Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика лабораторных методов диагностики кишечного иерсиниоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Корчагин, Глеб Александрович

Глава 1. Введение

Глава 2. Обзор литературы

2.1. Таксономия Y.enterocolitica

2.2. Распространение иерсиниоза

2.3. Морфология и биологические свойства

2.4. Патогенность

2.5. Методы идентификации иерсиний

2.5.1. Бактериологические методы

2.5.2. Серологические методы

2.6. Генетические методы идентификации

Глава 3. Собственные исследования

3.1. Материалы и методы

3.1.1. Реактивы и питательные среды

3.1.2. Оборудование

3.1.3. Штаммы, животные

3.1.4. Методы

3.2. Эффективность бактериологических методов иерсиний из объектов окружающей среды

3.3. Изучение эффективности серологических методов диагностики кишечного иерсиниоза

3.3.1. Получение антигена и гипериммунных сывороток возбудителя кишечного иерсиниоза

3.3.2. Получение гипериммунных сывороток

3.3.3. Приготовление антигенов для РТПГА

3.3.4. Постановка и эффективность РТПГА

3.3.5. Реакция агглютинации

3.3.5.1. Приготовление корпускулярных антигенов для РА

3.3.5.2. Постановка и учет РА

3.3.5.3. Апробирование пластинчатой РА для типизации кишечноиерсиниозного антигена

3.4. Определение чувствительности ПЦР-анализа на культуре Y.enterocolitica и в клиническом материале, объектах окружающей среды

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика лабораторных методов диагностики кишечного иерсиниоза"

Актуальность темы. Кишечные иерсинии - Y enterocolitica - широко распространены в окружающей среде. Они выделяются из почвенных и полных экосистем, из объектов внешней среды, циркулируют в организме и вызывают заболевания животных и человека [Toma, Deidrick.1975, Лысонов Ю.И и др. 1991]. В связи с этим закономерно то пристальное внимание которое в последнее десятилетие привлечено к кишечноиерсиниозной инфекции как в плане клинической так и лабораторной диагностики. Вместе с тем до настоящего времени в России не ясны ни истинный уровень заболеваемости кишечным иерсиниозом, ни ее структура и динамика [Смирнов И.В., Ценева Г.Я. 1992]. Это объясняется, с одной стороны, отсутствием нормативных документов в ветеринарной службе по диагностике заболевания и индикации микроорганизма, с другой - несовершенством существующих методов диагностики и их обилием не прошедшим аттестацию и рекомендацию для применения в ветеринарии.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка и сравнительная оценка некоторых, доступных для практики, методов диагностики кишечного иерсиниоза и индикации микроорганизма в объектах внешней среды.

Для достижения поставленной цели предусматривается решение следующих задач:

- выявить циркуляцию иерсиниозного микроба в хозяйствах Ульяновской области и определить основные биовары возбудителя заболевания,

- определить оптимальные схемы получения иерсиниозных антигенов, гипериммунных иерсиниозных сывороток для использования в диагностических тестах,

- по результатам проведённых исследований предложить серологические методы для прижизненной диагностики кишечного иерсиниоза,

- определить степень распространённости и сохранности гена инвазина Y.enterocolitica, что может являться основанием целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования клинического материала и материалов из окружающей среды,

- определить эффективность ПЦР-реакции по сравнению с бактериологическими методами исследования на выявление иерсиниозной инфекции, что позволит рекомендовать ее в качестве точного диагностического метода исследования.

Научная новизна. Впервые проведены исследования связанные с выделением и изучением циркулирующих на территории Ульяновской области штаммов Y enterocolitica и определением их биоваров. Предложена схема гипериммунизации кроликов, позволяющая в короткие сроки с минимальными затратами, получить активные кишечноиерсиниозные сыворотки. Рекомендовано для прижизненной диагностике использовать методы: РПГА, РТПГА, РА. Доказана высокая распространенность и сохранность гена инвазина Y.enterocolitica, что является основанием для вывода о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования клинического материала и материалов из окружающей среды. Получены данные, свидетельствующие о высокой эффективности ПЦР-реакции по сравнению с бактериологическими методами исследования, что позволяет рекомендовать ее в качестве диагностического метода исследования.

Практическая значимость. Обнаружена циркуляция на территории Ульяновской области штаммов Yersinia enterocolitica биоваров 1,2,3,4. Предложена эффективная схема иммунизации кроликов, позволяющая в короткие сроки (16 дней) с минимальными затратами, получить высокоактивные (титр антител в РПГА 1:12800, объемной реакции агглютинации до

1:1600) кишечноиерсиниозные сыворотки. Опираясь на результаты исследований рекомендовано, для прижизненной диагностике, использовать методы РПГА, РТПГА, РА. Доказана высокая распространенность и сохранность гена инвазина Y.enterocolitica. Это является основанием о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования клинического материала и материалов из окружающей среды. Рекомендуется ПЦР-реакцию использовать в качестве диагностического метода исследования на наличие возбудителя кишечного иерсиниоза. По материалам диссертации разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ № 22-7/28 от 2002 «Временное наставление по применению тест- системы для выявления возбудителя иерсиниоза Y enterocolitica методом полимеразной цепной реакции в порядке широких производственных испытаний», которые позволяют проводить исследования материала контаминированного Y enterocolitica в возможно короткие сроки и с достаточной эффективностью.

Положения, выносимые на защиту:

- выявление циркулирующих штаммов Y enterocolitica, на территории Ульяновской области,

- разработка оптимальной схемы гипериммунизации кроликов, для получения гипериммунной сыворотки на Y. enterocolitica,

- рекомендации по использованию для прижизненной диагностики кишечного иерсиниоза методов РТПГА и РПГА, РА,

- результаты по распространенности и сохранности гена инвазина Y.enterocolitica, что является основанием для вывода о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования материала,

- эффективность ПЦР-реакции по сравнению с бактериологическими методами исследования. 9

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава УГСХА за 2000-2001 гг; межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ (Омск, 2001);Всероссийской научной конфереции ВГНКИ (Москва, 2001); на научно-практической конференции "Зооиндустрия" (С.-Петербург, 2002);областной межвузовской научно-практической конференции (Ульяновск, 2002).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 9 печатных работах.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и библиографического списка использованной литературы. Работа содержит 151 страницу машинописного текста, 14 рисунков, 22 таблицы и библиографический список использованной литературы, включающий 289 наименований, в том числе 229 зарубежных изданий.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Корчагин, Глеб Александрович

ВЫВОДЫ

1.При исследовании, бактериологическим методом, образцов проб полученных из объектов внешней среды хозяйств Ульяновской области, выявлена 151 положительная проба Yersinia enterocolitica, 21 проба относится к биовару -1, 17 - к биовару 2, 12 - биовару 3, 7 - к биовару 4 и 0 - биовару 5.

2. Установлено, что наиболее оптимальной схемой получения гипериммунной сыворотки на Y. enterocolitica является иммунизация кроликов 4-х кратном, внутривенным введением антигена в нарастающих объёмах 0,5 мл, 1,0 мл, 1,0 мл, 1,5 мл при концентрации каждой дозы в 2x10 9 КОЕ и взятии крови на 16 день иммунизаци.

3.Для получения гипериммунной сыворотки на Y. enterocolitica наиболее эффективен антигенный препарат ЛПС Y. enterocolitica (максимальный титр антител 1: 12800 в РПГА, 1:1600 в РА) и препарат из живых бактерий, концентрации каждой дозы - 2x109 (максимальный титр антител 1: 12800 в РПГА, 1:1600 в РА).

4.Для прижизненной диагностики кишечного иерсиниоза можно использовать методы: РПГА, РТПГА, РА с рекомендуемым антигеном. Для серологической идентификации выделенной вирулентной культуры хорошие результаты получены в РА с СВИ.

5. Методом ПЦР исследовали пробы с объектов внешней среды хозяйств Ульяновской области, отмечено: а) из 300 образцов, взятых на исследование, в 56 случаях были выявлены патогенные культуры Y. enterocolitica; б) восемь хозяйств Ульяновской области (из 25 исследованных) не благополучны по иерсиниозу.

6. На основании полученных данных по бактериологическим и молеку-лярно-генетическим (ПЦР) методам исследования, были сделаны выводы о высокой распространенности и высокой степени сохранности при пересевах

98 гена инвазина Y.enterocolitica. Это является основанием для вывода о целесообразности его использования в качестве гена-мишени для скринингового исследования клинического материала и материалов из окружающей среды.

8. Высокая эффективность ПЦР-реакции позволяет рекомендовать ее в качестве диагностического метода исследования по кишечному иерсиниозу.

3.5. Заключение

Обработав и изучив данные, которые показывали высокую чувствительность тест-системы для идентификации Yersinia enterocolitica методом ПЦР мы решили провести исследование взятых клинических материалов для обнаружения возбудителя иерсиниоза бактериологическим методом и ПЦР. Всего исследовали 25 проб на каждую реакцию. Полученные результаты предоставлены в таблице 20.

Культивирование на среде Серова и TS1 в течение 3 суток выявило 11 положительных результатов(40%). Однако при культивировании, без вспомогательных методов дифференциации, практически невозможно установить какие штаммы. Yersinia enterocolitica являются патогенными, а какие нет, в отличие от ПЦР.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Корчагин, Глеб Александрович, Ульяновск

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. // Молек. генет. 1993. - № 4. - С.3-8.

2. Аксенов М.Ю., Мисуренко Е.Н., Шустрова Н.М. и др. // Журн. микробиол.- 1995. № 2. - С.80-84.

3. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. // Там же. 1997. - № 3. - С.78-80.

4. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. // Природа. 1997. - № 5. - С.3-7.

5. Гришина Т.Д., Шагинян И.А., Пузанов В.А. и др. // Молекул, генет.1995.-№ 1. С.36-39.

6. Михайлов М.И., Попова О.В., Павлова И.П. и др. // Рос. журн. гастроентерол.гепатол. 1995. - № 2. - С.21-26.

7. Нестеренко Л.Н., Аксенов М.Ю., Гришина Т.Д. и др. // Пробл. туб. 1994.- № 4. С.29-32.

8. Скрипкин Ю.К., Кубанова А.А., Аковбян В.Н. и др. // Антибиотики.1996.-№2.-С.5-8.

9. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. и др. // Молекул, генет.1993.-№ 6.-С. 18-22.

10. Шагинян А.И., Гинцбург А.Л. // Генетика. -1995. Т.31, № 5. - С.600-610.

11. Алексеева Н.В., Шустрова Н.М., Воронцова Т.А. Определение иерсиний в почве методом иммунорадиометрического анализа.// Тезисы Всесоюзной научнопрактической конференции.- Владивосток. 1986. с.6-7.

12. Белая О.Ф., Бунин К.В., Ценёва Г.Я., Денисова И.А. Определение антигенов иерсиний в реакции коаглютинации при ОКИ заболеваний у взрослых.// ОКИ Республиканский сборник. Ленинград., 1984.-вып.8. -с.119-121.

13. Бернгоф Ф.Г., Скрыпник П.И. Упрощенный способ приготовления специфических аглютенирующих типо-паратифозных сывороток.// Журнал

14. Микробиология, эпизоотология и иммунология. 1987.- Т. 19, №2. - с. 226-235.

15. Ващенок Г.И. Болезни природной очаговости.// Труды ЛНИИЭМ им. Пастер. Ленинград. - 1983.- Т.60. - с. 82-87.

16. Воронцова Т.А., Хоробрых В.В. Получение гипериммунных сывороток к Y.enterocolitica .// Лаб.дело.- 1989. №9. с.70.

17. Гордейко В.А., Воронцова Т.А., Литвин В.Ю. Сероэпидемиологическ^ изучение кишечного иерсиниоза у работников свинокомплеса.// Журнал Микробиология. 1990. - №3 с. 171.

18. Горловская Э.В., Хакимов Н.М., Гиниятуллина Ф.Х. Вспышка иерсиниоза в Куйбышевском районе Республики Татарстан.// Казансикй мед. журнал,- 1993. №6. - с. 443-446.

19. Гурлева Г.Г. Коллекция представителей рода иерсиний: некоторые аспекты биологический свойств и лабораторной диагностики: Автореферат дисс. док. мед. наук. Саратов.

20. Догель Л.З. Свойства Y.enterocolitica и гигиеническая оценка технологии производства молока и молочных продуктов в связи с возможностью передачи иерсиниоза.// Автореферат, канд. дисс. М. 1985.

21. Дулатова М.В. Проблемы и перспективы иммунологической диагностики иерсиниоза.// Сб. «Проблемы медицинской иммунобиотехнологии». -Ленинград. 1990. - с.33-34.

22. Дунаев В.П., Ющенко Г.В. Биологические свойства выделенных от людей штаммов Y.enterocolitica.// Журнал МЭиИ. 1977. - №7. с.85-88.

23. Ерёменко В.А., Воробьев И.Г., Васильев К.Д. и др. Эпидемиология иер-синеозов в С.- Петербурге.// Сб. научных трудов «Окружающая среда и здоровья человека» СПб. 1993.-е. 123-124.

24. Инвазивность и цитотоксичность как критерии оценки аттенуации иер-СИНИЙ.//Г.Я. Ценева, В.М. Бондаренко, Ю.Е. Полоцкий и др.// Журн.микробиол.- 1988. №9. - с. 10-16.

25. Инвазивность и цитотоксичность как критерии оценки аттенуаций иер-синий.//Ценева Г.Я., Бондаренко В.М., Полоцкий Ю.Е., Смирнов И.В., Попов B.JL, Смирнова Н.С. Журн.микробиол. - 1988. - №9. - с.10-16.

26. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Пастереллезное молоко, как фактор передачи возбудителей иерсениозов.// Журнал Микробиология. 1992.- №4. - с. 22-26.

27. Михайленко А.Г., Сандул Г.Н., Бузату А.Е., Чебан Д.С. Распространение кишечного иерсинеоза среди мелких млекопитающих в Молдавии.// Тез.докл. XII Всесоюзной конф. По природной очаговости болезни. -Новосибирск 1989.- с. 97-98.

28. Назарова Ш.Н., Балтабаева М.А., Валиев А.Г. и др. Применение реакции О-агригатаглюцинации для выявления антигенов при ерсиниозах.// Тезисы Всесоюзной научно-практической конференции. Владивосток. 1989.- ч.2. -с.144.

29. Недугова Г.И. Количественный метод определение иммунных комплексов.// Иерсиниозы микробиология, эпизоотология, клиника, патогенез, лаб.дело: Тезисы научно-практической конференции.- Владивосток. 1989. ч.2. с.114.

30. Новаселова Е.Ю., Басова Н.Н. Разработка антигенных эритроцитарных диагностикоумов для РПГА .// Иерсиниозы микробиология, эпизоотология, клиника, патогенез, иммунология: Тезисы Всесоюзной научно-практической конференции. - Владивосток. 1986. - с.90-91.

31. Новый признак патогенности, кодируемый плазмидой pVM 82 Yersinia pseudotuberculosis// A.JI. Гинзбург, Ф.Н.Шубин, Г.А.Шовадаева и др. -Генетика. 1988.- 24. - №9.-с. 1562-1571.

32. Покровский В.И., Полоцкий Ю.Е., Ющук Н.Д., Бондаренко В.Н. Патогенез кишечных инфекций как проявление взаимодействия возбудителей с организмом хозяина.// Журн.микробиол. 1989. - №4. - с.80-87.

33. Попов А.В., Никифиров Ю.В. О первых случаях выделения Y.enterocolitica в Тувинской АССР (Кызыл).// Материал регионального совещания противочумных учреждений по эпизоотологии, эпидемиологии и профилактики ООИ.- Куйбышев 1990.- с. 168-170.

34. Серологические варианты Y.enterocolitica, циркулирующие в различных географических зонах Советского Союза.// Г.Г.Гурлева, Г.Я. Ценева, JI.A. Митрикова и др.// Журн.микробиол. 1985. - №5. - с.49-52.

35. Смирнов И.В. К вопросу о психрофильных свойствах возбудителя иер-синиоза.// Тезисы докладов итоговой объединенной науч.-практ.конф. мол.уч., спец. и студ. Дагетана по медицине. Махачкала, 1988. - с. 6970.

36. Смирнов И.В. К вопросу о распространении R-плазмид у кишечных иерсиний.// Тезисы докладов Всесоюзной научно-практической конф. «Иер-синиозы: микробиология, эпидемиология, клиника, патогенез, иммунология». Владивосток, 1986. - с.68-70.

37. Смирнов И.В. Количественные показатели роста иерсиний в жидкой среде.// Деп. ВИНИТИ, 26.04.88. №3227 - В88. - 1988. - с. 10.

38. Смирнов И.В. Определение феномена аутоагглютинации вирулентных иерсиний.//Лаб.дело.- 1989. №6. - с.59-60.

39. Смирнов И.В., Горохов В.И. Диагностическая сыворотка с антителами вирулентным иерсиниям.//Лаб.дело.- 1990. № 10. - с.66-68.

40. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Культуральные свойства и вирулентность иерсиний.// Журн.микробиол. 1991. - №9. - с. 13-16.

41. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Фенотип возбудителя иерсиниоза и его зна-чениедля диагностики.// Журн.микробиол. 1992. - №1. - с.60-65.

42. Смирнов И.В., Ценева Г.Я., Митрикова Л.А. Выевление маркеров вирулентности у клинических штаммов иерсиний.//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1991. - №3. - с. 19-24.

43. Суркова Т.С., Гражданов А.К. О первых лабораторно-диагностических случаях иерсинеоза в Укр. Области.// Материал регионального совещания противочумных учреждений по эпизоотологии, эпидемиологии и профилактики ООИ.- Куйбышев 1990.- с.209 -210.

44. Тимофеева Л.А., Гурлева Г.Г., Миронова Л.П. и др. Методические рекомендации по лабораторной диагностике кишечного иерсиниоза. 1979.

45. Хоулт Д.Ж. Краткий определитель бактерий Берги.- 8-е изд.- М.: Мир. 1980. с.495.

46. Ценёва Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез. Пособие для врачей. С.Петербург 1992.

47. Ценева Г.Я. Смирнов И.В., Реброва Р.Н., Дмитриева Г.М. Характеристика патогенных свойств иерсиний, детерминируемых плазмидами.// ОКИ: Респ.сб. Л., 1986. - вып. 10. - с. 121-126.

48. Ценева Г.Я., Смирнов И.В., Реброва Р.Н. Штамм бактерий Y.enterocolitica 09 серовара, используемый в качестве тест-штамма для определения вирулентности иерсиний. А.С.№ 1427837 СССР// Б.И. -1988. -№36.

49. Шикулов В.А., Хайтович А.Б. Природные очаги иерсиниозов в Крыму.// Тез.докл. XII Всесоюзной конф. По природной очаговости болезни. -Новосибирск 1989.- с. 140-141.

50. Ющенко Г.В. Антропогенная трансформация природных очагов иерсиниозов и особенности эпидемиологии.// Тез.докл. XII Всесоюзной конф. По природной очаговости болезни. Новосибирск 1989.- с. 144-145.

51. Ющенко Г.В. Экологические аспекты эпидемиологии иерсиниоза и псевдотуберкулеза. М. 1984.

52. Ющенко Г.В., Дунае В.И. Об антигенном родстве Y.enterocolitica с представителями рода Bbrucella.// Журнал МЭиИ. 1980. - №3. с.48-51.

53. Ющенко Г.В., Дунаев В.И. Методика выделения и идентификации Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica.// Лаб.дело.- 1980.-№6. с.367-370.

54. Ющук Н.Д., Ценёва Г.Я., Вяльба Е.В. Диагностическое значение определения антигенов иерсиний в биологических субстратах больно-го.//Клиническая медицина.-1989.-№7 с.7-8.

55. Michelis, Т., Wattiau, P., Brasseur, R., Ruysschaert, J. М. and Cornelis, G. 1990. Secretion of Yop proteins by Yersiniae. Infect. Immun. 58: 2840-2849.

56. Skurnik, M., Nurmi, Т., Granfors, K., Koskelo, M. and Tiilikainen, A. S. 1983. Plasmid associated antibody production against Yersinia enterocolitica in man. Scand. J. Infect. Dis. 15: 173-177.

57. Vesikari, Т., Nurmi, Т., Maki, M., Skurnik, M., Sundqvist, C., Granfors, K. and Gnjnroos, P. 1981. Plasmids in Yersinia enterocolitica serotypes 0:3 and 0:9 correlation with epithelial cell adherence in vitro. Infect. Immun. 33: 870876.

58. Doherty, A., Sherida, J. J., Allen, P., McDowell, D. A., Blair, I. S. and Harrington, D. 1995. Growth of Yersinia enterocolitica 0:3 on modified atmosphere packaged lamb. Food Microbiol. 12: 251-257.

59. Ackers, M. L., Schoenfeld, S., Markman, J., Smith, M. G., Nichols, M. A. and DeWitt, W. 2000. An outbreak of Yersinia enterocolitica 0:8 infections associated with pasteurised milk. J. Infect. Dis. 181: 1834-1837.

60. Andersen, J. К., Sorensen, R. and Glensbjerg, M. 1991. Aspects of the epidemiology of Yersinia enterocolitica: a review. Int. J. Food Microbiol. 13: 231-238.

61. Anonymous. 2000. Infectious disease in Finland 1995-1999. National Public Health Institute, Helsinki, Finland. KTL B4/2000.

62. Antonarakis S.E. // New Engl. J. Med. 1989. - Vol.320, N 3. - P. 153-163.

63. Asplund, K., Johansson, T. and Siitonen, A. 1998. Evaluation of pulsed-field gel electrophoresis of genomic restriction fragments in the discrimination of Yersinia enterocolitica 0:3. Epidemiol. Infect. 121: 579-586.

64. Asplund, K., Tuovinen, V., Veijalainen, P. and Hirn, J. 1990. The prevalence of Yersinia enterocolitica 0:3 in Finnish pigs and pork. Acta Vet. Scand. 31: 39-43.

65. Aulisio, С. C. G., Mehlman, I. J. and Sanders, A. C. 1980. Alkali method for rapid recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl. Environ. Microbiol. 39: 135-140.

66. Ballagi-Pordany A. // Aplication of Polymerase Chain Reaction (PCR) inveri-nary Virdogy Uppsala, Sweden, 1995.

67. Ballagi-Pordany A., Klingeborn В., Flnsburg J. et.al. // Veter. Microbiol. -190.-V.22.-P.373-381.

68. Ballagi-Pordany A., Klintevall K., Merza M. // J.Vet.Mad. 1992. - V.39/ -P.69-77.

69. Barakat, R. K. and Harris, L. J. 1999. Growth of Listeria monocytogenes and Yersinia enterocolitica on cooked modified-atmosphere-packaged poultry in the presence and absence of natural occurring microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 65: 342-345.

70. Beech R., Rona J., Swan A.V. // J. med. Genet. 1989. - Vol.26, N 4. -P.237-244.

71. Belak S., Ballagi-Pordany A., Timonej P.J. at. al. // Mol. and Cellular Probes. 1993. - V.7. -P.241-248.

72. Bercovier, H. and Mollaret, H. H. 1984. Genus XIV. Yersinia. In: Krieg, N. R. (Ed.). Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 1. Williams and Wilkins Company, pp. 498-506.

73. Bercovier, H., Brenner, D. J., Ursing, J., Steigerwalt, A. G., Fanning, G. R., Alonso, J. M., Carter, G. P. and Mollaret, H. H. 1980. Characterisation of Yersinia enterocolitica sensu stricto. Curr. Microbiol. 4: 201-206.

74. Beuchat, L. R. 1996. Pathogenic microorganisms associated with fresh produce. J. Food. Prot. 59: 204-216.

75. Bissett, M. L., Powers, C., Abbott, S. L. and Janda, J. M. 1990. Epidemiological investigations of Yersinia enterocolitica and related species: sources, frequency, and serological distribution. J. Clin. Microbiol. 28: 910-912.

76. Blais, B. W. and Philippe, L. M. 1995. Comparative analysis of yadA and ail polymerase chain reaction methods for virulent Yersinia enterocolitica. Food Control. 6:211-214.

77. Bodnaruk, P. W. and Draughon, F. A. 1998. Effect of packaging atmosphere and pH on the virulence and growth of Yersinia enterocolitica on pork stored at 4°C. Food Microbiol. 15: 129-136.

78. Borie, C. F., Jara, M. A., Sanchez, M. L., SanMartin, В., Arellano, C., Martinez, J. and Prado, V. 1997. Isolation and characterisation of Yersinia enterocolitica from swine and cattle in Chile. J. Vet. Med. B. 44: 347-354.

79. Bottone, E. J. 1997. Yersinia enterocolitica: The charisma continues. Clin. Microbiol. Rev. 10: 257-276.

80. Bottone, E. J. 1999. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microb. Infect. 1: 323-333.

81. Brandt J., Quaid M.H., Folstein S. et.al. // J.A.M.A. 1989,- Vol.261, N 21. -P.3108-3114.

82. Bredholt, S., Nesbakken, T. and Hoick, A. 1999. Protective cultures inhibit growth of Listeria monocytogenes and Escherichia coli 0157:H7 in cooked, sliced, vacuum- and gas-packaged meat. Int. J. Food Microbiol. 53: 43-52.

83. Brennhovd, O., Kapperud, G. and Langeland, G. 1992. Survey of thermotol-erant Campylobacter spp. and Yersinia spp. in three surface water sources in Norway. Int. J. Food. Microbiol. 15: 327-338.

84. Brock D.J.H.,//J.med.Genet. 1990.-Vol.27, N 1.-P.8-13.

85. Brock D.J.H., Curtis A., Barron L. et.al. // Lancet. 1989. - Vol.2, N 8661. -Р.463-466/

86. Brocklehurst, T. F. and Lund, В. M. 1990. The influence of pH, temperature and organic acids on the initiation of growth of Yersinia enterocolitica. J. Appl. Microbiol. 69: 390-307.

87. Bucci, G., Maini, P., Volterra, L. and Chiesa, C. 1991. Direct isolation of Yersinia enterocolitica from stool specimens of patients with intestinal disorders. Contr. Microbiol. Immunol. 12: 50-55.

88. Buchrieser, C., Weagant, S. D. and Kaspar, C. W. 1994. Molecular characterisation of Yersinia enterocolitica by pulsed-field gel electrophoresis and hybridisation of DNA fragments to ail and pYV probes. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4371-4379.

89. Candrian, U. 1995. Polymerase chain reaction in food microbiology. J. Microbiol. Meth. 23: 89-103.

90. Cassiman J.J. //Actaclin. belg. 1988. - Vol.43, N.3. - P. 181-184.

91. Cheng, L. W. and Schneewind, O. 1999. Yersinia enterocolitica type III secretion. J. Biol. Chem. 274: 22101-22108.

92. Christensen, S. G. 1987a. Co-ordination of a nation-wide survey on the presence of Yersinia enterocolitica 0:3 in the environment of butcher shops. Contr. Microbiol. Immunol. 9: 26-29.

93. Christensen, S. G. 1987b. The Yersinia enterocolitica situation in Denmark. Contr. Microbiol. Immunol. 9: 93-97.

94. Cork, S. C., Marshall, R. В., Madie, P. and Fenwick, S. G. 1995. The role of wild birds and the environment in the epidemiology of Yersiniae in New Zealand. N. Z. Vet. J. 43: 169-174.

95. Cornelis , G. R., Boland, A., Boyd, A. P., Geuijen, C., Iriarte, M., Neyt, C., Sory, M. P. and Stainier, I. 1998. The virulence plasmid of Yersinia, an anti-host genome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 1315-1352.

96. Cornelis, G. 1994. Yersinia pathogenicity factors. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 192: 246- 263.

97. Cornelis, G. R. 1998. The Yersinia deadly kiss. J. Bacteriol. 180: 5495-5504.

98. Cover, T. L and Aber, R. C. 1989. Yersinia enterocolitica. N. Engl. J. Med. 321: 16-24.

99. Cox, N. A. and Bailey, J. S. 1990. Comparison of enrichment and plating media for isolation of Yersinia. Poultry Sci. 69: 686-693.

100. Cox, N. A., del Corral, F., Bailey, J. S., Shotts, E. B. and Papa, С. M. 1990. The presence of Yersinia enterocolitica and other Yersinia species on the carcasses of market broilers. Poultry Sci. 69: 482-485.

101. Danks D.M. // Aust. N. Z. J. Med. 1988. - Vol.18, N3. - P.339-348.

102. De Boer, E. 1992. Isolation of Yersinia enterocolitica from foods. Int. J Food Microbiol. 17: 75-84.

103. De Boer, E. 1994. Occurrence of Yersinia species in poultry products. Fleischwirtschaft 74: 287-288.

104. De Boer, E. 1995. Isolation of Yersinia enterocolitica from foods. Contr. Microbiol. Immunol. 13: 71-73.

105. De Boer, E. and Nouws, J. F. M. 1991. Slaughter pigs and pork as a source of human pathogenic Yersinia enterocolitica. Int. J. Food Microbiol. 12: 375-378.

106. De Boer, E., Seldam, W. M. and Oosterom, J. 1986. Characterisation of Yersinia enterocolitica and related species isolated from foods and porcine tonsils in the Netherlands. Int. J. Food Microbiol. 3: 217-224.

107. De Koning-Ward, T. F. and Robins-Browne, R. M. 1995. Contribution to urease to acid tolerance in Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 63: 37903795.

108. De Koning-Ward, T. F., Ward, A. C. and Robins-Browne, R. M. 1994. Characterisation of the urease-encoding gene complex of Yersinia enterocolitica. Gene 145: 25-32.

109. Escudero, M. E., Velazquez, L. and de Guzman, A. M. S. 1996. Yersinia enterocolitica and related species isolated from animals slaughtered for human consumption. Food Microbiol. 13: 201-204.

110. Falcao, D. P. 1991. Occurrence of Yersinia spp. in foods in Brazil. Int. J. Food Microbiol. 14: 179-182.

111. Farber, J. M. 1996. An introduction to the hows and whys of molecular typing. J. FoodProt. 59: 1091-1101.

112. Farrer L.A., Myers R.H., Cupples L.A., Conneally P.M.// J.med.Genet. -1988. Vol.25, N 9. - P.577-588.

113. Feng, P., Keasler, S. P. and Hill, W. E. 1992. Direct identification of Yersinia enterocolitica in blood by polymerase chain reaction amplification. Transfusion 32: 850-854.

114. Fenwick, S. G. and Murray, A. 1991. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by polymerase chain reaction. Lancet 337: 496-497.

115. Fenwick, S. G., Madie, P. and Wilks, C. R. 1994. Duration of carriage and transmission of Yersinia enterocolitica biotype 4, serotype 0:3 in dogs. Epidemiol. Infect. 113: 471-477.

116. Findlay J. // Clin. Chem. 1993. - V.39, N 4. - P.728-729.

117. Frederiksen, W. 1964. A study of some Yersinia pseudotuberculosis-like bacteria ("Bacterium enterocoliticum" and "Pasteurella X"). Scand. Congr. Pathol. Microbiol. 14: 103-104.

118. Fredriksson-Ahomaa, M., Korte, T. and Korkeala, H. 2001a. Transmission of Yersinia enterocolitica 4/0:3 to pets via contaminated pork. Lett. Appl. Microbiol. In press.

119. Fredriksson-Ahomaa, M., Lyhs, U., Korte, T. and Korkeala, H. 2001b. Prevalence of pathogenic Yersinia enterocolitica in food samples at retail level in Finland. Arch. Lebensmittelhyg. In press.

120. Fukushima, H. 1985. Direct isolation of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from meat. Appl. Environ. Microbiol. 50: 710-712.

121. Fukushima, H. and Gomyoda, M. 1986. Inhibition of Yersinia enterocolitica serotype 0:3 by natural microflora of pork. Appl. Environ. Microbiol. 51: 990-994.

122. Fukushima, H., Hoshina, K., Itowa, H. and Gomyoda, M. 1997. Introduction into Japan of pathogenic Yersinia through imported pork, beef and fowl. Int. J. Food Microbiol. 35: 205- 212.

123. Funk, J. A., Troutt, H. F., Isaacson, R. E. and Fossler, C. P. 1998. Prevalence of pathogenic Yersinia enterocolitica in groups of swine at slaughter. J. Food Prot. 61: 677-682.

124. Gonul, S. A. and Karapinar, M. 1991. The microbiological quality of drinking water supplies of Izmir City: the incidence of Yersinia enterocolitica. Int. J. Food Microbiol. 13: 69-74.

125. Gradil C.M., Harding M.J., Lewis K. // Amer. J.Vet.Res. 1994. - V.55, N 3. - P.344-347.

126. Gradil C.M., Harding M.J., Singh E.L. // Proc. 12th Inter. Congr. Anim. Rep. Netherlands. 1992. - V.3. - P. 1304-1306.

127. Grail A., Harbour D.A., Stokes C.R. e.a. // Vet.Microbiol. 1993. - V.36. -P.369-377.

128. Gurgui Ferrer, M., Mirelis Otero, В., Coll Figa, P. and Prats, G. 1987. Yersinia enterocolitica infections and pork. Lancet 8: 334.

129. Harnett, N., Lin, Y. P. and Krishnan, C. 1996. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica using the multiplex polymerase reaction. Epidemiol. Infect. 117: 59-67.

130. Harper P.S., Morris M. // Brit. med.J. 1989. - Vol.289, N 6671. - P.404-405.

131. Harris, L. J. and Griffiths, M. W. 1992. The detection of foodborne pathogens by the polymerase chain reaction (PCR). Food Res. Int. 25: 457-469.

132. Harrison, W. A., Peters, A. C. and Fielding, L. M. 2000. Growth of Listeria monocytogenes and Yersinia enterocolitica colonies under modified atmospheres at 4 and 8°C using a model system. J. Appl. Microbiol. 88: 38-43.

133. Hasebe H., Galeota W.J., Osorio F.A. // Vet.Microbiol. 1993. - V.34, N 3. -P.221-231.

134. Hayden M.R., Robbins C., Allard D. et.al. // Amer.J.hum.Genet. 1988. -Vol.43, N 5.-P.689-699.

135. Heesemann, J. and Griiter, L. 1987. Genetic evidences that outer membrane protein YOP1 of Yersinia enterocolitica mediates adherence and phagocytosis resistance to human epithelial cell. FEMS Microbiol. Lett. 40: 37-41.

136. Heesemann, J. and Laufs, R. 1983. Construction of a mobilisable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J. Bacteriol. 155: 761-767.

137. Heesemann, J., Gross, U., Schmidt, N. and Laufs, R. 1986. Immunochemical analysis of plasmid-encoded proteins released by enteropathogenic Yersinia sp. grown in calcium-deficient media. Infect. Immun. 54: 561-567.

138. Heesemann, J., Keller, C., Morawa, R., Schmidt, N., Siemens, H. J. and Laufs, R. 1983. Plasmids of human strains of Yersinia enterocolitica: Molecular relatedness and possible importance for pathogenesis. J. Infect. Dis. 147:107-115.

139. Hill, W. E. 1996. The polymerase chain reaction: applications for the detection of foodborne pathogens. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 36: 123-173.

140. Hill, W. E. and Keasler, S. P. 1991. Identification of foodborne pathogens by nucleid acid hybridization. Int. J. Food Microbiol. 12: 67-76.

141. Hudson, J. A., Mott, S. J., Delacy, К. M. and Edridge, A. L. 1992. Incidence and coincidence of Listeria spp., motile aeromonads and Yersinia enterocolitica on ready-to-eat fleshfoods. Int. J. Food Microbiol. 16: 99-108.

142. Hughes, D. 1987. Yersinia in the dairy industry. Contr. Microbiol. Immunol. 9: 22-25.

143. Hunter, D. and Hughes, S. 1983. Isolation of Yersinia enterocolitica from pigs in United Kingdom. Vet. Rec. 112: 322-323.

144. Hunter, P. R. and Gaston, M. A. 1988. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 26: 2465-2466.

145. Ibrahim, A. and MacRae, I. C. 1991. Isolation of Yersinia enterocolitica and related species from red meat and milk. J. Food Sci. 56: 1524-1526.

146. Ibrahim, A., Liesack, W. and Stackebrand, E. 1992a. Differentiation between pathogenic and non-pathogenic Yersinia enterocolitica strains by colony hybridisation with a PCR-mediated digoxigenin-dUTP-labelled probe. Mol. Cell. Probes. 6: 163-171.

147. Ibrahim, A., Liesack, W. and Stackebrand, E. 1992b. Polymerase chain reaction -gene probe detection system specific for pathogenic strains of Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 30: 1942-1947.

148. ISO. 1994. Microbiology general guidance for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica. ISO 10273. International Organisation for Standardisation, Geneve, Switzerland.

149. Iteman, I., Baril, C., Girons, I. S. and Carniel, E. 1991. Pulsed-field gel electrophoresis of the chromosome of pathogenic Yersiniae. Contr. Microbiol. Immunol. 12: 198-202.

150. Iteman, I., Guiyoule, A. and Carniel, E. 1996. Comparison of three molecular methods for typing and subtyping pathogenic Yersinia enterocolitica strains. J. Med. Microbiol. 45: 48-56.

151. Jenkins J.B., Conneally P.M.//Ibid. 1989. - Vol. 45, N 1.-P. 169-175.

152. Jinks D.C., Minter M., Tarver D.A. et.al. // Hum. Genet. 1989. - Vol.81, N 4. - P.363-366.

153. Johannessen, G. S., Kapperud, G. and Kruse, H. 2000. Occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica in Norwegian pork products determined by a PCR method and a traditional culturing method. Int. J. Food Microbiol. 54: 75-80.

154. Jourdan, A. D., Johnson, S. C. J. and Wesley, I. V. 2000. Development of a fluorogenic 5' nuclease PCR assay for detection of the ail gene of pathogenic Yersinia enterocolitica. Appl. Environ. Microbiol. 66: 3750-3755.

155. Kadasi J. // Hum. Hered. 1989. - Vol.39. - P.67-74.

156. Kapperud, G., Nesbakken, Т., Aleksic, S. and Mollaret, H. H. 1990b. Comparison of restriction endonuclease analysis and phenotypic typing methods for differentiation of Yersinia enterocolitica isolates. J. Clin. Microbiol. 28: 1125-1131.

157. Karib, H. and Seeger, H. 1994. Vorkommen von Yersinien- und Campylo-bacter-Arten in Lebensmitteln. (Presence of Yersinia and Campylobacter spp. in foods.) Fleischwirtschaft 74: 1104-1106.

158. Keefe J.S., Julian A, Moriarty К e.a. // New Zealand Vet.J. 1994. - V.42, N 3. - P.93-96.

159. Khare, S. S., Kamat, A. S., Doctor, T. R. and Nair, P. M. 1996. Incidence of Yersinia enterocolitica and related species in some fish, meat and meat products in India. J. Sci. Food Agric. 72: 187-195.

160. Kingston H.M. // Brit. med.J. 1989. - Vol.299, N 6690. - P.34-37.

161. Kleinlein, N. and Untermann, F. 1990. Growth of pathogenic Yersinia enterocolitica strains in minced meat with and without protective gas with consideration of competitive background flora. Int. J. Food Microbiol. 10: 6572.

162. Kontiainen, S., Sivonen, A. and Renkonen, О. V. 1994. Increased yields of pathogenic Yersinia enterocolitica strains by cold enrichment. Scand. J. Infect. Dis. 26:685-691.

163. Koornhof, H. J., Smego, R. A. and Nicol, M. 1999. Yersiniosis II: The pathogenesis of Yersinia infections. Eur. J. Clin. Infect. Dis. 18: 87-112.

164. Krech T. // FRMS Microbiol. Immunol. 1992. - V.89, N 6. - P.299-303.

165. Kuzmak J., Grundboeck J. e.a. // Med.Wet. 1993. V.49. N 7. - P. 13121315.

166. Kwaga, J. and Iversen, J. O. 1992. Laboratory investigation of virulence among strains of Yersinia enterocolitica and related species isolated from pigs and pork products. Can. J. Microbiol. 38: 92-97.

167. Kwaga, J., Iversen, J. O. and Misra, V. 1992. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by polymerase chain reaction and Digoxigenin-labelled polynucleotide probes. J. Clin. Microbiol. 30: 2668-2673.

168. Lachica, R. V. and Zink, D. L. 1984. Determination of plasmid-associated hydrophobicity of Yersinia enterocolitica by a latex particle agglutination test. J. Clin. Microbiol. 19: 660-663.

169. Lachica, R. V., Zink, D. L. and Ferris, W. R. 1984. Association of fibril structure formation with cell surface properties of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 46: 272-275.

170. Landegren U., Kaiser R., Casley C.T. Hood L. // Science. 1988. - Vol.242, N 4876. - P.229-237.

171. Lantz, P. G., Hahn-Htiagerdal, B. and Redstrom, P. 1994. Sample preparation methods in PCR-based detection of food pathogens. Trends. Food Sci. Technol. 5: 384-389.

172. Larkin, L. L., Vasavada, P. C. and Marth, E. H. 1991. Incidence of Yersinia enterocolitica in raw milk as related to its quality. Milchwissenschaft 46: 500-502.

173. Leal, Т. С. A., Leal, N. С. and de Almeida, A. M. P. 1999. RAPD-PCR typing of Yersinia enterocolitica 0:3 serotype strains isolated from pigs and humans. Gen. Mol. Biol. 22: 315-319.

174. Letellier, A., Messier, S. and Quessy, S. 1999. Prevalence of Salmonella spp. and Yersinia enterocolitica in finishing swine at Canadian abattoir. J. Food Prot. 62: 22-25.

175. Lindblom В., Holmlund G. // Gene Anal. Techn. 1988. - Vol.5. - P.97-101.

176. Lynch J.R., Brown J.M. // J. med. Genet. 1990. Vol.27, N 1. - P.2-7.

177. MacDonald M.E., Cheng S.V., Zimmer M. et.al. // J. clin. Invest. 1989. -Vol.84, N3.-P.1013-1016.

178. MacDonald M.E., Tanzi R.F., Gusella J.F. // Disc. Neurosci. 1988. -Vol.5, N3.-P.107-109.

179. Madic J. // Praxis Vet. 1993. - V.41, N 2-3. - P.155-160.

180. Mafu, A. A., Higgins, R., Nadeau, M. and Cousineau, G. 1989. The incidence of Salmonella, Campylobacter, and Yersinia enterocolitica in swine carcasses and the slaughterhouse environment. J. Food Prot. 52: 642-645.

181. Maki-Ikola, О., Heesemann, J., Toivanen, A. and Granfors, K. 1997. High frequency of Yersinia antibodies in healthy populations in Finland and Germany. Rheumatol. 16: 227-229.

182. Mcintosh I., Curtis A., Millan F.A. // Amer. J. med. Genet. 1989. - Vol.32. - P.274-276.

183. Merilahti-Palo, R., Lahesmaa, R., Granfors, K., Gripenberg-Lerche, C. and Toivanen, P. 1991. Risk of Yersinia infection among butchers. Scand. J. Infect. Dis. 23: 55-61.

184. Millan F.A., Curtis A., Mennie M. et.al. // J. med. Genet. 1989. - Vol.26, N2. - P.83-85.

185. Miller, V. L., Farmer III, J. J., Hill, W. E. and Falkow, S. 1989. The ail locus is found uniquely in Yersinia enterocolitica serotypes commonly associated with disease. Infect Immun. 57: 121-131.

186. Munk Petersen, A., Vinther Nielsen, S., Meyer, D., Ganer, P. and Lade-foged, K. 1996. Bacterial gastro-enteritis among hospitalised patients in a Danish County. Scand. J. Gastroenterol. 31: 906-911.

187. Najdenski, H., Iteman, I. and Carniel, E. 1994. Efficient subtyping of pathogenic Yersinia enterocolitica strains by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 32: 2913-2920.

188. Nesbakken, T. and Kapperud, G. 1985. Yersinia enterocolitica and Yersinia enterocolitica-like bacteria in Norwegian slaughter pigs. Int. J. Food Microbiol. 1: 301-309.

189. Nesbakken, Т., Kapperud, G., Sorum, H. and Dommarsnes, K. 1987. Structural variability of 40-50 Mdal virulence plasmids from Yersinia enterocolitica. Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B. 95: 167-173.

190. Nielsen, B. and Wegener, H. C. 1997. Public health and pork and pork products: regional perspectives of Denmark. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 16: 513-524.

191. Nilsson, A., Lambertz, S. Т., Stalhandske, P., Norberg, P. and Danielsson-Tham, M. L. 1998. Detection of Yersinia enterocolitica in food by PCR amplification. Lett. Appl. Microbiol. 26: 140-141.

192. Odumero, J. A., Mitchell, S. J., Alves, D. M., Lynch, J. A., Yee, A. J., Wang, S. L. Styliadis, S. and Farber, J. M. 1997. Assessment of the microbiological quality of ready-to-use vegetables for health-care food service. J. Food Prot. 60: 954-960.

193. Ostroff, S. M., Kapperud, G., Huteagner, L. C., Nesbakken, Т., Bean, N. H., Lassen, J. and Tauxe, R. V. 1994. Sources of sporadic Yersinia enterocolitica infections in Norway: a prospective case-control study. Epidemiol. Infect. 112: 133-141.

194. Ozbas, Z. Y., Lehner, A. and Wagner, M. 2000. Development of a multiplex and semi-nested PCR assay for detection of Yersinia enterocolitica and Aeromonas hydrophila in raw milk. Food Microbiol. 17: 197-203.

195. Pai, С. H. and Mors, V. 1978. Production of enterotoxin by Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 19: 908-911.

196. Palomares J.C., Rodriguez I.M.J., Cano R.J., Torres M.J. // Med. Clin. -1992. V.99, N 7. - P.261-264.

197. PCR Technology. Current Innovations / Eds H.G.Griffm, A.M.Griffm. -Boca Raton, 1994.

198. Pedersen, К. B. 1979. Occurrence of Yersinia enterocolitica in the throat of swine. Contr. Microbiol. Immunol. 5: 253-256.

199. Pedersen, К. B. and Winblad, S. 1979. Studies on Yersinia enterocolitica isolated from swine and dogs. Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 87: 137140.

200. Pin, C., Baranyi, J. and Garcia de Fernando, G. 2000. Predictive model for the growth of Yersinia enterocolitica under modified atmosphere. J. Appl. Microbiol. 88: 521-530.

201. Portnoy, D. A. and Martinez, R. J. 1985. Role of a plasmid in the pathogenicity of Yersinia species. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 118: 29-51.

202. Portnoy, D. A., Moseley, S. L. and Falkow, S. 1981. Characterisation of plasmids and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis. Infect. Immun. 31: 775-782.

203. Portnoy, D. A., Wolf-Watz, H., Bolin, I., Beeder, A. B. and Falkow, S. 1984. Characterisation of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in the expression of outer membrane proteins. Infect. Immun. 43: 108114.

204. Rasmussen, H. N., Olsen, J. E. and Rasmussen, O. F. 1994a. RAPD analysis of Yersinia enterocolitica. Lett. Appl. Microbiol. 19: 359-362.

205. Rasmussen, H. N., Rasmussen, О. F., Andersen, J. K. and Olsen, J. E. 1994b. Specific detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by two-step PCR using hot-start and DMSO. Mol. Cell. Probes. 8: 99-108.

206. Rasmussen, H. N., Rasmussen, O. F., Christensen, H. and Olsen, J. E. 1995. Detection of Yersinia enterocolitica 0:3 in faecal samples and tonsil swabs from pigs using IMS and PCR. J. Appl. Bacteriol. 78: 563-568.

207. Rea, M. C., Cogan, Т. M. and Tobin, S. 1992. Incidence of pathogenic bacteria in raw milk in Ireland. J. Appl. Bacteriol. 73: 331-336.

208. Robbins C., Theilmann J., Youngman S. et.al. // Amer. J. hum. Genet. -1989. Vol.44, N 3. - P.422-425.

209. Robertson J.S. // Virol. Aspects Safety Biol. Prod. Proc. Symp., London. Nov.8-9, 1990.-Basel, 1991. -P.205-209.

210. Robins-Browne, R. M. 1997. Yersinia enterocolitica. In: Doyle, M. P., Beuchat, L. R. and Montville, T. J. (Ed.). Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington D.C, pp. 192-215.

211. Robins-Browne, R. M., Miliotis, M. D., Cianciosi, S., Miller, V. L., Falkow, S. and Morris, Jr, J. G. 1989. Evaluation of DNA colony hybridisation and other techniques for detection of virulence in Yersinia species. J. Clin. Microbiol. 27: 644-650.

212. Robins-Browne, R. M., Tzipori, S., Gonis, G., Hayes, J., Withers, M. and Prpic, J. K. 1985. The pathogenesis of Yersinia enterocolitica infection in gnotobiotic piglets. J. Med. Microbiol. 19: 297-308.

213. Rona R.J., Swan A.V., Beech R. et.al. // J. med. Genet. 1989/. - Vol.26, N 4. - P.226-236.

214. Rossen, L., Norskov, P., Holmstrom, K. and Rasmussen, O. F. 1992. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions. Int. J. Food Microbiol. 17: 37-45.

215. Ruckdeschel, К., Roggenkamp, A., Schubert, S. and Heesemann, J. 1996. Differential contribution of Yersinia enterocolitica virulence factors to evasion of microbicidal action of neutrophils. Infect. Immun. 64: 724-733.

216. Saebo, A., Kapperud, G., Lassen, J. and Waage, J. 1994. Prevalence of antibodies to Yersinia enterocolitica 0:3 among Norwegian military recruits: Association with risk factors and clinical manifestations. Eur. J. Epidemiol. 10: 749-755.

217. Saiki R.K., Chang C.A., Levenson C.H. et.al. // New Engl. J. Med. 1988. -Vol.319.-P.537-541.

218. Saiki, R. K. Gelfand, D. H, Stoffel, S., Scharf, S. J, Higuchi, R., Horn, G. Т., Mullis, K. and Erlich, H. A. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science. 239: 487-492.

219. Saken, E., Roggenkamp, A., Aleksic, S. and Heesemann. 1994. Characterisation of pathogenic Yersinia enterocolitica serogroups by pulsed-field gel electrophoresis of genomic NotI restriction fragments. J. Med. Microbiol. 41: 329-338.

220. Scheu, P. M., Berghof, K. and Stahl, U. 1998. Detection of pathogenic and spoilage microorganisms in food with the polymerase chain reaction. Food Microbiol. 15: 13-31.

221. Schiemann, D. A. 1990. Yersinia enterocolitica in drinking water. In: McFeter, G. A. (Ed.). Drinking Water Microbiology. Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, pp. 322-339.

222. Sen, K. 2000. Rapid identification of Yersinia enterocolitica in blood by the 5' nuclease PCR assay. J. Clin. Microbiol. 38: 1953-58.

223. Sievers, К., Ahvonen, К. and Aho, К. 1972. Epidemiological aspects of Yersinia arthritis. Int. J. Epid. 1: 45-46.

224. Skjerve, E., Lium, В., Nielsen, B. and Nesbakken, T. 1998. Control of Yersinia enterocolitica in pigs at herd level. Int. J. Food Microbiol. 45: 195203.

225. Skraastad M.J., Bakker E., De Lange L.F. et.al. // Amer. J. hum. Genet. -1989. Vol.44, N 4. - P.560-566.

226. Skurnik, M. 1985. Expression of antigens encoded by the virulence plasmid of Yersinia enterocolitica under different conditions. Infect. Immun. 47: 183-190.

227. Skurnik, M. and Wolf-Watz, H. 1989. Analysis of the yopA gene encoding the Yopl virulence determinants of Yersinia spp. Mol. Microbiol 3: 517529.

228. Skurnik, M. and Zhang, L. 1996. Molecular genetics and biochemistry of Yersinia lipopolysaccharide. APMIS 104: 849-872.

229. Skurnik, M, ВцП, I, Heikkinen, H., Piha, S. and Wolf-Watz, H. 1984. Virulence plasmid-associated autoagglutination in Yersinia spp. J. Bacteriol. 158: 1033-1036.

230. Skurnik, M., Venho, R., Bengoechea, J.A. and Moriyyn, I. 1999. The lipopolysaccharide outer core of Yersinia enterocolitica serotype 0:3 is required for virulence and plays a role in outer membrane integrity. Mol. Microbiol. 31: 1443-1462.

231. Snell R.G., Lazaron L.P., Youngman S. et. al. // J. med. Genet. 1989. -Vol.26, N 11.-P.673-675.

232. Soine С., Watson S.K., Rybicki E. e. a. // Avian Diseases. 1993. - V.37. -P.467-476.

233. Stengel, G. 1986. Zur diagnostik und vorkommen von Yersinia enterocolitica in Wasser. (Diagnosis and occurrence of Yersinia enterocolitica in water.) J. Vet. Med. В 33: 82-92.

234. Stolk-Engelaar, V. M. M. and Hoogkamp-Korstanje, J. A. A. 1996. Clinical presentation and diagnosis of gastrointestinal infections by Yersinia enterocolitica in 261 Dutch patients. Scand. J. Infect. Dis. 28: 571-572.

235. Suryanarayana V.V.S., Rasool T.J., Natarajan C. // 3 Congr. Europ. Soc. for Vet.Virol. Immun. of Virol. Infect. Interlaken, Switz. 4-7 Sept. 1994. -P.8-10.

236. Szabo, E. A., Scurrah, K. J. and Burrows, J. M. 2000. Survey for psychro-trophic bacterial pathogens in minimally processed lettuce. Lett. Appl. Microbiol. 30: 456-460.

237. Tardy, F., Homble, F., Neyt, C., Wattiez, R., Cornelis, G. R., Ruysschaert, J. M. and Cabiaux, V. 1999. Yersinia enterocolitica type III secretion-translocation system: channel formation by secreted Yops. EMBO J. 18: 6793-6799.

238. Tassinari, A. R, de Melo Franco, B. D. G. and Landgraf, M. 1994. Incidence of Yersinia spp. in food in Sao Paulo, Brazil. Int. J. Food Microbiol. 21: 263-270.

239. Tauxe, R. V., Wauters, G., Goossens, V., van Noyen, R., Vandepitte, J., Martin, S. M., de Moel, P. and Tiers, G. 1987. Yersinia enterocolitica infections and pork: the missing link. Lancet, i: 1129-1132.

240. Telenti A., Imboden P., Marchesi F. et.al. // Antimicrob. Agents. Chemother. 1993. - Vol.37. - P.2054-2058.

241. Thibodeau, V., Frost, E. H., Chenier, S. and Quessay, S. 1999. Presence of Yersinia enterocolitica in tissues of orally inoculated pigs and the tonsils and faeces of pigs at slaughter. Can. J. Vet. Res. 63 : 96-100.

242. Toma, S. and Deidrick, V. R. 1975. Isolation of Yersinia enterocolitica from swine. J. Clin. Microbiol. 2: 478-481.

243. Toora, S., Budu-Amoako, E., Ablett, R. F. and Smith, J. 1992. Effect of high-temperature short-time pasteurisation, freezing and thawing and constant freezing, on survival of Yersinia enterocolitica in milk. J. Food Prot. 55: 803-805.

244. Toora, S., Budu-Amoako, E., Ablett, R. F. and Smith, J. 1994. Isolation of Yersinia enterocolitica from ready-to-eat foods and pork by a simple two step procedure. Food Microbiol. 11: 369-374.

245. Tsai, S. J. and Chen, L. H. 1991. Occurrence of Yersinia enterocolitica in pork products from Northern Taiwan. Contr. Microbiol. Immunol. 12: 5662.

246. Velazquez, L. D. C., Escudero, M. E. and de Guzman, M. S. 1996. Prevalence of Yersinia enterocolitica in hake (Merluccius hubbsi) fillets. J. Food Prot. 59: 781-783.

247. Vishnubhatla, A., Fung, D. Y. C., Oberst, R. D. Hays, M. P., Nagaraja, T. G. and Flood, S. J. A. 2000. Rapid 5' nuclease (TaqMan) assay for detection of virulent strains of Yersinia enterocolitica. Appl. Environ. Microbiol. 66: 4131-4135.

248. Waage, A. S., Vardund, Т., Lund, V. and Kapperud, G. 1999. Detection of low numbers of pathogenic Yersinia enterocolitica in environmental water and sewage samples by nested polymerase chain reaction. J. Appl. Microbiol. 87: 814-821.

249. Walker, S. J. and Gilmour, A. 1986. The incidence of Yersinia enterocolitica and Yersinia enterocolitica-like organisms in raw and pasteurised milk in Northern Ireland. J. Appl. Bacteriol. 61: 133-138.

250. Wang, R. F., Cao, W. W. and Cerniglia, С. E. 1997. A universal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in foods. J. Appl. Microbiol. 83: 727-736.

251. Wauters, G. 1973. Improved methods for the isolation and the recognition of Yersinia enterocolitica. Contr. Microbiol. Immunol. 2: 68-70.

252. Wauters, G., Aleksic, S., Charlier, J. and Schulze, G. 1991. Somatic and flagellar antigens of Yersinia enterocolitica and related species. Contr. Microbiol. Immunol. 12: 239-243.

253. Wauters, G., Goossens, V., Janssens, M. and Vandepitte, J. 1988a. New enrichment method for isolation of pathogenic Yersinia enterocolitica sero-group 0:3 from pork. Appl. Environ. Microbiol. 54: 851-854.

254. Wauters, G., Janssens, M., Steigerwalt, A. G. and Brenner, D. J. 1988b. Yersinia mollaretii sp. nov. and Yersinia bercovier sp. nov., formerly called Yersinia enterocolitica biogroups ЗА and 3B. Int. J. Syst. Bacteriol. 38: 424429.

255. Way J.S., Josephson K.L., Pillai S.D. et.al. // Appl. Environ. Microbiol. -1993. Vol.59, N 5. - P. 1473-1479.

256. Weagant, S. D., Jakow, J. A., Jinneman, К. C., Omiecinski, C. J., Kaysner, C. A. and Hill, W. E. 1999. Development of Digoxigenin-labelled PCR am-plicon probes for use in the detection and identification of enteropathogenic

257. Yersinia and shiga toxin producing Escherichia coli from foods. J. Food Prot. 62: 438-443.

258. Winblad, S. 1967. Studies on serological typing of Yersinia enterocolitica. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Suppl. 187: 115.

259. Wren, В. T. and Tabaqchali, S. 1990. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by the polymerase chain reaction. Lancet 336: 693.

260. Yates R.W., Malcolm S., Read A.P. // Ibid. N 4. - P.245-250.

261. Zheng, X. B. and Xie, C. 1996. Isolation, characterisation and epidemiology of Yersinia enterocolitica from humans and animals. J. Appl. Bacteriol. 81: 681-684.

262. СПК "Память Ильича" с. Кр. Городище - кол. проб. 24

263. СПК "Россия"- с. Андреевка- кол. проб 35

264. АОЗТ "Красноярское"- с. Красный яр кол. проб .12

265. УЧХОЗ УГСХА п. Октябрьский кол.проб 37

266. ЗАО "Зенит"- с. Архангельское- кол. проб 16

267. ЗАО "Волга"- с. Ст. Белый яр кол.проб. ,25 ,

268. А\Ф "Возрождение"- с. Богдашкино- кол. проб Ю

269. НПО "Марс"- с. Борисовка- кол. проб 10

270. ЧП "Фоменко" р. п. Чердакльь кол. проб 39

271. УЧХОЗ УГСХА п. Октябрьский, п. Первомайский, п. Пятисотенный

272. АОЗТ "Озерки"- с. Озерки- кол. проб 5 ; ,• V* '

273. A03f "Красноярское"- п. Колхозный, с. Красный яр.- кол. проб 23

274. СПК "Дружба"- с. Уразгильдино- кол. проб. 27

275. СПК "12 лет£ктября"- с. Поповка- кол. проб . 10.1. С Т Ф1. МТФкол. проб 45анный ветеринарный инспектор1. Л.Н. Медведскийг

276. ВСЕРОССИИСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СЕРТИФИКАЦИИ И СТАНДАРТИЗАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ- (ВГНКИ)выдан

277. Директор ВГНКИ, академик РАСХН, профессор^

278. Ответственный за обуче Зав. лаб. молекулярной диагностик.1. Обухов

279. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ1. ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

280. ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ ЦЕНТР КАЧЕСТВА ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ И КОРМОВ1. ФГУВГНКИ)

281. ЦЕНТР МЕЖДУНАРОДНОГО ЭПИЗООТИЧЕСКОГО БЮРО2, Москва, Д-22 городское шоссе, 5 акс (095) 253-14-91 il: Vgnki-vet@mtu-net.ru 77030568672 от .

282. СЛУШАЛИ: профессора Р.В.Душука о материалах на тест-систему «ЭНТЕРОКОЛ», для выявления возбудителя иерсиниоза Yersinia enterocolitica методом ПЦР, представленных ВГНКИ

283. ПОСТАНОВИЛИ: 1. Рекомендовать к широким производственным испытаниям тест-систему «ЭНТЕРОКОЛ», представленную ВГНКИ.

284. Авторам доработать проекты ТУ на опытную партию и временного наставления по применению набора и представить на согласование и утверждение в установленном порядке.1. Принято единогласно.

285. Председатель научно-проблемной комиссии по кoнfpoлю и стандартизации: биологических лекарственных средств, применяемых при вирусных болезнях животных /О

286. Заместитель председателя научно-проблемной комиссии по контролю и стандартизации: биологических лекарственных средств,. применяемых при бактериальных и грибковых болезнях животных

287. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

288. ОКП 93 8888 1000 СОГЛАСОВАНО Заместитель руководителя Департамента ветеринарии Минсельхоза Рорсии

289. Е. А. Непоклонов « » 2002 г.1. Группа Р 31

290. УТВЕРЖДАЮ Заместитель директора Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

291. А. Д. Третьяков « » 2002 г.

292. ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ИЕРСИНИОЗА YERSINIA ENTEROCOLITICA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ "ЭНТЕРКОЛ"

293. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ' ТУ 9388-087-00494189-02 (на опытную партию в количестве 300 наборов)1. Срок введения с2002 г.1. Срок действия до2004 г.

294. Продолжение на следующем листе

295. Продолжение титульного листа1. Технические условия ТУ

296. РАЗРАБОТЧИКИ: Директор ВГНКИ А. Н. Панин2002 г.

297. Заведующий лабораторией молекулярной диагностики ВГНКИ

298. И. JI. Обухов «» ' ,2002 г.

299. Заведующий отделом препаратовпротив хроническихболезней животных1. К. В. Шумилов «»2002 г.

300. Ведущий научный сотрудник отдела препаратов против хронических болезней животных

301. JI. П. Мельниченко «»2002 г.

302. Ведущий научный сотрудник отдела препаратов против хронических болезней животных1. О. Д. Скляров «»2002 г.

303. Руководитель научно-производственной лаборатории федерального научно-методического центра по борьбе и профилактике со СПИД1. Г. А. Шипулин « » 2002 г.

304. Заведующий кафедрой микробиологии Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии Д. А. Васильев «»2002 г.

305. Аспирант кафедры микробиологии Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии Г.А. Корчагин « » 2002 г.

306. ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ по применению тест-системы для выявления возбудителя иерсиниоза Yersinia enterocolitica методом полимеразной цепной реакции (в порядке широких производственных испытаний в 2002-2004 гг).1. Общие положения

307. ПЦР-смесь-2 2 пробирки по 1,1 млвоск для ПЦР 1 пробирка, 1,7 млмасло минеральное 2 флакона по 4,0 мл

308. Набор № 3 для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:концентрат буфера с бромидом этидия 2 флакона по 25,0 млагароза для электрофореза 3 флакона по 1,8 г

309. Набор № 4 контрольных образцов состоит из следующих компонентов: положительный контрольный образец ДНК Y. enterocolitica (ПКО ДНК Y. enterocolitica) 1 пробирка, 0,1 млположительный контрольный образец ДНК CMV (ПКО ДНК CMV) 1 пробирка, 0,1 мл

310. Внутренний контрольный образец ДНК CMV

311. ВКО ДНК CMV) 1 пробирка, 1,0 млотрицательный контрольный образец (ОКО) 1 пробирка, 1,6 мл ДНК-буфер для разведения и хранения

312. ДНК-контролей 1 пробирка, 1,0 мл13. Упаковка и маркировка.

313. На пробирки (флаконы) с каждым компонентом должна быть нанесена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке, номера серии и даты изготовления.

314. Транспортирование и хранение.

315. Тест-система пригодна для применения в течение 6 мес с даты изготовления.

316. ОТБОР МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

317. Для исследования используют:22.1. фекалии животных (свежие порции или ректальные смывы);22.2. моча;22.3. содержимое кишечника;22.4. лимфатические узлы;22.5. кусочки органов вынужденно убитых животных;22.6. сточные воды;22.7. корма.

318. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день. Допускается хранение материала при минус 20°С в течение 30 сут.

319. В одну из пробирок со 100,0 мкл лизированного ОКО добавляют 10 мкл положительной контрольной ДНК Y. enterocolitica из набора № 4, получают положительный контроль выделения ДНК. Оставшаяся пробирка с ОКО служит отрицательным контролем выделения ДНК.

320. Вносят по 20,0 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают содержимое пробирки на вортексе, оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбента, еще раз перемешивают и отстаивают 5-10 мин.

321. Осаждают сорбент на микроцентрифуге при 5x103 об/мин в течение 30 с и удаляют супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос с колбой-ловушкой для удаляемой жидкости).

322. Осаждают сорбент на микроцентрифуге при 5x10 об/мин в течение 30 с и отбираютсупернатант.

323. Вносят по 500,0 мкл отмывочного раствора № 2, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при10x10 об/мин в течение30 с, отбирают супернатант.

324. Осаждают на микроцентрифуге при (10-12)х10 об/мин в течение 1 мин. Супернатант содержит очищенную ДНК, которая используется в ПЦР.

325. На поверхность застывшего воска раскапывают по 10,0 мкл ПЦР-смеси-2, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1. В противном случае пробирку считают браком и выбрасывают. Сверху раскапывают по 1 капле минерального масла.

326. Набирают на амплификаторе нужную программу: Y. enterocolitica и CMV

327. Y. enterocolitica : 270 п.н. CMV : 350 п.н.

328. ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР (зона № 3)

329. УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ