Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных"

РГБ ОД

1 ^ МАП ¿303

На правах рукописи

ХАПЦЕВ ЗАУР ЮРЬЕВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов — 2000

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Зыкин Л.Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Попов Н.В., кандидат биологических наук. Донецкая Э.Г.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Защита состоится " 2000 г. в / '

часов на заседании диссертационного совета К 120.72.03 в институте ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И.Вавилова в аудитории кафедры патологической анатомии и патологической физиологии сельскохозяйственных животных. Адрес: 410005 Саратов, Соколовая, 335.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВМиБ СГАУ им. Н.И.Вавилова

Автореферат разослан "/£ " ^^¿-¿^/^/"У 2000 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

Я^.ткс^Оиим оп - С

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Кишечный нерсиниоз относится к числу относительно новых инфекционных болезней, которые особенно интенсивно начали изучаться за последние 25-30 лет. Эта болезнь относится к пищевым зоонозам, то есть к болезням, источником инфекции при которых являются больные дикие, домашние, сельскохозяйственные животные, а факторами передачи — продукты животноводства (молоко, мясо), а также овощи, фрукты, корма и др.

По данным Всемирной организации здравоохранения (1977) распространенность иерсиниоза носит глобальный характер. В связи с этим закономерно то пристальное внимание, которое в последнее десятилетие привлечено к кишечноиерсиниозной инфекции, в том числе и в плане лабораторной диагностики.

В последнее время в нашей стране, несмотря на определенные успехи в проблеме изучения кишечного иерсиниоза, особенно в медицинском аспекте, остается много неизученных вопросов, особенно в эпидемиологии и эпизоотологии этой инфекции.

В ветеринарии кишечный иерсиниоз стал официально регистрироваться лишь с 1996 года. Поэтому в отечественной литературе имеются лишь единичные работы по иерсиниозу сельскохозяйственных животных.

Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют, что эта болезнь встречается у крупного рогатого скота, свиней и некоторых других животных (Гомэску В. и соавт., 1982; Ющенко Г.В. и соавт., 1985; Стефанов И., 1989; Писаренко И.И. и соавт., 1990; Куликовский A.B., и соавт., 1993; Шумилов К.В. и соавт., 1998). Есть указания на важную роль животноводческой продукции (молоко, мясо) в заражении человека (Ющук И.Д., Карет-кина Г.И., 1987; Norbert К. et al., 1989; Куликовский A.B. и соавт., 1993; Ошейкр A.M., Паньков Р.Н., 1997).

Однако эти сведения носят несистематизированный, разрозненный характер и не создают цельного представления о иерси-ниозе сельскохозяйственных животных как по Российской Федерации в целом, так и по отдельным регионам.

В частности, в областях Среднего и Нижнего Поволжья кишечный иерсиниоз у сельскохозяйственных животных описан не был.

Кроме того, учитывая то, что обычная бактериологическая диагностика кишечного иерсиниоза длительна (до 3-х недель) и малоинформативна, в последнее время возросла роль экспрессных и недорогих методов лабораторной диагностики данной инфекции.

Указанные обстоятельства, а также остающаяся угроза распространения этой инфекции и определила выбор темы.

Цель работы. Целью нашей работы явилось изучение распространения кишечного иерсиниоза среди сельскохозяйственных животных в Саратовской области, а также возможности использования экспресс-метода лабораторной диагностики этой инфекции у животных на основе использования реакции коагглютинации.

Основные задачи. Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих конкретных задач:

1. Доказать существование кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных в Саратовской области.

2. Изучить возможность применения РКОА в сочетании с бактериологическим методом для диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

3. Дать сравнительную оценку эффективности бактериологической диагностики кишечного иерсиниоза и РКОА.

Научная новизна. Впервые с помощью серологического и бактериологического методов доказано существование в Саратовской области кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

Применена реакция коагглютинации для обнаружения антигенов У.етегосоШка в фекалиях, молоке больных животных и бактерионосителей, а также в патологическом материале. Доказана целесообразность применения реакции коагглютинации для экспресс-диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

Практическая ценность работы. Получены кишечноиерсини-озные и псевдотуберкулезные поливалентные и моновалентные диагностикумы для постановки РКОА с копрофильтратами, молоком, патологическим материалом. Для экспресс-диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных рекомендуется реакция коагглютинации в сочетании с Холодовым обогащением на жидких средах накопления (буферно-казеиново-дрож-жевая среда и таурохолат-сорбитол-фосфатная среда), примененная совместно с бактериологическим методом и позволяющая в 3 — 4 раза сократить время исследования и в 4,4 раза удешевить анализ. Определены диагностические возможности РКОА при обнаружении антигенов иерсиний. Проготовлены также иммунопе-роксидазные кишечноиерсиниозные коньюгаты для иммунофер-ментного метода.

Реализация результатов исследований. По результатам исследований составлены и утверждены Ученым Советом Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии "Методические рекомендации для лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сельскохозяйственных животных" (протокол №13 от 28 января 1997 года). Эти методические рекомендации представлены в головной Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН для включения в готовящуюся инструкцию по диагностике кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сельскохозяйственных животных.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Распространение кишечного иерсиниоза среди сельскохозяйственных животных в Саратовской области.

2. Выбор оптимальных сред для холодового обогащения при исследовании на иерсиниоз.

3. Применение РКОА для прижизненной и посмертной экспресс-диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспер-тизы института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова в соответствии с планом НИР федеральной программы "Ветеринарное благополучие", утвержденной МСХиП Российской Федерации.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

— Научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученных биотехнологического факультета Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии "Актуальные проблемы зооинженерии и биотехнологии", Саратов (1997; 1998; 2000 гг.);

— Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной системы России, Саратов, 1997 г.

Материалы диссертации представлены в отчетах о научно-исследовательской работе: "Усовершенствование лабораторной диагностики пищевых зоонозов" и "Сравнительная оценка эффективности лабораторных методов диагностики кишечного иерсиниоза, псевдотуберкулеза и листериоза".

Внедрения. По результатам исследований в 1997 году подготовлены "Методические рекомендации по лабораторной диагностике кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сельскохозяйственных животных", утвержденные Ученым Советом СГАВМиБ (протокол №13 от 28 января 1997 года).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научных статьи и 3 тезиса докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 23 таблицами. Список литературы включает 104 отечественных и 80 зарубежных источников.

Собственные исследования. В обзоре литературы дана характеристика представителей рода Yersinia, рассмотрены биологические особенности штаммов Y.enterocolitica. Кроме того, изложены вопросы эпизоотологии, эпидемиологии, состояния лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза.

Материалы и методы. Из серологических методов при обследовании сельскохозяйственных животных нами была использована РА. Сыворотки для серологического исследования получали в Саратовской областной ветеринарной бактериологической лаборатории. РА ставилась с коммерческими антигенами Y.enterocolitica сероваров 0:3; 0:5,27; 0:9, а также антигенами Y.pseudotuberculisos I и III сероваров в полистироловых планшетах для иммунологических реакций по общепринятой методике в разведениях 1:25 — 1:400. Кроме того, использовали антигены, приготовленные на кафедре микробиологии СГАВМиБ, по методике описанной Г.Я.Ценевой (1992). Учет РА производили по четырехбалльной системе. Всего было исследовано 147 сывороток от сельскохозяйственных животных, в том числе от крупного рогатого скота — 84, от свиней — 48, от лошадей — 15 из хозяйств Саратовского, Советского, Базарно-Карабулакского районов Саратовской области.

Бактериологически было обследовано 670 проб фекалий и патологического материала от больных и павших свиней и 80 проб молока от крупного рогатого скота из хозяйств Саратовского, Советского, Марксовского, Калининского, Энгельского районов Саратовской области.

Бактериологическое обследование сельскохозяйственных животных проводили с применением метода холодового обогащения проб в фосфатно-буферном растворе, 1% забуференной пептон-ной воде, буферно-казеиново-дрожжевой среде, таурохолат-сор-битол-фосфатной среде, 1% пептонной воде с добавлением К2НР04. Исследовали пробы фекалий, смывы из ротовой полости с корня языка, материал из подчелюстных и заглоточных лимфоузлов, от коров исследовали молоко.

Взятый материал помещали в жидкие среды накопления при 4°С.

Посев на плотные питательные среды (Эндо, иерсиниозно-псевдотуберкулезную среду (ИПС)) проводили из ФБР на 5, 10, 15 сутки, а с БКД, ТСФС, 1% ЗПВ, 1% пептонной воды с К2НР04 на 2 — 3-й, на 5-е, 7-е, 10-е сутки. Перед посевом материал подвергали щелочной обработке для освобождения от посторонней микрофлоры. Одновременно по 0,5 мл вносили в центрифужные пробирки, которые прогревали при 100°С на водяной бане 30 — 40 минут, центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 20 минут и использовали для исследования в РКОА.

Чашки с посевами выращивали в течение 48 часов при 26°С. Затем при помощи стереомикроскопа МБС-10 или лупы отбирали подозрительные колонии, пересевали на МПБ для выделения чистой культуры. Для дальнейшей идентификации использовали культуры бактерий, обладающие характерной морфологией (гра-мотрицательные палочки или коккобактерии), обладающие уре-азной активностью, ферментирующие маннит до кислоты и подвижные при 26°С и неподвижные при 37°С. Затем изучали биохимические свойства.

Если исследуемая культура обладала типичными биохимическими свойствами, то проводили серотипирование при помощи иерсиниозных и псевдотуберкулезных поливалентных и моновалентных агглютинирующих сывороток в РА. Идентификацию Y.pseudotuberculosis при помощи бактериофага проводили методом "стерильного пятна" согласно инструкции по применению.

Вирулентность определяли при помощи сывороток к вирулентным иерсиниям, аутоагглютинации (на среде Кларка), темпера-турозависимой морфологии (не агаре Хоттингера с конго-рот), кальцийзависимости (на среде Хигучи-Смита) по общепринятым методикам.

Чувствительность иерсиний к антибиотикам определяли методом диффузии в агар.

Экспериментальные агглютинирующие кишечноиерсиниозные сыворотки к сероварам Y.enterocolitica 0:3; 0:5; 0:6; 0:9 были получены по методике Н.Г.Гефан путем иммунизации кроликов убитыми нагреванием при 100°С в течение 60 минут культурами.

Стафилококковый реагент для РКОА готовили по методике, описанной О.Ф.Белой и соавт. (1990). Культуру Staphylococcus aureus Cowan I выращивали при 37°С на сердечно-мозговом агаре. Выросшие бактерии смывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,27,4) и центрифугировали при 5000 об./мин. 10 минут. Затем к осадку добавляли 0,5% формалин с таким расчетом, чтобы получилась 10% взвесь (по объему). Смесь инкубировали при 37°С в течение 3 часов при постоянном встряхивании или перемешива-

нии. Затем трижды отмывали фосфатно-солевым буфером при помощи центрифугирования, выдерживали на водяной бане при 80°С 30 минут, центрифугировали и из осадка готовили 10% взвесь стафилококков.

Наличие протеина А определяли при помощи диагностикума для определения ревматоидного фактора Санкт-Петербургского НИИВС. На предметное стекло наносили каплю диагностикума и вносили бактериологической петлей культуру S.aureus Cowan I, перемешивая до получения гомогенной взвеси. Если штамм исследуемого стафилококка содержал достаточное количество протеина А, то через 1-2 минуты наблюдалось просветление субстрата с образованием крупных агрегатов.

В качестве исходной взвеси также использовали лиофилизи-рованный стафилококковый реагент, содержащий белок А производства Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Л.Пастера.

Для сенсибилизации стафилококков в качестве источников специфических иммуноглобулинов использовали сыворотки кроликов как собственного приготовления, так и коммерческие.

Затем подобрали рабочее разведение сывороток.

Для получения диагностикума к 1 мл 10% исходной взвеси стафилококка добавляли 0,1-0,2 мл сыворотки (цельной или в соответствующем разведении), выдерживали 1 час при 20°С при постоянном перемешивании. Затем стафилококки трижды отмывали ФСБ от избытка иммуноглобулинов, а осадок ресуспензиро-вали в ФСБ для получения 2% концентрации.

Диагностикум проверяли на гомогенность. При отсутствии спонтанной агглютинации использовали в дальнейшей работе.

Контроль чувствительности диагностикумов осуществляли в РКОА на стекле со специфическими антигенами возбудителей.

Затем диагностикум консервировали мертиолятом натрия (1:10000).

Полученные диагностикумы использовали для типирования микроорганизмов в РКОА на стекле, а также для обнаружения антигенов иерсиний в патологическом материале.

Для типирования микроорганизмов в РКОА на предметное стекло наносили 1 каплю ФСБ и 1 каплю специфического препарата. Затем брали испытуемую культуру и вносили ее в каплю со специфическим препаратом и в каплю ФСБ. Результаты учитывались в течение 30 сек.-2 мин.

Для обнаружения иерсиниозного антигена на предметное стекло наносили каплю исследуемого материала, предварительно прогретого и отцентрифугированного. Затем добавляли 1 каплю диагностикума. Параллельно ставили заведомо положительный (с прогретыми при 100вС в течение 30 минут культурами иерсиний) и заведомо отрицательный (с ФСБ) контроли. Капли перемешивали осторожным покачиванием стекла. Результат учитывали спустя 5-30 минут после экспозиции во влажной камере.

Учет реакции проводили на черном фоне при помощи лупы.

Положительной реакцией считали появление хлопьев агглютинированных стафилококков при сохранении гомогенности взвеси в заведомо отрицательном контроле и при положительной реакции в заведомо положительном контроле. Учет проводили по четырех-крестовой системе. В качестве положительной учитывали реакцию не менее чем на "2+".

Для приготовления иерсиниозного иммунопериксидазного конъ-югата* иммуноглобулины выделяли из сыворотки сернокислым аммонием.

Количество белка определяли спектрофотометрически. Имму-нопероксидазный конъюгат готовили по методике Wilson, Nacane (1978).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью общепринятых статистических методов (В.Ю.Урбах, 1964; Сепетелиев Д., 1968; Плохинский H.A., 1970). Кроме того, обработка данных проводилась с помощью ПЭВМ IBM PC ХТ по Фишеру.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Обнаружение кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза у сельскохозяйственных животных в Саратовской области

Для сравнения свойств эталонных штаммов иерсиний с выделенными нами культурами от сельскохозяйственных животных были получены из музея живых культур РосНИПЧИ "Микроб" типовые штаммы Y.enterocolitica сероваров 0:3; 0:5; 0:6; 0:9 и Y.pseudotuberculosis I, III, IV, V сероваров и изучены их свойства.

Морфологию иерсиний изучали при микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Культуральные свойства изучали посевами на МПБ и МПА, на чашки со средами Эндо, Левина, ИПС. Подвижность определяли посевами в 0,7% полужидкий агар. Биохимические свойства определяли на коммерческих средах Гисса, среды Клиглера по общепринятой методике, а также при помощи системы индикаторных бумажных дисков (СИБ) и пластин биохимических, дифференцирующих энтеробактерии (ПБДЭ).

Кроме того, использовались также и наборы биохимической идентификации энтеробактерий "Энтеротест I" и "Энтеротест II" фирмы "Lachema".

Серотипирование полученных культур проводили в РА лри помощи коммерческих поливалентной и моноваленгных псевдотуберкулезных сывороток производства Российского НИПЧИ "Микроб",

* Эта часть работы выполнена в отделе диагностических препаратов РосНИПЧИ "Микроб" (заведующая Аленкина Т.В.).

а также кишечноиерсиниозных сывороток, полученных из Рос-товского-на-Дону НИПЧИ от Гурлевой Г.Г. и от Гефан Н.Г. из Иркутского НИПЧИ, которым автор приносит свою благодарность.

На первом этапе было проведено серологическое обследование различных видов животных на иерсиниоз и псевдотуберкулез. Для этого применялась РА. Диагностическими титрами для крупного рогатого скота считали 1:200, а для свиней 1:100. Результаты отражены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Результаты обследования сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации с иерсиниозными антигенами

Иерсини- оэные диагности- кумы сероваров Вид животных Количество сывороток Реагировало в титрах

1:25 1:50 1:100 1:200 1:400

0 : 3 крупный рогатый скот 84 71 (84%) 63 (75%) 31 (36,9%) 4 (4,8%) —

свиньи 48 — — — — —

лошади 15 — — — — —

0 : 5,27 крупный рогатый скот 84 76 (90%) 69 (82%) 52 (62%) 22 (26%) 2 (2,4%)

свиньи 48 43 (89,5%) 41 (85%) 21 (44%) 11 (23%) 3 (6%)

лошади 15 12 (80%) 10 (67%) 3 (20%) —

0 : 9 крупный рогатый скот 84 78 (93%) 61 (73%) 50 (60%) 31 (37%) 22 (26%)

свиньи 48 47 (98%) 47 (98%) 47 (98%) 4 (8,3%) 37 (77%)

лошади 15 15 15 13 (87%) 10 (67%) 7 (47%)

Примечание: "—" — отрицательный результат.

Таблица 2

Результаты обследования сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации с псевдотуберкулезными антигенами

Псевдо туберк. диагно- стикумы сероваров Вид животных Количество сывороток Реагировало в титрах

1:25 1:50 1:100 1:200 1:400

I крупный рогатый скот 84 34 (40,4%) 34 (40,4%) 34 (40,4%) 34 (40,4%) 25 (30%)

свиньи 48 36 (75%) 36 (75%) 27 (56,2%) 15 (31,3%) 12 (25%)

лошади 15 2 (13%) 1 (6,7%) 1 (6,7%) 1 (6,7%) —

III крупный рогатый скот 84 30 (36%) 23 (27%) 18 (21%) 13 (15%) 9 (11%)

свиньи 48 10 (21%) 10 (21%) 6 (12,5%) 6 (12,5%) 3 (6,2%)

лошади 15 — — — —

Примечание: "—" — отрицательный результат.

Как видно из таблицы 1 у крупного рогатого скота антитела к антигенам разных сероваров Y.enterocoliticä в диагностических титрах регистрировались довольно часто — 4,8% — 37%, у свиней — в 44% — 98%, у лошадей в 67% случаев. В то же время у свиней антител к антигену серовара 0:3, а у лошадей антител к антигенам 0:3 и 0:5,27 в диагностических титрах обнаружено не было.

Антитела к антигенам Y.pseudotuberculosis у крупного рогатого скота в диагностических титрах обнаруживались в 15% — 40,4%, у свиней в 12,5% — 56,2%, у лошадей — в 6,7%. Однако у лошадей антител к антигену Y.pseudotuberculosis III серовара выявлено не было (таблица 2).

Если даже учесть, что антигены Y.enterocoliticä 0:9 и Y.pseudotuberculosis I серовара дают перекрестные реакции с различными гетерогенными микроорганизмами и высокий процент

положительных реакций можно объяснить этим, то и тогда уровень серопозитивных реакций достаточно высок и свидетельствует, по нашему мнению, о том, что среди обследованных животных имелись переболевшие иерсиниозом и псевдотуберкулезом или бактерионосители.

Учитывая результаты серологического обследования, нами было проведено бактериологическое исследование животных по методике ГЛ.Ценевой, результаты которого отражены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты бактериологического обследования сельскохозяйственных животных в Саратовской области на кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез

Название хозяйств Количество Выделено Процент

обследованных штаммов инфициро-

животных иерсиний ванности

1. "Нитрон-Агро"

Саратовский район 60 свиней — —

2. ОПХ "Кристалл" 4 штамма

Саратовский район 120 свиней У.еп1егосоШ1са 3,33%

3. ОПХ "Трудовое"

Марксовский район 136 свиней 4 штамма

4. "Розовое" У.еп1егосо1Шса 2,95%

Советский район 200 свиней — —

5. Совхоз

"Симоновский"

Калининский район 20 свиней

6. ТОО им. Чапаева

Петровский район 20 свиней — —

7. Подсобное хозяй-

ство СПОГА-2 74 свиньи 3 штамма

Саратовский район У.еШегосоИНса 4,05%

8. ТОО "Безымянское"

Энгельский район 40 свиней — —

9. "Пробуждение" 80 голов круп- 4 штамма

Энгельский район ного рог. скота У.еп1его соШка 5%

2 штамма

У.рзеи<1ошЬегси1оз1з 2,5%

Всего: 750 17 2,27%

Примечание: "—" — культуры не выделены. Таким образом, всего было обследовано 670 голов свиней и 80 голов крупного рогатого скота. В результате в хозяйствах Сара-

говского, Энгельсского, Марксовского районов бьшо изолировано 15 штаммов У.еШегосоНиса и 2 штамма У.р5еис1о1иЬегс111о518.

Из 15 штаммов У.еШегосо1Шса 3 бьшо изолировано от павших поросят (из заглоточных лимфатических узлов), 4 штамма — из мо-гока, в том числе 2 — от коров, больных субклиническим маститом, а остальные 8 штаммов — из фекалий поросят с признаками диареи. Штаммы У.рзеисЫиЬегаЛоБИ были выделены из молока.

Полученные данные свидетельствуют, что процент инфици-розанности в этих хозяйствах составляет 2,5 — 5%, а с учетом зсего исследованного по области поголовья 2,27%.

Результаты изучения основных свойств выделенных штаммов

Таблица 4

Свойства выделенных от сельскохозяйственных животных штаммов У. еп1егосо1Шса

Штаммы Морфология Маннит А с*> о в- 3 я га Ё ю о, о н 5 п о X « г> о и 2 ч § X Подвижность енилаланинов. тест я е ч о о. о ч о п о &

и с; о н и я 22С 37С е >> о

27/127' грамотрица-тельные палочки и кок-кобактерии К к к к + +

24/124' ... К к — к — к — + — — + —

22' ___ к к _ _ _ к _ + .— _ + _

138' --- к к — — — к — + — — + —

962 ... к к — к к к + + — — + —

49* ... к к — к к к + + — — + —

43! ... к к — к к к + + — — + —

531 ... к к — к — к — + — — + —

58/158' ... к к — к к к — + — — + —

60/160' ... к к — к — к — + — — + —

12/112' ... к к — к — к + + — — + —

48' ... к к — к — к + + — — + —

354 ... к к — к _ к + + — — + —

754 ... к к — — к + + — — + —

50« ... к к — к — к + + — — + —

Обозначения: "К" — образование кислоты;

"—" — отрицательный результат;

"+" — положительный результат.

Примечание:

1 — штаммы, выделенные в ОПХ "Трудовое" Марксовского района;

2 — штаммы, выделенные в ОПХ "Кристалл" Саратовского района;

3 — штаммы, выделенные в подсобном хозяйстве СПОГА-2 Саратовского района;

4 — штаммы, выделенные в ТОО "Пробуждение" Энгельского района.

В мазках из выделенных культур обнаруживались грамотрица-тельные палочки средней величины или коккобактерии. Все штаммы сбраживали с образованием кислоты маннит, сахарозу, глюкозу, образовывали уреазу, были подвижны при 22°С и неподвижны при 37°С, сероводород не образовывали, фенилаланиновый тест был отрицателен. -Большинство штаммов сбраживало с образова нием кислоты сорбит, за исключением трех культур. Что касается инозита, то лишь 4 штамма разлагали его с образованием кислоты, остальные 11 штаммов его не разлагали. Индол образовывали 8 штаммов, а 7 культур дали отрицательный результат.

Таким образом, все выделенные штаммы обладали типичными для У.етегосо1Шса свойствами.

Оба выделенных штамма У.р5еис1о1иЬегси1о518 разлагали с образованием кислоты маннит, инозит, глюкозу, обладали уреаз-ной активностью, были подвижны при 22°С и неподвижны при 37°С, не сбраживали сахарозу, лактозу, сорбит; индол и сероводород не выделяли, фенилаланиновый тест отрицателен, проба с псевдотуберкулезным фагом была положительна.

Таким образом, эти штаммы обладали типичными для псевдотуберкулезного микроба свойствами.

Результаты серотипирования. Из 15 штаммов У.етегосо1Шса 11 относились к серовару 0:3, один штамм к серовару 0:6,30 и кроме того, три культуры агглютинировались только поливалентной иерсиниозной сывороткой, то есть были отнесены к У.етегосо1Шса, но их серотип не был точно определен.

Оба штамма У.рзеис1оЦ1Ьегси1о515 принадлежали к I серовару.

Определение вирулентности. При определении вирулентности оказалось, что 11 из 15 изученных штаммов У.е>иегосо1Шса агглютинировались СВИ, образовывали пигментированные колонии на агаре Хоттингера с конго-рот, были кальцийзависимыми на

среде Хигучи-Смита, а также обладали температурозависимой морфологией колоний и аутоагглютинацией. Иными словами по совокупности современных методов они являлись вирулентными. Четыре штамма (96, 43, 53, 49) оказались невирулентными по всем перечисленным тестам, за исключением температурозависимой морфологии колоний.

Большинство из указанных 11 штаммов были изолированы либо от павших поросят (27/127, 22, 138), либо от животных с клиническими проявлениями болезни (24/124, 60/160, 58/158, 12/112).

Использование РКОА для обнаружения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза у сельскохозяйственных животных

Используемый в настоящее время для диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза бактериологический метод длителен (до 3-х недель) и малоинформативен. Учитывая то, что в литературе есть упоминания о применении РКОА для обследования материала от людей (Николаева Л.Г. и соавт., 1989; Белая О.Ф. и соавт., 1990; Ценева Г.Я., 1992; 1997) было решено применить эту реакцию для диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сельскохозяйственных животных. Диагностикумы для этих целей использовали как коммерческие, так и экспериментальные. Для проверки специфичности КОА-диагностикумов были использованы музейные штаммы гетерогенных микроорганизмов (таблица 5).

Таким образом, испытанные коагглютинационные диагностикумы оказались специфичны. Они выявляли только иерсинии соответствующих сероваров и не взаимодействовали с гетерогенными микроорганизмами: сальмонеллами, эшерихиями, протеем и синегнойной палочкой. Поливалентные иерсиниозные диагностикумы также были группоспецифичны.

Для проверки чувствительности РКОА ставилась с различными концентрациями микробных взвесей, которые предварительно прогревали при Ю0°С в течение 30 минут.

Чувствительность кишечноиерсиниозных и псевдотуберкулезных диагностикумов составляет 5x107 — 1x10® мт./мл. Поливалентные диагностикумы были несколько менее чувствительны 5x10' — 1x10' мт./мл.

Таблица 5

Испытание специфичности диагностикумов для РКОА

N. Испытуемые штаммы Диагностикум N. S.pullorum S. dublin S.thyphymurium E. coli Pr. vulgaris Ps. aeroginosa Y. enterocolitica 0:3 Y. enterocolitica 0:6,30 Y. enterocolitica 0:9 Y. pseudotuberculosis I Y. pseudotuberculosis III

Y.enterocolitica 0:3 — — — — — — # — — — —

Y.enterocolitica 0:6,30 #

Y.enterocolitica 0:9 #

Y.enterocolitica полива-

лентный # # # — —

Y.pseudotuberculosis I # —

Y.pseudotuberculosis III #

Y.pseudotuberculosis

поливалентный # #

Полученные результаты свидетельствуют, что исследование на-тивного материала (молоко, копрофильтрат, секционный материал и др.) после его соответствующей обработки может быть успешным только при достаточно высокой микробной обсеменен-ности, что может наблюдаться лишь при ярко выраженном клиническом проявлении болезни. Однако кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез у сельскохозяйственных животных нередко протекает в форме носительства. Поэтому с целью увеличения концентрации микробных клеток нами было использовано подращивание материала на различных средах накопления: ФБР, БКД, 1% ЗПВ, ТСФС, 1% пептонная вода с добавлением КгНР04.

Оказалось, что наиболее подходящими средами накопления для после-дующей постановки РКОА являются БКД и ТСФС.

При исследовании искусственно обсемененных копрофильт-ратов и молока на средах БКД и ТСФС выяснилось, что даже при малых контаминирующих дозах (1х102 — 1x10' мт./мл и 1х103 — 1 х 104 мт./мл соответственно) уже через 8-10 суток в РКОА закономерно обнаруживали иерсиниозные и псевдотуберкулезные антигены. Увеличение заражающей дозы до 1хЮ4 — 1хЮ7 мт./мл

приводит к сокращению времени анализа до 2 — 5 суток. Разницы между чувствительностью коммерческих и экспериментальных коагглютинационных диагностикумов отмечено не было.

Апробировали РКОА для обнаружения иерсиний в молоке, фекалиях, патологическом материале от сельскохозяйственных животных. Параллельно проводили и бактериологическое обследование (таблица 6).

Таблица б

Результаты обследования сельскохозяйственных животных в Саратовской области на кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез при помощи РКОА и бактериологического исследования в 1997—1999 годах

Исследовано животных Выделено штаммов бактериологически % выделения Неточность при р = 0.95 Положительные в РКОА (со сред, накопления) % Неточность при р = 0.95

74 гол. Свиней 3 штамма У.еШегосо1Шса: 60/160; 58/158; 12/112 4,05% 4,4 5 положительных РКОА с диагнос-тикумон У.еп1егосо1Шса 0:3 6,7% 5,7

80 гол. Крупного рогатого скота 4 штамма У.егПегосоНИса: 48,35; 75,50 5% 4,75 3 положительных РКОА с диагнос-тикумом У.еШегосо1Шса 0:3 4,2% 4,4

2 штамма У.рзеиёоШЬег-сЫсшб I 2,5% 3,4 2 положительных РКОА с диагнос-тикумом У.рзешкЛиЬегси-1о$1з I 2,5% 3,4

154 гол. 9 штаммов 5,8%

Как следует из таблицы 6, при исследовании материала от свиней в РКОА было получено 5 положительных результатов (6,7%), причем в 3-х случаях получено бактериологическое под-

тверждение (4,05%). В 2-х случаях положительную РКОА бактериологически подтвердить не удалось.

При исследовании молока положительная РКОА была в 3-х случаях. Бактериологически было выделено 4 штамма, в том числе и в тех случаях, в которых РКОА оказалась позитивной.

Что касается У.р$еш1ошЬегси1о5ц, то РКОА была положительна в 2-х случаях и в обоих было бактериологическое подтверждение.

Таким образом, результаты бактериологического метода и РКОА практически совпадают (таблица 7).

Таблица 7

Сравнение результатов бактериологического метода и РКОА (в %)

—^Метод Вид животных"-\^ РКОА Бактериологический метод

Свиньи 6.7% 4.05%

Крупный рогатый скот Y.enterocolitica 4.2% Y.pseudotuberculosis 2.5% 5% 2.5%

Таблица 8

Экономическая эффективность бактериологического анализа на иерсиниозы и РКОА

Сроки исследования Стоимость 100 анализов

Бактериологический метод РКОА Бактериологический метод РКОА

I 2 3 4

14-17 дней 3-5 дней I. Питательные среды 1. Среда Эндо - 44 руб 2. Питательный бульон -2 руб 3. Мясо-пептонный агар -23 руб 4.Среды Гисса: лактоза глюкоза сахароза 32 руб маннит мальтоза J Итого: 101 руб I. Ингридиенты 1. Стафилококковый реагент, содержащий белок А, сухой, 1 флакон - 20 руб Из 1 флакона получается 10 мл диагно-сгикума, что хватает на 250 анализов, то есть стоимость 100 анализов — 8 руб II. Зарплата врача-бакгериолога

Продолжение таблицы 8

1 2 3 4

II. Зарплата врача-бактериолога За 24 дня 600 руб, за 1 день: 600:24 = 25 руб Средняя продолжительность исследования 15 дней: 15x25 =375 руб Итого: 101+375 = 476 руб В среднем на постановку диагноза уходит 4 дня: 25x4 =100 руб Итого: 100 + 8 =108 руб

Очень важно, что РКОА позволяет поставить диагноз в более ранние сроки и с меньшими затратами (таблица 8).

При экономическом анализе оказалось, что затраты на проведение анализа на кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез с помощью РКОА в 4,4 раза ниже, чем при бактериологическом методе.

В отделе дигностических препаратов Российского НИПЧИ "Микроб" совместно с Т.В.Аленкиной были приготовлены кишеч-ноиерсиниозные иммунопероксидазные конъюгаты, установленная активность которых была — 1:256.

ВЫВОДЫ

1. С помощью серологических и бактериологических методов впервые доказано существование в Саратовской области кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

2. При серологическом исследовании 84 голов крупного рогатого скота, 48 голов свиней, 15 голов лошадей выявлена положительная РА в диагностических титрах у крупного рогатого скота 4,8 — 37% случаев, у свиней — 44-98% случаев, у лошадей — 6,7— 67% случаев.

3. С антигеном У.еШегосо1Шса 0:3 реагировало в диагностических титрах 4,8% голов крупного рогатого скота. Среди свиней и лошадей положительно реагирующих с данным сероваром не было. С антигеном У.етегосо1Шса 0:5,27 в диагностических титрах положительно реагировали 26% голов крупного рогатого скота, 44% голов свиней. С антигеном У.егиегосо1Шса 0:9 в диагностических титрах реагировало 37% голов крупного рогатого скота, 98% голов свиней, 6,7% голов лошадей.

4. С антигеном У.р8еиёо1иЬегси1о515 I серовара положительно реагировало в диагностических титрах 40,4% голов крупного рогатого скота, 56,2% голов свиней, 6,7% голов лошадей. С антиге-

ном Y.pseudotuberculosis III серовара в диагностических титрах реагировало 15,5% голов крупного рогатого скота, 12,5% голов свиней.

5. При бактериологическом обследовании 670 голов свиней и 80 голов крупного рогатого скота выделено 17 штаммов иерси-ний, в том числе 15 штаммов Y.enterocolitica, 11 из которых оказались вирулентными.Изолировано также 2 штамма Y.pseudotuberculosis.

6. Экспериментально получен коагглютинационный кишеч-ноиерсиниозный диагностикум, который был применен совместно с коммерческим препаратом для диагностики этой инфекции. При исследовании 80 проб молока и 74 проб фекалий в реакции коагглютинации кишечноиерсиниозный антиген обнаруживался в 2,5% — 6,7% случаев.

7. Использование коагглютинационного диагностик ума позволило сократить время проведения анализа с 13 —15 суток до 3— 5 суток и в 4,4 раза удешевить стоимость анализа.

8. Для подращивания кыпечных иерсиний с целью повышения их концентрации и последующего применения РКОА особенно рекомендуются следующие среды: буферно-казеиновая дрожжевая среда и таурохолат-сорбитол-фосфатная среда.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хапцев З.Ю.

Приготовление специфического диагностикума для реакции коагглютинации с целью выявления антигена псевдотуберкулеза.// Тезисы докладов научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых биотехнологического факультета СГАВМиБ — Саратов, 1997. — вып. 1. — С. 25 — 26.

2. Зыкин Л.Ф., Собакин A.C., Оркин В.Ф., Хапцев З.Ю.

Доказательства существования кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сельскохозяйственных животных в Саратовской области.// Сборник материалов научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России. — Саратов — 1997. — С. 49 — 50.

3. Хапцев З.Ю., Гефан Н.Г., Собакин A.C., Анников В.В.

Приготовление агглютинирующих сывороток для идентификации и типирования Yersinia enterocolitica.// Сборник "Проблемы общей биологии и прикладной экологии". — Саратов — 1997. — С. 14 — 15.

4. Хапцев З.Ю.

О возможности повышения чувствительности реакции коаг-нютинации при диагностике кишечного иерсиниоза сельскохо-айственных животных.// Тезисы докладов научной конференции гуденгов, молодых ученых и аспирантов биотехнологического фа-ультета СГАВМиБ. — Саратов — 1998. — вып. 2. — С. 40 — 41.

5. Собакин A.C., Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю., Оркин В.Ф.

Выявление кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза у жи-

отных.// Ветеринария 1998. — № 8. — С. 15 — 16.

6. Зыкин Л.Ф., Оркин В.Ф., Щербаков A.A., Иващенко C.B., [апцев З.Ю.

Распространение иерсиниозов сельскохозяйственных живот-ых в Саратовской области.// Сборник материалов Международ-ой научно-производственной конференции, посвященной 100-етию со дня рождения члена-корреспондента ВАСХНИЛ В.Т.Ко-ова "Экологические аспекты эпизоотологии и патологии живот-ых". — Воронеж — 1999. — С. 22 — 24.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хапцев, Заур Юрьевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Биологические свойства Y.enterocolitica.

1.2. Эпидемиология кишечного иерсиниоза.

1.3. Клинические признаки у людей.

1.4. Эпизоотология.

1.5. Клинические признаки кишечного иерсиниоза у животных.

1.6. Кишечный иерсиниоз как сапроноз.

1.7. Состояние лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза.

Глава 2. Собственные исследования. Материалы и методы.

2.1. Серологический метод.

2.3. Бактериологический метод.

2.3. Определение вирулентности выделенных штаммов.

2.4. Коммерческие препараты.

2.5. Получение гипериммунных сывороток.

2.6. Приготовление антигена для РА.

2.7. Технология приготовления носителя и специфического диагностикума для РКОА.

2.8. Приготовление иммунопероксидазных конъюгатов для ИФА.

2.9. Статистическая обработка данных.

Результаты исследований

Глава 3. Обнаружение возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза у сельскохозяйственных животных в Саратовской области

3.1. Изучение музейных штаммов.

3.2. Результаты серологического исследования.

3.3. Результаты бактериологического исследования.

3.4. Определение вирулентности выделенных штаммов Y.enterocolitica.

3.5. Определение чувствительности выделенных штаммов Y.enterocolitica к антибиотикам.

Глава 4. Использование РКОА для обнаружения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза у сельскохозяйственных животных.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных"

Кишечный иерсиниоз — острое инфекционное заболевание, протекающее с полиморфной клинической картиной. Часто эта инфекция протекает как острое кишечное заболевание, клинически проявляющееся синдромом гастроэнтерита. Установлены и другие формы инфекции: с поражением печени, суставов, различными кожными высыпаниями. Описаны септические формы заболевания, а также регистрируемые под диагнозом "аппендицит".

Кишечный иерсиниоз относится к числу относительно новых инфекционных болезней, которые особенно интенсивно начали изучать за последние 25-30 лет. Эта болезнь относится к пищевым зоонозам, т.е. к болезням, источником инфекции при которых являются больные дикие, сельскохозяйственные, домашние животные, а факторами передачи - продукты питания: молоко, мясо, овощи и фрукты.

По данным экспертов ВОЗ, эта проблема имеет глобальный характер (Хроника ВОЗ, 1977). Особенно широко кишечный иерсиниоз выявляют в Скандинавии, Чехии, Словакии, Венгрии, Франции, Румынии (Королюк A.M., 1978). В некоторых странах роль Y.enterocolitica в возникновении гастроэнтеритов превосходит количество заболеваний, обусловленных Shigella, Salmonella, Campylobacter (Шумилов К.В. и соавт., 1998) и поэтому иногда Y.enterocolitica называют патогенной бактерией 80-х гг. (Garrigue G. et al., 1993). Б.Л.Черкасский и соавт. (1995) указывают, что по уровню заболеваемости иерсиниоз находится в России на втором месте после сальмонеллеза.

Что касается ветеринарного аспекта, то проблема кишечного иерсиниоза изучена недостаточно (Куликовский А.В. и соавт., 1993). Это связано с тем, что исследования на кишечный иерсиниоз животных до последнего времени не проводились вообще и лишь в 1996 г. эта инфекция была включена в перечень Санитарных правил (СП 3.1.084 - 96) и Ветеринарных правил (ВП 13.3.4.1100

96) как обязательная для регистрации ветеринарной службой России. В странах, где эта болезнь у животных регистрировалась, было установлено, что иерсини-оз нередко поражает свиней, крупный рогатый скот, овец и других животных (Павлов А. и соавт., 1988 г.; Стефанов И., 1989; Стефанов И. и соавт., 1990; Fukushima S. et al., 1990; Jakubczak A. et al., 1993).

Особенностью бактериологической диагностики этой инфекции является ее длительность (до трех недель), трудоемкость и низкая чувствительность методов обнаружения возбудителя (Белая Ю.А. и соавт., 1991). Поэтому особое значение приобретают быстрые, чувствительные и надежные методы лабораторной диагностики - реакция коагглютинации, иммуноферментный анализ, реакция агглютинации латекса, реакция непрямой агглютинации, метод флюоресцирующих антител, полимеразная цепная реакция, метод ДНК-ДНК-зондов.

Не менее актуальна эта проблема и для ветеринарии, так как сельскохозяйственные животные являются одним из основных источников заражения людей кишечным иерсиниозом.

Цель работы

Целью нашей работы явилось изучение распространения возбудителя кишечного иерсиниоза среди сельскохозяйственных животных в Саратовской области, а также возможности использования экспресс-метода лабораторной диагностики этой инфекции у животных на основе использования реакции коагглютинации.

Основные задачи

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих конкретных задач:

1. Доказать существование кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных в Саратовской области.

2. Изучить возможность применения РКОА в сочетании с бактериологическим методом для диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

3. Дать сравнительную оценку эффективности бактериологической диагностики кишечного иерсиниоза и РКОА.

Научная новизна

Впервые с помощью серологического и бактериологического методов доказано существование в Саратовской области кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

Применена реакция коагглютинации для обнаружения антигенов Y.enterocolitica в фекалиях, молоке больных животных и бактерионосителей, а также а патологическом материале. Доказана целесообразность применения реакции коагглютинации для экспресс-диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

Практическая ценность работы

Получены кишечноиерсиниозные и псевдотуберкулезные поливалентные и моновалентные диагностикумы для постановки РКОА с копрофильтратом, молоком, патологическим материалом. Для экспресс-диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных рекомендуется реакция коагглютинации в сочетании с Холодовым обогащением на жидких средах накопления (бу-ферно-казеиново-дрожжевая среда и таурохолат-сорбитол-фосфатная среда), примененная совместно с бактериологическим методом и позволяющая в 3-4 раза сократить время исследования и в 4,4 раза удешевить анализ. Определены диагностические возможности РКОА при обнаружении антигенов иерсиний. Проготовлены также иммунопероксидазные кишечноиерсиниозные конъюгаты для иммуноферментного метода.

На защиту выносятся следующие положения:

•1. Распространение кишечного иерсиниоза животных в Саратовской области.

2. Выбор оптимальных сред для холодового обогащения при исследовании на иерсиниоз.

3. Применение РКОА для прижизненной и посмертной экспресс-диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И.Вавилова в соответствии с планом НИР федеральной программы "Ветеринарное благополучие", утвержденной МСХиП Российской Федерации.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на:

• Научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученных биотехнологического факультета Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии "Актуальные проблемы зооинженерии и биотехнологии", Саратов (1997; 1998 гг.).

• Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной системы России, Саратов, 1997 г.

Материалы диссертации представлены в отчетах о научно исследовательской работе: "Усовершенствование лабораторной диагностики пищевых зооно-зов" и "Сравнительная оценка эффективности лабораторных методов диагностики кишечного иерсиниоза, псевдотуберкулеза и листериоза". 9

Внедрения

По результатам исследований в 1997 году подготовлены "Методические рекомендации по лабораторной диагностике кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сельскохозяйственных животных", утвержденные Ученым Советом СГАВМиБ (протокол N 13 от 28 января 1997 года).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Хапцев, Заур Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. С помощью серологического и бактериологического методов впервые доказано существование в Саратовской области кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.

2. При серологическом исследовании 84 голов крупного рогатого скота, 48 голов свиней, 15 голов лошадей выявлена положительная РА в диагностических титрах у крупного рогатого скота 4.8-37% случаев, у свиней - 44-98% случаев, у лошадей - 6,7 - 67% случаев.

3. С антигеном Y.enterocolitica 0:3 реагировало в диагностических титрах 4.8% голов крупного рогатого скота. Среди свиней и лошадей положительно реагирующих с данным сероваром не было. С антигеном Y.enterocolitica 0:5,27 в диагностических титрах положительно реагировали 26% голов крупного рогатого скота, 44% голов свиней. С антигеном Y.enterocolitica 0:9 в диагностических титрах реагировало 37% голов крупного рогатого скота, 98% голов свиней, 6.7% голов лошадей.

4. С антигеном Y.pseudotuberculosis I серовара положительно реагировало в диагностических титрах 40.4% голов крупного рогатого скота, 56.2% голов свиней, 6.7% голов лошадей. С антигеном Y.pseudotuberculosis Ш серовара в диагностических титрах реагировало 15.5% голов крупного рогатого скота, 12.5% голов свиней.

5. При бактериологическом обследовании 670 голов свиней и 80 голов крупного рогатого скота выделено 17 штаммов иерсиний, в том числе 15 штаммов Y.enterocolitica и 2 штамма Y.pseudotuberculosis.

6. Экспериментально получен коагглютинационный кишечноиерсиниозный диагностикум, который был применен совместно с коммерческим препаратом для диагностики этой инфекции. При исследовании 80 проб молока и 74 проб фекалий в реакции коагглютинации кишечноиерсиниозный антиген обнаруживался в молоке в 2.5% - 4,2%, в фекалиях - в 6.7% случаев.

7. Использование коагглютинационного диагностикума позволило сократить время проведения анализа с 13-15 суток до 3-5 суток и в 4.4 раза удешевить стоимость анализа.

8. Для подращивания кишечных иерсиний с целью повышения их концентрации и последующего применения РКОА особенно рекомендуются следующие среды: бу-ферно-казеиновая дрожжевая среда и таурохолат-сорбитол-фосфатная среда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных работ разработаны и утверждены Ученым Советом Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии "Методические рекомендации для лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сельскохозяйственных животных" (протокол № 13 от 28 января 1997 года).

Данные Методические рекомендации представлены в головной Всероссийский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН для включения в готовящуюся инструкцию по диагностике кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза сельскохозяйственных животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хапцев, Заур Юрьевич, Саратов

1. Ахмедов Р.А. Кишечный иерсиниоз как природноочаговое заболевание// Тезисы докладов научной конференции «Современные аспекты профилактики зоонозныхинфекций», Ставрополь, 1991.-С.156-158;

2. Балахонов С.В., Миронова А.П. Идентификация штаммов новых видов иерсиний методом молекулярной ДНК-ДНК гибридизации// В сб. Совершенствование методов диагностики и профилактики чумы и холеры. Саратов, 1987.-С. 29-33;

3. Балахонов С.В. Использование ПЦР для обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний// Журнал инфекционной патологии. 1993. - Том 3, № 2-С. 8-11.

4. Барков А.В., Ленченко Е.М. Патогенные и вирулентные свойства иерсиний// Ветеринария. 1997. - № 10. - С. 20-23.

5. Белая О.Ф., Черкасов B.JL, Белая Ю.А. и др. Реакция коагглютинации при кишечных инфекционных заболеваниях// Методические рекомендации М., 1990. - 12 с.

6. Белая Ю.А. Реакция коагглютинации чувствительный экспресс-метод индикации антигенов и токсинов возбудителей кишечных и других инфекционных заболеваний// Новое в практике лабораторных исследований. - Горький, 1987. - С. 66-69;

7. Вяльба Е.В., Ющук Н.Д., Белая Ю.А. Определение антигенов иерсиний в биологических субстратах при иерсиниозе у взрослых// Советская медицина. 1989. - № 4 - С. 96-97.

8. Гефан Н.Г. Приготовление и использование агглютинирующих сывороток для идентификации и типирования Y.enterocolitica// Автореф. дисс. канд. мед. наук Саратов, 1996. - 19 с.

9. Гордейко В.А., Воронцова Т.А., Литвин В.Ю. Сероэпидемиологическое изучение кишечного иерсиниоза у работников свинокомплексов// ЖМЭИ.1990.-№3.-С. 111-112.

10. Гордейко В.А., Литвин В.Ю., Шустрова И.М. Иерсинии в почве полей, орошаемых сточными водами свинокомплекса//Гигиена и санитария. 1991. - № 1.-С. 28-30.

11. Гречищева Т.С. Кишечные иерсиниозы (псевдотуберкулез и иерсиниоз) у людей в Егорьевском районе Московской области// Актуальные вопросы инфекционной патологии. Саратов, 1981. - С. 46-48;

12. Гукасян Г.Б., Хачатрян Т.С., Алексанян М.А. Обсемененность иерсиниями сырого молока и молочного порошка// Актуальные вопросы краевой инфекционной патологии. Ереван. 1988. - выпуск VIII - С. 36-37;

13. Гурлева Г.Г. Упрощенный способ определения серологических вариантов Y.enterocolitica// Лабораторное дело. 1989 - № 7 - С. 70-72.I

14. Гурлева Г.Г., Халяпина Е.Е., Смолякова Л.М. и др. Коагглютинирующие диагностикумы для серологической идентификации Yersinia enterocolitica// Лабораторное дело. 1989 - № 10 - С. 66-69.

15. Дайтер А.Б., Полоцкий Ю.Е., Ценева Г.Я. Патогенные свойства иерсиний и их роль в патологии иерсиниозов// ЖМЭИ. 1987. - № 3 - С. 108-115.

16. Джангалина Н.К., Толстов К.Г. Использование некоторых стимуляторов роста в бактериологической диагностике иерсиниозов// Лабораторное дело.1991. -№3 -С. 75-77.

17. Дмитровский JI.M., Довгаль Г.Д. Заболевания, вызванные Y.enterocolitica у сельскохозяйственных животных// Проблемы инфекционных болезней. Алма-Ата- 1989. - С. 79-82;

18. Дранкин Д.И., Гельдыев А.Г., Хотько Н.И. Вода и инфекция Ашгабад:, Мирап, 1994. - 67 с.

19. Дунаев В.И., Амиркулов А.И. Антигенное родство Yersinia enterocolitica с родом Brucella// Актуальные вопросы инфекционной патологии. Саратов -1981.-С. 58-60;

20. Иерсиниозы// Санитарные правила СП 3.1.094-96, Ветеринарные правила ВП 13.3.13.18-96.-М.,- 2996.

21. Климанова Е.М., Белая О.Ф., Лаврова К.В., Белая Ю.А. Использование реакции коагглютинации в диагностике иерсиниоза у детей// Педиатрия. 1993. -№ 4 - С. 48-49.

22. Климанова Е.М., Лаврова К.В. Сравнительный анализ доступных методов диагностики иерсиниозов у детей// Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М:. - 1997 - С. 451.

23. Колос Е.Н., Тутов Н.Н., Ющенко Г.В., Дунаев В.И. Сельскохозяйственных животных как источник иерсиниоза// ЖМЭИ. 1985. - № 4 - С. 77-79.

24. Королюк A.M. Микробиологическая диагностика кишечного иерсиниоза// Военно-медицинский журнал. 1978. - № 6. - С. 48-52

25. Королюк A.M., Стрелкова М.Р., Авраменко B.C. Диагностичекое значение бактериологического и серологического исследований при выявлении кишечного иерсиниоза у детей// ЖМЭИ. 1980. - № 6. - С. 19-22.

26. Королюк A.M. Применение реакции коагглютинации для обнаружения и быстрой идентификации возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза// Лабораторное дело. 1984. - № 4 - С. 250-252.

27. Королюк A.M., Головачева С.Н., ДулатоваМ.В. Серологическая диагностика кишечного иерсиниоза. Конструирование стабильного эритроцитарного препарата для реакции непрямой гемагглютинации// ЖМЭИ. 1989. - № 3 - С.30-34.

28. Королюк A.M., Михайлов Н.В., Мирошниченко И.В. Диагностическая ценность ПЦР при иерсиниозах// Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М:. - 1997 - С. 380-381.

29. Костюкова Н.Н., Точилкина М.Х., Звягина И.Б. Реакция коагглютинации и ее применение с целью экспресс-диагностики менингококкового менингита// ЖМЭИ. 1981.-№ 3. - С. 62-66.

30. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии М:, Высшая школа, 1980.-272 с.

31. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Пастеризованное молоко как фактор передачи возбудителей иерсиниозов// ЖМЭИ. 1992. - № 4. - С. 22-26.

32. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н., Клименко В.В. Роль рефрижераторов в распространении бактерий рода Yersinia// Гигиена и санитария 1992. - № 2. - С. 43-46.

33. Ленченко Е.М., Штукарева М.Ю. Сравнительная оценка трех методов выделения иерсиний из пищевых продуктов// Материалы Международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек», М:. 1995. - С. 215;

34. Литвин В.Ю. Сапрофитическая фаза в экологии возбудителей инфекционных заболеваний// ЖМЭИ. 1985. - № 6. - С. 98-101;

35. Литвин В.Ю. Эколого-эпидемиологические аспекты случайного паразитизма некоторых патогенных бактерий// ЖМЭИ. 1986. - № 1. - С. 85-91.

36. Литвин В.Ю., Шустрова Н.М., Гордейко В.А. Экспериментальное изучение иерсиний в растениях// ЖМЭИ. 1991. - № 9. - С. 5-7.

37. Марков И.С., Ткаченко В.И., Симен Д.Д. Вспышки псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза среди советских специалистов и членов их семей в Монгольской Народной Республике// ЖМЭИ. 1989. - № 8. - С. 43-49.

38. Митрикова Л.А., Ценева Г.Я., Куляшова Л.Б. и др Распространенность иерсиний и их серологические варианты у больных острыми кишечными заболеваниями неустановленной этиологии в Ленинграде// ЖМЭИ. 1989. - № 8. -С. 17-20.

39. Писаренко Н.И., Куцевалов С.И., Проценко С.Л. Характеристика иерсиний, выделенных от овец//Ветеринария. 1990. - №2. - С. 43-46.

40. Распространение инфекций, вызываемых Yersinia enterocolitica// Хроника ВОЗ, 1977. Т. 31: № 4 - С. 216-218;

41. Руководство по профилактике чумы // Под ред. А.В.Наумова и Л.В.Самойловой. Саратов, 1996. - 278 с.

42. Сепетлиев Д. Статистические методы в научных медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1968. - 420 с.

43. Смирнов И.В., Горохов В.И. Диагностическая сыворотка с антителами к вирулентным иерсиниям// Лабораторное дело. 1990. - № 10. - С. 66-68.

44. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Актуальные вопросы диагностики иерсиниозов// Тезисы докладов 6-го Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, Нижний Новгород, 1991 М.: 1991. - Т. 1. - С. 132-133.

45. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Культуральные свойства и вирулентность иерсиний// ЖМЭИ. 1991. -№ 9. - С. 13-15.

46. Сомов Г.П. Выделение группы сапрозоонозов// Тезисы докладов XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней, Новосибирск, 10-12 октября 1989. С. 42-44;

47. Сомов Г.П. Особенности экологии внеорганизменных популяций патогенных бактерий и их отражение в эпидемиологии инфекций// ЖМЭИ. 1997. -№5.-С. 7-11.

48. Соколова Е.Е. Совершенствование методов серологической идентификации Y.enterocolitica серовара 0:9 и дифференциальной диагностики антительного ответа при иерсиниозе и бруцеллезе// Автореф. дисс. канд. мед. наук Саратов, 1984. - 20 с.

49. Степанов В.М., Некрасова JI.E., Безрукова Л.С. Особенности чувствительности к антибиотикам культур иерсиний, выделенных из различных объектов// Проблемы инфекционных болезней. Алма-Ата, 1989. - С. 86-90.

50. Сыпченко А.Я., Прокопьева Л.С., Гаранина Е.И. и др. Распространение во внешней среде иерсиний и роль иерсиниоза в кишечной патологии больных// Материалы Международного симпозиума «Пищевые зоонозы». М:, 1995. -С. 73-75.

51. Томэску В., Гаврилэ И., Гаврилэ Д. Зоонозы М:, Колос, 1982. - 319 с.

52. Урбах В.Ю. Биометрические методы М.: Наука, 1964. - 409 с.

53. Хазенсон С.Л., Шимановская А.В., Жебрун А.Б., Носков А.В. Определение оптимальных условий постановки реакции коагглютинации// Лабораторное дело. 1982. - № 12. - С. 39-40.

54. Хазенсон С.Л. Реакция коагглютинации и ее применение для идентификации и обнаружения бактерий, вирусов, растворимых антигенов// ЖМЭИ. 1983. -№2.-С. 8-13.

55. Хачатрян Т.С. Обсемененность овощей иерсиниями в условиях г.Еревана// Актуальные вопросы краевой инфекционной патологии. Ереван, 1988. -ВыпускVIII.-С. 106-107;

56. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез СПб:, 1992. - 60 с.

57. Ценева Г.Я., Мессорош В.Г., Куляшова Л.Б. и др. Эффективность применения питательных сред для выделения иерсиний// Клиническая лабораторная диагностика. 1993. - № 3. - С. 73-74.

58. Ценева Г.Я. Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза -СПб:, 1997. 62 с.

59. Черкасский Б.Л., Подукова Л.Г., Акулова Н.Г. Пищевые зоонозы людей в России// Материалы Международного симпозиума «Пищевые зоонозы». М:, 1995.-С. 18-20;

60. Шпилюк Г.Ф., Головешкина Т.Н., Володина И.К. и др. Иммуноглобулино-вые латексные препараты для экспресс-диагностики иерсиниозов// ЖМЭИ. -1993.-№6.-С. 92-93.

61. Шумилов К.В., Мельниченко Л.П., Селиверстов В.В. Современные данные об иерсиниозе животных// Ветеринария. 1998. - №4. - С. 7-13.

62. Ющенко Г.В. К проблеме острых кишечных инфекций, вызываемых некоторыми условно патогенными микробами// Пищевые токсикоинфекции. Саратов, 1997. - С. 220-225.

63. Ющенко Г.В., Дунаев В.И. Методика выделения и идентификации Yersinia pseudotuberculosis и Y.enterocolitica// Лабораторное дело. 1980. - № 6. - С. 367-370.

64. Ющенко Г.В., Некрасова Л.И. Псевдотуберкулез и иерсиниоз у людей в Архангельске// Актуальные вопросы инфекционной патологии. Саратов, 1981.- С. 54-55.

65. Ющенко Г.В. Род Yersinia// Энтеробактерии: (Руководство для врачей)/ Под ред. В .И.Покровского. М.: Медицина, 1985, - Гл. 3. - С. 220-239.

66. Ющенко Г.В., Дунаев В.И. Новый метод выделения иерсиний от больных и из объектов окружающей среды и сравнительная оценка его с общепринятыми// Вопросы физиологии, метаболизма и идентификации микроорганизмов -М:, 1987. -С. 115-119;

67. ЮО.Ющенко Г.В. Антропогенная трансформация природных очагов иерсинио-зов и особенности эпидемиологии// Тезисы докладов XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней, Новосибирск, 10-12 октября 1989. С. 144-145.

68. Ющенко Г.В. Особенности эпидемиологического процесса при псевдотуберкулезе и иерсиниозе// Материалы VII Съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов М:, 1997. - С. 100-101.

69. Ю2.Ющук Н.Д., Кареткина Г.Н. Иерсиниоз// Советская медицина. 1987. - № 9.- С. 54-58.

70. ЮЗ.Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Вяльба Е.В. Диагностическое значение определения антигенов иерсиний в биологических субстратах больного// Клиническая медицина. 1989. - №7. - С. 77-81.

71. Bisseff Marjorie L., Powers Catherinae, Abboff Sharon L., Janda J. Michael Epidemiologic investigations of Yersinia enterocolitica and related Species: sources fregnency, and serogroup distribution// J. Clen. Microbiol. 1990. Vol. 28, № 5. P. 910-912

72. Юб.Божкова К. Специфични серумни антитела срещу Yersinia enterocolitica се-ротип 0:3 у болни с различна клинична диагноза// Инфектология. 1997. - 34, №3.-С. 14-15.

73. Bodnaruk Peter W., Williams Robert С., Golden David A. Survival of Yersinia enterocolitica during fermentation and storage of yogurt// J. Food. Sci. 1998. -Vol. 63, №3.-C. 535-537.

74. Boer de E., Nows J.F.M., Nijland E., Smulders A.N.S. Varkens (Vlees) als bron van pathogene Yersinia enterocolitica// Tijdschr. Diergenels. 1991. - Vol. 116, № 6. - P. 227-280.

75. Cox P., Rosell R., Gaya A., Prats G. Research note: the presence of Yersinia enterocolitica and other Yersinia species on the carcasses of market broilers// Poultry Sci. 1990. - Vol. 69, № 3. - P. 482-485.

76. Czernomysy-Furowicz Danuta. Fist isolation of Yersinia pseudotuberculosis from foods in Poland// Adv. Agr. Sci. 1996. - Vol. 5, № 1. - P. 25-29.

77. Н.Ефремова А., Куюмджиев Д. Диареен синдром с причинител Yersinia еп-terocolitica изомеран за пръв нът у нас// Епид., микр., инф. болести. 1975. -№ 4. - С. 350-352.

78. Fernandes-Lago L., Rodrignez-Nebredo M.S., Chord A. Rapid serotyping of en-teropathogenic Yersinia enterocolitica strains by co-agglutination// Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1988. - Vol. 139, № 4. - P. 461-471;

79. Furowicz Antoni J., Czernomysy-Furowicz Danuta. Yersinia pseudotuberculosis infection in animals// Adv. Agr. Sci. 1996. - Vol. 5, № 1. - P. 5-10.

80. Fukushima Iochi, Marugama Kenji, Omori Ichiro et al. Kontamination von Schweinen mit Yersinia im Schlachthaus// Fleischwirtschaft. 1990. - Vol. 70, № 10.-P. 1330-1332.

81. Garrigue G., Poveda J.D., Carniel E. Yersinioses: Rappel bacteriologigue, epi-demiologigue et clinigue. Etude de 8856 serologic en France// Feniel. Biol. 1993. - № 190. - P. 25-28.

82. Garcia-Jalin I., Muro L., Leiva I., Diar R. Contribucion al estadio de Yersinia enterocolitica en carnes de cerdo// Alimentaria 1998. Vol. 35, № 292. - P. 27-31.

83. Gilmour A., McGuiggan I.T.M. Thermization of milk. Safety aspects with respect to Yersinia enterocolitica// Milchwissenschaft. 1989. - Vol. 44, № 7. - P. 418-422.

84. Gonul Sahika Aktug, Karapinar Mehmef. The microbiological guality of drinking water supplies of Izmir City: the incidence of Yersinia enterocolitica// Int. I. Food. Microbiol. 1991. - Vol. 13, № 1. - p. 69-73.

85. Greenwood M.H., Kooper W.L. Exeretion of Yersinia spp. Associated with consumption of pasteurized milk// Epidemiol. And Infert. 1990. - Vol. 104, № 3. - P. 345-350.

86. Greenwood M.H., Kooper W.L., Rodhouse I.C. The sourse of Yersinia spp. In pasteurized milk: an investigation at a dayri// Epidemiol. And Infect. 1990. - Vol. 104, №3. -P. 351-360.

87. Gueraud I.M. Vers une epizootic de Yersiniose ches le chinchilla// Bull. Acad. Vet. Fr. 1988. - Vol. 61, № 1. - P. 95-98.

88. Jones B.L., Saw M.N., Hanson M.F. et al. Yersinia enterocolitica from transfusion of red cell concentrate stored for 16 days// J. Clin. Pathol. 1993. - Vol. 46, № 5. - P. 477-478.

89. Kaneuchi Choji, Shibata Masashi, Kawasaki Takako et al. Occurrence of Yersinia spp. in migratory birds, ducks, seaguels and swallows in Japan// Jap. J. vet. Sci. 1989. - Vol 51, № 4. - P. 805.

90. Клисурова Й., Тюфекчиев Т., Захариев 3. Yersinia enterocolitica, изолирани от групово заболеване// Епид., микр., инф. болести. 1976. - № 3. - С. 239-241.

91. Костов Г., Божилов Б., Тодорова П., Тодоров Г. Диагностичка стойкост на протеикови антигени от Br.abortus и Y.enterocolitica 9// Ветеринарно-медицински науки. 1980. - № 5. - С. 60-66.

92. Kronvall G. A rapid slide agglutination method for typing pneumococci by means of specific antibody adsorbed to protein A containing staphylococce// J. Med. Microbiol. 1973. - № 6. - P. 187-190.

93. Кунев Ж., Донзо M., Павлов А. И др. Значение на йерсиниите за лаборатория ветеринарно-санитерен контрол// Ветеринарна сбирка. 1984. - № 7. - С. 20-21.

94. Kwaga Jacob К.Р., Iversen John О. Laboratory investigation of virulence among strains of Yersinia enterocolitica and related species isolated from pigs and pork prodact// Can. J. Microbiol. 1992. - Vol. 38, № 2. - P. 92-97.

95. Lahesmaa-Rantala Riitta, Magnusson Kart-Eric, Granfors Kaisa et al. Intestinal permeability in pathies with Yersinia friggered reactive arthritis// Ann. Rheum Dis. 1991.-Vol. 50, №2.-P. 91-94.

96. Laregue J., Gialluty C. De. Yersinia enterocolitica et enfection dorigine alimen-taire// Rev. Fr. Lab. 1994. - Vol. 22, № 64. - P. 22-24.

97. Levre E., Terreni M., Brunetti M. et al. Indagine sulla gualita igienica di gelati di produzione artigianale// Riv. ital. ig. 1988. - Vol. 48, № 5-6. - P. 329-342.

98. Merier P., Rideaud P. Bacteriologie du sperma frais de lapin: Etude prelimi-naire// Prod. anim. 1990. - Vol. 3, № 3. - P. 215-221.

99. Mickova V. Vyskyf Yersinia enterocolitica, zvlaste serovaru 0:3, biovaru 4 ve veprovem a hovezim mase// Cs. epidemiol., microbiol., immunol. 1990. - Vol. 39, № 4. - P. 222-227.

100. Pacini R., Quaglio E., Galassi R., Morganti R. Osservazion sulla contaminazione microbica degli alimenti nell area Livornese: isolamenti di Yersinia enterocolitica//• Ind. alim. (ital.). 1993. - Vol. 32, №321. - P. 1216-1219.

101. Павлов А., Желев В., Тодоров Т. Патохистологички промени у морски свинчета, експериментально заразни с Y.enterocolitica серотип 9//Ветеринарно-медицински науки. 1976. - № 9. - С. 34-39.

102. Павлов А., Филипов В., Данев Й., Хвърчилков В. Проучвания върху раз-пространението на Yersinia enterocolitica при лактирации крави// Ветеринарна сбирка. 1982. - № 2. - С. 47-49.

103. Павлов А. Развитие на Yersinia spp. В крове мляко// Ветеринарна сбирка. -1989. -№1.- С. 57-60.

104. Quaglio P., Aggazzotti G., Messi P. et al. Presenza di batteri appartenenti al genere Yersinia in alimenti carnei in vendita al dettaglio// Ril. Ital. ig, 1988. - Vol 48, № 5, 6. - P. 376-378.

105. Quaglio P., Aggazzotti G., Fabio A. et al. Presenza di batteri appartenenti al genere Yersinia in agna superficiali e di falda// Ann. ig.: Med. prev. comunita -1989. Vol. 1, № 1-2. - P. 157-162.

106. Ramisse J., Manet G., Pellerin J. et al. Biotypes de Yersinia retrouves dans des produits alimentaires. Des prelevements biologigues et des eaux// Microbiol., alim. nutr. 1990. - Vol. 8, № 1. - P. 39-43.

107. Robbins-Browner R., Miliotis M., Cianciosi S. et al. Evaluation of DNA colony hybridization and other fechnigues for detection of virulence in Yersinia species// J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27, № 4. - P. 644-650.

108. Saebo A., Lassen J. Yersinia enterocolitica: An inducer of chronic inflamation// Int. J. Tissue React. 1992. - Vol. - 16, № 2. - P. 51-57.

109. Saiki R.K., Soharf S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sicklecell anemia// Sci. 1985. - Vol. 239. - P. 1350-1354.

110. Slee Kenneth J., Skilbeck Nael W. Epidemiology of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis infection in sheep in Australia// J. Clin> Microbiol. -1992. Vol. 30, № 3. - P. 712-715.

111. Славчев Г., Гогов Й. Преживленост на Yersinia enterocolitica в българско кисело мляко и кисело мляко «Вита» (експерименталии проучвания)// Вете-ринарно-медицински науки. 1983. - № 9. - С. 68-73.

112. Славчев Г. Развития и проживаемост на Yersinia enterocolitica в постьери-зирано мляко и сладолед// Ветеринарно-медицински науки. 1986. - № 6. - С. 77-85.

113. Славчев Г. Чувствительност на йерсиниф бактерии към антибиотици и де-зинфекционни средства// Ветеринарно-медицински науки. 1987. - № 5. - С. 64-69.

114. Славчев Г., Дмитрова 3. Доказане на йерсиния ентероколитика в мляко и млечни продукти чрез ензим-свързания имуносорбентен метод// Ветеринарна сбирка. 1988. - № 5. - С. 55-56.

115. Славчев Г., Цанев Н. Доказане на Y.enterocolitica серотип 0:3 в мляко и млечни продукти посредством коаглутинационния тест// Ветеринарна сбирка. 1989.-№ 6. - С. 18-19.

116. Славчев Г. Развитие и преживаемост на Yersinia enterocolitica в краве масло// Ветеринарна сбирка. 1989. - № 3. - С. 50-52.

117. Славчев Г. Термоустойчивост на Yersinia enterocolitica в краве мляко// Ветеринарна сбирка. 1989. - № 2. - С. 46-47.

118. Славчев Г. Продукция на термастобилен ентеротоксин от щамове на Y.enterocolitica серотип 0:3// Ветеринарна сбирка. -1990. № 5, 6. - С. 43-45.

119. Solino Noleto Alba Lima, Tibano Anita. Sensibilidade a antimicrobianos de Yersinia spp. isoladas de alimentos na cidade do Rio de Janeiro// Rev. microbiol. -1989. Vol. 20, № 2. - P. 170-173.

120. Sory Marie-Poule, Talleraere Jacgueline, Laszlo Christine et al. Defection of pYV+ Yersinia enterocolitica isolated by PI slide agglutination// J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, № 11. - P. 2403-2408.

121. Стефанов И. Изолирана на Yersinia spp. от тонзили и езици на рядовно за-клани свине//Ветеринарна сбирка. 1989. - № 8. - С. 41-43.

122. Стефанов И. Йерсинии и йерсиниози по животните// Ветеринарна сбирка. -1989.-№ 7.-С. 39-40.

123. Стефанов И. Биохимична и серологична характеристика и потенциална па-тогенност на щамове Yersinia enterocolitica, изолиране от свине// Епид., микр., инф. болести. 1990. - № 2. - С. 30-36.

124. Стефанов И., Кунев Ж. Изолиране на Yersinia enterocolitica и подобните видове от рядовно заклани свине// Ветеринарна сбирка. 1990. - № 5, 6. - С. 4345.

125. Tellervo Valtonen Е., Rihtmaki P., Koskivaara M. Occurence and pathogenisity of Y.ruckeri at fish farms in northen and central Finland// J. Fish Dis. 1992. - Vol. 15, № 2. - P.163-171.

126. Toora Syed, Singh Gagandeep, Tiwari Ram Parkash, Singh Gurinder

127. Drug resistance and lecithinase activity of Yersinia enterocolitica isolated from buffalo milk// Int. J. Food Microbiol. 1989. - Vol. 9, № 3. - P. 167-171.

128. Цанев H. Проучване върху приложимостта на коаглутинацията за сероти-пизаране на Yersinia enterocolitica// Епид., микр., инф, болести. 1982. - № 1. -С. 48-51.

129. Цанев Н., Цветкова Е., Томов А. И др. Проучване специфичността на пре-кия имунофлуоресцентел метод за открыване и идентифициране на сероти-пове 3 и 9 на Yersinia enterocolitica// Епид., микр., инф. болести. 1982. - № 1. - С. 63-67.

130. Юруков М., Славчев Г. Подобрей метод за изолиране на Yersinia enterocolitica// Ветеринарно-медицински науки. 1984. - № 6. - С. 75-83.

131. Васильев П. Йерсиния ентероколитика в гърлени секрети на свине// Вете-ринарна сбирка. 1986. - № 2. - С. 30-31.

132. Vladik P., Prouza A. Naler Yersinia ruckeri u pstrohu duhovych v Ceskosloven-sku// Vet. med. 1990. - Vol. 35, №7. - P. 437-442.

133. Wakefield Denis, Stahlberg Tom H., Toivanen Auli et al. Serologic evidence of Yersinia infection in patients with anterior weitis// Arch. Opthalmol. 1990. - Vol. 108, №2.-P. 219-221.

134. Wilson X., Nacane P. Immunofluorescence and related staining techngues/ Knapp, Kalubur and Wicke (Elzetier). North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1978.-P. 215-224.

135. Yesim Ozbas Z., Aykut Aytac S. Incidence of Yersinia enterocolitica in samples of pasteurized milk// Chem. microbiol. Technol. Lebensm. 1993. - Vol. 15, № 5-6.-P. 129-133.

136. Ziegert Erika, Diestesterweg Ingriol. Untersuchungen zum vorkommen von Yersinia enterocolitica im Abwasser// Zbl. Microbiol. 1995. - Vol. 45, № 5. - P. 367-375.