентов и антигенов лептоспир для биотехнологических целей, позволяющая получать очищенные от чужеродного белка корпускулярные вакцины, а также иммунобиологические препараты на основе структурных компонентов клэтки, антигенов и их комбинаций.

7. Установлена возможность клонирования генов лептоспир. ответственных за биосинтез антигеноз в Е fol 1 и создана для этих целей библиотека генов.

8. Показана возможность "иммунизации" антигенами лептослир лимфоидных тканей человека в культурах клеток и конструирования

на этой основе гибридом смешанного происхождения, (мышь-человек), продуцирующих специфические к лептоспирам моноклональные антитела человека. Получена и задепонирована гибридомная линия мышь-человек, продуцирующая моноклональные антитела человека к мембранам лептоспир.

Практическая ценность работы:

Из числа выделенных и изученных природных вирулентных штаммов лептоспир штамм серовара Copenhagen! отобран для производства вакцины. Штамм задепонирован и на него получено положительное решение на патент Российской Федерации.

Разработана новая технология получения концентрированной очищенной вакцины в моно-, би- и поливалентном исполнении. Технология получения вакцины была запатентована и находится в реестре патентов России (патент 1480354). На концентрированную очищенную вакцину против иктерогеморрагического лептоспироза составлена документация (Инструкция по изготовлению и контролю Экспериментально-производственный регламент и проект Временной фармакопейной статьи).

Вакцина прошла испытания в опытах на экспериментальных животных, ограниченной группа добровольцев и решением Комитета па иммунобиологическим препаратам признано целесообразным проведение Государственных испытаний новой ьикцины (решение N"1 от 23, 02. 94 г.).

Сконструированная библиотека генов лептоспир может быть использована для дальнейших исследований по получению новых генно-инженерных продуцентов антигенов лептоспир.

Полученный штамм гибридомы C-II, продуцирующий человеческие моноклональные антитела против мембран лептоспир был задепонирован в Российской коллекции клеточных культур (N ВСКЛ/П/6176) инсттута цитологии Академии наук России и может быть использован в биотехонологических целях. Оснош-.ые положения, выносимые на защиту: -

1. Лептоспиры способны диссимилировать углеводы по пуп Змбдена-Мейергофа с участием гексозомонофосфатного шунта.

Новая технология получения концентрированной и очищенноР от кроличьего белка убитой клеточной вакцины против лептоспирозг для лодей включает в качестве основных этапов культивирование лептоспир на новой полусинтетической среде и новые методы моиб-

т ? -

пакной фильтпаши на полых полиамидных волокнах.

3. " "'ЛЯ у.'^.-.ла про'.'1 ¡¡ .'...;"■; >i r'if.CK'Ji'C; íi"i:TOC:V.,pL"":;-

u^.a^âwi ■• С" • : . ". ru:;: po::r-¡■■."VHÜCO

a. Г"::<НОЛП:"':я Получг-Küíl 04'. i "lOl-!:'-/^ ЧГ<Л ИЧМЫК !'0м5рч; ¡:iíí.-:

ТГ'ЛТУГ ~in?fsn.'ï,*CTOn поптлгпмр ПЯТОГСНК0ГО H СЗПРОФИТНОГО

■ - ' -. • • 'V'.:4i"i 41'": V.-'t .-•': -í ^■.i-'V,.,ii.i!':T¡--(.1

5. лсптоспиры в процессе и сродгк

..oirtíari/HfnT п ппзпи ЯНГКГЕНЫ.

t! I'nuu Wíl-nt riUll IITHtíri.llICnnBC v3<l Ct». u • ¿w .

возможно клонировать в штаммы Е coll.

7. В условиях "in vivo" лервнчно-трипсннизировамные лимфо-идкые клетки человека могут отвечать антительным отпето» на антигены лептоспир и использоваться для конструирования гибриде.« смешанного происхождения (иьиь-человек), которые стабильно продуцируют специфические к лептоспирам мсноклональкко антитела.

8. Принципы создания вакцин для людей против лептсспироза и гтарспоктип»» дальнейших работ в этом направлении.

.*л!&о5аиид рабе m Материалы диссертации долохекк:

- ;;а I Всесоюзной конференции по иммунологии (Сочи

- ня VI] ','о:хг.\:>аро&иоп Ввропчпской и IX Всесоюзно:: нгн^ук-н: "D ."Огл оспироэу (Москпа, 1991).

- на Реядународаоц конференции "'Перспективы иммукотни!;**:* • ; • . 1ис»«нкч з^оолгпачги" (Берлин, 1 f>°0>

• на (4оздунзродном конгрессе по зоонорл» (Словакия ш.'л

- на юбилейной конференции, погвященнои 70-летпи ^пм-иаи.,.

0Ур''С1'0Г0 ин.;, H'rv'Ta !««. Псстсрг

- coom'.cthí.,:-: засодани.ч Ростовского отделен ид otar логов il Ростовского отделения общества микробиолога», Л.Т08 и паразитологов.

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета иксти-»... - : !!(.рэбиологии и паразитологии. Протокол №2 от if! 02 "5 -

Публикац^м. По материалам диссертации опублнисч-а- : ¿: г, ;.-tí> « зарубежная к центральных изданиях, а также в сборниках труда-- конференции. Утзерздено 5 нормативно-техническьх лоь-умчн-/.-ций, программ и отчетов об испытаниях вакцин, получен i пнхтт Российской Федерации и одно положительное решение на патент.

Структура и объем диссертации.

Диссертация написана в монографическом стиле и включает введение. 5 глас результатов собственных исследований и их обсуждение, общее заключение по работе и выводы. Список литературы содержит 229 наименований. Работа йзлонена на 240 страницах машинописного текста и иллюстрирована таблицами, рисунками и фотографиями. Основные результаты, приведенные в диссертации, получены лично автором. Исследования по отдельным разделам проводились совместно с сотрудниками лаборатории особо опасных инфекций института под руководством автора и его личном участии. Раздел по изучению метаболизма лептоспир выполнены совместно с младшим научным сотрудником 0. В. Фрунзе. Раздел по иммунохимии лептоспир выполнен совместно со стараим научным сотрудником Б.0.Вачаевым Исследования по использованию гибридомных технологий проводились в комплексе с лабораторией гибридом Ростовского противочумного института (руководитель - докт. биол. наук Л.П.Алексеева).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В работе использовали культуры Leptospira Interrogans се-рогруппы Icterohaemorrtiaglae серовара Copenhagen! штаммы Крыса-2 » Одесса-853 культуру Leptospira blflexa серогруппы Semaranga, шташ Patoc I.

Штамм L. interrogans Крыса-2 был выделен из почек серой крысы на территории Ростовской области в 1989 г. Штамм идентифицирован до сероварианта по методике, изложенной в методических рекомендациях по эпидемиологии, диагностике, клинике и профилактике лептоспирозов (1387).

По морфологическим признакам шташ Крыса-2 представляет собой хорошо подвижные спиралеподобные нити длиной 7-10 шш и диаметром 0,06-0,10 мкы. При посеве на питательные среды клетки хорошо растут на среде Терских с кроличьей сывороткой.На 10-12 сутки культивирования число лептоспир достигает 100-150 клеток в поле зрения микроскопа (х200).

Второй использованный птамм L. interrogans серогруппы Icte-

rohaemorrhagiae серовар Copenhagen! Одесса-853 является производственным штаммом, выделенным Одесской противочумной стинфа-н и был получен из производственной коллекции Ставрополье^^ иас титута вакцин и сывороток. Штамм имел типичные для лоптпащр свойства. Изучение вирулентности штамма Крыса 2 проводили на зо лотистых хомячках при внутрибрюшинном заражении. ЛЯ,и для золотистых хомяков составляло 2' 104 микробных тол, рагчиг.тного но методу Кербера, изложенного в монографин Ашмарина И. II., Ворооьева

t П / , AAAt

А. II.

(СиЛпЧесП»^ Ль!(iboiUip 3 ПСЛС

при увеличении х200, а также по метиду Власова А. П.,Фоменко А.С.(1979), который основан на выявлении соотношения между площадью поля зрения и площадью , занимаемой исследуемой культурой, распределенной строго под покровным стеклом 18x18 мм, с учетом кратности увеличения оптической системы микроскопа, объемом взятой культуры (0,02 мл),среднего числа лептоспир в поле зрения микроскопа и кратности разведения культуры.

Расчет проводился по формуле-К - 3570, 4 х 50 х М х N где , К - число лептоспир в мл;

3570,4 - коэффициент, указывающий, во сколько рал п«.сил»« {».* hi деления культуры под стеклом преьышакг нломл.- греки*, 50 - Коэффициент, указывающий, во сколько раз объем 1 ил превышает объем исследуемом культуры;

И - среднее число лептоспир и ¡юле зрении.

N - кратность разведения культуры.

Используемый нами метод подсчета клеток лептоспир сравнивался с методом определения концентрации леп-госпнр в счетной камере Петрова-Хауссера и показал идентичность рыультп'чж -инч.-ш.-ления числа лептоспир двумя методами.

Антигенные свойства штамма Крыса-г (¡пределяли нуп.-м инпри-веннои двукратной вакцинации кроликов до-.шх 1 wi с и/ггн- и.<. лептоспир 100-150 клеток в поле зрения мнкроским. При этом титры антител, определяемые в реакции микроапчитшацин и лизиса с аутентичной культурой, составляли в сродней Ш00-3200.

Биологические свойства штамма при условии хранения в жидком азоте и на среде Терских с кроличьей сывороткой стабильно сохраняются.

Штаммы L. interrogans Крыса 2 и Одесса 853 хранятся в коллекции музея лептоспир в референс-лаборатории ВОЗ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.

Leptospira ЫПеха серогруппы Semaranga, штамм Patoc 1 получен из справочной лаборатории ВОЗ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи и является типичным представителем непатогенных лептоспир. Для постановки РМАЛ и адсорбции сывороток исполььовали набор диагностических штаммов лептоспир из института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи.

1.1. Методы биохимических, иммунохимических и физико-химических исследований.

Для изучения химического состава препаратов использовали общеизвестные методы.Содержание белка определяли по методу Bradford hi (1976),углеводы по Dubois М. et.al. (1956), сумму нуклеиновых кислот по Спирину A.A. (1958).

Общие лилиды определяли по Woodmanrl (221). Разделение белковых компонентов электрофорезом в полиакриламидном геле осуществляли по методу Laemmli V. (1970).

Ионообменную и гельхроматографию проводили на различных носителях, . пользуясь рекомендациями изложенными в монографиях 0с-термана (1985) и Детермана (1971), а также фирм-производителей сорбентов.

Липиды из полученных мембранных препаратов экстрагировали методов Bllgh Е. и Duer W. (95). Общие липиды и фосфолипиды разделяли методом тонкослойной хроматографии на пластинках селикагеля Фирмы Berva в системе хлороформ-метанол-вода (Бергельсон Л. Д. и д(>., im). .

Для характеристики степени чистоты выделенных антигенов использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию на приборе фирмы LKB, пользуясь рекомендациями фирмы-изготовителя.

. Изучение метаболизма глюкозы у лептоспир проводили с использованием радиореспирометрического метода .применяя меченную С14 глюкозу по первому и шестому углеродному атому.

Мембраны лептоспир получали из лизоцииных сфоропластог, с последующей очисткой оболочек метолом центомМутирования d градиенте плотности сахарозы.

Функциональную активность мембран характеризовали, определяя активность НАДН- и НАД?Н-оксидаз (Llgetl Е. ct.al..1988).

Для характеристики структурных компонентов лептоспнп использовали методы электронномикроскопических исаю/юваяий с контрастированием нативных мембран уранилацетатом.

Более Д-?С-Л1л:СС мо^пяммм* O-i iiyK i wO jiMiTUUinü i,WC

водили на ультратонких срезах фиксированных в течение 15 »ин>> * 15%-ном растворе глутарового альдегида и 0,1%-ном растворе пара-формальдегида с последующей инкубацией в течение 1ч и в 1%-ном растворе осмия. После дегидратации этиловым спиртом материал заливали эпоксидной смолой. Ультратонкие срезы получали с помощью ультратома фирмы LKB (Швеция). Затем среды просматривали и фотографировали с- помощью электронного микроскопа УЭМВ-100 при увеличении в 25-30 тыс. раз.

Антигенный состав оболочек лептоспир изучали методом двойной диффузионной преципитации в геле по 0.Oucftterlony (1943) с использованием 1Ж-ного агара Дкфко, приготовленного на физиологическом растворе, забуференном 0,001 М фосфатным буферов (рН-7,2). Нагрузки препаратов на антигенные лунки оас/ьирос.ми с зависимости от целей исследования.

В качестве антител применяли коммерческие сыворотки производства Ставропольского института "Аллерген",а также экспериментальными сыпоротки, полученные путем б-ти кратной внутривенной иммунизгции мембранами лептоспир и цельными клетками кроликов породы "Шиншилла".

При имчунохимических исследованиях мембран лептоспир применяли и абсорбированные антисыворотки, которые приготавливали путем добавления к 1 мл гилериммунной кроличьей сыворотки против оболочек L. Interrogara штамма Крыса-2 10 мг лиофилизированных мембран L.bifiexa штамм Patoc i. Полученную суспензию перымеши-ьа/íH 3 часа на магнитной мешалке при 37° С, после чего центрифугировали прк 1000 g в течение 15 мик. Супернатант сыворотка отделяли и использовали в имиунохимическом анализе.

Дополнительные иммунохимические исследования проводили с использованием метода иммуноблотинга (Т. Нго и Г.Лекхофф, 1988).

Отдельные оригинальные методики при использовании гибридом-ных и генноинженерных методов исследования приведены в соответствующих главах.

1.2. Методы биологических исследований.

Изучение биологических свойств разрабатываемых иммунобиологических препаратов проводили с учетом требований, предъявляемых к вакцинам. В качестве препаратов сравнения использовали коммерческую поливалентную вакцину против лептоспироза.

Токсичность препаратов изучали в соответствии с требованиями, изложенными в приказе N31 МЗ СССР "Об унифицированных методах контроля медицинских и иммунобиологических препаратов" (58).

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа определяли на белых мышах по изменению массы конечности в соответствии с РД 42-28-8-89 "Доклинические испытания новых иммунобиологических препаратов" (1989).

Антигенную активность изучали на взрослых кроликах породы Шиншилла, массой 2-3 кг, проводя иммунизацию по различным схемам. Титры антител в сыворотках выявляли в РМАЛ (1987), а такие иумуноферментным методом, пользуясь "Методическими рекомендациями к проведению иммуноферментной диагностики лептоспироза" (Волина Е. П., 1985).

В ИФА в качестве антигенов для сенсибилизации панелей использовали очищенную концентрированную лептоспирозную вакцину и клеточные оболочки лептоспир, солюбилизированные SDS'Na.

Протективные свойства исследовали в тесте активной зациты на золотистых хомячках. Учитывая, что выпускаемая коммерческая вакцина дозируется в мл, а не в количестве клеток, оценивали ЕЛ30 в мл.

Влияние мембран на функциональную активность лимфоцитов крови человека изучали, используя метод хемилюминесценции (Faden Н., Maciejewski N., 1981). Определение проводили на хемилшино-метре ХЛ-3603 производства СП "Диалог".

Материалы и методы, использованные при сравнительном изучении вакцин в опытах на ограниченной группе добровольцев изложены в главе III.

Цифровые показатели, полученные в ходе экспериментальных

исследовании подвергали статис[ичэ1 кой обработке.

При характеристике антигенных свойств использовали метод непрямых разностей (Некляев Н.Ф. ,1968). Среднее квадрзтическое отклонение (6) от средней геометрической титра антител определяли по формуле:

Полученную ошибку средней увеличивали с учетом уровня вероятности Л95, определенную по критерию Стьюдента-Фишера. Протек-тивную активность в опытах на животных вычисляли по формуле Кер-бера а модификации И. П. Ашмарина и А.А.Воробьева (1987). Статистическую обработку материалов клинико-лабораторных, биохимических и иммунобиологических исследований проводили с использованием компьютерной программы "СЬагГ' иирьы МНлизоН (США).

ГЛАВА П. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ЛЕПТОСПИР И РАЗРАБОТКА

Одной из основных причин недостаточной эффективности убитых лептрспирочсых вакцин является малая коицентрг\цин антигенного материала (В.3.Ангмьин, 1867), что связано с трудностью культивирования лептоспир и наличием кроличьего селка в яидких средам культивирисгчния.

Вг-чмпннив и/ти решения этой проблемы сазаны с нонсгруиро ванием новых сред культивирования, гаторые должны осноиывагис.. на особенностях метаболизма лептоспир, а такае путем создания новых биотехнологий очистки и концентрирования клеток лептоспир.

Р.о способу получения энергии лэптосииры относятся к ха<лор-ганотрсфам, т. е. источники энергии испоньзуонш этими микроорганизмами многочисленны и эта группа микроорганизмов монет получать энергии) за счет окисления широкого н¿¡'юра органических соединений.

Наиболее часто в качестве источника энергии для микроорганизмов используются углеводы З.Роуз (1971).

^ ^ , 'У • _• ' »» 1Н 1Пг"Г

п - общее число вариантов.

Т Гум™ гугмнпииммй <11 соьиььл 1 bofcC.fi.4CQi

ПИТА'Ш!ЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА НАК!1ИН.

При изучении распада глюкозы у лептоспир. проведенным Bas-seman J.и Сох С. (1969), Ежовым Г.М. (1979), не удалось выявить i экстрактах клеток активности некоторых ферментов пути Эмбде на-Мейергофа. На этом основании была поставлена под сомнени! способность лептоспир метаболизировать углеводы по указанном] пути. Однако, не исключалась возможность потери активности фер ментсв при получении клеточных экстрактов. Тем не менее - это' вопрос необходимо было окончательно выяснить, так как он важен i теоретическом и практическом плане.

Известно, что путь Эмбдена-Мейергофа особенно важен в здер гетическом плане, а гексозомонофосфатный путь обеспечивает мета бсшические процессы важным фактором НАДОН. участвующим в липид ном обмене, а также является источником пентоз для биосинтез; нуклеиновых кислот.

Решение этих вопросов было возможным при использовании но вых методических подходов, юторые могли бы дать более информа тивные сведения об участии углеводов в энергетическом и биосин тетическом обменах лептоспир. В связи с этим в наших исследова ниях был использован радиореспиромотрический метод для оценк характера диссимиляции глюкозы, позволяющий получить сведения i реакциях обмена непосредственно в живых клетках этого возбудите ля.

1 В опытах использовали штаммы L.Pateс-1 и L. Interrogans Кры са-2. Культуры ьыращивали на жидкой полусинтетической среде разработанной в нашей лаборатории, и на среде Терских. Лептоспи ры концентрировали центрифугированием при 13000 об/мин в течени 40 мин и дважды отмывали фосфатным буфером (рН-7,2), затем внов концентрировали до 20-23 млрд в 1мл.

При инкубации клеток лептоспир с глюкозой, меченой по 1-м и 6-му углеродному атому, 1.4-Си янтарной, 1С14-яблочной 2СИ-лимонной и 2С14 -уксусной кислотами, наблюдали, выделение ра диоактивной COg(табл.1), что указывает на присутствие комплекс Ферментов, способных диссимилировать эти субстраты.

Как следует из таблицы, выход радиоактивного COj при ис пользовании 1С14-глюкозы превышает выход COj, наблюдающийся пр распаде 6С14-глюкозы. Это свидетельствует о наличии у лептоспи двух путей метаболизма глюкозы, функционирующих одновременно

Таблица 1

Интенсивность ксляченмя рздиог.'ггив!1сЛ уотхн з СОг при

субстрлтсп V п (Т ± .ЬО

мечспие Пи углероду

С'^С-ОИ"-'

глзкоза

"1С«"-

1С14 - яблочная кислота 1 ¿

1,4-С - янтарная кислота 2С1* - лимонная кислота 2СИ - уксусная кислота

Инкубационная среда

Ь. Рй10С-

21972 1 1200

ПЮГ) ж ппп

15340 ± 936

13700 1 840

5300,1 423

12360 ± 791

" 26323 Т1326

II 4 О л ЛЛ1

17238 1 848 15120 * 902 7240 1 180 13872 i 850

ЯмЯпена-Ией'ррг'о^. и гексозоионофосфатного.

Из-ггипч^оку, основное зкзчениэ этих путей cnr.fi.wiv с /частном з использовании гликопротоиднк:; компонентов сягс :>тг

Дй-.'ЗЯ !'ар2КТСр!«С?ИКУ отечсстсеккя?; Ц ЗаруиО;*" Гн'от-т• "к!* по создания питательных сред для культивирования г..~;:г"-"'

п'кцнн, необтади"а 07«рт"?>>, что

«ые результат?' бмлк получены в случай, когда уп:-:гтгу Г" • ""ел базиоэзагась на дзг.гчх ^изяологич и нетаболи.":-- *

Внянлеи»;!'? ноене ртрив о роли «ир^уу ««слот •.<*»»*•><» , метаболизме лептоспнр способствовали создания Сазсмророто^мня

Г*";'. !«•-. "П'г '.П ИТЯ», наилучшие розу.'-ьтчтм пл<? ':'*. '¿'Т^'Т'- ' !""!г!2!'ЯСТГ?? г."рОПа'Ч,'> Г!?П7СГЯ!Ир бмЛИ пр;: ^г»"»:.*!-' ' ■

синтетических сред, где используются компоненты сыворотки, до-:"\т-'«тс>/!ьныз факторы питания и вещества, обеспечивающие вогиоя-исстга Евтоксикаиии ооганических перекисей. Именно исследования п

нгпрйепс-:-.:«! булут в настоящей врем" наиболее г^пг:::';'^. :! получения биомасса дли вакцинного

С^ССТУЛ^Я и России технологий т/п'чення ЛЮТйяиосХ-чпР оженим поя/ц'счатрмззе? последовательноэ культивироги*нке «.гаиясг лептоспир на среде Терских с кроличьей сывороткой и заменой на заключительном этапе культивирования на среду из фосфатного буфера без сывороточного белка. Тем не менее, это не позволяет по-

лучить высокие концентрации клеток лептоспир и не может нскла-чить содержания больших количеств кроличьего белка в вакцине. В связи с этим, важным аспектом исследования является разработка и совершенствование питательных сред культивирования лептоспир, которые бы обеспечивали высокий уровень выхода биомассы лептоспир с отсутствием или значительным ограничением количества чужеродного белка.

Нами была изучена возможность культивирования вирулентных штаммов лептоспир на синтетических безбелковых средах. За основу была взята среда Shenberg Е. и Torten М. (1973). Выли приготовлены и испытаны также варианты сред с использованием в качестве добавок среды 199, среды Игла, гидролизата лактоглобулина, экстракта селезенки, сарцинового стимулятора и пептона Dlfco. Всего было испытано 7 вариантов сред.

На синтетических средах при посеве 1 мл культуры с плотность» 150+20 клеток на 7 мл среды, как природные вирулентные, тач и музейные штаммы не размножались. Клетки лептоспир теряли активную подвижность, появлялась зернистость, набухание и на 5-10 сутки наступал лизис. Использование выиеописанных добавок к синтетической среде не приводило к улучшению ее ростовых свойств. Таким образом на синтетичгских средах нам не удалось накапливать биомассу лептоспир. Одна из причин трудности культивирования лептоспир на этих средах мояет быть связана с необходимостью адаптации штаммов к этим средам при пассировании (Maz-гопеШ У. et. al.,1984).

Представляет интерес возможность использования для культивирования лептоспир сывороточных препаратов крови человека. Применение этих компонентов позволило бы исключить гетерогенный белое, как источник азотистого питания и анергии.

В наших исследованиях испытаны производственные серии двух препаратов из сыворотки крови человека - альбумин н "протеин", в том числе забрзкованные по физическим свойствам. Было установлено, что на среде Терских с добавлением 5% альбумина и 4,8% "протеина" в дозах от 3 до 535 (об/об) происходило нарастание биомассы лептоспир, которая достигала максимума на 15-30-й день и составляла для среды с альбумином 70 + 20 клеток в поле зрения микроскопа (х200) и 90 + 30 для среды с "протеином".

Накопление биомассы на этих средах не достигала уровня раз-

позначного при использования среды Терских с кроличьей сывороткой, но эти результата подтвердили возможность применения пкпус-г.аемкл промышленностью стандартных белковым препаратов из крови человека для конструирования сред с целью культивирования леп-тоспир.

На основании анализа данных литературы по метаболизму леп-тоспир и проведенных исследований была сконструирован i новая полусинтетическая среда, содержащая в своем состапз в качестве не-

■ГГ" " • • »— н(1нлм<|л t, ^«тпп^жниЛотпл iininnniil гм ППППОПОШ

iUiiiiii-.U lii^i ii.i * tOili .Jl 11 ^'ilui-. ь . ! - .'^i 'J '.Лм , ; ^ ,

"Протеин" получаемый из сыворотки крови человека. Дополнительно в качестве источника азота был введен аспарагин, играющий важную роль в обмене аминокислот у лептоспир, а также 1,-цистеин в качестве компонента, поддерживающего скислительно-воссталовитель-ный потенциал. В среду был введен твин-80 или спиртовый раствор линетола, представляющий собой смесь этиловых эфиров ненасыщенных жирных кислот. При использовании твина-80 или линетола мы учитывали энергетическую роль жирных кислот и их аначемие как детергента, изменяющего функционирование мембран микроорганизмов (Сорвин C.B. и др., 1987). В качество витаминных добавок мы использовали тиамин и цианчобаломин.

Поскольку у лептоспир Функционирует активно цикл в-окисления жирных кислот и высокий уровень синтеза липидоп дополнительно был введен пантотснат кальция, входящий в состав ациллорено-сящего («Фермента, играющего важную роль в метаболизме липидоп.

Одним из факторов угнетающих рост лептоспир являй.ся наличие еппбп^ных жирных кислот и перекисных продуктов, образующихся при росте лептоспир. Для снятия их токсического действия кспол?.-зосался полкашшлпиррешидон,входящий в состав препарата Teno-дез" или "Полиглюкин".Все ингредиенты растворяли в И/15 фосфатном буфере. 0птих1альнцй pH среды составлял 7, 3-7, 4. Стерилизацию среды осуществляли фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0, 22 ммк.

В экспериментальных условиях подбирали оптимальные концентрации для каждого компонента.

По результатам проведенных исследований быгл екпнетруиренп на полусинтетическая среда, имеющая в состава следующие компоненты: .

Белки сыворотки человека "Протеин" - 3,2 г/л

"Полнглюкин" '6% в/об или "Гемодез" - 6.0 . -"-Аспарагин -0,5 -"-

Цистеин - 0.01 -"-

Линетон или Твин 80 - 0,05

Тиамин - 0,025

Цианокобаломин - 0,0001

Пантотенат кальция 20 % в/об . - 0,08 -"-

Фосфатный буфер М/15 рН 7,6 - до 1000-"-

Данные по ростовым свойствам новой полусинтетической среды в сравнении со средой Терских с кроличьей сывороткой представлены в таблице 2. Посевная доза составляла 1 мл с содержанием леп-тоспир 50-100 клеток в поле зрения микроскопа(ув. х200) на 5 мл испытуемых сред.

Таблица 2.

Наименование сред культивирования Число лептоспир в поле зрения микроскопа (х 200)

через 10 дней через 30 дней

Среда полусинтетическая 187+30 174+40

оптимального состава •

Среда Терских с кроличьей 158+30 160+25

сывороткой

Как видно из таблицы, вновь разработанная среда обеспечивает высокую концентрацию лептоспир, не уступающую среде Терских.

Бьи№ исследованы ростовые свойства новой среды для представителей различных серогрупп лептоспир и показано, что предложенная среда обеспечивает оптимальный рост основных серогрупп лептоспир. •

Таким образом, в результате проведенных исследований сконструирована новая полусинтетическая среда, которая обеспечивает возможность накопления биомассы лептоспир без применения высоких концентраций кроличьего белка, и определены параметры, необходимые для ее использования в производстве вакцины. Проведенный экономический расчет показал, что по себестоимости новая среда в 2 раза дешевле, чем среда Терских с кроличьей сывороткой и приготавливается из отечественных ингредиентов, выпускаемых промышленностью.

ГЛАВА III. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ ЛЕПТ0СПИР03НЫХ ВАКЦИН И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИХ ПРОИЗВОДСТВА.

В настоящее время в России и странах СНГ с целью специфической профилактики применяется клеточная поливалентная убитая гретая вакцина, содержащая в качестве примеси кроличий белок. Вакцина вызывает недостаточно напряженный иммунитет и требует

nnntimAiiiin лп плг»«пЛ|^т(|г>1 ши ЛпгчЛ/чшп ( 11лгм П Г* Coni imnn П II

I lUl'm.üLitf-Л К ; 1|'W i i »ii.:; ичл ^DwiiW J V ïw-pil/ЛСЛ W. i , t DapU^UJJ» И. n. ,

197B; Чернуха D.Г., 1983).

За рубежом также используются вакцины, состоящие из убитых суспензий лептоспир и содержащие животный белок. При парентеральном введении они вызывают общие и местные реакции (цитировано по Faine S., 1982).

В последние годы (Shenberg R.. Torten M.. 1973), была приготовлена формоловая клеточная двухвалентная концентрированная вакцина из взвеси лептоспир, выращенных на синтетической среде с твинами. В экспериментальных условиях и при испытаниях на добровольцах вакцина обладала слабой реактогенностыо при средней степени антигенной активности. К сожалению последующих данных о применении этой вакцины в доступной нам литературе не имеется.

Совершенно очевидно, что проведенные работы по усовершенствованию лептоспирозной вакцины для людей недостаточны и н~ могут в полной мере обеспечить улучшение качества вакцины. В наггсй стране работы в этой области значительно отстают от уровня исследований, проводимых за рубежом

На наш взгляд, усовершенствование корпускулярной убитой Ьакцины должно быть разделено на несколько этапов.

На первом этапе должны быть разработаны новые подходы к культивированию лептоспир с учетом достижений в изучении метаболизма у лептоспир и методов культивирования, изложенных нами в Иервой главе, а также разработаны технологии концентрирования биомассы лептоспир с применением современных технологических подходов и, прежде всего, на основе использования мембран отечественного производства.

Как и в ветеринарной практике, необходимо создавать технологии производства вакцин как в моно- би- и поливалентном исполнении.

Ваяно также продолжить исследования по замене штаммов леп-тоспир, входящих в вакцины, с учетом результатов хорошо поставленного в нашей стране эпидемиологического мониторинга. Это позволит отобрать наиболее вирулентные штаммы, которые могли бы быть применены не только для производства вакцины, но и для разработки более информативных методов контроля с использованием методов активной защиты.

С этой целью нами в период с 1984 г. по 1987 г. было обследовано на лептоспироз 4210 экземпляров 15 видов мелких млекопитающих, добытых в открытых станциях и помещениях. В результате проведенных исследований выявлены эпизоотии иктерогеморрагичес-кого лептоспироза среди серых крыс в пойме и дельте Нижнего Дона, а также в г. Сапьске. Наиболее интенсивные эпизоотии лептоспироза протекали среди крыс на территории рыбхозов. Из почек крыс-лептоспироносителей выделено 94 культуры лептоспир. Все культуры были типичными по морфологическим свойствам.

При изучении иммуногенных свойств одного из штаммов (Кры-са-2) было установлено, что 2-х кратная с интервалом, в 10 дней внутривенная вакцинация кроликов живой культурой в дозе 1 мл с содержанием 100-150 лептоспир в поле зрения микроскопа (х200) вызывала образование антител к штаммам Крыса-2, Одесса-853 и М-20 в титрах более 1:50 тыс. Иммунная сыворотка в дозе 1 мл защищала 100 % хомяков от заражения вирулентными штаммами лептоспир.

Изученные свойства штамма Ь. 1с1егоЬаетоггЬай1ае серовар со-регЛадеп! - Крыса 2 свидетельствуют о возможности его применения для получения вакцинного препарата. Штамм был депонирован во Всесоюзной коллекции штаммов лептоспир и на него был выдано положительное решение на патент. ¡,

Одной из причин недостаточной эффективности лептоспирозных вакцин является малая концентрация вводимого антигена, требующая применения больших доз вакцин, что при наличии балластного чужеродного белка значительно ограничивает ее применение. В связи с этим необходимо было, помимо разработки полусинтстической среда, отработать методы концентрирования к очистки лептоспирозкого антигена. которые бы не сопровождались концентрированием компонентов питательной среды при технологичности его исполнения в лабораторных и производственных, условиях.

Нами были применены методы-у. 1ьграцентрифугирования и ультрафильтрации. ..В работе использоэатк нитроцеллюлозные, капроновые и ядерные фильтры с диаметром пор 0.22 ммк. При центрифугировании применяли факторы разделения от 5700 до 30000 g. Испыты-зали возмойность концентрирования нативных и обездвиженных леп-тсспнр.

Методы ультрафильтрации и центрифугирования при 5700 % на-попгпгпио не позволяют эффективно концентрировать здтишзя «птор»«« н силу свосй актнзагсй тодскянояп* по-

никают через поры мембраны и большую часть клеток находилась з центрифугате и фильтрате. Ультрацентрифугирование при 30000 в и выше позволяет сконцентрировать клетки, но применение этого ре-яима нетехнологично и» кроме того, использование высоковнрулент-ных штаммов затрудняет выполнение режимных требований защиты. Обездвиживание лептоспир с последующим центрифугированием или ультрафильтрацчей обеспечивает хороший эффект концентрирования, но в некоторых случаях наблюдалась Фрагментация клеток лептоспир, которая зависела от использования методов обездвиживания. Был испытан ряд веществ: формальдегид, азид натрия, мертиолат натрия, этиловый спирт, азид натрия в комбинации с оДТА, хлороформ, а •!•:./•:/<••.' препарат хикокаличового ряда - диоксидин. Элективное обездвиживание клеток лептоспир происходило поя использовании азида натрия и мертиолата натрия. Х;юсоформ и комбинация азида натрия с ЭДТА вызывали лизис клеток в низких концентрациях. формальдегид обеспечивал быстрый шеренг ибездаиаивания, но через 3-5 члсоо част:, кястск пслгергэлчгь дпягиенташш и лизиро-зелыь Наэффект обездвиаивзнмя на&лвдался при использовании . диоксидина, применение которого в ньышх одщентрацьих обездвиживало клетки лептоспир без морфологических изменений через 10 часов.

Следувдии этапом была разоа&тка иронзшлствоиюй течноло-гк»гзсгой суечи получения вакцин:.; с учетом экспериментальных лабораторный исследований. Разработка технологии включала этапы приготовления попусинтетической среды и режима культивирования на ней лептоспир, концентрирование лептоспир и получение биомассы, стандартизацию и контроль вакцины.

Технология приготовления среды требовала применения мембранной стерилизации. Это было достигнуто использованием отечест-

венной промышленной установки УСФ-293, выпускаемой заводом в г. Кириши и отечественных стерилизующих мембран ЫФЦ. МФЛ-Ма, а также капроновых фильтров.

Для концентрирования обездвиженных лептоспир использовались пластинчатые, нитроцеллюлозные, ацетатцеллюлозные, а также капроновые мембраны с диаметром пор 0.22 ммк. При этом установлено, что мембранная фильтрация на указанных фильтрах позволяла проводить концентрирование обездвиженных лептоспир в 2-3 раза, но при пропускании больших количеств посевного материала вследствие образования примембранного слоя (вторичная мембрана) замедлялась скорость фильтрации на всех типах мембран, имелась вторичная сорбция клеток лептоспир и требовалось проводить длительный этал отмывки мембраны, что снижало эффект концентрирования, а увеличение вакуума или давления при снижении скорости потока разрушало клетки лептоспир.

Наиболее простым и технологичным приемом было применение метода центрифугирования обездвиженных лептоспир на отечественных центрифугах ЦР-6 в режимах 6000 об/мин на угловом роторе марки Р98х90 при 5° С в течение 40-60 минут с последующей отмывкой М/15 фосфатным буфером pH 7.3-7.4. Но метод центрифугирования хотя и был технологичным, не позволял работать с большим количеством материала.

1 Учитывая вышеизложенное, были продолжены исследования дл? разработки технологии с использованием методов фильтрации. Нам» была применена тангенциональная фильтрация с использованием полиамидных полых волокон, пропускающих вещества с массой 2000С дальтон на ультрафильтрационном волоконном аппарате УВА-200. Н: данной установке скорость фильтрации значительно улучшилась, происходило концентрирование биомассы лептоспир, ко наблюдалиа сорбционные процессы и не было полной очистки от белковых компонентов среды, что снижало эффект концентрирования. - В связи с вышеизложенным нами были применены новые полые полиамидные волокна, пропускающие вещества с молекулярной массой до 100000 дальтон. разработка проводилась совместно с сотрудниками НПО "Химво-лото" и конструкторским бюро биологического прнборостроени) (г. Кириши). ;; .

• 8 результате исследований бала разработана технология ttoH центрирования и очистки биомассы лептоспир с использование»! оте

чествснной установки УПЛ-0,8 для тангенциальной фильтрации на полых полиамидных волокнах, фильтрующих вещества с молекулярными параметрами до 300000 дальтон. Результаты концентрирования биомассы лептоспир с использованием различных технологических опера',1ни представлены в таблице 3,

Таблица 3.

Сравнительный анализ методов концентрирования лептоспир

пи I АЛОЛК I Ни ипсиеШИг! I ООЬЬм |ип

пп

оиомассы, сконцентрированной за 1 ч до 0,5 л

_.- IГГ. .______, ,

ПООЛЬ >'1-о;г п | -

рации

,6

1. Центрифугирование 1,5 30-4040° 60-70' 10°

2. Ультрафильтрация на -пластинчатых фильтрах 2,5 . 30-404 0° 60-100 10

3. Тангенциальная фильтрация на полиамидных - й

полых волокнах 10 30-40' 10 51С-650 50

Как видно из таблицы, наиболее эффективным споссюи концентрирования клеток лептоспир является технологил с использованием тангенциальной фильтрации на новых полых вагч.'.-кнай, гозте/р-кяцая за короткий промежуток времени не только концентрировал о, но и очищать биомассу от компонентов среды культиг)иг>0п"г':;д.

При необходимости могли быть применены и комбиниг-оп-.ннъ'? схемы, включающие ультрафильтрационные операции и центрифугирование.

Разработанная технология получения биомассы .'¡оптооъ;;- с использованием новой среды культивирования и методов концентрирования и очистки с целью получения иммунобиологических препаратов оьша запатентована и зарегистрирована в реестре патентов России.

»1 результате биологической и технологической проргботк:» 5»?-предловена следующая схема получения концентрированней аат^ч-ны против кктероге'Юррагического лептоспироза (ркс !).

Более кэсткие требования к концентрированной за!<цикэ ч новая технология ее получения потребовали введения новый и совершенствование существующих методов контроля лептоспирозной вакцины. :

Пассаж шгамма для поддержания вирулентности

Вакцинный штамм; лептоспкр на ! сседд "емких | (проокрки) !

Ш створа идина 1 * его нтраши

^рЕзлйна^.З*

цента: ЕЗНИ&

об/м пр!} 40мин "

ифугищ-

тгт-.ц

ант 'А) центрирование на потах полиамидных волок-(.Еариант

Определение - концентрации лептоспир в физ. р-ре

X

Полуспнтетическая с человеческим протеином срЕ=1в -с ?-10 суток

Микообная масСа ппобпрки биологические (.мзточ- , ная культура)

Полусиктетичэс- ! КЭЯ С Ч5Л0В9Ч9С-,: ккм протеином

СРеЯ!=£8 «С 7-10 суток

Микообная мае С а пройгзод-ствекные флаконы

Микробная масса предваоительно инактивированная и обездвиженная

Концентпированная микробная масса (концентрат 1, обадок)

Отмызка 2х кратная фосфатным Оушепом при ценхрис'/Пйзова-п нйи 500,1 об/м При 6°С 40 мин (вариант А) Отмывка на полых волокнах Xвариант Б)

Отмыта?, концентрированная, микробная масса (концентрат II осадок;

I

м

Разведение вакцины тиэ.р-ром до 10-1Тмлрд по кишечному стандарту мутности

Концентрированная стандартизованная микробная масса

Еакидаа лептаспиразная пктерогеморраги-ческая концентрированная инактпзирован-ная жидкая.

Рис. 1. Биологическая схема получения концентрированной

вакцины.

Учитывая, что вакцина концентрированная, дополнительно введены методы контроля специфической стерильности.При контроле ан-тнгенности вакцины внутривенная иммунизация кроликов заменена на подкожную, применяемую при вакцинации людей.

Так как вакцина предназначается для иммунизации доноров и не должна содержать кроличьего белка, введен иммунохимическин сгй ссдср™г_"''п иг технологического процесса и

готоьоА продасцнн с испс?я-?.овг*ни«?м ст*м мотмы вщисн<илк;А пйс мышленностью ант!.кроличьей сыворотки в реакции кольцепреципита-цни.

По разработанной технологии получения вакцины на заключительном этапе после очистки не обнаруживаются принеси белков сыворотки кролика, выявляемых иммунохимически в реакции кольцепре-цнпитации.

Высокая вирулентность выделенных штаммов 1, 1с1егоЬаетоггЬа-

П1ао позволила внести для контроля вакцины тест активной защиты на хомяках, более адекватно отражающий протективную активность вакцин.

Новая технология позволила применить количественную стандартизацию микробной пассы с использованием оптического кишечного стандарта мутности (0С0-42-28-59-85-20 ед), который соответствует примерно 10 х10а лептоспир в мл.

Разработанная технология обеспечивает выход стандартного продукта и предполагает использование отечественного оборудования.

По новой технологии было получено 10 серий концентрированной вакцины, которые были изучены на безвредность и токсичность по требованиям, изложенным в приказе МЗ СССР N31 от 13.01.83 г. "Об- унификации методов.контроля меднцннсних и иммунобиологических препаратов". Токсичность вакцины проверяли на беспородных белых мышах массой (18,5±1,5) г и на морских свинках массой (300'50)г. Белым мышам препарат вводили внутрибрюшинно в дозе (1,010,1) мл. Наблюдения за привитыми животными осуществляли в течение 7 дней, ежедневно проверяя их состояние: отмечали наличие или отсутствие признаков интоксикации, гибели, изменение веса, парезы, параличи, а также регистрировали изменение на месте введения препарата.

Вакцина не обладала острой токсичностью, не отмечалось параличей, парезов на месте подкожного введения изменений выявлена не было.

Изучение сенсибилизирующих свойств вакцины проводили путем определения гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) по тесту отекогенного эффекта в соответствии с рекомендациями, изложенными в РД-4-28-8-89 на модели белых мышей. При изучении регистрировали и общую реакцию экспериментальных животных на введение сенсибилизирующих и разрешающих доз. Сенсибилизацию белых мышей проводили путем внутрибрюшинного введения новой вакцины в дозе 0,5 мл двукратно с 10 дневным интервалом. В качестве препарата сравнения использовали коммерческую вакцину, вводимую, исходя из наставления по применению, в дозе 1,0 мл внутрибрюшинно, двукратно с 10 дневным интервалом. Спустя 5 суток после заключительной сенсибилизации вводили разрешающую дозу вакцин в количестве 0,05 мл подкожно в подушечку задних лапок мышей. Сценку ГЗТ прозодили по степени отекогенного эффекта (индекс отека).

При применении новой вакцины не выявлена аллергическая реакция замедленного типа. Индекс ГЗТ при применении экспериментальной вакцины составлял 3,6+1,4% при контроле 3,46+1,11%. В опытах на кроликах не было проявлений и гиперчувствительности немедленного типа при внутривенном многократном введении вакцины (;,о 10 инъекций).

Таким образом, приведенные результаты свидетельствуют о безвредности вакцин для лабораторных животных.

Были изучены антигенные и протективные свойства новой вакцины по сравнению с коммерческой поливалентной лептоспирозной вакциной. Кроликов массой 2-3 кг вакцинировали подкожно двукратно с 10-ти дневным интервалом в дозе Г,0 мл. При вакцинации коммерческой вакциной использовали схему рекомендуемую в наставлении по применению вакцины. Через 10 и 30 дней после ревакцинации в сыворотка* определяли титры антител в реакции микроагглютинации и лизиса. Результаты представлены в таблице 4.

Как видно из приведенных данных, новая вакцина обладает выраженными антигенными свойствами, которые превышают антигенную активность поливалентной вакцины.

Определение классов иммуноглобулинов с использованием в качестве редуцирующего вещества 2-неркалтоэтзнола показало, что при

Таблица 4.

Антигенные свойства вакцинных препаратов.

Наименование препаратов

Антитела в РМАЛ(Х-сре дние обратные геометрические титры против L.copenhafteni Крыса-2

Антитела в РМАЛ(Х-сре дние обратные геометрические титры против !.. copenlnKeni М-20

через Юдн через ЗОдн через Юдн через ЗОдн

Вакцина концентрированная

Вакцина поливалентная коммерческая

251 (253-249)

19 5 (21.5-17,5)

Ad К

(647-643)

39,8 (41,8-37,8)

Oh Ц {ОЙ

(Э8, 5-93,5) (187+185)

25 39

(27+23,0) (40+38)

двукратной вакцинации концентрированной вакциной через 10 дней антитела имели IgM природу, а через 30 дней нарастали титры антител и класса IgG. При иммунизации поливалентной вакциной антитела имели IgM природу. Введение депонированной на геле гидроокиси алюминия концентрированной вакцины не изменяло характера иммунного отпета.

Сыворотки, полученные от кроликов, иммунизированных концентрированной вакциной подкожно двукратно, защищали в дозе 1+0,1 мл 80-100% золотистых хомяков и морских свинок от заражения вирулентным штаммом лептоспир серогруппы IcterohaenorrJr riae.

Для изучения возможности получения специфического про'; исо-лептоспирозного иммуноглобулина от иммунизированных кроликов брали кровь ц из сыворотки выделяли иммуноглобулин методом сульфатно-аммонийного насыщения. Выделенный иммуноглобулин обладал протективной активностью при заражении морских свинок и золотистых хомяков вирулентным штаммом лептоспир.

Изучение протективной активности вакцин в тестах активной защиты показало высокую активность экспериментальной вакцины. ЕД50 для экспериментальной вакцины составляло 0,042+0,05 мл, а поливалентной коммерческой 1,8+0,01 мл при заражении 122 LD50 (1 LD^o " 20000 клеток) вирулентного штамма L. lcterohaemorrhagiae.

Г'еактогенные и антигенные свойства вакцины были исследованы в опытах на обезьянах Ростовского зоопарка, где среди них воз-нт&ти заболевания лептоспирозом.

Все виды обезьян были провакцинированы очищенной концентри-

гв -

рованной вакциной в дозах, учитывающих различия в массе животного. Были применены 2 схемы вакцинации. Однократная в дозе 2 мл и двукратная в дозе 1,0 мл. Для оценки эффективности вакцинопрофи-лактики контролировали уровень нарастания титров в РМАЛ с I.. 1с-1егоЬаетоггЬае1ае. В результате установлено, что двукратная и однократная вакцинация вызывала у обезьян нарастание в сыворотках титров антител в среднем 1:900.

Изучение иммунного ответа по классам иммуноглобулинов показало, что антитела имели ^-природу как при однократной, так и при двукратной вакцинации. Не отмечено как общих, так и местных реакций на введение вакцины при разных схемах применения. Ни одно из вакцинированных животных не заболело лептоспирозом.

Таким образом, полученные результаты экспериментального изучения свидетельствуют, что концентрированная лептоспирозная вакцина не относится к - числу высокореактогенных препаратов и могла быть рекомендована для дальнейшего испытания на ограниченном числе добровольцев.

По результатам исследований нами был разработан и оформлен Экспериментально-производственный регламент и Временная фармакопейная статья, по которой были приготовлены 3 серии вакцины для испытания на ограниченной группе добровольцев по разработанной и утвержденной Комитетом МИБП программе.

Следующий этап включал испытание очищенной концентрированной вакцины против иктерогеморрагического лептоспироза с целью определения ее реактогенности, безопасности и специфической активности на ограниченной группе добровольцев по утвержденной программе.

Испытания проводились с учетом требований методических рекомендаций по испытанию на добровольцах медицинских иммунобиологических препаратов, разработанных ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Испытания проводились на базе клиники НПО "Биопрепарат". Все сыворотки перед исследованием шифровались.

Отбор добровольцев осуществлялся клиницистами после всестороннего обследования с учетом данных клинико-физиологических, лабораторных, биохимических и иммунологических показателей.

Были отобраны лица, не болевшие ранее лептоспирозом и не привитые против этой инфекции, не имеющие противопоказаний к иммунизации. Распределение добровольцев по группам осуществляли с

помощью случайной Еыборки.

В соответствии с программой прививаемые добровольцы были распределены на три группы, по 10 человек □ каждой группе.

Группа I. - Иммунизация экспериментальной вакциной. Курс вакцинации состоял из 2-х прививок с интервалом 10 дней в дозах: для 1 инъекции 0, 5 мл, для 2-ой инъекции - 0, 5 мл. Иммунизация проводилась подкожно.

Группа П. - Иммунизация экспериментальной вакциной. Курс

р»Ш1Иня11ми гпотяи ил 1 ппининки В /юаь 1.Ü МЛ ПОДКОЖНО.

Группа III. (контрольная) - иммунизация коммерческой поливалентной лептоспирозной вакциной. Курс вакцинации состоял из 2-х прививок с интервалом 10 дней в дозах: для 1-ой инъекции 2,0 цл, для 2-ой инъекции 2,5 ил. Иммунизация подкожная.

Изучение реактогенности было направлено на выявление общих и местных поствакцинальных реакций, степени их выраженности и длительности проявления.

Оценку общих реакций проводили в клинических условиях в день прививки ( в течение 30 мин и через 6-8 часов), а затем ежедневно на основании термометрии и жалоб

Оценка местных реакций проведена на основании осмотра места прививки и регистрации максимального диаметра гиперемии, отека, инфильтрата и других возможных реакций. ■ Одновременно определяли наличие лимфангоита и лимфаденита.

Местные реакции как слабые расценивались при гиперемии кожи диаметром до 2,5 см и незначительной болезненности в месте введения; средние реакции - при гиперемии гезяк диаметром 2,5-5 см, умеренной болезненности а месте инъекции; сильные реакции - при интенсивной гиперемии диметром более 5 см, выраженном уплотнении в месте инъекции, увеличении и болезненности региональных лимфатических, узлов.

Общую температурную реакцию оценивали как слабую при повышении температуры в пределах 37,0°-37,4°; среднюю при повышении температуры в пределах (37. 5°-37, 9"), и, как сильную реакцию -при повышении температуры до 38°С и более.

Изучение безопасности предусматривало выявление возможных предпатологических и патологических реакций органов и систем организма прививаемых, их выраженности и длительности проявления.

Прививаемые до и после иммунизации поело каждой инъекции

обследованы' с применением клинико-функциональных, лаборатор-но-бнохимических, иммунологических методов которые включали:

- определение артериального давления до и через 6, 8, 12. 24. 48, 72 ч , через 10 и 30 дней;

- общий клинический анализ крови с расшифровкой формулы до и через 24, 48 ч;

- общий клинический анализ мочи;

- снятие ЭКГ до и после 4 суток и 10 дней после прививки.

Биохимические показатели при иммунизации изучали до вакцинации, на 3-й сутки, на 10-й и 30-й день после вакцинации..Исследуемые показатели включали изучение функционального состояния печени: определение уровня общего белка по биуретовой реакции, белковых фракций - путем осаждения нейтральными солями, определение активности трансаминиз по Райтману и Фрейнкелю (цит. Колб В.Г., Камышников B.C., 1982), щелочной фосфатазы по Боданскому (цит. Колб В.Г., Камышников В.С., 1982), определение уровня общего, свободного и связанного билирубина по методу Sraysnaw (1973), тимоловую пробу проводили диагностическим набором фирмы "Лахема" (ЧСФР). Функциональное состояние поджелудочной железь оценивали по активности амилазы, определяемой методом Смита к РОЭ(32), а также - по содержанию сахара в моче. Функциональное состояние почек изучали, проводя общий .днализ мочи и определяя £ сыворотке крови уровень мочевины по цветной реакции с диацетон-монооксимом, и креатинин - в реакции с пикриловой кислотой, используя набор реактивов фирмы "Лахема" (ЧСФР).

Иммунологическую безопасность вакцин контролировали, изуча} иммунный статус до и после прививки путем определения Т-розетко-образовання по Gondal М. с соавт. (1072) и В- розеткообразованш по Mendos N. с соавт. (1973). Субпопуляционный состав Т н В лимфоцитов определяли ишунофлюоресцентным методом, указанным в монографии Фримель (1987) с использованием моноклональных антител, выпускаемых Институтом иммунологии МЗ России.

Циркулирующие иммунные комплексы определяли по методу Has-kova V. с соавт. (1977). Содержание классов иммуноглобулинов G, М, А определяли по методу Manchinl G. с соавт. (1985). Уровен: иммуноглобулинов Е изучали иммуноферментным методом с использо ванием коммерческих наборов реактивов, выпускаемых НПО "Аллер ген". ? ■

Содержание комплемента определяли по метолу А. Б. Габриловича и С. В. Соболевой (1962).

Учитывал наличие и коммерческий вакцине кроличьего белка, бнпя изучена возможность образования антител у добровольцев к белкам сыворотки кролька. Для этой цели использовался иммуно.Т.рр-ментный катод. В системе для сенсибилизации планшет использована кооличья сыворотка, антитела выявляли коммерческим пероксидазным мин кипим ,п"ыя «рппиккл.

вакцинных препаратов оценивали путем определен.!« гг"?""

вакцинации через 10-30 дней с использованием реакции микроагглютинации и лизиса (РМАЛ), описанном в методических рекомендациях по лабораторной диагностике лептоспирозов. Реакция ставили со штаммами Ь. 1с1егоЬаеюогг!1а^1ае М-20, Крыса-2 и Одесса 853.

Кроме реакции микроагглютинации и лизиса использовали реакцию иммуноферментного анализа. В качестве антигена для сенсибилизации планиегов использована концентрированная Формсшозая экспериментальная вакцина. После титрования сыоороткк выявлен!«? тител осуществляли коммерческим пероксидазным конмгатсм с ком А. За титр принимали то разведение сыворотки, пои истср/г оптическая плотность ингредиентов реакции при- длине ясу»-« 49? н > превышала контрольную а два раса. Средний геометрический тиг;< серологических реакциях рассчитывали, пользуясь рекомендация:«» изложенными в монографии Ашмарина и Воробьева (1962)

Статистическую обработку материала клиникс-л.-гСсрат:г ;'..', инокт-нсст,* " иммунологических исследований проводили с использованием компьютерной прогг змш "СйагЬ" М) его; .о П. (США).

Проведенные испытания показали важность предварительного зсестороннего обследования прививаемых, в том числе оценка сос-иммунной системы, так как у ряла предполагаемых к вакцинации лиц выли выявлены отклонения в иммунном стагу-с у сд^ют из них а последующем, были определены высокие гг т' .-»нтеи-,-/. лептоспирозу, что еще раз подтвердило существовать мнябзрятда-форм лелтоспироза и свидетельствовало о возможности иммучю/дп-рессивного действия лептоспирозной инфекции.

Температурная реакция на введение вакцинных препаратов является важным показателем, характеризующим их реактогенность. После 1-й инъекции сравниваемых вакцинных препаратов температура

/

г 32 -

повышалась в группе привитых экспериментальной вакциной при двукратной схеме у одного привитого. Температура увеличивалась до 37,1° и возвратилась к исходной через 2 часа. У одного привитого температура поднялась до 37° через 72 часа после прививки. В данной группе после 2-й прививки слабая температурная реакция до 37° была отмечена у одного привитого через 24 часа после иммунизации.

При иммунизации экспериментальной вакциной по однократной схеме в дозе 1,0 мл слабая температурная реакция до 37° наблюдалась у одного привитого через 24 часа после прививки.

В группе привитых коммерческой вакциной слабая температурная реакция (до 37,1°) была отмечена через 48 часов у 2-х привитых. После второй прививки слабая температурная реакция до 37,0° отмечалась у одного привитого через 12 часов.

Общее клиническое, состояние добровольцев во всех группах привитых не ухудшалось. Функция сердечно-сосудистой системы, по данным клинического наблюдения, показателям артериального давления и ЭКГ была без изменений по сравнении с состоянием до вакцинации. При оценке местных реакций была отмечена небольшая болезненность в месте введения у 3-х прививаемых I и II групп. Болезненность прекращалась через 10 минут после введения препаратов. У одного привитого из I группы имело место покраснение размером до 1,0 см, которое через сутки исчезло.

Из 10 добровольцев привитых коммерческой вакциной у одного наблюдалась болезненность и у одного покраснение в месте введения до 1,5 см.

Полученные данные свидетельствовали о равнозначности результатов между коммерческой и экспериментальной вакцинами при исследовании реактогенностн по признакам интенсивности температурных реакций и местным проявлениям и характеризовались как слабо реактогенные.

Общий анализ крови не выявил отклонений от физиологической норш, хотя более интенсивная реакция со стороны клеток белой крови отмечалась при вакцинации экспериментальной вакциной, что является показателем неспецифического антигенного воздействия на системы клеточного звена защиты.

Данные биохимических исследований не выявили статистически значимых отклонений от физиологических норм, характеризующих

гикции печени и почек.

При вакцинации коммерческой вакциной у двух добровольцев lera место транзиторная глжозурия, что свидетельствовало об стивирущем влиянии вакцинации коммерческой вакцины на предиа-шэгичсскои состоянии инкреторной функции поджелудочной железы показывает важность проведения всестороннего обследования доб-эвольцев при испытании иммунобиологических препаратов.

Важным показателем качества вакцин является их иммунологи-

■ЮКЙЯ OfcSOiiexOmjOiti.

Во всех трех группах доброиильцс-а ¿й йзсцгасцн:: э сравнению с нормой, относительное снижение количества Т-ро-эткообразующих клеток с уменьшенным процентным содержанием об-гго количества Т-клеток.

При вакцинации экспериментальной вакциной в I группе отме-алось статистически значимое (р<0,02) уменьшение по сравнении с оном Т-розеткообразующих клеток, при этом процентное содержание -лимфоцитов статистически не отличалось от фановых показателей. 30-му дню количества Т-розеткообразующих клеток возвращалось к сходному уровню.

При однократной вакцинации экспериментальной и 'коммерческой акцинами отмечалось увеличение общего количества Т-лимфоцитов и роцёнта розеткообразующих клеток, уменьшая дефицит их содгржа-ия по отношению к физиологической норме.

Изучение субпопуляционнсго состава не выявило отклонений от «экологической нормы Т-хелперов (Т4) и Т-супресссрсв (Т8) при акцинации как экспериментальной, так и коммерческой вакцинами, ^отношение Т4: Т& соответствовало физиологической норме.

Во всех группах привитых отмечалось статистически значите-гзеличение количества В-розеткообразущих клеток по отношении к юрмальным показателям.

Было изучено влияние вакцинации на содержание классов irnty- • ¡оглобуликов. У добровольцев, вакцинированных экспериментальной ¡акциной о I группе отмечалось уменьшение иммуноглобулинов клзс-;а Л на 10-й день после вакцинации. К 30-му днп уровень иммуиог-табулинов нарастал и превышал исходный до вакцинации. При это» увеличение шло за счет иммуноглобулинов класса G.

У добровольцев, вакцинированных экспериментальной вакциной 1ри однократной вакцинации в дозе 1.0 мл и коммерческой вакциной

не отмечалось увеличения уровня иммуноглобулинов С, И, А классов по сравнение с ({оновыми показателями.

Уровень иммуноглобулина Е, являющегося показателем аллергической перестройки у привитых во всех группах не превышал нормы.

При вакцинации как экспериментальной, так и коммерческой вакцинами имело место повышения уровня ЦИК, но мы это рассматривали как нормальную реакцию на введение чужеродного агента, так как их образование не сопровождалось клиническими проявлениями и повышением уровня иммуноглобулинов класса Е.

Проведенные испытания показали, что иммунизация добровольцев коммерческой вакциной приводила к синтезу у них антител к кроличьему белку, выявляемых методом ИФА.

Таким образом, по результатам изучения иммунологической безопасности вакцин, можно сделать вывод, что • вакцинация новой очищенной вакциной приводит к адекватной реакции иммунной системы без отрицательного воздействия на клеточные и гуморальные системы иммунитета, которые бы приводили к срыву физиологической нормы. . '

Отмеченное у вакцинированных добровольцев I группы некоторое снижение уровня Т-розеткообразования с увеличением количества В-розеткообразующих клеток, по мнению Краскиной Н. А. (цитирую по Лебедеву К.А., 1988), может обусловливать более высокую степень защиты от соответствующего возбудителя.

Наличие антител к кроличьему белку у вакцинированных коммерческой вакциной может приводить к сенсибилизации прививаемых, что необходимо учитывать при многократной вакцинации в группах эпидемиологического риска.

Следующим этапом испытания было Изучение специфической активности, вакцин. ь.

Одним из важных показателей эффективности является уровень сероконверсии. Полученные результаты (табл. 5) свидетельствуют, что иммунизация экспериментальной вакциной .обеспечивает достаточную степень сероконверсии. Низкий процент сероконверсии отмечался при вакцинации коммерчеашй вакциной. В таблице 6, рис.2 представлена динамика среднегеометрических титров антител, выявляемых в РМАЛ у добровольцев привитых лептоспирозныш вакцинами.

Тайдица 5.

'•'роаень серокоЕвврона на введение лептоспироз,йг;

££КЦИН у дсбрсвольцев.

г: ••:• злонзнке. зратоз ' зыво- : роте.-. Й6 шк число скзороток о .приростом ^-:глтел на 10-й день со нталаш-я Из юн с .'сло вывороток с приростом ¿ети^ел нз 30--й день СО ШТоЛ'ГШ

! Кры;а-2 ! М-20 ) 0десса-й35 1 ! Крис.ЕЧ! М-20 ОдеасЕ-Нзо

ггдкзл зкспершеп (I группа: - _ п ? Г. 11 11 11 11

53,5 1С'-1 100 10С 100 100

Гп-И : • '¡■"ПврИМеН (II грусяа 10 ё 10 1С -10 ¿0

ее юо ЮС 100 100

:•. £ 5-XI'-: г. ' т т ■ - 1 . . >- ДПа) 5 ? 9 2 г :з

;.- г. 90 ЗС- 50 1:0

Л:; г: числи?-.; ЗН^К.Г - ас с - ь - -

Результаты определения антител г (В.'АЛ) е сьшороткаг. людей, привитых лептоспирогными вакцинами (м±м)

Габлицг. 6.

ЯйлыекоБание Среднегеометрические титры антител ка 10-й день со штаммами 1п1егго£ап5 Спедкегеометрические титры наДО-й день со штаммами Ь антител ^еггсгапэ

Крыса-2 и-20 Одесса-835 Крыса-2 М-20 Рдесса-835

Вакцина зксперимен-. галькзя (I труппа) 17,9+3,2 81",3+2,6 . 548,1 ±2,65 63,2+2,9 126,1+2,53 751,1+2,6 .

Вакцина экспериментальная (II группа)-. 13,2+2,82 30,9+3,47 428,7+2,96 38,0+2,08 • ^ 70,8+3,03 606,3+2,95

Вакцина коммерческая 7,57±2,82 С111 группа)

достоверность разли- . чий между ' "

I гр. и III гр. ' Р= 0,05"

Мехцу II И III гр., ' Р- 0,05

Между' Ги II гр. Р> 0,05

11,48±2,86 ,.'. 56,3±3,5

Р< 0,0^ Р» 0,05" Р< 0,05

Р< 0,01* Р< 0,001 Р>0.05

8,7+2,86 23,7+2,98 303,14±3,2

Р< 0,001*- Р< 0,001* Р< 0,05 Р< 0,001* Р< 0,05 Р- 0,05 ' Р> 0,05 Р> 0,05 Р> {3,05

о> а>

*.- Различия достоверны

?50-

5ES

250-

10

к ытшшу i j к ытамну ШЗ к итаину

J___xv.V.l.

i 2

30 р^ей

Одссса-051

И-20 Кркса-2

Рис.2. Динамика титров антител о РИАЛ к различным . штаммам лептсспир у добровольцев, вакцинированных лептоспирозными вакцинами 1-1 группа вакцинированных экспериментальной вакциной.

2 - II группа вакцинированных экспериментальной вакциной

3 - III группа вакцинированных коммерческой вакциной

Из полученных данных видно, что титры антител, определенные в РМАЛ, были выше с достоверность 95% у добровольцев вакцинированных экспериментальной вакциной, особенно при двукратной вакцинации. Во всех группах привитых имелись и штаммовые различия в антительном ответе. Наиболее выраженная реакция была на штамм Ь. 1с1егсЬаешоггЬаб1ае Одесса 853, несколько ниже - со штаммами М-20 и Крыса-2, что, по-видимому, надо учитывать при конструировании лептоспирозных вакцин.

Результаты серологического ответа на вакцинирование с использованием ИФА (табл. 7, рис. 3) также показали, что экспериментальная вакцина, по сравнению с коммерческой, обеспечивала более интенсивный антительный ответ.

Как в РМАЛ, так и в ИФА не выявлено статистически значимых различий между I и И группами вакцинированных экспериментальной вакциной.

Таблица

Результаты определения антител в ИФА в сыворотках людей привитых лептоспирозными вакцинами.

Наименование вакцин

Среднегеометрические титры антител на 10-й (М±м)

Среднегеометрически титры антител на 30 (М±м)

Вакцина экспериментальная (I группа)

Вакцина экспериментальная (II группа)

Вакцина коммерческая (III группа)

Достоверность различий между I гр. и III гр. Между И и III гр. Между I и II гр.

180,32*3,8 340,53*2,54 64,713,95

Р- 0,05* Р< 0,05* Р> 0,05

852,0*310 565,7*2,75 298,4*3,5

Р- 0.05* Р- 0,05* Р> 0,05

* - Различия достоверны

Таким образом, подводя итоги испытания вакцин, южно сделать вывод о слабой реактогенности и безопасности экспериментальной вакцины при высокой специфической активности.

1ЙЙУ-,

Л X

в

¡й 3 й Я

50Й-

250-

ш

на 18 шзнь

на 30 «ель

ш

1 группа вйкцнннрованных эк«н*н!«е« тарном аакцптш II группа вакц1вп!Роваииы.ч зкспьрннентадьним Аакцимок III группа Еакцшнроваяных конмерчеккои вакциной

Т

Рис. 3. Динамика титров антител в ИФА у добриыильции, вакцинированных лсптоспирозными вакцина,'«!

ГЛАВА IY. ИШНОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СТРУКТУРНЫХ КОМПОНЕНТОВ И АНТИГЕНОВ ЛЕПТОСЛИР И ПЕРСПЕКТИВА РАЗРАБОТКИ БЕСКЛЕТОЧНЫХ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ.

Перспективность создания бесклеточных вакцин определяется тем, что их применение может обеспечить уменьшение реактогеннос-ти и повышение иммуногенности вакцин в связи с возможностью выделения и очистки наиболее важных для иммуногенности структурных компонентов и антигенов.

Бесклеточные лептоспирозные вакцины можно условно разделить на две группы - вакцины на основе структурных компонентов клетки и.вакцины, содержащие растворимые антигены. Чаще всего вторая группа содержит адьювант и иммуностимулирующие добавки.

Разнообразие свойств и функций мембран, в том числе и имму-ногённых, определило необходимость их детального изучения, что потребовало разработки методов их выделения и очистки.

Если в отношении большинства общеизвестных грамположитель-ных и грамотрицательных микроорганизмов, благодаря работам Os-born М. (1972), Станиславского Е. С. (1971), разработаны высокоэффективные методы выделения, очистки и получения функционально активных мембранных структур, то для представителей рода Leptospira, эти исследования еще находятся на начальном этапе развития.

Исследования.структурных компонентов лептоспир показывают целесообразность и перспективность их использования в качестве вакцинирующих препаратов при лептоспирозе.

Наиболее важными из них являются мембранные образования, о частности, внешняя мембрана.

Перспективность этого направления во многом определяется технологическими возможностями получения больших количеств биомассы лептоспир и получения из нее нативных очищенных мембран, достаточных для их тщательногр иммунохимического и биологического изучения.

В первой и второй главах исследования нами была показана возможность получения концентрированной очищенной биомассы лептоспир. Это позволило нам совместно с Вачаевым Б.Ф. начать исследования по получению и характеристики мембранных структур лептоспир.

При выборе способа получения очищенных оболочек лептоспир

мы исходили из того, что наилучшим из применяемых до настоящего гречени методов является лизоцнмная обработка натиспых микробных меток в 1 М в растворе KaCI.

Баделогдае мембранных структур лелтоспир проводили по схеме, указанной на рис. 4.

Meva/ibfCf зяскгроньочикроскопичесг'о^ изучение очищенных иёмбран было сделано с использованием ультратонких срезов очищенных. На ПИП. S ППРППТЛпn^i-JKJ .ViTrtnn.a/f.i.iiJ um.<fniev>ui/iiw ^лпплп

ОЧИтйННГЧ* пмптпгпип

На рисунке видны кольцевидные структуры, иногда встречаются линейные мембраны не замкнутые в везикулы. В мембранах просматривается типичная трехслойная структура.

Одним из критериев нативного состояния изолированных мембранных структур микроорганизмов является сохранение биологической активности ряда окислительных ферментов: НАДН-оксидазы, сук-цинатоксидазы, цитохромов (Кушнарев В. Н., 1969). Нами исследовалась ферментативная активность НАДН к НАДРН-скс»даз Cna-anvi мембран. Активность НАДН-оксидазы составляла 23, ? мч tw/frí белха, а НАДРН-оксидазк 47,4 иМ (мин/мг) белка.

Данные злектронномикроскопических исследовани!: к fiuoxwv-ческих характеристик свидетельствовали, что применение :;■::, подходы выделения мембранных структур позволили получить ..;; !-ныо оболочки с сохранением биологической активности И»муксл<.:-л-ческие исследования подтвердили, что о мембранных струга) ра;: содержатся основные специфические для лептоспир антигены, которые

' впервые были выделены йо немирен и охаракт<?ркгопа<-;::

Антиген, специфический для патогенного отамм-ч. Ыяся-ул-яв ■■ группо- и типоспецифические свойства имел гликолипопротеид-нув природу, а родоспецифический в основном был представлен гли-

¿•езулыат:; иммунокимнчееккх исследований явились оснозаше»: для изучения мембран о качестве нммунизирущих пропар^то? В опытах на экспериментальных ягивоткыя была показана их виххгсхч протективиость и антигенность при низюзй степени розктоге:-посты.

Было установлено, что протективностъ и антигенность мембран связана со специфическими для патогенных штаммов антигенами и не зависит от родоспецифического антигена. Полученные данные обос-

Коыюнтрированная биомасса лептоспир до 0,5 литра

центрифугат|-

16нч Т-37 °с

иентришугат {удаляется)

Осадок - 2 (сфеоопдасты) икуоирование в 20 ж„водн растворе сахарозы 18 ч +

ентрифугат-иалнз,,поотив„ ист. .Най 24-8 ч ри +4 С

м'тат п °с|

реакция "цельной"

1т01

Осадок - 4 (мембраны, с клеточным« „ детритом) „ л|

отмывание 3-?-кратное„0лдист. Н20в [рн^р^гир^в^ием 15000 в. |

1)ентри|у-ляется

- Осалок Тмейорш центриФ1 остатками кл. детрита) 1 жированием в ступенчатом | Б? приТШИг?^Т3"4 °с !

Фракция клеточного детрита Фракция (Суммарная Фракция осевых нитей! 1клеточных иёморан

Рис. 4. Схема выделения очищенной суммарной фракции мембран лептоспир.

Рис. 5. Ультратонкие срезы очищенных оболочек лептоспир. Контрастирование уранилацетатом, ув. хЗОООО.

повывают перспективность использования мембран в качестве составных компонентов вакцин.

Наш впервые было показано, что мембраны патогенного штаммг лептоспир тормозят функциональную активность лимфоцитов kpobv человс :а, обладая антиоксидантной активностью. Вещество липопо-лисахаридной природы, с которым связана эта активность было выделено из мембран лептоспир.

Полученные результаты по антиоксидантной активности мембра* лептоспир представляют интерес как для изучения возможных новы) факторов патогенности, так и для оценки иммунологической активности и реактогенности вакцинных препаратов и могут являться предметом дальнейших углубленных исследований.

Одной из малоизученных проблем при лептоспирозе, являете! существование так называемых сецернируемых антигенов. К ним относятся прежде всего токсические компоненты. Поиск экзотоксичес-ких субстанций у лептоспир на привел к положительным результатам. Последние исследования (Masuzawa T. et.al., 1989, 1990, 1992) связывают токсические свойства с существованием в оболоч ках лептоспир цитотоксического гликолипида. К сожалению не про водились исследования по его обнаружению в культуральных средах

Предложенные нами мембранные технологии получения биомасс позволили нам из культуральной жидкости выделять антиген белко вополисахаридной природы, который был специфичным для лептоспир ЭТо первое исследование, в котором даны прямые доказательства что антигены лептоспир выделяются в культуральную жидкость.

По-видимому, неудачи обнаружения экзогенных антигенных кои понентов лептоспир связаны с особенностями состава жидких сре культивирования и, превде всего, с наличием в них альбумина, ко торий, как хорошо известно, связывает токсические вещества.

Аналогичная картина, по-видимому, протекает в организме за раженных лептоспирозом человека и животных.. Дальнейшие исследо вания должны быть направлены на поиски чисто белковых токсичес ких веществ.

Разработанные технологии получения мембранных структур, an тигенов из них, а также выделяемых в культуральную жидкость nos во /шли нам предложить универсальные подходы для получения вакци и других антигенных препаратов (рис. 8).

Культивирование лелтоспир| на жидких средах

Концентрирование клеток фильт-| ' ■

ргцпаП на пилах волокнах I _^

центрифугирование

Получение поверхностных антигенов из структур

Рис. 6. Схема возмояных подходов для получения

иммунобиологических препаратов из лептоспир.

Эти подходы позволяют конструировать иммунобиологические вакцинные препараты различной степени сложности, от очищенных цельноклеточных корпускулярных вакцин, до вакцинных препаратов на основе структурных компонентов, индивидуальных антигенов из клеточных структур и культуральной жидкости, а также их комбинаций. При этом для практической реализации предложенных подходов, по-видимому, необходимо поэтапное решение.

На первом этапе необходимо разработать и внедрить технологии получения очищенной концентрированной корпускулярной вакцины в moho-, ди- и поливалентном исполнении. Вторым этапом может быть конструирование комбинированной вакцины на основе очищенной концентрированной клеточной вакцины или структурных компонентов с обогащением отдельными антигенами и. прежде всего, экзогенными компонентами.

ГЛАВА V. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЛЕПТОСПИРОЗЕ.

Успехи в области молекулярной биологии произвели ревалюци» в развитии биотехнологического направления создания биопрепаратов.

Наиболее значимые результаты были достигнуты в двух основных направлениях. Первое - это молекулярное клонирование и экспрессия генов. Второе - связано с развитием гибридомных технологий.

В настоящее время с помощью генетической инженерии уже разработано и производится более 50 биологически активных вещвсп (инсулин, гормон роста, вакцина против гепатита В и др.).

Гибридомная технология позволила но только расширить на® представления о структуре детерминант специфичности антигенов i эпитопной архитектоники антител, но, благодаря успехам в это) направлении, созданы и выпускаются десятки новых диагностически препаратов, обладающих высоким уровнем специфичности и чувстви тельности.

Учитывая вышеизложенное, необходимо было оценить перепек тивность молекулярно-биологических подходов для создания лептос

пирозных иммунобиологических препаратов и наметить пути их реализации.

Проведенные до настоящего времени попытки клонирования и экспрессии генов касались ферментов и факторов патогенности леп-тоспир (Дайн A.A. и др., 1985; Rund Р. А , Segers R., et. al. 1990). Для биотехнологических целей необходима разработка подходов по клонировании генов лептоспир, ответственных за биосинтез антигенов и методов их обнаружения в рекомбинантных клонах. Эти

ОЭаНИЯ " Р п I" I . I "2"?' Г! --------— : : : w I. w" .'.w * С i. ri

генов.

В результате проведенных исследований была отработана методика получения нативной и полимерной формы ДНК лептоспир, которая позволяла использовать ее для генноиняенерных целей. Были использованы плазмиды рAT-153 и pNO-1523, являющиеся производными плазмиды pBR-322, которые возможно было использовать для получения рекомбинантных клонов, несущих гены лептоспир.

Чтобы увеличить вероятность получения рекомбинантных клонов, содержащих гены лептоспир, ответственных за биосинтез антигенов, клонирование вели по двум вариантам в зависимости от используемых рестриктаз и реципиентов (рис. 7). Хромосомную ДНК и ДНК векторных плазми.ч "разрезали" эндонуклеазамн Bain HI, Hind III, Ира I по методикам фирмы-изготовители (Pharmacia).

Рестрикцию'проводили в течение 1 часа при +37°С, используя 2 ед. фермента на 1 мкг ДНК. Фрагменты ДНК разделяли гель-электрофорезом в 0,8 %-ной агарозе в Трис-ацетатпом буфере (49) 8 качестве стандарта применяли Hlnd III фрагменты ДНК фага лямбда. Для клонирования с помощью вектора рАТ 153 применяли зндонуклел-зу Вага H I и штаммов.HB 101,' а в случае вектора pf.'O Í523 - змдо-нуклеазу Нра I и штамм MC 1009.

Лигирование фрагментов ДНК L. Interrogans с векторами рАТ 153 и pNO 1523 проводили как описано в монографии Девис и Ботс-тайн (1984).

В качестве реципиентов для трансуэрмации использовали штаммы E.coli IIB 101 и MC 1009, дефектные по способности к рекомбинации (мутация в гене гее А) . Штамм MC 1009 устойчив к стрептомицину.

Трансформацию плазмндных ДНК осуществляли по методу MandelM. и Higa А. (1970).

При трансформации плазмид_ой рАТ 153 штамм НВ 101 приобретал устойчивость только к ампициллину (на уровне 100 мкг/ил). Поэтому из-за отсутствия других селективных маркеров для выявления среди трансформантов клонов со вставками ДНК лептоспир Необходимо было проводить дополнительный электрофоретический анализ плазмидных ДНК отобранных клонов.

Что касается штамма МС 1009, то трансформанты, не получившие вставок лептоспирозной ДНК, приобрели устойчивость к ампициллину (за счет плазмиды рШ 1623), но сохраняли резистентность к стрептомицину, присущую штамму МС 1009 (дальнейшему изучению их не подвергали). Интересующие нас вставки несли лишь клоны, ставшие чувствительными к стрептомицину, что подтверждалось при последующем определении размеров их плазмидных ДНК (подобно штамму Н8 101 с рАТ 153 эти клоны отбирали на среде с ампициллином).

В наших опытах эффективность трансформации штамма МС 1009 составляли примерно 105 клонов на 1 мкг ДНК вектора. Эффективность же трансформации штамма НВ 101 оказалась на порядок ниже.

В результате селекции по двум антибиотикам из общего числа трансформантов было.отобрано 400 клонов как потенциальных носителей нужных нам генов и 30 из были отклонированы на их способность экспрессировать биосинтез антигенных детерминант лептоспир с .помощью разработанной нами методики ингибирования ультразвуковыми лизатами рекомбинантных клонов реакции мироагглютинации и лизиса лептоспир со специфическими лептоспирозными антителами. Из числа изученных рекомбинантных клонов^ содержащих вставки ДНК лептоспир^, лишь 5 клонов содержали фрагменты ДНК, ответственные за биосинтез . антигенов. Из них только у 2-х клонов сохранялась эта активность к концу года.

Таким образом, проведенные исследования показали принципиальную возможность получения рекомбинантных молекул, синтезирующих антигенные детерминанты лептоспир. Для практического применения необходимы дальнейшие исследования, которые должны быть направлены на подбор более емких векторов и получение стабильной экспрессии биосинтеза антигенных детерминант.

ДНК вектоснок плазмиды рАТ-1£3

КрОЩОСОМЯГоН ¿НК ^.inxocriKf

Обработка рестри тагэмл: Бэт HI, Ват. HI + Hir/Л; I

Обработка, рзс

т~аам::; Вззт Н Е.-га HI + Hind

i

Трансформация в кле-хкк шта^а E.coli НЕ-101

Отбор рекомбинантнкч клоное по устс?кивости- к антибиотикам ;; данным электрсфогеэа i

Обработка клеток улг тргзву.-ки

Отбор рлг.мбинантнк-" кео;;ое по способности да.'::йгров.'»1£ ьнткхела ь FMAJI

PilC.

ДНК векторной пяазмиды рМ0-1о2::

1еомсоо!.:ЗЛЬК5Я ;НЧ .-."'nr^ciüip

Обработка рестрш:-тааой Нра!

Сбрatотка реотриста-эй Н;'а1

ЛИгировш кз ДНК-- "-iras «t -т-ата Г-4

Трансфор). е.л к г ^легк" Е.coli Mi 1009

i t

Отбор ре i' с - л 5i'.H=j; - ни < icob-js по yoTofrt-кз ;стр. -•. аг-;^;:-: лот •сам и да1 к.л aj.e-Tpjt^^a

Обработка' < гетск у.тьтг2ааук^"м

Отбор pet 5инангнис клоков

I

I»

С£ 1

по опосс'йзли ;.н?кс антитела в :МА1

ив дептоспир з E.ccli

Давая оценку использованию генноинженерных подходов для.получения вакцин, вряд ли маяно надеяться на ее получение с бли-кайшее время, не только из-за трудностей генноинженерных подходов, но и особенностей формирования иммунитета, который носит типа- и группоспецифический характер, и при наличии большого числа серовариантов эта вакцина может быть экономически не выгод ной.

Тем не менее, использование генноиняснерных подходав может быть перспективным для получения отдельных антигенов и особенна токсинов.

Один из иммунобиологических препаратов, применяемых при лептоспирозе в качестве лечебного и профилактического средства является воловий иммуноглобулин. Однако применение этого препарата имеет ограничения, связанные с его гетерологическим происхождением и невозможностью использования для детского населения.

Поэтому одной из актуальных задач является разработка технологии получения противолептоспярозного иммуноглобулина из сыворотки крови человека.

На наш взгляд, по аналогии с другими препаратами могут бып рассмотрены три направления. Первое - это сбор и титрация сырья, собранного в эндемичных районах по заболеваемости лептоспирозом.

Проведенные нами исследования в районах Северо-Кавказскоп региона (Краснодарский край. Ростовская область), являющиха одним из неблагоприятных по заболеваемости лептоспирозом в России, показали невозможность получения необходимого количеств, высокотитранного сырья для производства.

Вторым направлением шкот быть получение донорского сырья, Но для этих целей использование коммерческой лептоспирозной вак цнны не представляется возможным ввиду ез слабой иммуногенности, а глазное, наличия в этой вакцине в больших количествах кроличь его белка, что не позволяет применять ее для вакцинации доноров

В наиих исследованиях при испытании вакцины на ограниченно группа добровольцев из небольшого пула собранной сыворотки бы получен иммуноглобулин методом сульфатно- аммонийного насыщения Препарат содержал антитела в титрах 1:400 и обладал протективно активностью.

1^!мункзация доноров новой вакциной с целью получения иммун ного сывороточного сисья является реальной и выполнимой задачей

Учитывая небольшую потребность в иммуноглобулина для лечения тяжелых бальных, целесообргче 1 мелкосерийный выпуск внутривенного препарата с разработкой I овых технологий, включающих этапы спиртового фракционирования и комбинации с хроматографи-ческими и мембранными методами.

Принципиально новым подходом может быть применение гибри-демни» технологий и получении моноклональных антител.

В настоящее время уже получены высокоспецифические ыонофак-торные антитела к лептоспирам. В исследовании Ананьиной Ю. В.

стъ "сргпектпппзсть их ¡¡яодюишиы* для серологической дифференциации сероваров.

Помимо применения моноклональных антител в диагностических целях особый интерес представляют исследования по перспективному использованию моноклинальных антител для лечения.

Успехи в этом направлении определяются возможностями создания гибридом человеческого происхождения. Использование этих технологий позволяет создать высокостандартные препараты, лишенные побочных эффектов, связзнных с чуяеродностыэ антител, и 'решить актуальную и трудную проблему получения донорского сырья.

Хотя мы еще далеки до развертывания нрлмьегленных технологий с использованием моноклональных антител, ко горце связаны с трудностями их получения и ограничениями в связи с мозможной малиг-низацией человеческих гибридом, тем не ¡«¡нее эти исследования перспективны, и ряд фирм начали интенсивные работы по создали» препаратов для лечения соматических и инфекционных заболеваний. Лсэтаиу ¡¡пенно а ото« направлении мы. предшжили и начали исследования совместно с сотрудниками ляйпрятлрим гибридом Ростовского г<ротнйочумни;х' института с целью уешю&лечия оозиоилостн гю-.•¡учй'ил еннтьзируацнх ионииюгиа^ныв антитела челове-

ческого происхождения,.

В качестве источника кммунокомпетентных клеток О'КК) чело-река использовали миндалин» пеглэ тоюилэитомии по медицинским показаниям. Фрагменты здоровой гнлни стерильно растирали и сток-линиом гомогенизаторе, отмывали в среде, содержащей 2 % (об/пб) сымеротки. Полученную суспензий клеток центрифугировали в сднос-тупемчаччзч градиенте плотности перколла ( • 1,077 г/си3). Ингер-фазное кольцо мононуклеарных клеток дважды отмывали и ресуспен-дировали в среде ЙРМ1 1640 (По«, Великобритания) с содержанием

10 % эмбриональной сыворотки.

В качестве иммуногенов использовали очищенную концентриро ванную лептоспирозную вакцину, специально приготовленную бе: формалина и мембраны лептоспир Interrogans Крыса-2.

Для "иммунизации in vitro" мононуклеарные клетки, выделен ные из миндалин человека с концентрацией 5 ' 106 клеток/мл в об еме 5 мл помещали в 6-ти луночные плоскодонные культурапьные па нели (производство Ленинградского завода медицинских полимеров) Одновременно в культуру клеток вносили антигены в оптимально концентрации 10 мкг/мл. Клетки культивировали при 37°С в атмос фере 6% СОг в среде RPMI 1640 (Flow, Великобритания), дополнен ной пуриватом натрия (2 мМ), 2-меркаптоэтанолом (5105М), L-глу тамином (2мМ). В конечную сраду вводили 25% супернатанта Т-леЯ кемической линии "Jarkat", Ъ% телячьей эмбриональной сыворотки 5% человеческой пуповинной сыворотки.

На 4-5-е сутки "иммунизации" клетки использовали для гибри дизации. Жизнеспособность клеток в культуре к этому времени сос тавляла 80%. В гибридизациях использовали человеческую гетерсад еломмую линию мышь х человек CB-F7 (любезно предоставленную до* тором Grunow R., Германия), которую сливали с клетками иммуннь лимфоцитов миндалин человека. Слияние проводили полиэтиленгликс лем 1500 Д (производства фирмы "Lova", Австрия). Селекция ги( рудных клеток на среде HAT, клонирование и реклонирование споа бом предельных разведений в суспензионной культуре проводили о( щепринятыми методами, описанными в руководстве Кеннета др. (1983).

Отбор гибридом, продуцирующих антитела к лептоспирозным ai тигенам проводили на основании наличия антител в супернатанта выявленных методом твердофазного ИФА. В качестве тест-антигена; для сенсибилизации планшет использовали лептоспирозную вакцин; а в ряде опытов мембраны лептоспир. Положительным ..контролем п; исследованиях служила человеческая сыворотка вакциннрованн: лептоспирозной вакциной доноров. Цветную реакцию регистрирова с помощью фотометра "Uniscan" при длине волны 482 нм.

Замораживание клеток проводили в охлажденной среде с 1 диметилсульсоксидом в течение 12 часов в парах азота, затеи жидксм азоте. После проведения серий слияний тонзиллярных лимф цитое'., иммунизированных "in vitro" лептоспирозной вакциной

геток гетерсмиеломы мыиь х человек СВ-Р7, получены результаты. >едставленные в таблице 8.

Таблица 8.

Результаты гибридизации иммунных лимфоцитов человека с клетками гетеромиеломы (мышь х человек) СВ-Р7

ш-во

¡бриди-

щии

Число луком

Доля %

♦

засеян- склонами клонов, гибридных клонов,секрет»-

1(/'у'йлцИл _!_

1 98 52 3 54 5,7

2 192 84 2 43.7 2, »3

3 192 47 5 24,4 10,6

Из 183 гибридных клонов удалось отобрать 10, секретирующих

шоклональные антитела к лептоспирозной вакцине

Б таблице 9 представлены характеристики секретирующих гтп->л гибридных клонов.

Таблица 3.

Характеристика гибоидсм маь х человек х человек, секретирующих антитела

шменование [класс секрети-клонов I оуемых иммуноглобулинов

Взаимодействие с антигенами в ИФА

лептоспи-рознэт

!вакцина

мембраны

Стабильное;;: клонов п пассажах

I

51 м 4 С

вго м + + 6

вп м + + 3

В5 • "М + - 2

С4 М + - 3

Со я* м + + ю

сз м - 5

пи м + + 15

АЗ м + - ■ 4

+ + 6

Из 10 клонов отобран один гибридный клон C-II, который стабильно в течение 15 пассажей "In vitro" сохранял активность продуцировать в культурную среду противолептоспирозные антитела в титрах 1:100 в ИФА с мембранами и клетками лептоспир.

Штамм гибридом С-II был депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур (NBCKK/П/вПД) Института цитологии Академии наук России.

Таким образом, в результате проведенных исследований удалось сконструировать гибридому, продуцирующую противолептоспирозные антитела человеческого происхождения и показать принципиальную возможность применения гибридомной технологии для получения в перспективе иммунобиологических препаратов против леп-тоспироза.

Дальнейшие исследования с целью организации производства должны вестись в плане повышения продукции антител, технологии их очистки и проверки биологических свойств.

Кроме того, эти исследования могут стать предпосылкой развития работ по созданию ентиидиотипических лептоспирозных вакцм

Давая оценку исследованиям молекулярно-биологических подходов к созданию иммунобиологических препаратов при лептоспирозе, нужно отметить, что нами лишь показана принципиальная возмоа-ность их применения, но для практической реализации нужны дополнительные сложные исследования, особенно если вопрос станет ( промышленном производстве, так как они потребуют оценки экономической целесообразности, технологичности процессов.

Хотелось также подчеркнуть, что молекулярно-биологические i генетические методы создания иммунобиологических препаратов hi могут полностью заменить классические иммунохимические подходы.

Скорее всего эти подходы должны быть дифференцированными, одних случаях, например, для получения антигенов, для создани диагностических препаратов целесообразно использовать молекуляр но-биологические подходы, но они могут быть малоприемлемы дл создания, например, поливалентных лептоспирозных вакцин.

Таким образом, будущие успехи в биотехнологии производств лептоспирозных препаратов со многом будут определяться рацис нальными исследованиями в области молекулярного клонирования гибридокных технологий и классическими подходами иммунохимии.

Оценивая наши исследования, которые мы обобщили в моногр<

фическом плане, хотелось бы еще'рач подчеркнуть кидающиеся и признанные научным миром успехи, достигнуть1?, российскими исследователями в области изучения природной очаговости лептоспнро--зов, эпидемиологии, эпизоотологии, клиники и иммунологии. Но г» будущем наиболее крупные перспективы в исследовании лептоспиро-эов открываются при изучении биохимии, генетики, иммунохимии и молекулярной биологии ЭТИХ удивительных МШфООР1 аыимов.

ВЫВОДЫ

1. Штамм лептоспир сероварианта copenhagenl Крыса - 2 по своим биологическим свойствам может быть использован в производстве лептоспирозных вакцин.

2. Лептоспиры способны диссимилировать углеводы по пути Змб-дена-Мейергофа с участием гексозомонофосфатного шунта. Метаболизм углеводов у лептоспир происходит в 10 раз менее интенсивно, чем у Е.coll.

3. Сконструирована высокоэффективная накопительная полусинте-тическап среда, которая обеспечивает возможность получения биомассы и определены параметры необходимые для ее использования в производстве вакцины против лептоспироза.

4. Разработана новая технология получения концентрированной ' очищенной корпускулярной вакцины против лептоспироза для

людей, включающая в качестве основных этапов культивировании лептоспир на новой полусинтетической среде и новых методов мембранной фильтрации на no/jsix полиамидных волокнах.

5. Выявлены в опытах на экспериментальных животных и в испытаниях на добровольцах особенности развития поствакцинальных реакций и функционирования гуморального и клеточногс звеньев иммунитета при вакцинации юммерческой цельнокле-точной и новой экспериментальной вакциной. Показана более высокая эффективность очищенной концентрированной мащинь при низкой степени ее реактогенности.

6. Разработана технология получения очищенных мембранны; структур лептоспир и изучены их иммунохимические и биологические свойства. Показано, что мембранные структуры лептоспир содержат специфические для'лептоспир антигены. Установлена высокая протективность и антигенность мембрш патогенного штамма лептоспир.

7. Выделены и охарактеризованы из мембранных структур лепто< пир очищенные антигены с групповой и общеродовой специфи» ностью. Группоспецифический антиген имеет rnmwiHnHflHO-ôej кооу» природу, а родоспецифический в основном представл( гликолипидом.

8. Лептоспиры при культивировании выделяет в среду 1сультиви' рования специфические антигены и показана возможность вьт

попоииа аитигчзиа р01тоопп-пппига¥Я.пцп«пй гтцооЯЧ ИЗ КУЛНТ^-

5. ирьдлищеиа и ансивримьпганопй йицспоьопа унибврсдлы&п

~ '£•>■<:: Ниры-Сг.чи ачТ1!ГС-НКЫХ препгрЛС!!ТСС!!ЯГ А":-' >" ¡•ЙГ-'ЭИ, ПО "Г. ПЗлу-'ТП: ГПН^СНКЫС С.Т .-, ..„.. - -^пг---. о. гг:г?г> .......-•

клетки, ектнгенов и их комбинаций.

этих целей библиотека генов. 1. Показана возможность "иммунизации" антигеном;-: лептоспмр лимфоидиых тканей человека в культурах клеток и конструирования на этой основе гибридом смешанного происхождения (мышь-человек), продуцирующих специфические к лептоспирам моноклоиапьнке антитела человека; ,2. Ражеии и практически реализовали' принципы саз лап: испи;: -"¡¡'о~:.<у* ^1йг,'.-огпироз8 длп -¡тол^ ч опане^* -•"•¡л.т'г--^. дальнкйит ргбет й этой направлении.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Иммунобиологические свойства новой концентрированной вакцины против лептоспироза //Тезисы докл. I Всесоюзн. иммунологического съезда. Сочи - 1989. - 15-17 ноября. - том 1,- с. 260 (соавт. Н. И. Костина, Б. Ф. Вачаев, Т. П. Романцова).

2. Перспективы получения специфического противолептоспироз-ного иммуноглобулина из крови человека //Вестник Всесоюзн. микробиологического общества: Ростовское отделение, 1989. - N1. -с.32-34 (соавт. Н.И.Костина, Б.Ф.Вачаев).

3. Выделение и характеристика фракции мембран лептоспир // Вестник Всесоюзн. микробиологического общества: Ростовское отделение, 1989. - N1. - с. 98-103 (соавт. Б. Ф. Вачаев, Н. И. Костина, С. А. Колпаков, А. Л. Кизильштейн).

4. Обмен глюкозы у возбудителя лептоспироза // Вестник Всесоюзн. микробиологического общества: Ростовское отделение, 1989.

- N1. - с. 105-109 (соавт. О.В.Фрунзе, А. П. Шепелев. Н. И. Костина.).

5. Совершенствование иммунобиологических противолептоспи-розных препаратов. Экспериментальное изучение вакцины против ик-терогеморрагического лептоспироза для иммунизации людей // Журнал микробиол. - 1990. -N2. -с. 47-51 (соавт. Н.И.Костина, Б. Ф. Вачаев, Т. П. Романцова. В. Ф. Кондратенко, И. К. Бунин, 3. А.Голь-денштейн, В. Ф. Ананьина).

8. Природный очаг кктерогеморрагического лептоспироза в дельте р.Дон и его эпидемиологическое значение //Известия Северо-Кавказского научного центра Высшей школы. Естественные науки.

- 1930. - N2. - с.58 - 62 (соавт. В.Ф.Кондратенко, И.К.Бунин, В. Д. Рабинович, А.П.Данилкин, Т. А. Иерстнева).

7. Биологические свойства очищенных мембран лептоспир // V] Всесоюзный съезд микробиологов, эпидемиологов и паразитологов: Нижний Новгород. Тез. докл. - 1991. - т. 2. М. - с. 166-167 (соавторы Б.©.Вачаев, Н.И.Костина).

8. Природный очаг иктерогеморрагического лептоспироза 1 Ростовском зоопарке // В кн.: Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний. М. - 1991. Деп. в НПО "Соазмединформ" №21474 (соавторы И.К.Бунин,

В. Ф. Кондрчте-.кс, Б Ф. Вачаев).

9. О перспектнье применения кпеточнач мембран в качестве ачтигена в ИМ //3 кн.: Актуальнее проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний, М. - 1:>91. - Деп. и НПО "Союзмединформ" №21474 (соавторы В. Ф Вачаев. Н И Костина)

10. Ишунохимические и биологические сноиства мембран леп-тосшф //2урк. иикробиол. - 1932. - N11-12,- и. 26 - 29 (соавторы 5. Ф. Вачаев).

'Л. п.^;« -icnriis diiirii cnob иа и6ш«)чм< /итиниц ч *rw «пи» Актуальные проблемы инфекционной патологии; ч. 3 Иммунология и биотехнология. С.-Петербург. 1993. - с. 56 (соавторы Б. Ф. Вачаев, И. Л. Юрьева).

12. Конструирование библиотеки генов лептосш.р для биотехнологических целей // Всес.конф. Актуальные проблемы инфекционной патология; ч.З Иммунология и биотехнология. С.-Петербург. 1993. -с. 100 (соавторы А.П.Мельников).

13 Особенности эпидемиологии и профилактики липтоспирознон инфекции в Ростовской области // Тезисы 17-го съезда Всесхюзногъ» общества эпидемиологов, микробиологов и пар.а^тп.^ц'оь И. И. Мечникова. - Алма-Ата. - 1909. - с. 6B-R9 (и>->ьч-пры В. Ф. Кондратенко, И, К. Бунин, А П. Данилкин, Т. А. Верстнева)

14. Функциональная активность ттм1«гов при ьаяцтшмюя процесса на лептоспирозную вакцину г;< >.<я 11 Mi.у мл родно-

го симпозиума имнунологов " Реабилитации ¡'»««уннои системы" Цхаптубо. - la'iO. - с. 153 (соавторы Т. Е. Калинина, Костина Н. И.,

R ft Ргэцаоп)

ip, New ripc'o.-tcheii to vaccination U'tf>ron:u.'iv>rilHgl-

ae lepiospirxjsls //Immunotheropeutlc prospects of Infections diseases. Sprlnger-Verlag. Berlln-Heldeiberg: - 19S0. - P. 48 - 50 (co-authors B. F. Vachaey, N.I Kostlna).

-6 Ipi'.a'.'i.-ibSo'ofji(;dl properties of мъЧпж against I с-letoh-леиcrrha'»Iae Leptospirosis for h>u>f»ns ;»n. Luptospirosi.. Abstracts VII European and IX All-Union Research conference. Moscow - 1590. ■<■'({- 75 (co-authora В f V.it.hab-v, N l.Krutina. O.V.iialaeoiievd).

17. Macrophages functional activity In the vaccinal process on leptosplral vaccine // Ibid., P.71 (co-authors Т.E.Kallnina, L. W. Ternovshaya, N. I.Kostina).

- во.-'

18. Epidemiological peculiarities of Leptospirosis in Rosto' region // Ibid., P.5-6 (co-authors I.K.Bunin, V. Ph. Kondratencko, A. P.Danllckln, T. A. Sherstneva).

19. The activity of Metabolic pathways of Glucose in th agent of Leptospirosis Infection // Ibid., P. 87 (co-author O.V.Frunze, A.P.Shepeiev, B.D. Roublyov).

20. Norway Rat (Ratus Noveglous) as a source of Leptospira sis Icterohaemorrhagiae on Nljney Don River Area //Ibid.. P.4 (co-authors V. Ph. Kondratencko. I. K. Bunin, A. P. Danllckln T. A. Sherstneva).

21. Biological Characteristics of Leptospira interrogans Ic terohaemorrhagiae strains Isolated in Rostov Region //Ibid. P.80 (co-authors I.K.Bunin. V.Ph.Kondratencko, N. I.Kostlna).

СПИСОК ДОКУМЕНТОВ ПО ВНЕДРЕНИЮ НАУЧНЫХ ДОСТИЖЕНИЙ В ПРАКТИКУ.

1. Инструкция ло изготовлению и контролю "Вакцина лептосш розная иктерогеморрагическая концентрированная инактивированнг жидкая". 1987. - 124 с.

1 2. Отчет о лабораторном испытании вакцины лептоспирозн« иктерогешррш'ической концентрированной инактивированной жидга на экспериментальных животных. 1988. - 28 с.

3. Программа испытания вакцины лептоспирозной иктерогемо рагической концентрированной инактивированной жидкой на огран ченной группе добровольцев, согласованная с Комитетом МИБП, 1.9 -7о.

4. Разрешение Комитета по медицинским иммунобиологическ препаратам ГИСК им. Л. А. Тарасевича на испытание . новой вакци лептоспирозной иктерогеморрагической концентрированной инактив рованной жидкой на ограниченном контингенте добровольцев (прот кол № 10 от 19.07.1990г.).

5. Отчет о результатах испытания вакцины лептоспирозной и терогеморрагической концентрированной инактивированной жидкой ограниченном контингенте добровольцев. 1993. - 38 с.

6. Экспериментально-производственный регламент "Вакцина ■

юптослирозная иктерогеморрагическая концентрированная инактигш-юванная жидкая". 1993. - 106 с.

7. Временная фармакопейная статья на вакцину лептоспирозную «ктерогеиоррагическую концентрированную инактивированную жидкую, 1993. - 106 с.

8. Разрешение Комитета МИШ на испытание вакцины лептоспи-)озной иктерогеморрагической концентрированной инактивированной шдкой на расщзснном контингенте добровольцев (протокол ГГ2 от »3.02.1994 г.)

9. Программа испытания вакцины лептоспирсзной иктерогемор-загической концентрированной инактивированной жидкой на расширенном контингенте добровольцев. 1994. - 8 с.

10. Авторское свидетельство №1480354: на патент "Способ получения биомассы лептоспир". Зарегистрирован 15.01.1989г.

И. Штамм гибридомы СИ. продуцирующий моноклонапьные антитела к мембранным белкам возбудителей рода Leptospira. Свидетельство о депонировании в институте Цитологии АН России №12316 - 633 - 134 от 31.03.93г.

12. Штамм бактерий Leptospira lnterrogans НИИЭМ №4вв, предназначенный для получения лептоспирозных вакцин. Положительное решение на патент Российской Федерации №5041846/13/022775 от 30.03.94 г.

Подписано к печа:ы Форма а 60лЬ4/16

Бумага аип.З. Объем 2,0 усл.п.;;. 0,9 уч.-иуд.л., Заказ 29. 'Jnpüjs |00. ____

Ростовский ЦН1И