Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Приготовление и использование агглютинирующих сывороток для идентификации и типирования Yersinia enterocolitica

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Приготовление и использование агглютинирующих сывороток для идентификации и типирования Yersinia enterocolitica"

На правах рукописи

РГБ ОД

2 5 ПОП

ГЕФАН Наталья Геннадьевна

Приготовление и использование агглютинирующих сывороток для идентификации и типирования Yersinia enterocolitica

03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов, 1996

Работа выполнена в отделе биологического контроля Иркутского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, доцент Тюменцев С.Н.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник З.Л. Девдариани,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М.Сергеева

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится ¡^¿■¿Ц^У 199 ¿>г. в часов на

заседании диссертационного совета К 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071 г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук З.Л .Девдариани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.Кишечные иерсинии - У. еШегосоШка -широко распространены в окружающей среде. Они выделяются из почвенных и водных экосистем, из объектов внешней среды, циркулируют в организме и вызывают заболевания животных и человека. В связи с этим закономерно то пристальное внимание, которое в последнее десятилетие привлечено к кишечноиерсиниозной инфекции как в плане клинической, так и лабораторной диагностики. Вместе с тем до настоящего времении в России не ясны ни истинный уровень заболеваемости кишечным иерсиниозом, ни ее структура и динамика. Это объясняется, с одной стороны, отсутствием раздельной регистрации кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза, которая официально введена только в 1992 г., с другой, - несовершенством существующих методов диагностики. Основными факторами, лимитирующими диагностические возможности бактериологических лабораторий, являются отсутствие или острый дефицит в нашей стране коммерческих реактивов и биологических препаратов, в частности типовых ки-шечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток, для внутривидового типирования У. еп{егосо1Мса и оценки их вирулентности. Несмотря на то, что в Ростовском-на-Дону противочумном институте и Санкт-Петербургском институте вакцин и сывороток разработана научно-техническая документация, а в 1991-1992 гг. были выпущены по две серии сухих кроличьих кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток, в настоящее время серийный выпуск этих препаратов не осуществляется. В связи с этим усовершенствование способов получения кишечноиерсиниозных сывороток, а также расширение спектра диагностических препаратов, позволяющих уже на ранних этапах диагностики идентифицировать иерсинии, прежде всего - вирулентные, является актуальной задачей современной микробиологической науки.

Цель работы. Целью настоящего исследования является разработка надежных способов получения в лабораторных и производственных условиях диагностических агглютинирующих сывороток для идентификации, серотипирования и оценки вирулентности У. еп~ (еюсоИИса.

Задачи работы. Для достижения поставленной цели предусматривается решение следующих конкретных задач:

- выбор донора - продуцента, обеспечивающего получение в достаточном объеме целевых антисывороток хорошего качества;

- изучение и отбор высокоиммуногенных штаммов иерсиний;

- разработка оптимальной схемы иммунизации животных;

- разработка технологии и получение видоспецифической (поливалентной), групповых и моноспецифических кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток;

- разработка технологии и получение сыворотки для идентификации вирулентных иерсиний;

- апробация полученных сывороток в лабораторных и полевых условиях.

Научная новизна. Предложена эффективная схема иммунизации кроликов, позволяющая в короткие сроки (18 дней) получить высокоактивные (титр антител в объемной реакции агглютинации до 1:104200) кишечноиерсиниозные агглютинирующие сыворотки. Разработаны общие принципы и методические приемы получения видоспецифической (поливалентной), групповой и моноспецифических сывороток. Отработана надежная технология получения сыворотки для дифференциации вирулентных и авирулентных представителей вида Yersinia enterocolitica. Предложен оригинальный способ дозирования, фасовки и хранения иммунных сывороток.

Практическая значимость работы. Предложенная схема иммунизации животных дает возможность в короткие сроки получить высокоактивные кишечноиерсиниозные сыворотки. Разработанная технология получения моноспецифических сывороток позволила внести дополнения в нормативно-техническую документацию на этот препарат - регламент № 220-95, ВФС № 42-200ВС-89 и инструкцию по его применению. Разработана технология получения видоспецифической (поливалентной) кишечноиерсиниозной сыворотки. На основе полученных данных составлены и утверждены "Методические рекомендации по получению поливалентной агглютинирующей кишечноиерсиниозной сыворотки". Апробация сывороток на базе микробиологического отдела Иркутского противочумного института, бактериологических лабораторий отделов особо опасных инфекций Новосибирского, Сахалинского областных, Алтайского, Красноярского краевых и Якутского (Саха) республиканского центров санэпиднад-зора показала эффективность и надежность полученных диагностических кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток. Предложен оригинальный и высокоэкономичный способ дозирования, фасовки и хранения иммунных сывороток (авторское свидетельство № 1678371).

На защиту выносятся следующие предложения:

1. Схема иммунизации кроликов, позволяющая в короткие сроки получить высокоактивные кишечноиерсиниозные агглютинирующие сыворотки.

2. Технология получения высокоспецифических (поливалентных), групповых и моноспецифических кишечноиерсиниозных сывороток.

3. Способ дозирования, фасовки и хранения иммунных сывороток. Работа выполнена в отделе биологического контроля Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока в соответствии с планом НИР в рамках двух тем:

"Разработка технологии получения типовых моноспецифических групповых и поливалентных агглютинирующих сывороток" (№ государственной регистрации 01910033791); "Изучение эколого-эпи-демиологических закономерностей иерсиниозов в Сибири и на Дальнем Востоке" (№ государственной регистрации 01910033778). Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на:

• Всесоюзной научно-практической конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии". Махачкала, 1990.

• Научной конференции Иркутского государственного медицинского института, посвященной 70-легию образования санэпид-службы Иркутской области. Иркутск, 1993.

• Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций". Саратов, 1993.

• Научной конференции, посвященной 60-летию Иркутского ордена Трудового Красного Знамении научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока. Иркутск, 1994.

• Научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока. Материалы диссертации представлены в отчетах о научно-исследовательской работе.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы шесть научных статей, получено и опубликовано авторское свидетельство на изобретение № 1678371. Одобрены ученым советом (протокол № 3 от 20.04.95) и утверждены директором института "Методические рекомендации по получению поливалентной агглютинирующей кишечноиерсиниозной сыворотки".

Объем и структура диссертации. Рукопись диссертации содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение собственных экспериментальных результатов, заключение, выводы и список литературы. Объем рукописи 103 страницы, включая 15 таблиц. Список литературы содержит 56 отечественных и 88 зарубежных источников.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы представлен в двух главах. В первой главе обсуждены современные основы идентификации и типирования кишечных иерсиний, дана характеристика представителей рода Yersinia, рассмотрены биологические особенности штаммов У. enterocolitica. Во второй главе описаны научные основы производства агглютинирующих кишечноиерсиниозных сывороток, значение вида животного-продуцента для получения иммунных сывороток, обсуждены во-

просы оптимизации свойств иммуногенов, схемы иммунизации продуцентов, способы фасовки и хранения сывороток.

Материалы и методы

В работе использовали 32 типовых штамма Y. enterocolitica из коллекции доктора G. Wauters, 8 штаммов из музея живых культур Иркутского противочумного института и 3 полевых штамма. Для контроля специфичности сывороток использовали штаммы Y. pseudotuberculosis 5 сероваров, Shigella flexneri, Sh. boydii, Sh. sonnei, Sh. newcastle, Salmonella typhi murium, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Brucella abortus, Francisella tularensis, Vibrio cholerae (всего 30 штаммов).

Морфологию иерсиний проверяли микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Культуральные свойства изучали посевами в бульон Хоттингера и на чашки с питательной средой для диагностики чумного микроба. Подвижность иерсиний определяли посевами культуры в 0.3% полужидкий агар. Биохимические свойства определяли по методу P.R. Edwards, W.H. Ewing и посевами в полные ряды Гисса. О наличии S-R-диссоциации судили по стабильности бактериальной взвеси в 0.9% растворе хлористого натрия, 0.3% растворе аурамина и при кипячении суспензии в течение 1 часа. S-ва-рианты получали путем многократного пассирования исходной культуры при инкубировании на холоду (4°С) и посева в U-образные трубки с полужидким агаром.

Для получения антисыворотки к вирулентным иерсиниям в качестве антигена использовали штамм Y. enterocolitica 8П+ серовара 03, который содержал плазмиду вирулентности с молекулярной массой 48-50 МД. В качестве адсорбента в этом случае служил изоген-ный бесплазмидный вариант этого штамма (К enterocolitica 8П'). Наличие плазмиды определяли по феномену аутоагглютинации в среде Кларка (Portnoy D.A., 1985) и кальцийзависимости на среде ВМ (Gemeski Р., 1980). Плазмидный профиль изучали по T.Kiesser (1984).

Микробную массу получали культивированием Y. enterocolitica на казеиново-дрожжевом агаре, скошенном во флаконах, и в бульоне Хоттингера реакторным способом. Для иммунизации животных при получении антисывороток использовали живые клетки, клетки, инак-тивированные кипячением или формалином, а также липополисаха-рид (ЛПС) и клеточные стенки.

Липополисахарид получали по методу С.Н.Тюменцева и др. (1983) и путем экстракции трихлоруксусной кислотой (Кэбот, Мейер, 1968) или мочевиной (Lohia et al., 1984).

Клеточные стенки изолировали из ультразвуковых дезинтегратов путем дифференциального центрифугирования.

В качестве животных-продуцентов диагностических сывороток использовали кроликов породы шиншилла весом 2.5-3.0 кг.

Для оценки титра антител осуществляли постановку капельной (KP) и объемной (РА) реакции агглютинации и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Диагностикумами для KP, РА и РПГА служили бактериальные суспензии густотой 3* 10|0-5х Ю10 м.к./мл типовых штаммов Y. enterocolitica, приготовленные из двухсуточных агаровых культур, выращенных при 28°С. Диагностикум для РПГА готовили на основе формалинизированных эритроцитов барана по модифицированному методу Б.В. Каральника и др. (1982). В качестве сенситинов в последнем случае использовали корпускулярные антигены штаммов Y. enterocolitica сероваров 05; 09; 010; 014; 015; 017; 018; 020; 021; 022 ; 034; 01,2а,3; 04,32; 04,33; 06,30; 06,31; 07,8; 011,23; 012,25; 012,26; 016,29. Видовую специфичность диа-гностикумов определяли в РПГА с коммерческими диагностическими сыворотками: чумной, салмонеллезной, бруцеллезной, туляре-мийной, О-холерной (Инаба и Огава) и дизентерийной, а также с полученными в Иркутском противочумном институте гипериммунными псевдотуберкулезными сыворотками 1, 2, 4 и 5 сероваров.

Материалы опытов обрабатывали статистически по Е.П.Монце-вичюте-Эрингене (1964).

Полученные результаты и их обсуждение

Проблема заболеваемости кишечным иерсиниозом в Сибири и на Дальнем Востоке, как, впрочем, и в других географических регионах мира, остается одной из малоизученных разделов инфекционной патологии. В то же время нельзя не отметить существующее несоответствие между эпидемиологической актуальностью кишечного иер-синиоза и недостаточным уровнем его практической диагностики. В связи с этим актуальным является совершенствование серологических методов диагностики кишечных иерсиниозов.

Для специалистов по инфекционной патологии, в частности кишечным иерсиниозам, чрезвычайно важны результаты серологической идентификации и типизации иерсиний, для чего, естественно, нужны соответствующие агглютинирующие кишечноиерсиниозные сыворотки. Типирование выделенных культур кишечных иерсиний сыворотками экспериментальных серий не решит проблему. Для повседневной идентификации возбудителей инфекции необходимы коммерческие препараты, надежность которых была бы гарантирована.

Методику получения агглютинирующих кишечноиерсиниозных сывороток начал разрабатывать еще в пятидесятые годы Е. Thal (1954), который своей основной целью ставил изучение специфической агглютинабельности выделяемых культур. Однако только в конце шестидесятых - начале семидесятых годов была сформулирована и частично реализована задача получения типовых агглютинирующих кишечноиерсиниозных сывороток для внутривидовой серологической дифференциации иерсиний (Winblad S., 1968, 1979). Позже как

за рубежом (Aleksic S., Bockemuhl, 1984; Kapperud G., Bergman Т., 1984) так и у нас в стране (Королюк A.M., 1983) получены высокоактивные специфические кишечноиерсиниозные сыворотки путем гипериммунизации кроликов. Однако практическая ценность (в плане серологической типизации) таких сывороток оказалась ограниченной из-за недостаточно широкого спектра использованных для иммунизации сербвариантов иерсиний. Подобное замечание справедливо и для набора диагностических сывороток, предложенных Г.В. Ющенко и др. (1982).

Существенным достижением с точки зрения внутривидовой-диф-ференциации является разработка способа идентификации иерсиний на основе использования поливалентных и моноспецифических сывороток, благодаря которым штаммы У. enterocolitica были подразделены на 32 серологических варианта (Wauters G. et al., 1971, 1972).

В России типовые кишечноиерсиниозные сыворотки против штаммов Y. enterocolitica 32 сероваров по G. Wauters впервые получили Г.Г. Гурлева и др. (1985, 1989). Г.Г. Гурлева совместно с сотрудниками Ленинградского НИИЭМ им. Пастера (1989) составила научно-техническую документацию в виде экспериментально-производственного регламента № 220-89 "Сыворотки диагностические к Yersinia enterocolitica О-моновалентные сухие для РА" и временной фармакопейной статьи 42-200ВС-89.

Несмотря на имеющиеся разработки, серийное производство кпшечноперсиниозных сывороток в России в настоящее время не осуществляется, а коммерческие препараты зарубежного производства не всегда доступны.

Получение высококачественных кишечноиерсиниозных, в частности типовых, агглютинирующих сывороток является трудоемкой процедурой. Задача существенно осложняется тем обстоятельством, что для идентификации и последующей типизации выделенных штаммов помимо поливалентной требуется получение обширного набора групповых и моновалентных сывороток, каждая из которых изготовляется по индивидуальному плану с учетом особенностей антигенного спектра сероварианта.

Многообразие антигенной структуры штаммов кишечных иерсиний, выделенных в различных географических регионах мира от различных хозяев и объектов окружающей среды, обширные антигенные связи со многими представителями семейства Enterobacteri-асеае и микроорганизмами других семейств, более частая, чем у бактерий других видов, S-^-R-диссоциация создают значительные трудности при подборе иммуногена и повышении активности и специфичности антителосодержащих препаратов. Положение еще более осложняется необходимостью получения больших объемов однородной по своим биологическим свойствам бактериальной массы, необходимой, в частности, с целью приготовления адсорбентов для из-

влечения из сывороток групповых (перекрестнореагирующих) антител. Важным моментом является выбор метода инактивации бактериальных культур, поскольку применение живых микроорганизмов не всегда приемлемо по режимным соображениям, а воздействие бактерицидных процедур может неблагоприятно сказаться на антигенной структуре иммуногена и, как следствие, - привести к частичной или даже существенной утрате антителопродуцирующей активности.

В процессе получения агглютинирующих сывороток важную роль играет технология применения антигена - дозы, способ и кратность введения, наличие или отсутствие адъювантов, продолжительность периода между инъекциями, общая продолжительность цикла (циклов) и т.д. Между тем, применяемые в настоящее время при изготовлении кишечноиерсиниозных сывороток схемы иммунизации животных-продуцентов недостаточно эффективны и требуют для реализации больших отрезков времени (не менее 35-57 дней). Последнее, помимо повышения трудовых затрат, ведет к необходимости продолжительного содержания животных и совокупно - к росту экономических затрат.

Не всегда рационален традиционный способ разлива сывороток для хранения и применения с целью идентификации и типизации иерсиний, когда независимо от назначения сыворотки разливаются по ампулам в объеме 1 мл. Между тем, в практических бактериологических лабораториях обычно одновременно подлежат исследованию единичные культуры, вследствие чего остатки (как правило, большую часть) сыворотки из вскрытой ампулы приходится выливать, поскольку в разведенном состоянии она быстро теряет специфическую активность.

Отмеченные выше обстоятельства привели нас к выводу о необходимости новых подходов к разрешению проблемы усовершенствования способов получения кишечноиерсиниозных сывороток и расширения спектра диагностических препаратов. С учетом этого нами проведены исследования, результаты которых способствовали разработке эффективной технологии изготовления поливалентной, групповых и моноспецифических агглютинирующих кишечноиерсиниозных сывороток, которые могли бы упростить и ускорить процедуру идентификации иерсиний.

Первый шаг нашей работы с учетом данных о зависимости специфичности антисывороток от состояния культуры, используемой для иммунизации, заключался в подборе штаммов иерсиний, которые обеспечили бы достижение намеченной цели (Королюк A.M., 1983). Из обширной коллекции штаммов У. enterocolitica, имевшихся в нашем распоряжении, мы включили в работу прежде всего 32 штамма, представляющие разные сероварианты коллекции G. Wauters и хранившиеся в музее нашего института в лиофилизированном состоя-

нии. Кроме них, в разных опытах использовали штаммы иерсиний, выделенные в регионах Сибири и Дальнего Востока. Следует оговориться, что к началу нашей работы схема серологической классификации кишечных иерсиний по G. Wauters получила всеобщее признание, однако в последние годы она существенно модифицирована как за счет расширения до 76 числа сероваров (Wauters G., 1981), так и уточнения критериев классификации внутри самой схемы (Гурлева Г.Г., 1989; Aleksic S., Bockenmuhl J., 1984).

Изучение специфичности получаемых кишечноиерсиниозных сывороток и адсорбцию гетерологичных антител осуществляли -с помощью штаммов других бактериальных видов, в числе которых представители семейств (родов) Enterobacteriaceae, Salmonella, Shigella, Proteus, Brucella, Francisella.

Для контроля за состоянием диссоциации и отбора S-вариан-тов иерсиний использовали реакцию агглютинации в 0.3% растворе аурамина, 0.9% растворе хлористого натрия и термопробу (Wauters G., 1981). Комплексная проверка по этим тестам 32 штаммов коллекции G. Wauters показала, что в популяции большинства (24) из них в большем или меньшем количестве присутствуют R-вари-анты, что послужило основанием для отбора гладких S-клонов с полноценной структурой О-антигена. С этой целью апробированы три методических приема. Первый из них основывался на психро-фильности кишечных иерсиний, в связи с чем смешанные S-R-культуры выращивали на холоду (4-10°С). При таком способе культивирования в процессе многократного пассирования удавалось в ряде случаев заметно повысить содержание S-клеток. Принцип второго метода заключался в использовании свойства подвижности иерсиний в S-форме, благодаря чему в U-образных трубках с полужидким агаром подвижные клетки накапливались в удаленном от места посева отрезке трубки. В третьем случае культуры, содержащие живые S- и R-клетки, в нативном состоянии (без предварительной термо-или химио-дезактивакции) использовали для иммунизации животных в расчете на преимущественное накопление in vivo клеток в S-форме. Во многих экспериментах удалось показать высокую эффективность данного метода, благодаря чему оказалось возможным предложить способ получения высокоактивных кишечноиерсиниозных сывороток путем иммунизации животных живыми клетками иерсиний.

При сочетании всех трех методов отбора из 32 типовых штаммов коллекции G. Wauters в состоянии S-диссоциации получены 26. У остальных 6 типовых штаммов (134 (03), 161 (08), 614 (015), 885 (05,27), 1647 (025,35), 7100 (027)) R-диссоциация была настолько глубокой, что получить из них культуры в S-форме не удалось. Для восполнения недостающих сероваров мы провели серологическую типизацию с помощью сывороток, любезно предоставлен-

ных Г.Я. Ценевой, штаммов музейной коллекции, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока, и полученные в результате этой работы штаммы использовали с целью иммунизации животных и адсорбции групповых антител.

Следующий этап нашей работы состоял в дальнейшей оптимизации свойств иммуногена, поскольку помимо исходного состояния, обусловленного Б-Я-диссоциацией, на его свойства, в том числе антигенную структуру, оказывают влияние целый ряд других факторов, такие как условия культивирования (питательная среда, температура выращивания, продолжительность инкубирования), способ обезвреживания (кипячение, автоклавирование, воздействие химическими агентами) и т.д. В ходе предварительных опытов нами установлено, что иммуностимулирующая активность и О-специфичность наилучшим образом сочетаются в культурах кишечных иерсиний, выращенных на казеиново-дрожжевом агаре при 28°С в течение 48 часов. Наилучший иммуногенный эффект вызывают живые клетки иерсиний, однако при работе с ними необходимо обеспечение выполнения режимных (противоэпидемических) требований как на этапе проведения цикла иммунизации, так и на этапах получения и особенно практического использования конечного продукта - агглютинирующей сыворотки. Снимает заботу о соблюдении режимных требований и при этом существенно не ухудшает иммуностимулирующих свойств иммуногена обезвреживание культур путем прогревания их на водяной бане при 100°С в течение 2.5 часов.

При получении кишечноиерсиниозных сывороток мы предпочли использовать в качестве продуцента кроликов породы шиншилла. Основанием для такого решения послужили анализ литературных данных, а также собственный опыт работы по получению и контролю качества диагностических сывороток. Особую роль сыграли такие положительные факторы, как относительная простота содержания животных, непродолжительность цикла иммунизации, высокий титр специфических антител, достаточная производительность (получение от каждого животного до 50 мл сыворотки). Вместе с тем при оценке с помощью реакции агглютинации (в макропланшетах) наличия в сыворотке интактных, клинически здоровых кроликов "нормальных антител" мы во всех случаях обнаружили агглютинины в титрах 1:1001:200 к штамму 57г. /¡ехпеп 40777. Эта находка подчеркивает необходимость тщательного отбора продуцентов для того, чтобы "нормальные антитела" не повлияли на результаты специфической агглютинации.

Исходя из задач исследования, мы выполнили значительный объем работы по подбору рациональной схемы иммунизации животных-продуцентов. Под этим понятием мы подразумевали прежде всего такие факторы, как дозы антигена, его физико-химическое состояние, способы, интервалы и кратность введения, общая про-

должительность цикла иммунизации. При этом мы исходили из того, что схема иммунизация, предлагаемая для производства, должна соответствовать определенным требованиям, главное из которых -возможность получения сывороток с достаточно высоким титром специфических антител за сравнительно короткий промежуток времени. Немаловажно, чтобы реализуемая схема была удобна, проста и безопасна для здоровья персонала. При создании схемы необходимо учитывать каждый составляющий ее фактор, учитывая, что в процессе антителообразования ни один из них не действует изолированно (Смирнов В.В. и др., 1980).

Общеизвестна зависимость антителообразования от дозы антигена, вводимого животному: в малых дозах имеет место недостаточное иммунизаторное раздражение, в слишком больших - может наступить иммунизаторное утомление, приводящее к снижению титров антител (Бернгоф Ф.Г., Скрыпник П.И., 1937; Topley W.W.G., 1933). Так же не может решаться однозначно вопрос о длительности и кратности иммунизации. Результаты изучения зависимости антителообразования от кратности введения антигена свидетельствуют об очевидном преимуществе многократной иммунизации (Богоявленская Л.Б., 1973). Интервалы между инъекциями иммуногена подбирают эмпирическим путем, причем полученные результаты обычно применимы только к данному конкретному антигену (Гофман И.Л., 1969; Рагинская В.П., 1977).

Взаимодействие антигена с органами и тканями иммунной системы животного во многом обусловливается способом его введения. При подкожной и внутримышечной инъекциях антигена антитела вырабатываются, в основном, в регионарных лимфатических узлах, тогда как при внутривенном введении антиген индуцирует образование антител в селезенке (Петров Р.В., 1970). Как правило, от способа введения антигена зависит не только локализация выработки, но и количество продуцируемых антител, которое заметно больше при внутривенном или комбинированном введении (Богоявленская Л.Б., 1973; Зуев A.C., 1959).

При изготовлении кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток к настоящему времени апробированы внутривенный (Ющенко Г.В. и др., 1982; Королюк А.М., 1983; Гурлева Г.Г., 1989, 1995; Thal Е„ 1954; Winblad S., 1968; Wauters G., 1971) и комбинированный (Воронцова Т.А., Хоробрых В.В., 1969) методы. Эффективность каждого из методов в плане стимулирования выработки антител более или менее удовлетворительна. Что касается продолжительности цикла иммунизации, то она не всегда приемлема, поскольку конечные результаты в лучшем случае (Гурлева Г.Г., 1989) достигаются через 35, а в худшем (Воронцова Т.А., Хоробрых В.В., 1989) - 57 дней.

С учетом накопленного опыта и теоретических предпосылок мы предложили и экспериментально обосновали собственную схе-

му иммунизации животных-продуцентов кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток. В случае использования в качестве им-муногена клеток, »»активированных кипячением, мы применили комбинированный метод иммунизации, включающий последовательное введение антигена внутривенно, в подушечки передних и задних лап и в подколенные лимфатические узлы. Общая продолжительность цикла иммунизации в нашем случае составляет 17-18 дней, при этом титр сывороточных антител достигает в РА 1:32001:6400, а в РПГА - 1:12800-1:25600. При использовании в качестве иммуногена живых клеток иерсиний мы апробировали и рекомендовали другую схему иммунизации кроликов, в соответствии с которой антиген вначале вводится под конъюнктиву глаза, затем трехкратно - внутривенно, и завершает цикл повторное введение антигена под конъюнктиву. При данном способе продолжительность цикла иммунизации составляет 27-30 дней, а титры антител в неад-сорбированной сыворотке при определении в РА против гомологичного штамма составляет 1:51200-1:102400.

При сопоставлении достигнутых нами показателей как по продолжительности иммунизации, так и специфической активности получаемых кишечноиерсиниозных сывороток с аналогичными данными других авторов совершенно очевидно преимущество наших схем иммунизации.

Используя разработанные нами схемы, мы получили агглютинирующие сыворотки против иерсиний каждого из 32 серологических вариантов "\УаЩег5, причем в 26 случаях (Б-формы) иммуногеном служили клетки, инактивированные кипячением, и в 6 (штаммы в стабильном К-состоянии) - живые бактерии.

Как и ожидалось, полученные сыворотки характеризовались по-лииалентностыо, поскольку агглютинировали не только штаммы гомологичного, но и других сероваров. Это обстоятельство определяло задачу следующего этапа нашей работы - получение моноспецифических сывороток со специфической активностью, направленной против гомологичного серовара. Для освобождения поливалентных сывороток от групповых и гетерологичных антител мы избрали адсорбционный метод.

Известно, что выбор оптимального режима адсорбции неспецифических антител представляет довольно сложную задачу, поскольку он предполагает необходимость экспериментальной проверки воздействия на процесс целого ряда факторов - характера и физического состояния адсорбента, его концентрации, продолжительности и температуры инкубации смеси сыворотка-адсорбент и т.д. (Вершигора А.Е., 1975; Герберт У.Д., 1974). В конечном итоге нам удалось, во-первых, подобрать такие штаммы-адсорбенты, которые связывали антитела не к одному, а одномоментно к нескольким сероварам, что существенно упрощало процедуру адсорбции.

Во-вторых, определены оптимальные соотношения сыворотки и асдорбента и, наконец, установлены оптимальные температура и продолжительность процесса адсорбции.

Адсорбцию при необходимости осуществляли двух- и даже трехкратно с тем, чтобы добиться максимального освобождения сыворотки от групповых антител, но при этом сохранить способность агглютинировать гомологичные культуры при разведении сыворотки 1:50 и выше.

Всего таким образом получено 19 сывороток, из которых 11 содержали антитела только к иерсиниям одного серовара, то есть-являлись моноспецифическими. Остальные 8 сывороток, несмотря на все усилия по их очистке, включали антитела к 2-3 (в общей сложности к 18) сероварам и могут рассматриваться как групповые. Факт получения моноспецифических, би- и трехвалентных сывороток существенно облегчил серологическую идентификацию иерсиний. Все эти сыворотки прошли апробацию на базе микробиологического отдела Иркутского противочумного института, бактериологических лабораторий отделов особо опасных инфекций Новосибирского, Сахалинского областных, Алтайского, Красноярского краевых и Якутского (Саха) республиканского центров санэпиднадзора и получили положительные отзывы.

Принимая во внимание, что на территории Сибири и Дальнего Востока наиболее часто встречаются штаммы кишечных иерсиний сероваров 05; 06,30; 06,31; 07,8 и 016, мы попытались разработать технологию получения групповой сыворотки, агглютинирующей штаммы именно этих сероваров. В состав сыворотки было решено также ввести антитела против иерсиний сероваров 03, 09 и 05,27, значение которых в патологии человека показано многими авторами. В результате проведенных исследований нами сконструирована групповая кишечноиерсиниозная сыворотка, которая агглютинирует в разведении 1:25 штаммы кишечных иерсиний сероваров 01,2а,3; 03; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 09; 013,7 и 019,8.

Многообразие клинических симптомов и широкий спектр эпидемиологических проявлений кишечного иерсиниоза создают определенные трудности в диагностике этого заболевания, в связи с чем в числе диагностических средств крайне желательно иметь универсальную (поливалентную) агглютинирующую сыворотку, пригодную для постановки реакции агглютинации на стекле. Последняя может служить в качестве теста, позволяющего уточнить и ускорить постановку диагноза, что немаловажно с эпидемиологической точки зрения, особенно при групповых заболеваниях и чрезвычайных эпидемических ситуациях.

Имея в виду приведенные соображения, мы отработали методику получения поливалентной кишечноиерсиниозной сыворотки, агглютинирующей в разведении 1:25 штаммы кишечных иерсиний

27 серологических вариантов (01,2а,3; 02а,2Ь,3; 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 09; 010; 011,23; 011,24; 012,25; 012,26; 013,7; 014; 015; 016; 016,29; 017; 019,8; 020; 022; 028; 034).

Оценивая видоспецифичность сконструированных препаратов агглютинирующих сывороток, мы подтвердили литературные данные (Ющенко Г.В., Дунаев В.И., 1978; Ahvonen P., Jansson, 1968; Wauters G., 1981; Kupperud В., 1984) о наличии обширных антигенных связей Y. enterocolitica с многочисленными патогенными и непатогенными микроорганизмами других видов, в том числе представителями таких таксонов, как Enterobacteriaceae, Brucella, Vibrio, Francisella и т.д. Нами, кроме того, получены дополнительные доказательства антигенного родства У. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis. Установлено, в частности, что сыворотка против Y. enterocolitica серовара 018 агглютинирует подавляющее большинство штаммов Y. pseudotuberculosis 1 серовара. Отдельные штаммы псевдотуберкулезного микроба 2 серовара реагировали с сывороткой против кишечных иерсиний серовара 021, а штаммы Y. enterocolitica 846 (018) и 1110 (021) агглютинировались псевдотуберкулезными сыворотками 1 и 2 сероваров соответственно.

Наличие общих антигенов обусловливает перекрестные серологические реакции и тем самым снижает диагностическую ценность препаратов. Это обстоятельство побудило нас попытаться изыскать методические приемы для максимального освобождения кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток от гетероло-гичных антител. В ходе проведения исследований в качестве адсорбентов апробированы штаммы бактерий семейства Enterobacteriaceae, штаммы V. cholerae, F. tularensis и В. abortus. Параллельно с кишечноиерсиниозными сыворотками, получеными нами, для контроля использовали целый ряд коммерческих диагностических сывороток (псевдотуберкулезные, поливалентная бруцеллезная, туля-ремийная, О-холерные Огава и Инаба и другие). В результате многочисленных экспериментов в качестве адсорбентов для поливалентной кишечноиерсиниозной сыворотки нами отобраны и рекомендованы для производственной работы штаммы Sh.flexneri 1271, Е. coli К-12 и Y. pseudotuberculosis 140 (2 серотипа). Применение этих штаммов позволило получить поливалентную кишечноиерсиниозную сыворотку, отличающуюся высокой специфичностью в отношении иерсиний. К сожалению, пока не удалось достигнуть абсолютной специфичности, поскольку сыворотка продолжала агглютинировать штаммы Sh. flexneri. Это обстоятельство, однако, не играет существенной отрицательной роли благодаря тому, что реакция агглютинации протекает только при невысоких разведениях сыворотки.

При выполнении настоящей работы нами принят во внимание факт широкого, практически повсеместного, распространения штам-

мов Y enterocolitica сероваров 03; 05,27; 09 и биотипов 2-4, известных как "клинические штаммы" иерсиний. Патогенный потенциал этих штаммов связан с наличием в клетках специфической плазми-ды с молекулярной массой 48-50 МД. По известным литературным данным, и в нашей стране (Смирнов И.В., Горохов В.И., 1990), и за рубежом (Sory et al., 1990) предпринимались попытки получения антисывороток для идентификации патогенных штаммов кишечных иерсиний, однако достигнутые положительные результаты, к сожалению, так и остались на стадии экспериментальных разработок.

С учетом практической важности указанной проблемы мы отработали технологию производственного процесса изготовления агглютинирующей сыворотки против патогенных иерсиний для постановки реакции агглютинации на стекле. Для иммунизации кроликов был избран плазмидосодержащий штамм Y. enterocolitica 8П+ серовара 03 биотипа 4, выделенный в 1990 году в Республике Тува. Иммунизацию животных проводили культурой живых иерсиний, выращенной в среде Игла при 37°С в течение 24 ч. Иммуноген вводили путем чередования внутривенных и субконъюнктивалных инъекций. По завершении цикла иммунизации и тотального кровопускания титр антител против иммунизирующего штамма в РА составлял 1:12800. Для удаления антител против авирулентных штаммов иерсиний использовали адсорбционный метод. Адсорбентом служили живые клетки изогенного бесплазмидного штамма Y. enterocolitica 8П" (серовар 03, биотип 4).

Проверку агглютинабельных свойств сыворотки проводили в РА на стекле с использованием 17 штаммов Y. enterocolitica серовара 03, содержащих плазмиду pYV, 5 штаммов, не имеющих этой плаз-миды, а также 10 штаммов Y. enterocolitica биовара 1а, 5 - К frederik-senii, 5 - Y. kristensenii и 2 - E. coli. Четкая положительная реакция получена со всеми плазмидосодержащими штаммами, отрицательная - с бесплазмидными дериватами кишечных иерсиний, а также с иерсиниями других видов и штаммами кишечной палочки. Таким образом нами получена кишечноиерсиниозная агглютинирующая сыворотка, позволяющая идентифицировать вирулентные клоны кишечных иерсиний (по крайней мере, - серотипа 03) уже на этапе отбора колоний с агаровых пластинок.

Важным моментом в процессе производства и дальнейшего использования сывороток является отработка оптимальных параметров их фасовки, дозирования и условий хранения. Традиционный способ заключается в разливе сыворотки по ампулам в объеме не менее 1 мл с последующими лиофильным высушиванием и запаиванием ампул. Недостаток этого приема заключается в том, что 1 мл сыворотки предназначен для исследования в объемной реакции агглю-

тинации до 50, а в капельной реакции на стекле - до 500 штаммов. В практической работе, как правило, такое количество культур одновременно не исследуется. Поскольку растворенная сыворотка может использоваться лишь в течение 24 часов, большая часть качественного препарата выбрасывается. Для более полноценного использования диагностических сывороток мы предложили разливать сыворотки по 0.1 мл на стандартные полоски фильтровальной бумаги (с последующей лиофилизацией), что позволяет не только снизить общую потребность в сыворотках, но и обеспечить удобный способ их практического применения. Достоинством метода является и возможность длительного хранения образцов сыворотки без потери активности и специфичности. Результаты исследования составили предмет изобретения, на которое получено авторское свидетельство "Способ дозирования кроличьих иммунных диагностических сывороток" № 16783718, опубликованное 23.09.91.

ВЫВОДЫ

1. Отработаны оптимальные параметры получения (животное-продуцент, иммуноген, схема иммунизации) в экспериментальных и производственных условиях кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток при иммунизации продуцента Оантигеном из кишечных иерсиний в Б-форме и культурой живых клеток в состоянии "стойкой" Л-диссоциации.

2. Рекомендована технология производства:

• поливалентной кишечноиерсиниозной агглютинирующей сыворотки;

• групповых и моноспецифических кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток;

• кишечноиерсиниозной агглютинирующей сыворотки для идентификации патогенных штаммов иерсиний.

3. Предложен способ дозирования и хранения кишечноиерсиниозных агглютинирующих сывороток на полосках фильтровальной бумаги.

4. По итогам проведенной крупномасштабной апробации в лабораторных и полевых условиях полученные поливалентные, групповые и моноспецифические сыворотки признаны пригодными для практического применения.

5. Подготовлена нормативно-техническая документация на производство, хранение и применение 19 кишечноиерсиниозных типовых и моноспецифических агглютинирующих сывороток.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Миронова Л.П., Климов

B.Т., Гефан Н.Г. Получение моноспецифических агглютинирующих сывороток для идентификации штаммов иерсиний// Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии,- Махачкала, 1990.вып.4,- С.68-69.

2. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Миронова Л.П., Климов В.Т., Гефан Н.Г. Моноспецифические агглютинирующие сыворотки для идентификации штаммов иерсиний// Лаб. дело.- 1991.-№ 1,- С.54-58.

3. A.C. № 1678371 А 61 К 39100 А 61 К 39/106. Способ дозирования кроличьих иммунных диагностических сывороток/ Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Миронова Л.П., Каретникова Э.С., Гефан Н.Г..- Опубл. 23.09.91.

4. Гефан Н.Г., Миронова Л.П., Андреевская Н.М. К сравнительной оценке агглютинирующих иерсиниозных сывороток// Сб. материалов науч. конф., посвящ. 70-летию образования сан-эпидслужбы Иркутской области.- Иркутск, 1993,- С.72.

5. Попов A.B., Климов В.Т., Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Гефан Н.Г., Докучаева С.Ф., Новикова Т.Н., Щербина Н.Д. Характеристика кишечных иерсиний, выделенных от больных в Сибири и на Дальнем Востоке// Сб. материалов науч. конференции, посвящ. 70-летию образования санэпидслужбы Иркутской области,- 1993.-С. 80-82.

6. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Гефан Н.Г., Попов A.B., Климов В.Т. Диагностическая иммунная сыворотка к вирулентным штаммам Y. enterocolitica// Сб. Иммунология и специфическая профилактика особо опас. инфекций (Материалы Российской научной конференции).- Саратов, 1993,- С.242.

7. Тюменцев С.Н., Гефан Н.Г., Миронова Л.П., Андреевская Н.М. Получение поливалентной агглютинирующей кишечноиерсини-озной сыворотки// Тез. докл. науч. конф., посвященной 60-летию Иркутского противочумного института,- Иркутск, 1994.-

C. 161.