Совершенствование иммунодиагностики кишечного иерсиниоза на основе моноклональных антител

Уткин, Денис Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование иммунодиагностики кишечного иерсиниоза на основе моноклональных антител
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование иммунодиагностики кишечного иерсиниоза на основе моноклональных антител"

На правах рукописи

УТКИН Денис Валерьевич

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИММУНОДИАГНОСТИКИ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 2004

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Девдариани Зураб Леванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Попов Юрий Алексеевич

доктор медицинских наук

Самыгин Виктор Михайлович

Ведущая организация:

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

Защита диссертации состоится «4» октября 2004 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.208.078.01. при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Автореферат разослан «Ж». с^-а. 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

2005-4

12659

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Кишечный иерсиниоз принадлежит к числу трудно диагностируемых острых инфекций и часто регистрируется под видом других заболеваний, таких как аппендицит, инфекционный гепатит, острая респираторная вирусная инфекция, скарлатина, холецистит и др. (Гурлева Г.Г. с соавт., 1986; Ющенко Г.В., 1977). Большой научный и практический интерес к кишечному иерсиниозу обусловлен широким распространением возбудителя в природе, резистентностью его к низким температурам, появлением не только спорадических заболеваний, но и крупных вспышек в организованных коллективах (Головачева С.Н. с соавт., 1986). Трудности в постановке клинического диагноза, длительность бактериологического выделения возбудителя, перекрестная иммунореактивность с рядом других микроорганизмов являются основанием для совершенствования методов и приемов диагностики этой инфекционной болезни.

Существующие в настоящее время кишечноиерсиниозные иммунодиагностические тест-системы преимущественно сконструированы на основе кроличьих антисывороток, содержащих поликлональные антитела, или антигенов Yersinia enterocolitica. Разработаны препараты для реакции агглютинации (РА) (Воронцова Т.А., 1989; Гефан Н.Г., 1996; Григорьян Э.Г. с соавт., 1979; Гурлева Г.Г., 1989; Тюменцев С.Н. с соавт., 1990; 1991; 1993), эритроцитарные (Дулатова М.В. с соавт., 1990; Королюк A.M. с соавт., 1981; 1989; Янькова В.И., 1990; Янькова В.И. с соавт., 1986; 1989; 1991), коагпнотинирующие (Гурлева Г.Г. с соавт., 1989; Королюк A.M., 1984; Славчев Г., 1989) и латексные (Анисимова Т.И. с соавт., 1996; Дулатова М.В. с соавт., 1990; Шпилюк Г.Ф. с соавт., 1990) диагностикумы. Однако указанные препараты не всегда удовлетворяют требованиям, предъявляемым к их информативности, чувствительности и специфичности. Ввиду тесного антигенного родства возбудителя кишечного иерсиниоза с представителями родов Yersinia, Brucella, семейства Enterobacteriaceae и др. при получении специфических сывороток приходится использовать весьма трудоемкие и длительные методы адсорбции, приводящие к снижению титра антител. Источники получения сывороток, как правило, ограничены, и они трудно поддаются стандартизации. Эти недостатки можно устранить с помощью моноклональных антител (МКА) с использованием гибридомной биотехнологии.

МКА имеют ряд существенных преимуществ: они обладают строгой специфичностью; имеют одинаковую структуру, идиотип, аллотип, аффинность и авидность, что позволяет их легко стандартизировать (Албертс Б. с соавт., 1994; Ройт А., 1991); доступны в достаточно больших количествах при культивировании продуцентов МКА - гибридомных клеток - in vitro и in vivo; титры МКА в биологическом сырье (асцитической жидкости) обычно выше, чем в поливалентных гипериммунных сыворотках. В 80-90 годах прошлого столетия за рубежом (Bundle D.R. et al., 1984; Kooi С. et al, 1995; Wächter E. et al„ 1989; Weninger J. et al., 1988; 1989) получены МКА к отдельным антигенам У. enterocolitica, в том числе к видо- и серовароспецифическим, которые, в основном, используются для проведения научно-исследовательских работ, связанных с изучением антигенной структуры возбудителя. Лишь в последние 5 лет отечественным ученым удалось создать гибридомы, синтезирующие МКА к 09 серовару Y. enterocolitica (Алексеева Л.П. с соавт., 1999; Михайлов Л.М., 1999). На основе МКА к 09 серовару разработан и испытан в лабораторных условиях иммунофлуоресцентный диагностический препарат (Алексеева Л.П. с соавт., 1999). Вместе с тем в распоряжении российских специалистов отсутствуют диагностические тест-системы на основе МКА к не менее важному с эпидемиологической точки зрения 03 серовару, а также к некоторым другим серовариантам кишечноиерсиниозных бактерий, циркулирующих в природе. В связи с этим получение отечественного набора МКА, имеющих научно-прикладное значение, особенно в перспективе создания на их основе диагностических тест-систем для обнаружения, идентификации и серотипирования кишечноиерсиниозных бактерий, имеет весьма актуальное значение.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам возбудителя кишечного иерсиниоза, изучение их свойств и разработка на основе набора МКА экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления, идентификации и серотипирования Y. enterocolitica.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Подобрать оптимальную схему иммунизации мышей растворимым и корпускулярными кишечноиерсиниозными антигенами для получения максимального количества специфически стимулированных спленоцитов.

2. Модифицировать условия культивирования гибридом с целью повышения эффективности гибридизации.

3. Получить клеточные линии гибридом, стабильно продуцирующих МКА к Y enterocolitica in vitro и in vivo.

4. Изучить иммунохимические свойства моноклональных антител.

5. Определить с помощью МКА антигенные детерминанты, отвечающие за специфичность отдельных сероваров Y enterocolitica, установить их природу.

6. Сконструировать и апробировать в лабораторных условиях экспериментальные моноклональные иммуноферментные тест-системы для обнаружения, идентификации и серотипирования Y enterocolitica.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Разработаны оптимальные схемы иммунизации мышей BALB/c - источники иммунных спленоцитов для гибридизации с сингенными клетками мышиной миеломы и усовершенствованы отдельные этапы гибридомной технологии, повышающие эффективность получения стабильных антителопродуцирующих гибридом. Получен оригинальный набор МКА, обладающих избирательной специфичностью в отношении бактерий Y enterocolitica и его отдельных серовариантов, в том числе, имеющих эпидемиологическое значение. Впервые установлено, что сероваропринадлежность штаммов Y enterocolitica может определяться не только углеводами О-специфических боковых цепей бактериального липополисахарида или его коровой части, но и антигенными детерминантами белковой природы, экспрессия которых не зависит от наличия или отсутствия плазмиды pCad. Новыми являются сведения о том, что общий для патогенных иерсиний термостабильный белок с м.м. (38 (40) ± 2) кДа содержит как видо-, так и серовароспецифические эпитопы возбудителя кишечного иерсиниоза. Впервые выделена стабильная линия гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела, специфически взаимодействующие одновременно с двумя наиболее распространенными в России ОЗ и 09 серовариантами кишечноиерсиниозных бактерий.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Создана кпонотека стабильных гибридных клеточных линий, синтезирующих МКА к антигенам Y. enterocolitica ОЗ; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 09 сероваров, которые могут быть использованы для изучения антигенной структуры возбудителя и конструирования иммунодиагностических препаратов

с целью лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза. Три клеточные линии, продуцирующие МКА к Y. enterocolitica ОЗ серовара (1G72), к У. enterocolitica 09 серовара (lBjoi) и одновременно к обоим указанным сероварам (1С10|), депонированы в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур (г. С.-Петербург) под номерами РККК(П) 680Д, РККК(П) 678Д, РККК(П) 679Д.

Образцы МКА к видо- и серовароспецифическим эпитопам возбудителя кишечного иерсиниоза успешно прошли лабораторные комиссионные испытания в соответствии с программой, утвержденной директором PocI 1ИПЧИ "Микроб" 8 января 2003 г.

Экспериментальные иммуноферментные тест-системы для обнаружения, идентификации и серотипирования Y.enterocolitica в ТИФА и ДИА, сконструированные на основе набора МКА, апробированы на коллекционных и свежевыделенных штаммах Y.enterocolitica от больных людей и из объектов внешней среды.

Подана заявка на изобретение «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. РККК (П) 679Д - продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену Yersinia enterocolitica 03 и 09 сероваров» в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

По материалам диссертации составлены методические рекомендации «Идентификация возбудителя кишечного иерсиниоза 03 и 09 сероваров в иммуноферментном анализе с помощью моноклональных антител», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (Протокол № 7 от 23 сентября 2003 г.) и утвержденные директором института 23.09.2003 г.

Материалы диссертации используются при чтении лекций по иммунологии и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ "Микроб".

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Белково-полисахаридный комплекс (БПК) Y. enterocolitica ОЗ серовара, выделенный методом уксуснокислого гидролиза, содержит родо-, видо- и серовароспецифические антигенные детерминаты.

2. Оптимизация схем иммунизации линейных мышей ВАЬВ/с кишечноиерсиниозными антигенами и условий селективного отбора гибридных клеток повышает эффективность слияния лимфоцитов в 10-100 раз и число гибридом, продуцирующих моноклональные антитела разной специфичности, в среднем в 10-20 раз.

3. Использование спленоцитов линейных мышей, иммунизированных корпускулярным антигеном К еШегосоНЧса 03 серовара, при слиянии с сингенными мышиными миеломными клетками приводит к образованию гибридом, секретирующих моноклональные антитела не только к выше указанному, но и к ряду других серовариантов кишечноиерсиниозных бактерий.

4. Серовароспецифические кишечноиерсиниозные моноклональные антитела направлены к антигенным детерминантам не только углеводной, но и белковой или гликопептидной природы.

5. Видоспецифические эпитопы У.еМегосоНИса локализованы на термостабильном полипептиде, молекулярная масса которого определяется сероваром бактерий. Его синтез не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов.

6. Сконструированные на основе МКА экспериментальные иммуноферментные тест-системы позволяют проводить индикацию, идентификацию и серотипирование штаммов У. еМегосо1Шса с чувствительностью 3,1 • 104 - 2,3 • 105 м.к./мл в ТИФА и 7,8 • 103 -2,5 • 105 м.к./мл в ДИА в зависимости от сероваропринадлежности микробов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на: Российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции Минздрава России (Астрахань, 2001), Международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-легию Талдыкорганской противочумной станции (Алматы, 2001), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 50-летию Дагестанской ПЧС (Махачкала, 2002), 69-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2004), итоговых научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2000,2001, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 главы), собственных исследований (4 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 242 источника, в том числе 114 зарубежных. Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста и включают в себя 27 таблиц, 10 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. В работе использовали 55 штаммов У. enterocolitica, 20 штаммов Yersinia pseudotuberculosis, 5 штаммов Yersinia pestis и 15 штаммов бактерий семейства Enterobacteriaceae. Штаммы Y. enterocolitica и других представителей Enterobacteriaceae выращивали на агаре Хотгингера, рН 7,2, при температуре 37 °С в течение 48 ч, Y. pestis - при 28 °С 48 ч. Бактериальные взвеси с концентрацией 1 ■ 109 м.к./мл готовили в забуференном физиологическом растворе по стандартному образцу мутности ОСО-42-85П 10 ед., эквивалентному 1-109 м.к. Y. enterocolitica. Все работы, связанные с культивированием микроорганизмов, выполняли в соответствии с требованиями Санитарных правил СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».

Для иммунизации животных использовали цельные клетки Y. enterocolitica и БПК, выделенный из биомассы Y. enterocolitica 03 серовара Н.В. Сладковой с соавт. (1989) по Р.В. White (1936) в модификации Е.Э. Бахрах с соавт. (1960).

Донорами иммунных спленоцитов и иммуноасцитической жидкости служили мыши инбредной линии BALB/c в возрасте 8-12 недель, весом 18-20 г из лаборатории биомоделей РосНИПЧИ «Микроб». Гибридизацию иммунных спленоцитов проводили с клетками сингенных миеломных линий Sp.2/0-Ag.8 и Sp.2/0-Ag.l4 по методу G. Galfi-ё et al. (1977).

Для культивирования миеломных и гибридомных клеток использовали среду RPMI-1640 («Flow Laboratories») с добавлением 2 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES, 0,2 % NaHC03, содержащую 10 % сыворотки плода коровы («Flow Laboratories») - при выращивании гибридом или 5 % лошадиной сыворотки («Flow Laboratories») - при культивировании миелом. Для предотвращения бактериального и грибкового загрязнения в среду добавляли соответствующие антибиотики- 0,2 % гентамицина, 1 % пенициллина (5000 Ш/ш1)/стрептомицина

(5000 мкг/мл) и 2 % амфотерицина. Селекцию гибридных клеток осуществляли на среде с добавлением гипоксантина, аминоптерина, тимидина. Клонирование и реклонирование гибридом проводили методом лимитирующих разведений. Миеломные и гибридомные клетки культивировали в С02-инкубаторе «Labomed» при температуре 37 °С, влажности 60 % и содержании в атмосфере С02 5 %, а хранили в криогенных сосудах Дьюара СК-40 в жидком азоте при температуре минус 196 °С в 1,8 мл пробирках для криоконсервации («Costar»). Клетки культивировали в 96-луночных планшетах для культуры клеток («Flow Laboratories») и в 50 мл культуральных пластиковых сосудах («Costar»), Все работы, связанные с культивированием клеток, проводили в ламинарном боксе ЛБ-Г с горизонтальным потоком воздуха. Для просмотра клеток использовали инвертированный микроскоп Diavert («Leitz»), Среды и растворы стерилизовали через свечи Шамберлена и нитроцеллюлозные мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («Владипор»).

Скрининг МКА, секретируемых гибридомами, определение специфичности, чувствительности и активности МКА и антител в сыворотке крови иммунных животных проводили в различных вариантах твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) (непрямой, прямой, «сэндвич») (Егоров A.M. с соавт., 1991; Нго Т.Т., Ленхофф Г., 1988; Фримель Г., 1987) и в дот-иммуноанализе (ДИА) (Коллинз У.П., 1991). ТИФА проводили в пластиковых 96-луночных планшетах (ВНИИМедПолимер), а для ДИА использовали нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0,45 мкм («Sigma»). Результаты ТИФА учитывали с помощью 8-ми канального спектрофотометра Titertek Multiskan («Flow Laboratories») при длине волны 405 нм, а ДИА - по наличию и интенсивности окрашивания пятен на нитроцеллюлозной мембране. Изучение иммунохимических свойств поли- и моноклонапьных антител осуществляли методом иммуноблотгинга по Н. Towbin et al. (1979) на аппарате для полусухого блота с графитовыми электродами. Эпитопный анализ МКА проводили по В.А. Зайденову с соавт. (1991).

Электрофоретическое разделение клеточных лизатов бактерий проводили в 12,5% ПААГ-ДСН по U.K. Laemmli (1970) на аппаратах для вертикального электрофореза LKB 2050 и MiniVagoan с окраской гелей Кумасси R-250.

Выделение иммуноглобулинов из культуральной и асцитической жидкостей осуществляли двукратным осаждением сульфатом аммония (Kekwick

R., 1940) при насыщении 45 % и 40 % с последующим центрифугированием на центрифуге K24D при 2000 g 20 мин и очисткой осажденной фракции от соли диализом в дистиллированной воде. Конъюгирование иммуноглобулинов с пероксидазой хрена («Serva») проводили по методу Р.К. Nakane and A. Kawaoi (1974). В непрямом варианте ТИФА использовали антитела диагностические против иммуноглобулинов G мыши, меченные пероксидазой хрена (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).

Препараты и среды хранили в бытовых холодильниках при 4 "С, выделенные МКА и конъюгаты с пероксидазой - в морозильниках при минус 20 "С.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли по И.П. Ашмарину, A.A. Воробьеву (1962) и H.A. Плохинскому (1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для конструирования антителопродуцирующих гибридом оптимальным является применение специфических высокоочищенных растворимых антигенов, хотя использование в гибридомной технологии цельных микробных клеток имеет свои преимущества, особенно при получении МКА различной специфической направленности (Лефковитс И., Пернис Б., 1988; Пол У., 1989; Фримель Г., 1987). В связи с этим для иммунизации животных с целью пролиферации спленоцитов, синтезирующих кишечноиерсиниозные антитела, использовали взвеси микробов У. enterocolitica 03 и 09 сероваров, а также специфический для Y enterocolitica, по данным Н.В. Сладковой (1991), антиген -БПК.

Для подтверждения специфичности БПК были проведены специальные исследования. В ДИА показано, что в сыворотке крови мышей, иммунизированных БПК, присутствовали антитела не только к возбудителю кишечного иерсиниоза, но и к гетерогенным микроорганизмам (К pseudotuberculosis, Salmonellaparathyphi), а при постановке иммуноблоттинга оказалось, что в состав БПК входит целый комплекс различных антигенов с м.м. от (12 + 2) кДа до (38 ± 2) кДа, к которым синтезируются антитела. При изучении в ТИФА коммерческих агглютинирующих сывороток, предназначенных для идентификации в РА бактерий, имеющих общие антигенные детерминанты с возбудителем кишечного иерсиниоза, крови мышей, иммунизированных БПК и микробными клетками Y. enterocolitica различных

сероваров, а также сывороток людей больных ОКЗ, на наличие антител к антигенам БПК установлено, что в крови мышей иммунизированных препаратом БПК и микробными клетками У еШегосоННса 03 серовара, титр специфических антител составил 1/25000, при иммунизации животных бактериями других сероваров - от 1/1600 до 1/6400. В туляремийной, эшерихиозной, шигеллезных и сальмонеллезных сыворотках антитела к БПК обнаружены в титрах от 1/2 до 1/512. Положительная реакция зарегистрирована с цельными холерной и бруцеллезной сыворотками, а в чумной и псевдотуберкулезной сыворотках антитела к БПК не обнаружены. Титры антител в сыворотках больных ОКЗ колебались в интервале от 1/800 до 1/25600 в зависимости от нозологической формы заболевания и сроков взятия крови. У больных сальмонеллезом титр антител составил 1/800-1/25600, дизентерией Флекснера - 1/6400-1/25600, дизентерией Зонне - 1/1600-1/3200. Полученные результаты свидетельствуют о наличии в составе БПК как общих с другими энтеробактериями антигенов, так и видоспецифических для У. еШегосоНИса детерминант, получение антител к которым возможно с помощью гибридомной биотехнологии.

При получении гибридом одним из ключевых моментов является подбор оптимальной схемы иммунизации животных, обеспечивающей пролиферацию максимального количества антителопродуцирующих спленоцитов. О степени пролиферативной активности лимфоцитов судили по величине титров специфических антител в сыворотке крови мышей. Для иммунизации использовали мышей инбредной линии ВАЬВ/с, сингенной по отношению к миеломным линиям 8р2/0-А§.14 и 8р2/0-А§.8, клетки которых служили в качестве партнеров для гибридизации. При подборе оптимальной схемы иммунизации животных варьировали дозы и способ введения антигена, сроки иммунизации и количество прививок. Низкие дозы БПК (2,5-5 мкг при первичной иммунизации) равно как и высокие (100 мкг и более) приводили к выработке антител в относительно невысоких титрах (1/800-1/6400), причем с увеличением количества прививок титр антител даже снижался. Оптимальной оказалась первичная иммунизация в дозах 25-40 мкг, с последующим введением 40-50 мкг препарата, причем с увеличением количества прививок (5-6) титр антител повышался до 1/20480-1/25600. При внутривенной иммунизации титр антител был относительно невысоким (1/1600-1/4525). Для корпускулярных антигенов (У. еШегосоИйса 03 и 09 сероваров) оптимальной была 3-4-х разовая

внутрибрютинная инъекция в дозах 1 • 107 - 5 • 107 клеток с интервалом 2-3 недели. Спустя 3 дня после последней иммунизации выделяли клетки селезенки и проводили гибридизацию. Титр специфических антител к микробным клеткам соответствовал уровню антител, образующемуся в ответ на введение БПК, и составил 1/10240-1/25600. Спленоциты мышей с наиболее высокими титрами антител в крови были использованы в качестве партнеров для гибридизации.

С целью получения гибридом, продуцирующих специфические МКА, проведено 10 гибридизаций клеток миеломных линий Sp2/0-Ag.l4 и Sp2/0-Ag.8 со спленоцитами мышей BALB/c, иммунизированных БПК (5 гибридизаций), цельными клетками Y enterocolitica 03 серовара (3 гибридизации), цельными клетками Y enterocolitica 09 серовара (2 гибридизации). Эффективность гибридизации оценивали по количеству лунок с гибридомами по отношению к общему количеству засеянных лунок. Установлено, что эффективность гибридизации во многом зависит от условий культивирования клеток после слияния, в частности, от концентрации в среде селективного агента HAT и сроков его внесения. Так, при культивировании клеток на селективной среде, содержащей 2 % HAT, полностью подавлялся рост клеток. При добавлении HAT на 2-3 сут после слияния эффективность гибридизации оказалась равной 100 %, при этом количество гибридом, продуцирующих специфические антитела, в среднем составило (5,36 + 1,96) %. При культивировании гибридом на среде с 1 % HAT эффективность гибридизации была абсолютной (100 %), причем (22,65 ± 0,25) % гибридом продуцировали специфические антитела. В результате первичного скрининга культуральной жидкости на наличие кишечноиерсиниозных антител установлено, что в зависимости от иммунизирующего агента 1,2 % - 15,6 % гибридом синтезировали антитела к ОЗ серовару Y. enterocolitica, 2,4 % - 5,5 % - к 09 серовару, 6,2 % - 17,2 % - к БПК. Клонирование гибридом проводили методом предельного (лимитирующего) разведения.

Необходимо отметить, что при гибридизации иммунных спленоцитов мышей, иммунизированных разными антигенами, выделены клоны гибридом различной специфичности. Так, после прививок Y. enterocolitica 09 серовара, получено 27 клонов гибридом, продуцирующих как специфические к 09 серовару, так и перекрестно-реагирующие с гетерогенными микроорганизмами МКА.

При гибридизации лимфоцитов селезенки мышей, иммунизированных БПК, получено 8 клонов, продуцирующих антитела к 03 серовару, по 1 клону -к 09 и 03+09 сероварам, 2 клона - к 04,32 серовару, кроме того, выделено по 1 клону, продуцирующему видоспецифические и родоспецифические МКА.

В результате гибридизации спленоцитов мышей, иммунизированных У. enterocolitica 03, получено по 2 клона, синтезирующих МКА к 03; 05,27 и 06,30 сероварам и 5 клонов - к 04,32 серовару. В последних двух случаях иммунные спленоциты, использованные в качестве партнеров для гибридизации, должны были синтезировать антитела к эпитопам, специфическим только для 03 серовара кишечноиерсиниозных бактерий. По результатам же скрининга гибридом и определения специфической активности МКА были получены гибридные клетки, синтезирующие антитела к другим сероварам У. enterocolitica. На основании полученных данных, а также с учетом результатов исследований JI.M. Михайлова (1999), Ж.Г. Самелия (2002) и В.А. Федоровой с соавт. (1999, 2003) можно предположить, что понятие «серовароспецифические» антигены, широко распространенное в микробиологии, не совсем правомерно. Скорее следует вести речь о большей или меньшей степени экспрессии отдельных эпитопов, которые определяют серовароспецифичность конкретных микроорганизмов, в частности, У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis при использовании поливалентных (в том числе адсорбированных) сывороток. Такое предположение стало возможным только с применением технологии моноклональных антител, являющихся, в отличие от поликлональных сывороток, продуктами клонированной лимфоидной клетки, секретирующей специфические антитела в неограниченном количестве независимо от степени экспрессии отдельных антигенных детерминант микробной клетки.

После повторного клонирования для дальнейшей работы было отобрано 12 гибридом, продуцирующих специфические МКА к различным серовариантам возбудителя кишечного иерсиниоза: 1 клон - к 03 и 09 сероварам, 3 клона - к 03 серовару, по 2 клона - к 09; 04,32; 06,30 сероварам, по 1 клону - к 05 и 05,27 сероварам и 1 клон, синтезирующий видоспецифические МКА (7С71). Отобранные клоны гибридом сохраняли способность продуцировать специфические антитела при культивировании in vitro в течение 6 месяцев (срок наблюдения). При этом титр специфической активности антител оставался

практически на одном уровне (1/80-1/320 при первом пассаже и 1/40-1/320 через 6 месяцев).

Для получения препаративных количеств МКА гибридомы вводили внутрибрюшинно в количестве 1,5 ■ 106-2 - 106 клеток мышам линии BALB/c, предварительно за 10 дней праймированных минеральным маслом "Pristan" в объеме 0,5 мл. На 8-14 день после инокуляции клеток у мышей из сформировавшейся опухоли прижизненной пункцией осуществляли забор асцитической жидкости, содержащей МКА. Титр специфической активности МКА в иммуноасцитической жидкости составил 1/25600-1/102400 (на первом пассаже) - 1/51200-1/204800 (при последующих пассажах). Продукция антител сохранялась на высоком уровне после 6-7-ми пассажей in vivo (срок наблюдения). При перевивании гибридом через организм мыши сокращались сроки формирования асцитной опухоли с 13-16 до 8-9 дней, увеличивался объем асцитической жидкости при однократном заборе с 2-3 до 5-9 мл (максимально 12 мл). Концентрация клеток в асците составила 8 ■ 106 - 1,6 • 107 кл./мл. Увеличение количества асцитической жидкости и сокращение сроков образования асцита, вероятно, связано с адаптацией гибридных клеток к условиям пролиферации в организме мыши.

Концентрация Ig в культуральной среде составила от 0,24 мг/мл до 0,6 мг/мл, в асцитической жидкости - от 3,18 мг/мл до 17,48 мг/мл. Очищенные Ig сохраняли специфическую активность при их разведении от 1/256000 до 1/1024000 в зависимости от клона - продуцента антител.

При проведении эпитопного анализа установлено, что МКА 3 клонов к 03 серовару, 2 клонов - к 09 и 2 клонов - к 04,32 были направлены к разным эпитопам, МКА 2 клонов к 05 и 05,27 сероварам выявляли 2 разных эпитопа у 05 и 05,27 сероваров, соответственно, а МКА 2 клонов к 06,30 серовару взаимодействовали с одним эпитопом.

Для определения природы антигенных детерминант, к которым направлены полученные нами МКА, клеточные лизаты бактерий, в том числе обработанные протеиназой К, изучали в ТИФА. При этом установлено, что большая часть МКА не взаимодействовали с депротеинизированными образцами, обладая паратопной специфичностью к белковым молекулам бактериальной клетки, либо к эпитопам, в образовании которых играют роль белковые молекулы.

Для определения иммунохимических свойств МКА проводили иммуноблоттинг с клеточными лизатами штаммов соответствующих сероваров У еМегосоНИса, подвергнутых предварительно электрофоре! ическому разделению в ПААГ-ДСН. В результате установлено, что большинство МКА взаимодействовали только с белками бактерий, а некоторые из них (Ю4 ь 508 2, 2?4 ь 6П)5,) дополнительно выявляли углеводные компоненты (таблица 1).

Таблица 1 - Лиганды бактерий, выявляемые специфическими МКА в иммуноблоттинге

МКА Специфичность Лизаты бактерий М.м. специфических лигандов, кДа

1 2 3 4

1С|01 03+09 У еШегосоНИса 03 и 09 17 ± 2

У еМегосоШса 03 и 09 (после

протеолиза) 17 ±2

1С4, 03 У. еШегосоИйса 03 (18-30) ±2*, 86 ±2

ю72 03 У еШегосоНИса 03 14 ±2, 38 ±2

6Е73 03 У. етегосоИНса 03 62 ±2

1В юл 09 У. еШегосоННса 09 16 ±2,40 ±2

50,2 09 У. егйегосоШса 09 (18-25) ±2*, 88 + 2

2^4 1 04,32 У. еМегосоИНса 04,32 14 ± 2, (25-30) ± 2*, 80 ± 2

6052 04,32 У еШегосо1Шса 04,32 (14-20) ± 2*, 40 ± 2, 80 ± 2

1С21 05 У еШегосо1Шса 05 18 ±2, 40 ±2

2С92 05,27 У. еШегосоИНса 05,27 96 ±2

ЗСц | 06,30 У еШегосоИНса 06,30 40 ±2

ЗС„ 2 06,30 У. еМегосоШса 06,30 40 + 2

7С71 видо- У еШегосоИйса 01,2а,3; 02а,2Ь,3 16 + 2, 38 ±2

специ- У еШегосоННса 01,2а,3; 02а,2Ь,3

фичес- (после кипячения) 40 ±2

кие У. еМегосо1Шса 09 16 ±2, 38 ±2, 68 ±2, 80 ±2

У еШегосоШка 09 кипячения) (после 40 ±2

Таблица 1 (Продолжение)

1 2 3 4

7С71 видо- У. enterocolitica 03; 04,32; 05;

специ- 05,27; 06,30; 07,8; 08; 013,7 16 + 2, 38 ± 2, 80 ± 2

фичес- У. enterocolitica 03; 04,32; 05;

кие 05,27; 06,30 (после кипячения) 40 ±2

Примечание: * - углеводные компоненты

Ряд МКА специфически реагировали с белком м.м. от 38 до 40 кДа. По данным электрофореза в ПААГ-ДСН (рисунок 1) белки с м.м. (38 ± 2) кДа и (40 + 2) присутствовали в клеточных лизатах всех взятых для электрофореза штаммов У. enterocolitica, а также отдельных сероваров У. pseudotuberculosis (И, IV, V, VI) и У. pestis EV НИИЭГ. Возможно белок с м.м. (40 ± 2) кДа соответствует ранее описанному О.Д. Новиковой с соавт. (1996) белку общему для всех видов рода Yersinia - порину (иерсинину).

кДа

12 3 4 5 6 7 8 9 Ю 1112 1314 15 16 17 18 19 20 21 22

Рисунок 1 - Электрофорез в 12,5 % ПААГ-ДСН с окраской кумасси R-250 клеточных лизатов бактерий У. enterocolitica 01,2а,3 (1, 2), 02а,2Ь,3 (3, 4), 03 (5), 04,32 (6), 05 (7), 05,27 (8), 06,30 (9), 013,7 (10), 07,8 (11), 08 (12), 019,8 (13), 09 (14) сероваров; У. pseudotuberculosis I (15), II (16), III (17), IV (18), V (19), VI (20) сероваров; У. pestis EV НИИЭГ (21); 22 - маркеры молекулярных масс

Видоспецифические МКА в иммуноблоттинге в соответствии с рисунком 2 взаимодействовали с белком м.м. ((38-40) ± 2) кДа У enterocolitica и не выявляли специфические эпитопы у штаммов У. pseudotuberculosis и У pestis. После кипячения клеточных лизатов в течение 2 ч видоспецифические МКА 7С7: выявляли в блоте исследуемых штаммов только одну белковую полосу, соответствующую м.м. (40 ± 2) кДа. Следовательно, указанный белок с м.м. (40 ± 2) кДа был термостабильным.

кДа

8068-

4038-

— -200 --92,5

Р4 -66

— -45 *> -зо

— -17,8

— -14,3

1 23456789 10111213 14

15 16 1718 19 20 21

Рисунок 2 - Иммуноблоттинг БПК (1) и клеточных лизатов штаммов У. enterocolitica 01,2а,3 (2), 02а,2Ь,3 (3), 03 (4), 04,32 (5), 05 (6), 05,27 (7), 06,30 (8), 013,7 (9), 07,8 (10), 08 (11), 019,8 (12), 09 (13) сероваров; У. pestis EV НИИЭГ (14); У. pseudotuberculosis I (15), II (16), III (17), IV (18), V (19), VI (20) сероваров с видоспецифическими МКА 7С7 Ь 21 - маркеры молекулярных масс.

Результаты настоящих исследований с использованием полученного нами набора МКА свидетельствуют о локализации на термостабильном белке с указанной выше м.м. видоспецифических и некоторых серовароспецифических детерминант У етегосоШка, что согласуется с данными В.А. Федоровой с соавт. (2001) установленными на модели псевдотуберкулезного микроба.

Для разработки экспериментальной иммуноферментной тесг-системы с целью серотипирования штаммов У. еМегосо1Шса были отобраны МКА 1Смь направленные к антигену общему для 03 и 09 сероваров У еп!егосоШка, МКА

6Е7 з к У. еп1егосо1Шса 03 серовара, МКА 2¥4 \ к У. еШегосоННса 04,32 серовара, 2С92 к У еШегосоННса 05,27 серовара. Характеристика их активности представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Активность серовароспецифических МКА, использованных для экспериментальной иммуноферментной тест-системы

МКА Титр специфической активности МКА

в культуральной жидкости в иммуноасцити-ческой жидкости (I -III пассажи) после очистки меченных пероксидазой хрена

1Cio 1 1/80 1/25600-1/51200 1/1024000 1/25600

IQo 1 1/80 1/25600-1/51200 1/1024000 1/6400

6Е73 1/160 1/51200-1/102400 1/512000 1/12800

2F4) 1/160 1/25600-1/102400 1/1024000 1/25600

2С92 1/80 1/25600-1/102400 1/512000 1/6400

Специфичность разработанной на основе указанных МКА тест-системы подтверждена с использованием набора из 61 штаммов микроорганизмов Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), а также бруцеллезной, туляремийной вакцин в «сэндвич»-варианте ТИФА и ДИА. Данные представлены в таблице 3.

Чувствительность экспериментальной тест-системы в «сэндвич»-варианте ТИФА составила 3,1 • 104 - 6,2 • 104 м.к./мл, в ДИА - при фиксации бактериальных взвесей на нитроцеллюлозной мембране при 110 °С 10 минут -7,8 • 103 - 1,2 • 105 м.к./мл, при фиксации 96° этанолом в течение 20 мин - 1,6 • 104 - 1,2 105 м.к./мл. При наличии в пробе посторонней микрофлоры чувствительность тест-системы в ТИФА составила 3,1 • 104 - 1,2 • 105 м.к./мл.

Экспериментальная иммуноферментная тест-система на основе полученных МКА была успешно апробирована на 20 свежевыделенных штаммах У. етегосо1Шса 03, 09, 04,32, 05,27, 06,30 сероваров, любезно предоставленных проф. Г .Я. Ценевой (НИИЭМ им. Пастера, г. С.-Петербург), изолированных с 1999 по 2001 гг. на территории России и Франции от больных

людей и из объектов внешней среды (смывы с моркови, картофеля) и 14 штаммах Y. pseudotuberculosis.

Таблица 3 - Специфичность экспериментальной тест-системы на основе серовароспецифических МКА

Антиген Количество штаммов Специфическое взаимодействие с МКА

к 03+09 сероварам к 03 серовару к 04,32 серовару к 05,27 серовару

Y. enterocolitica 03 1 + + - -

Y. enterocolitica 09 5 + - - -

Y enterocolitica 04,32 1 - - + -

Y. enterocolitica 05,27 1 - - - +

Другие серовары Y. enterocolitica* 27

Y. pseudotuberculosis 6 - - - -

Y. pest is 5 - - - -

Escherichia coli 5 - - - -

Salmonella sp. 5 - - - -

Shigella sp. 5 - - - -

Бруцеллезная вакцина 1 - - - -

Туляремийная вакцина 1 - - - -

Примечание:

* - 01,2а,3; 02а,2Ь,3; 05; 06,30; 06,31; 07,8; 08; 010; ОЮ[К1]; 011,23; 011,24; 012,25; 012,26; 013,7; 014; 015; 016,29; 017; 018; 019,8; 020; 021; 022; 025,35; 028; 034;

«+»- наличие специфической реакции при разведении МКА 1/1000; «-»- отсутствие специфической реакции при разведении МКА 1/1000

Бактериальные культуры тестировали в прямом ТИФА и ДИА с меченными пероксидазой МКА 6Е73 - к 03 серовару, МКА 1Сю i - к 03+09 сероварам, 2F41 - к 04,32 серовару, МКА 2С9.2 - к 05,27 серовару и в непрямом ТИФА с МКА ЗСц i - к 06,30 серовару. В результате было установлено, что МКА специфически взаимодействуют как в ТИФА, так и в ДИА со штаммами Y. enterocolitica сероваров соответствующих их паспортным данным.

Для конструирования экспериментальных иммуноферментных тест-систем, предназначенных для идентификации штаммов У. еМегосоИНса, были использованы видоспецифические МКА 7С7!. Активность видоспецифических МКА в непрямом ТИФА составила от 1/1600 до 1/12800 (средний геометрический титр 1/2716 х/ 1,08). Экспериментальные иммуноферментные тест-системы (ТИФА и ДИА), разработанные на основе указанных МКА, выявляли все 35 штаммов К еШегосоИйса ГКПБ «Микроб» при рабочем разведении МКА 1/1000 независимо от сероваропринадлежности и не взаимодействовали с близкородственными в антигенном отношении гетерогенными микроорганизмами (28 штаммов). Чувствительность видоспецифической иммуноферментной тест-системы в ТИФА составила от 3,7 -104 до 2,3 • Ю'м.к., в ДИА от 3,1 • 104 до 2,5 • 105м.к.

Таким образом, в результате проведенных исследований получен набор стабильных линий гибридом, продуцирующих видо- и серовароспецифические кишечноиерсиниозные МКА. На их основе разработаны и успешно апробированы в лабораторных условиях два варианта экспериментальных иммуноферментных тест-систем, перспективных для использования в научно-исследовательской работе при изучении антигенной структуры бактерий и практического применения с целью лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция гибридом, стабильных продуцентов моиоклональных антител к антигенам У еШегосоИНса 03; 09; 04,32; 05; 05,27 и 06,30 сероваров, которые могут быть использованы для иммунохимичсской характеристики бактерий и разработки иммунобиологических препаратов в целях лабораторной диагностики кишечноиерсиниозной инфекции.

2. На основе набора видо- и серовароспецифических моиоклональных антител разработаны и успешно испытаны в лабораторных условиях экспериментальные иммуноферментные тест-системы (для ТИФА и ДИА) для обнаружения, идентификации и серотипирования от 7,8 ■ 103 до 2,3 ■ 105 бактерий У еШегосоИйса.

3. С помощью поли- и моиоклональных антител установлено, что белково-полисахаридный комплекс, выделенный из бактериальной массы У. еп1егосо1Шса 03 серовара методом уксуснокислого гидролиза, обладает высокой

перекрестной иммунореактивностью и содержит родо-, видо- и серовароспецифические антигенные детерминанты.

4. Экспериментально определены оптимальные схемы иммунизации линейных мышей кишечноиерсиниозным растворимым и корпускулярными антигенами, а также условия селективного отбора гибридных клеток, существенно увеличивающих эффективность слияния лимфоцитов и количество специфических антителопродуцирующих гибридом.

5. Установлено, что при слиянии сингенных миеломных клеток с иммунными спленоцитами линейных мышей, примированных корпускулярным антигеном определенного серовара кишечноиерсиниозных бактерий, образуются клоны гибридом, секретирующие моноклональные антитела как к гомологичному, так и к некоторым другим серовариантам У enterocolitica, значительно упрощая тем самым процедуру получения набора серовароспецифических моноклональных антител.

6. С помощью моноклональных антител в иммуноферментном анализе и иммуноблоттинге получены новые данные, свидетельствующие о том, что серовароспецифичность может определяться не только углеводными компонентами микробной клетки, но и антигенными детерминантами белковой и гликопептидной природы.

7. Показано, что кишечноиерсиниозные видоспецифические моноклональные антитела взаимодействуют с термостабильным полипептидом У enterocolitica, молекулярная масса которого определяется сероваром бактерий, а его экспрессия не зависит от температуры культивирования и наличия плазмиды pCad.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Уткин Д.В., Девдариани З.Л. Современное состояние иммунодиагностики кишечного иерсиниоза и перспективы ее совершенствования / Рос. науч.-иссл. противочумн. ин-т «Микроб». - Саратов, 1999. - 16 с. - Библиогр.: 85 назв. - Рус. - Деп. в ВИНИТИ 28.04.99, № 1341-В99.

2. Уткин Д.В., Девдариани З.Л., Ляпина Е.П., Гладилина Е.Г., Ляпин М.Н. Изучение специфичности белковополисахаридного антигена Yersinia enterocolitica в иммуноферментном анализе // Сб. научных трудов. Природно-очаговые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика. -Астрахань, 2001. - С. 281-263.

3.Угкин Д.В., Девдариани 3.JI. Получение моноклональных антител к отдельным сероварам Yersinia enterocolitica II Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. Матер, межд. науч.-практ. конф. «Современный эпидемиологический потенциал очагов чумы», поев. 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумн. станции. -Алматы, 2001. - Вып. 3. - С. 259-263.

4. Уткин Д.В., Девдариани 3.JI. Получение моноклональных антител к видоспецифическому антигену Yersinia enterocolitica // Матер. Юбилейн. науч.-практ. конф., поев. 50-летию Дагестанской противочумн. станции «Инфекционные болезни в регионах Северного Кавказа: эпидем., лаб. диагн., профил. - Махачкала, 2002. - С. 67-69.

5. Уткин Д.В., Девдариани 3.JI. Использование моноклональных антител для обнаружения в твердофазном иммуноферментном анализе Yersinia enterocolitica ОЗ, 04,32 и 05.27 сероваров // Сб. научных трудов, поев. 75-летию НИИ Микробиологии Минобороны России. - Киров, 2003. - С. 57-58.

6. Уткин Д В., Девдариани 3.JL, Федорова В.А., Дроздов И.Г. Получение и характеристика моноклональных антител к различным серовариантам Yersinia enterocolitica II Биотехнология. - № 1. - 2004. - С. 91-96.

7. Уткин Д.В., Девдариани З.Л., Федорова В.А., Ценева Г .Я. Применение моноклональных антител для серотипирования выделенных на территории России в 1999-2001 г.г. штаммов Yersinia enterocolitica II Сб. работ 69-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН (г. Курск, 3-6 февр. 2004). - Курск, 2004. -Ч. 1.-С. 119.

Сдано в набор 20.08.04 г. Подписано к печати 20.08.04 г. Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать лазерная. Объем 1,0 усл. печ. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании РосНИПЧИ «Микроб» Минздрава России 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

fi 5 А 07

РНБ Русский фонд

2005-4 12659

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Уткин, Денис Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов.

2.2. Антигены.

2.3. Реактивы и буферные растворы.

2.4. Культуральные и питательные среды.

2.5. Условия гибридизации.

2.6. Биохимические методы.

2.7. Приготовление пероксидазных конъюгатов.

2.8. Методы иммуноанализа.

2.9. Оборудование и приборы.

2.10. Лабораторные животные.

2.11. Методы статистического анализа.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДОМ-ПРОДУЦЕНТОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ.

3.1. Изучение иммунореактивности белково-полисахаридного комплекса

Y. enterocolitica.

3.2. Подбор оптимальной схемы иммунизации животных.

3.3. Эффективность гибридизации, клонирования и реклонирования.

3.4. Стабильность продуцирующих моноклональные антитела гибридом in vitro и in vivo.

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА КИШЕЧНОИЕРСИНИОЗНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

4.1. Выделение и очистка.

4.2. Специфическая активность.

4.3. Иммунохимические свойства.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ - СИСТЕМ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И

СЕРОТИПИРОВАНИЯ Y. ENTEROCOLITICA.

5.1. Твердофазный иммуноферментный анализ.

5.2. Дот-иммуноанализ.

5.3. Серотипирование свежевыделенных штаммов Y. enterocolitica 03, 09, 04,32, 05,27, 06,30 сероваров в ТИФА и ДИА.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование иммунодиагностики кишечного иерсиниоза на основе моноклональных антител"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Кишечный иерсиниоз принадлежит к числу трудно диагностируемых острых инфекций и часто регистрируется под видом других заболеваний, таких как аппендицит, инфекционный гепатит, острая респираторная вирусная инфекция, скарлатина, холецистит и др. [28, 123]. Большой научный и практический интерес к кишечному иерсиниозу обусловлен широким распространением возбудителя в природе, резистентностью его к низким температурам, появлением не только спорадических заболеваний, но и крупных вспышек в организованных коллективах [21]. Трудности в постановке клинического диагноза, длительность бактериологического выделения возбудителя, перекрестная иммунореактивность с рядом других микроорганизмов являются основанием для совершенствования методов и приемов диагностики этой инфекционной болезни.

Существующие в настоящее время кишечноиерсиниозные иммунодиагностические тест-системы преимущественно сконструированы на основе кроличьих антисывороток, содержащих поликлональные антитела, или антигенов Yersinia enter ocolitica. Разработаны препараты для реакции агглютинации (РА) [16, 19, 23, 24, 109-111], эритроцитарные [34, 55, 56, 127-130], коагглютинирующие [29, 53, 95] и латексные [5, 34, 121] диагностикумы. Однако указанные препараты не всегда удовлетворяют требованиям, предъявляемым к их информативности, чувствительности и специфичности. Ввиду тесного антигенного родства возбудителя кишечного иерсиниоза с представителями родов Yersinia, Brucella, семейства Enterobacteriaceae и др. при получении специфических сывороток приходится использовать весьма трудоемкие и длительные методы адсорбции, приводящие к снижению титра антител. Источники получения сывороток, как правило, ограничены, и они трудно поддаются стандартизации. Эти недостатки можно устранить с помощью моноклональных антител (МКА) с использованием гибридомной биотехнологии.

В 80-90 годах прошлого столетия за рубежом [145, 183, 230, 235, 236] получены МКА к отдельным антигенам Y. enterocolitica, в том числе к видо- и серовароспецифическим, которые, в основном, используются для проведения научно-исследовательских работ, связанных с изучением антигенной структуры возбудителя. Лишь в последние 5 лет отечественным ученым удалось создать гибридомы, синтезирующие МКА к 09 серовару Y. enterocolitica [2, 70]. На основе МКА к 09 серовару разработан и испытан в лабораторных условиях иммунофлуоресцентный диагностический препарат [2]. Вместе с тем в распоряжении российских специалистов отсутствуют диагностические тест-системы на основе МКА к не менее важному с эпидемиологической точки зрения 03 серовару, а также к некоторым другим серовариантам кишечноиерсиниозных бактерий, циркулирующих в природе. В связи с этим получение отечественного набора МКА, имеющих научно-прикладное значение, особенно в перспективе создания на их основе диагностических тест-систем для обнаружения, идентификации и серотипирования кишечноиерсиниозных бактерий, имеет весьма актуальное значение.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

2. Модифицировать условия культивирования гибридом с целью повышения эффективности гибридизации.

3. Получить клеточные линии гибридом, стабильно продуцирующих МКА к Y. enterocolitica in vitro и in vivo.

4. Изучить иммунохимические свойства моноклональных антител.

5. Определить с помощью MICA антигенные детерминанты, отвечающие за специфичность отдельных сероваров Y. enterocolitica, установить их природу.

Получен оригинальный набор MICA, обладающих избирательной специфичностью в отношении бактерий Y. enterocolitica и его отдельных серовариантов, в том числе, имеющих эпидемиологическое значение.

Впервые установлено, что сероваропринадлежность штаммов Y. enterocolitica может определяться не только углеводами О-специфических боковых цепей бактериального липополисахарида или его коровой части, но и антигенными детерминантами белковой природы, экспрессия которых не зависит от наличия или отсутствия плазмиды pCad.

Новыми являются сведения о том, что общий для патогенных иерсиний термостабильный белок с м.м. (38 (40) ± 2) кДа содержит как видо-, так и серовароспецифические эпитопы возбудителя кишечного иерсиниоза.

Впервые выделена стабильная линия гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела, специфически взаимодействующие одновременно с двумя наиболее распространенными в России 03 и 09 серовариантами кишечноиерсиниозных бактерий.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

- Создана клонотека стабильных гибридных клеточных линий, синтезирующих МКА к антигенам Y. enterocolitica 03; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 09 сероваров, которые могут быть использованы для изучения антигенной структуры возбудителя и конструирования иммунодиагностических препаратов с целью лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза. Три линии гибридом, продуцирующих МКА к Y. enterocolitica 03 серовара (1G7.2), к Y. enterocolitica 09 серовара (1Вюл) и одновременно к обоим указанным сероварам (1C10.i), депонированы в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур (г. С.-Петербург) под номерами РККК(П) 680Д, РККК(П) 678Д, РККК(П) 679Д.

- Образцы МКА к видо- и серовароспецифическим эпитопам возбудителя кишечного иерсиниоза успешно прошли лабораторные комиссионные испытания в соответствии с программой, утвержденной директором РосНИПЧИ "Микроб" 8 января 2003 г.

- Экспериментальные иммуноферментные тест-системы для обнаружения, идентификации и серотипирования Y. enterocolitica в ТИФА и ДИА, сконструированные на основе набора МКА, апробированы на коллекционных и свежевыделенных штаммах Y. enterocolitica от больных людей и из объектов А внешней среды.

- Подана заявка на изобретение «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. РККК (П) 679Д - продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену Yersinia enterocolitica 03 и 09 сероваров» в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

- По материалам диссертации составлены методические рекомендации «Идентификация возбудителя кишечного иерсиниоза 03 и 09 сероваров в иммуноферментном анализе с помощью моноклональных антител», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (Протокол № 7 от 23 сентября 2003 г.) и утвержденные директором института 23.09.2003 г.

- Материалы диссертации используются при чтении лекций по иммунологии и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ "Микроб".

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Белково-полисахаридный комплекс (БПК) Y enterocolitica 03 серовара, выделенный методом уксуснокислого гидролиза, содержит родо-, видо- и серовароспецифические антигенные детерминаты.

2. Оптимизация схем иммунизации линейных мышей BALB/c кишечноиерсиниозными антигенами и условий селективного отбора гибридных клеток повышает эффективность слияния лимфоцитов в 10-100 раз и число гибридом, продуцирующих моноклональные антитела разной специфичности, в среднем в 10-20 раз.

3. Использование спленоцитов линейных мышей, иммунизированных корпускулярным антигеном Y. enterocolitica 03 серовара, при слиянии с сингенными мышиными миеломными клетками приводит к образованию гибридом, секретирующих моноклональные антитела не только к выше указанному, но и к ряду других серовариантов кишечноиерсиниозных бактерий.

5. Видоспецифические эпитопы Y. enterocolitica локализованы на термостабильном полипептиде, молекулярная масса которого определяется сероваром бактерий. Его синтез не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов.

6. Сконструированные на основе МКА экспериментальные иммуноферментные тест-системы позволяют проводить индикацию, идентификацию и серотипирование штаммов Y. enterocolitica с чувствительностью 3,1 • 104- 2,3 • 105 м.к./мл в ТИФА и 7,8 • 103- 2,5 ■ 105 м.к./мл в ДИА в зависимости от сероваропринадлежности микробов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на:

- Российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции МЗ РФ, Астрахань, 2001 г.

- Международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции, Алматы, 2001 г.

- Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 50-летию Дагестанской ПЧС, Махачкала, 2002 г.

- 69-й итоговой научной конференции сотрудников КГМУ и научной сессии отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН, Курск, 2004 г.

- итоговых научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб", Саратов, 2000, 2001, 2003 гг.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Уткин, Денис Валерьевич

выводы

1. Создана коллекция гибридом, стабильных продуцентов моноклональных антител к антигенам Y. enterocolitica 03; 09; 04,32; 05; 05,27 и 06,30 сероваров, которые могут быть использованы для иммунохимической характеристики бактерий и разработки иммунобиологических препаратов в целях лабораторной диагностики кишечноиерсиниозной инфекции.

2. На основе набора вид о- и серовароспецифических моноклональных антител разработаны и успешно испытаны в лабораторных условиях экспериментальные иммуноферментные тест-системы (для ТИФА и ДИА) для обнаружения, идентификации и серотипирования от 7,8 • 103 до 2,3 • 105 бактерий Y. enterocolitica^

3. С помощью поли- и моноклональных антител установлено, что белково-полисахаридный комплекс, выделенный из бактериальной массы Y. enterocolitica 03 серовара методом уксуснокислого гидролиза, обладает высокой перекрестной иммунореактивностью и содержит родо-, видо- и серовароспецифические антигенные детерминанты.

4. Экспериментально определены оптимальные схемы иммунизации линейных мышей кишечноиерсиниозным растворимым и корпускулярными антигенами, а также условия селективного отбора гибридных клеток, существенно увеличивающий эффективность слияния лимфоцитов и количество специфических антителопродуцирующих гибридом.

5. Установлено, что при слиянии сингенных миеломных клеток с иммунными спленоцитами линейных мышей, примированных корпускулярным антигеном определенного серовара кишечноиерсиниозных бактерий, образуются клоны гибридом, секретирующие моноклональные антитела как к гомологичному, так и к некоторым другим серовариантам Y. enterocolitica, значительно упрощая тем самым процедуру получения набора серовароспецифических моноклональных антител.

6. С помощью моноклональных антител в иммуноферментном анализе и иммуноблотгинге получены новые данные, свидетельствующие о том, что серовароспецифичность может определяться не только углеводными компонентами микробной клетки, но и антигенными детерминантами белковой и гликопептидной природы.

7. Показано, что кишечноиерсиниозные видоспецифические моноклональные антитела взаимодействуют с термостабильным полипептидом Y. enterocolitica, молекулярная масса которого определяется сероваром бактерий, а его экспрессия не зависит от температуры культивирования и наличия плазмиды pCad.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кишечный иерсиниоз характеризуется сложным и разнообразным симптомокомплексом, в результате чего затруднена его дифференциация от других инфекций и постановка точного клинического диагноза [123, 163, 193, 220, 231]. Из-за длительности выделения возбудителя снижена также эффективность бактериологических методов исследования [19, 69, 92, 121, 128]. Наряду с бактериологическими применяются серологические методы диагностики с использованием адсорбированных сывороток [16, 19, 27, 28, 58, 110, 111]. Последние гетерогенны по своему составу и их трудно стандартизировать. Ввиду тесного антигенного родства Y. enterocolitica с другими микроорганизмами [58, 101, 122, 123] результаты серологических исследований не всегда отличаются строгой специфичностью. Все это является основанием для совершенствования имеющихся средств и методов диагностики кишечноиерсиниозной инфекции, в том числе, разработки новых специфичных иммунодиагностических препаратов.

Одним из эффективных научных направлений, связанных с разработкой моноспецифических иммуноглобулиновых тест-систем для диагностики инфекционных болезней, является целенаправленное создание гибридом, продуцирующих МКА со специфичностью к конкретным структурным компонентам патогенных микроорганизмов [181, 182]. Комплексные препараты МКА в высоких титрах используются для изготовления высокочувствительных, точных, простых в применении и скоростных в осуществлении диагностических наборов [2, 70, 71, 80, ИЗ, 149, 165, 214, 215]. Кроме того, МКА в настоящее время становятся незаменимым инструментом для тонкой характеристики антигенной структуры микроорганизмов и количественного анализа антигенов [94, 112, 145, 155-157, 183, 235, 236]. Использование МКА для идентификации специфических иммунодоминантных структур микроорганизмов является одним из перспективных направлений в микробиологии и иммунохимии.

В этой связи основной задачей исследования было получение гибридом-продуцентов МКА к возбудителю кишечного иерсиниоза, изучение их свойств и разработка на их основе экспериментальных моноклональных диагностических иммуноферментных тест-систем.

Для получения гибридом, синтезирующих специфические антитела, были использованы сингенные плазмоцитомы Sp2/0-Ag.8, Sp2/0-Ag.l4 и В-лимфоциты (спленоциты) мышей инбредной линии BALB/c, иммунизированных как убитыми цельными клетками Y. enterocolitica 03 и 09 сероваров (корпускулярными антигенами), так и водорастворимым БПК, выделенным из биомассы Y. enterocolitica 03 серовара Н.В. Сладковой [97] методом уксуснокислого гидролиза по Р.В. White [238] в модификации Е.Э. Бахрах с соавт. [7].

БПК был взят для работы в связи с тем, что он обладал видовой специфичностью [97-99] при постановке внутрикожных аллергических проб на морских свинках, зараженных патогенными иерсиниями. При проверке специфической иммунореактивности данного антигенного комплекса в ТИФА нами было установлено, что в сыворотке крови мышей, иммунизированных БПК и микробными клетками Y. enterocolitica 03 серовара содержатся антитела к БПК в одинаковом титре - 1/25000; в сыворотке крови мышей, иммунизированных клетками других сероваров Y. enterocolitica - в титрах от 1/1600 до 1/6400; в коммерческих некишечноиерсиниозных сыворотках - в титрах до 1/512, в сыворотках людей больных ОКЗ - в титрах от 1/800 до 1/25600 в зависимости от нозологической формы. Полученные результаты свидетельствовали о присутствии в БПК Y. enterocolitica неспецифичеких эпитопов, реагирующих в ТИФА с гетерогенными антителами, несмотря на отсутствие пререкрестных реакций в аллерготестах [97-99]. Тем не менее, разная степень сероконверсии гомо- и гетерологичных сывороток указывала также на наличие в составе БПК специфических антигенных детерминант, получение антител к которым возможно с помощью гибридомной технологии.

Для стимуляции пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток, выступающих в качестве партнеров при гибридизации, варьировали различные иммунизирующие дозы, способы введения антигенов, схемы прививок. В результате установлено, что небольшие дозы БПК (2,5-5 мкг) и цельноклеточных антигенов (2 • 104 - 3,2 • 105 м.к.) приводили к выработке антител в титрах 1/800

1/1600 и 1/200 - 1/12800 соответственно. Большие дозы (100-300 мкг) также способствовали выработке антител в относительно невысоких титрах (1/1600 -1/3200), что можно объяснить известным по литературным данным феноменом иммунологической толерантности [91, 106]. Наиболее высокие титры антител зарегистрированы при в/б иммунизации мышей 25-40 мкг БПК с последующей 5-ти - 6-ти кратной прививкой в дозах 40-50 мкг (1/20480 - 1/25600) и при иммунизации п микробными клетками в дозах (1 • 10° - 5 • 10') м.к. (1/5120 - 1/25600). При в/в инъекции титры антител колебались в пределах от 1/1600 до 1/4525. Применение ПАФ не играло существенной роли в стимуляции антительного ответа. Возможно, это связано с тем, что использованный для иммунизации антиген обладал собственной адъювантной активностью за счет присутствия в нем углеводного компонента. При введении животным штаммов кишечноиерсиниозных бактерий, выращенных при температуре 37 °С, титры антител в сыворотке крови оказались выше, чем при иммунизации штаммами, выращенными при 28 °С.

Была также изучена сравнительная эффективность использования для гибридизации в качестве партнеров двух линий миеломных клеток Sp2/0-Ag.l4 и Sp2/0-Ag.8. Однако, выбор клеточной линии не влиял, существенным образом на интенсивность образования гибридом.

Известно, что эффективность гибридизации зависит от состава среды, используемой для селекции гибридных клеток сразу после слияния и, в частности, от концентрации селективного агента, подавляющего рост неслившихся миеломных клеток [112]. Нами установлено, что внесение ингибирующего агента -HAT в рекомендуемой для селекции концентрации 2 % подавляет рост не только миеломных, но и гибридных клеток. Это согласуется со сведениями о цитотоксичности аминоптерина, входящего в состав HAT, на гибридные клетки [49, 94, 112]. По данным В.А. Федоровой [112] добавление HAT на 2-3 сут после слияния повышает эффективность гибридизации. Нам также удалось добиться 100 % эффективности гибридизации при добавлении HAT на 2-3 сут после слияния, при этом количество гибридом, продуцирующих специфические антитела составило (5 ± 2) %. При культивировании гибридом на среде с 1 % HAT число гибридных клеток - продуцентов специфических МКА повысилось до (23 ± 0,3) %.

При иммунизации мышей клетками Y. enterocolitica 09 серовара и последующей гибридизации мышиных В-лимфоцитов получены гибридные клетки, продуцирующие МКА к Y. enterocolitica 09 серовара. Прививка мышам БПК Y. enterocolitica 03 серовара приводила к образованию гибридом, синтезирующих МКА к общим для 03 и 09 сероваров детерминантам (1C10.i), а также видо- (7C7.i) и родоспецифические МКА (8G7.i). При гибридизации спленоцитов мышей, иммунизированных клетками Y. enterocolitica 03 серовара, с миеломными клетками получены клоны гибридом, продуцирующие МКА к Y. enterocolitica 03; 04,32; 05,27; 06,30 сероваров. В последнем случае иммунные спленоциты, использованные в качестве партнеров для гибридизации, должны были синтезировать антитела к эпитопам, специфическим только для 03 серовара кишечноиерсиниозных бактерий. По результатам же скрининга гибридом и определения специфической активности МКА были получены гибридные клерки, синтезирующие антитела к другим сероварам Y. enterocolitica. На основании полученных данных, а также с учетом результатов исследований JI.M. Михайлова [70], Ж.Г. Самелия [94] и В.А. Федоровой с соавт. [113, 157] можно предположить, что понятие «серовароспецифические» антигены или антигенные детерминанты, широко распространенное в микробиологии, не совсем правомерно. Скорее следует вести речь о большей или меньшей степени экспрессии отдельных эпитопов, которые определяют серовароспецифичность конкретных микроорганизмов, в частности, Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis при использовании поливалентных (в том числе адсорбированных) сывороток. Отсутствие перекрестной реактивности в низких титрах МКА с кишечноиерсиниозными бактериями 07,8; 08; 013,7; 019,8 сероваров, которые отнесены к так называемой «американской группе» [190], не противоречит изложенному выше предположению, свидетельствуя об очень незначительной экспрессии характерных для них детерминант, а не об их отсутствии у Y. enterocolitica 03, что закономерно, если учесть, что они генетически и эволюционно отдалены от сероваров «европейской группы» [148]. Вполне вероятно, что расширение набора антителопродуцирующих гибридом позволит выделить МКА, обладающих высокой специфической активностью, и к представителям кишечноиерсиниозных бактерий «американской группы». Предположение о большей или меньшей степени выраженности «серовароспецифических» антигенных детерминант, а не об их наличии или отсутствии у соответствующих штаммов микроорганизмов стало возможным только при использовании гибридомной биотехнологии моноклональных антител, принципиально отличающейся от традиционного способа получения гипериммунных поликлональных диагностических сывороток.

В общей сложности в результате гибридизации, клонирования и реклонирования было отобрано 12 гибридом, продуцирующих специфические МКА к различным серовариантам возбудителя кишечного иерсиниоза: 1 клон к 03 и 09 сероварам, 3 клона - к 03 серовару, по 2 клона - к 09; 04,32; 06,30 сероварам, по 1 клону - к 05 и 05,27 сероварам и 1 клон, синтезирующий видоспецифйческие МКА (7С 7.]). Установлено, что отобранные клоны гибридом сохраняли антителопродуцируюшую активность при культивировании in vitro на протяжении 6-ти месяцев (срок наблюдения), при этом титр антител в культуральной жидкости составил от 1/160 до 1/320. При пассировании гибридом in vivo на протяжении 6-ти - 7-ми пассажей (срок наблюдения) снижались сроки асцитообразования с 13-16 до 8-9 дней, увеличивался объем асцитической жидкости с 2-3 до 5-9 мл (максимально f\ 7

12 мл). Концентрация клеток в асците составила (8-10 - 1,6 • 10 ) кл./мл. Увеличение количества асцитической жидкости, вероятно, связано с адаптацией гибридных клеток к условиям пролиферации в организме мыши. Повышалась также активность асцитической жидкости. Если после I пассажа титр антител был равен 1/12800 - 1/102400, то после VI пассажа - 1/51200 - 1/204800.

Для выделения из культуральной и асцитической жидкостей моноклональных иммуноглобулинов использовали наиболее распространенный и простой способ осаждения сульфатом аммония. В культуральной жидкости при выращивании гибридом in vitro содержание Ig составило (0,24 - 0,6) мг/мл. В иммуноасцитической жидкости концентрация Ig была от 3,18 мг/мл до 17,48 мг/мл.

Специфичность выделенных Ig была изучена на 35 штаммах Y. enterocolitica 31-го серовара, 6 штаммах Y. pseudotuberculosis 6-ти сероваров, 5 штаммах Y. pestis и 15 штаммах энтеробактерий (Е. coli, Salmonella sp., Shigella sp.). Титр специфической активности МКА в ТИФА с гомологичными сероварами составил от 1/256000 до 1/1024000, с другими сероварами - 1/125 - 1/500. При разведении МКА 1/1000 они взаимодействовали только с бактериями гомологичного серовара

Y. enterocolitica. Специфическое взаимодействие МКА наблюдалось при минимальной концентрации Ig от 0,01 мкг/мл до 0,1 мкг/мл.

В связи с тем, что МКА ряда клонов гибридом имели одинаковую специфичность был проведен эпитопный анализ. В результате установлено, что МКА 3 клонов к 03 серовару, 2 клонов - к 09, 2 клонов - к 04,32 были направлены к разным эпитопам, МКА 2 клонов к 05 и 05,27 сероварам выявляли 2 разных эпитопа у 05 и 05,27 сероваров соответственно, а МКА 2 клонов к 06,30 серовару взаимодействовали с одним эпитопом.

Как известно, сероваропринадлежность штаммов Y. enterocolitica устанавливается по реакции с типовыми О-специфическими сыворотками, полученными к соответствующим кипяченым О-антигенам и структурно обусловлена О-специфическими цепями ЛПС (О-антигена) углеводной природы [46, 51, 106, 113, 114]. Однако в последние годы получены специфические кишечноиерсиниозные МКА, взаимодействующие как с углеводными компонентами ЛПС [2, 30, 145, 169, 170, 221, 227, 230, 236], так и с белками Y. enterocolitica [163, 164, 176, 183, 192, 219, 228, 230, 235, 242]. Для установления природы специфических антигенов, к которым направлены МКА, клеточные лизаты бактерий подвергали протеолитической обработке протеиназой К в течение 3 ч при 60 °С. При этом разрушались белковые молекулы бактериальной клетки и сохранялись углеводные компоненты. Установлено, что до протеолиза все МКА реагировали с лизатами штаммов Y. enterocolitica в титрах 1/51200 - 1/102400. После протеолитической обработки образцов большинство МКА не взаимодействовали с ними, что указывало на паратопную специфичность к белковым молекулам.

Иммунохимические свойства МКА изучались методом иммуноблотгинга. Установлено, что МКА 1Сюл выявляли общий антиген гликопептидной природы с м.м. (17 ± 2) кДа у 03 и 09 сероваров. Это согласуется с данными Е. Wachter et al. [230] о направленности МКА 03+09 к полисахариду кора ЛПС. Действительно, по данным И .Я. Захаровой с соавт. [45] в препаратах, полученных уксуснокислым гидролизом по Р.В. White [238], к которым относится и БПК, содержатся О-специфические боковые цепи деградированного полисахарида и базисный полисахарид (кор).

МКА 1G4 j выявляли белок с м.м. (86 + 2) кДа Y. enterocolitica 03 и углеводный компонент м.м. 18-30 кДа того же серовара; МКА Ю72 - белки с м.м. (38 + 2) и (14 ± 2) кДа Y. enterocolitica 03, МКА 6Е7.3 - белок с м.м. (62 + 2) кДа Y. enterocolitica 03 серовара. МКА 1Вю.1 реагировали с белками м.м. (40 + 2) и (16 + 2) кДа Y. enterocolitica 09; МКА 5Gg.2 взаимодействовали как с белковой молекулой м.м. (88 ± 2) кДа , так и с углеводным компонентом м.м. 18-25 кДа Y. enterocolitica 09 серовара. МКА 2F4.1 были направлены к эпитопам белковой природы м.м (80 + 2) и (14 + 2) кДа Y. enterocolitica 04,32 и к углеводному компоненту м.м. 25-30 кДа того же серовара; МКА 6D52 - к белкам с м.м. (40 ± 2) и (80 ± 2) кДа Y. enterocolitica 04,32 и углеводному компоненту м.м. 14-20 кДа того же серовара. МКА 1C2.i взаимодействовали с белками м.м. (40 ± 2) и (18 ± 2) кДа Y. enterocolitica 05 серовара; МКА 2С9.2 - с белком м.м. (96 ± 2) кДа Y. enterocolitica 05,27 серовара. МКА ЗСцЛ и ЗСц.2 выявляли один белок с м.м. (40 + 2) кДа у Y. enterocolitica 06,30 серовара.

Данные ПААГ-ДСН показали, что представители рода Yersinia (штаммы Y. pseudotuberculosis II, IV, V, VI сероваров, Y. pestis EV НИИЭГ) имеют белок с м.м. (40 ± 2) кДа, который близок по показателю электрофоретической подвижности белкам с м.м. (38-40 + 2) кДа Y. enterocolitica. Однако ни один из указанных штаммов не взаимодействовал в ТИФА с полученными МКА. МКА 7С7Л, обладающие эпитоп-паратопной специфичностью по отношению к белкам с м.м. (38 ± 2) кДа - (40 + 2) кДа, выявляли белковые полосы у штаммов Y. enterocolitica (включая 07,8; 08; 013,7; 019,8 серовары) и не обнаруживали их у штаммов Y. pseudotuberculosis, Y. pestis EV НИИЭГ, что указывает на наличие у этого белка специфических для Y. enterocolitica эпитопов. Причем детерминанты, узнаваемые МКА 7С7л, присутствовали у большинства сероваров и на белке с м.м. (80 ± 2) кДа. Из проведенных нами исследований следует также, что белок с м.м. (40 ± 2) кДа является сложной в антигенном отношении структурой и содержит как видоспецифические для Y. enterocolitica, так и специфические для отдельных его сероваров эпитопы. Данный белок является термостабильным, его синтез не зависит от температуры культивирования бактерий (22 °С, 37 °С), а также плазмидного состава штаммов.

Для выявления и серотипирования возбудителя кишечного иерсиниоза обычно используются агглютинирующие сыворотки [16, 19, 23, 24, 27, 28, 58, 110, 111], или эритроцитарные [13, 21, 34, 54-56, 68, 76-78, 90, 97, 127, 128, 130], латексные [34, 121], коагглютинирующие [12, 29, 50, 53, 79, 95] диагностикумы, полученные к отдельным его сероварам. Иммуноферментные тест-системы на основе видо- и серовароспецифических кишечноиерсиниозных моноклональных антител в настоящее время отсутствуют, хотя являются наиболее перспективными современными иммунодиагностическими препаратами благодаря сочетанию высокой чувствительности иммуноферментного анализа и специфичности моноклональных иммуноглобулинов. В связи с этим нами были разработаны два варианта экспериментальных моноклональных тест-систем для обнаружения, идентификации и серотипирования кишечноиерсиниозных бактерий в ТИФА и ДИА.

При разработке экспериментальных иммуноферментных тест-систем были использованы МКА к К enterocolitica ОЗ (6Е7.3), 04,32 (2F4 I), 05,27 (2С92) сероваров, МКА к двум сероварам Y. enterocolitica (03+09) и видоспецифические МКА (7С71). Серовароспецифические МКА конъюгировали с пероксидазой хрена методом периодатного окисления по К.Р. Nakane and A. Kawaoi [200]. Активность -i fc меченных МКА в «сэндвич»-варианте ТИФА составила 1/6400 - 1/25600 со штаммами гомологичных сероваров. Специфическая активность видоспецифических МКА составила 1/1600 - 1/12800 со штаммами Y. enterocolitica и 1/50 - 1/100 с другими патогенными иерсиниями. С гетерогенными микроорганизмами указанные МКА не взаимодействовали. Специфичность разработанных на основе МКА экспериментальных иммуноферментных тест-систем для идентификации и серотипирования штаммов Y. enterocolitica изучали на наборе из 61 штаммов микроорганизмов ГКПБ «Микроб», бруцеллезной и туляремийной вакцин. В результате исследований было установлено, что иммуноферментные тест-системы обладали строгой специфичностью. Чувствительность экспериментальных тест-систем в ТИФА с чистыми культурами Y. enterocolitica составила (3,1 • 104 - 2,3 • 105) м.к./мл. Экспериментальные тест-системы оказались достаточно эффективными при определении Y. enterocolitica в материале, искусственно контаминированном посторонней микрофлорой. При этом бактериальные клетки Y. enterocolitica выявлялись в концентрации (6,2 • 104 -1,2 • 105) м.к./мл. Полученные результаты позволили сделать заключение о возможности их использования не только для идентификации чистых культур, но и индикации в образцах, содержащих примеси других микроорганизмов.

Были также разработаны экспериментальные иммуноферментные тест-системы для ДИА, который имеет ряд преимуществ перед ТИФА, заключающихся в простоте технического исполнения, экономичном расходовании ингредиентов реакции и исследуемого материала, экспрессности и документированное™ анализа. При определении активности МКА в ДИА с гомологичными сероварами она оказалась ниже, чем в ТИФА и соответствовала титрам 1/250 - 1/1000. Специфичность указанных тест-систем была изучена на наборе из 61 штаммов гомо- и гетерогенных микроорганизмов, бруцеллезной и туляремийной вакцин. Результаты в ДИА полностью совпали с полученными ранее данными о специфичности экспериментальных тест-систем в ТИФА, подтвердив, таким образом, соответствие разработанного дот-варианта требованиям, предъявляемым по этому показателю к диагностическим препаратам. Особое внимание было уделено способу фиксации бактерий на нитроцеллюлозной мембране, которую проводили при 110 °С в течение 10 мин или 96° этанолом 20 мин. Отмечено, что при фиксации образцов при 110 °С чувствительность тест-систем несколько выше и составила (7,8 • 103 - 1,2 • 105) м.к./мл, чем при фиксации спиртом ((1,6 • 10 -2,5 ■ 105) мгк./мл). Однако, применение способа фиксации бактериальных взвесей на мембране 96° спиртом в течение 20 мин более предпочтительно, так как не требует специального оборудования и сочетает процессы фиксации и обеззараживания. Последнее особенно важно, поскольку позволяет использовать ДИА для исследования условно-заразного или заразного материала с соблюдением правил биологической безопасности в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 [8]. Это же преимущество свидетельствует в пользу применения в практике ДИА в сравнении с ТИФА.

Заключительным этапом явилась апробация разработанных нами экспериментальных иммуноферментных моноклональных тест-систем, предназначенных для идентификации и серотипирования кишечноиерсиниозных бактерий, на 20-ти штаммах Y. enterocolitica, выделенных в период 1999-2001 гг. на территории России и Франции от больных людей и из объектов внешней среды и 14-ти штаммах Y. pseudotuberculosis, любезно предоставленных проф. Г.Я. Ценевой. Серотипирование кишечноиерсиниозных бактерий проводилось с помощью диагностической тест-системы сконструированной на основе полученных нами серовароспецифических МКА. Была подтверждена принадлежность штаммов к 03; 09; 04,32; 05,27; 06,30 сероварам. Лабораторные испытания показали, что плашечная и точечная иммуноферментные тест-системы выявляют серовары Y. enterocolitica строго соответствующие паспортным данным независимо от плазмидного состава, места, времени и источника их выделения и не обнаруживают штаммы Y. pseudotuberculosis.

Таким образом, в результате проведенных исследований получен набор стабильных линий гибридом, продуцирующих видо- и серовароспецифические кишечноиерсиниозные МКА. Полученная нами панель МКА может быть использована для конструирования не только иммуноферментных тест-систем, но и других диагностических иммуноглобулиновых препаратов -иммунофлуоресцентных, коагглютинирующих, латексных, эритроцитарных и т. д. Кроме этого, МКА весьма перспективны при разработке конкурентных методов ТИФА для обнаружения в сыворотке крови больных и пререболевших кишечным иерсиниозом людей специфических антител с целью ретроспективной диагностики этой инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Уткин, Денис Валерьевич, Саратов

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. Т. 1. Пер. с англ. - М.: Мир, 1994. - 517 с.

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

3. Бахрах Е.Э., Коробкова Е.И., Павлова Л.П. и др. Полисахаридосодержащая фракция чумного микроба как аллерген для выявления активного иммунитета у морских свинок // Тр. ин-та "Микроб". Саратов, 1960. - Вып. 4. - С. 63-65.

4. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила. СП 1.3.1285-03 // Бюлл. нормативных и методических документов. М.: Госсанэпиднадзор, 2003. - Вып. 3 (13). - С. 61144.

5. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами. Санитарные правила. СП 1.2.731-99. М.: Федеральный центр госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 1999. - 107 с.

6. Белая О.Ф., Бунин К.В., Ценева Г.Я. и др. Определение антигенов иерсиний в реакции коагглютинации при острых кишечных инфекционных заболеваниях у взрослых // Острые кишечные инфекции. Республ. сб. Ленинград, 1984. -Вып. 8.-С. 119-121.

7. Белая Ю.А., Ценева Г.Я., Сергеева Н.С. и др. Иммуноэлектрофоретический анализ антигенного состава иерсиний // ЖМЭИ. 1989, № 8. - С. 21-24.

8. Беленький А.Г. Изучение циркулирующих бактериальных антигенов и антител к ним при реактивных артритах, болезни Бехтерева и ревматоидном артрите: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1987. - 22 с.

9. Ващенок Г.И., Андрейчик Э.П., Ващенок B.C. и др. Иерсиниозы в Ленинграде // Болезни с природной очаговостью. Тр. ин-та им. Пастера. -Ленинград, 1983. Т. 60. - С. 82-87.

10. Воронцова Т.А., Хоробрых В.В. Получение гипериммунных сывороток к Yersinia enterocolitica II Лаб. дело. 1989. - № 9. - С. 70.

11. Габрилович И.М., Жугова Т.Ч. Перспективы использования бактериофагов в лабораторной диагностике иерсиниоза // Иерсиниозы: микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, лаб. диагностика: Тез. Всес. науч.-практ. конф. Владивосток, 1989.-Ч. 2.-С. 92-93.

12. Гамизаев П.А., Гасанзаде Н.П., Джаганов М.М. и др. О свойствах бактериофага, изолированного из культуры кишечного иерсиниоза // Соврем.аспекты профилактики зоонозных инфекций: Тез. докл. научн. конф. Ставрополь, 1991 г.-С. 209-211.

13. Гефан Н.Г. Приготовление и использование агглютинирующих сывороток для идентификации и типирования Yersinia enterocolitica: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Иркутск, 1996. - 17 с.

14. Гефан Н.Г., Климов В.Т., Андреевская Н.М. Об антигенном родстве Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis II Мат. науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сент. 1997 г.). Саратов, 1997.-Т. 2.-С. 27.

15. Григорьян Э.Г., Гурлева Г.Г. Определение серо- и биоваров зарубежных и отечественных штаммов Yersinia enterocolitica IIЖМЭИ. 1979, № 11. - С. 57-61.

16. Гурлева Г.Г. Упрощенный способ определения серологических вариантов Yersinia enterocolitica II Лаб. дело. 1989, № 7. - С. 70-72.

17. Гурлева Г.Г., Григорьян Э.Г., Шошиев Л.Н. Антигенные и серологические свойства Yersinia enterocolitica И ЖМЭИ. 1976, № 8. - С. 36-40.

18. Гурлева Г.Г., Колпикова Л.Д. Сравнительная оценка роста Yersinia enterocolitica на разных элективных средах // Лаб. дело. 1989, № 4. - С. 71-72.

19. Гурлева Г.Г., Смоликова Л.М., Иванютенко М.И. и др. Серологические варианты штаммов Yersinia enterocolitica, выделенных в Белорусской ССР //

20. Иерсиниозы: микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, иммунол.: Тез. Всес. науч.-практ. конф. 28-29 авг. 1986 г. Владивосток, 1986. - С. 30-31.

21. Гурлева Г.Г., Халяпина Е.Е., Смоликова Л.М. и др. Коагглютинирующие диагностикумы для серологической идентификации Yersinia enterocolitica II Лаб. дело. 1989.-№ 10.-С. 66-68.

22. Диханов Г.Г., Подладникова О.Н. Родоспецифический ДНК-зонд для детекции иерсиний // Молекул, биология. 1990. - Т. 24, Вып. 4. - С. 1010-1016.

23. Доморадский И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы. -Саратов, 1993.- 130 с.

24. Драновская Е.А., Лапина Е.Б., Желудков М.М. и др. Сравнительная характеристика серологически активных компонентов представителей Бруцелла и Иерсиния // Соврем, аспекты профилакт. зоонозных инфекций. Тез. докл. науч. конф. Ставрополь, 1991. - С. 24-25.

25. Дунаев В.И., Амеркулов И.А. Антигенное родство Yersinia enterocolitica с родом Brucella II Акт. вопр. инф. патологии. Саратов, 1981. - Ч. 1. - С. 58-60.

26. Дунаев В.И., Ющенко Г.В. Биологические свойства выделенных от людей штаммов Yersinia enterocolitica IIЖМЭИ. 1977, № 7. - С. 85-88.

27. Желудков М.М. Значение перекрестных реакций в оценке серологической диагностики бруцеллеза у людей // ЖМЭИ. 1982, № 7. - С. 57-61.

28. Желудков М.М. К вопросу об антигенном родстве возбудителей бруцеллеза и иерсиния энтероколитика серотип 9 // Соврем, проблемы зоонозных инфекций. Всес. межведомственная конф. (Симферополь 28-29 мая 1981 г.): Тез. докл. -Москва, 1981.-С. 98-99.

29. Желудков М.М., Чернышева М.И. Использование аллерготеста in vitro для дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза у людей // ЖМЭИ. -1985, №2.- С. 92-95.

30. Жугова Т.Ч., Габрилович И.М. К вопросу о фаготипировании Yersinia enterocolitica II ООИ на Кавказе: Тез. докл. V краевой науч.-практ. конф., поев. 50-летию образования противочумной службы Кавказа (17-20 сент. 1985 г.). -Ставрополь, 1985. С. 90-91.

31. Зайденов В.А., Игнатьева Г.А., Новиков В.И. и др. Эпитопный анализ капсульного антигена чумного микроба с помощью панели моноклональных антител // Ген., микробиол. и совершенствование методов лаб. диагностики ООИ. -Саратов, 1991.-С. 69-71.

32. Захарова И .Я., Варбанец Л.Д. Углеводсодержащие биополимеры мембран бактерий. Киев, Наукова думка. - 1983. - 128 с.

33. Захарова И.Я., Косенко J1.B. Методы изучения микробных полисахаридов. -Киев, Наукова думка. 1982. - 192 с.

34. Иммунологические методы / Под ред. Фримеля Г. Пер. с нем. Тарасова А.П. -М.: Медицина, 1987. 472 с.

35. Иммунологические методы исследований / Под ред. Лефковитса И., Перниса Б. Пер. с англ. под ред. Михайлова А.Т. М.: Мир, 1988. - 528 с.

36. Иммунология: В 3-х т. / Под ред. Пола У. Пер. с англ. М.: Мир. - Т. 3, 1989. -360 с.

37. Климанова Е.М., Лаврова К.В. Сравнительный анализ доступных методов диагностики иерсиниозов у детей // Материалы VII съезда Всерос. общ-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (28-31 янв. 1997 г.). М., 1997. -Т. 1.-С. 451.

38. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Структура липополисахаридов грам-негативных бактерий. III Структура О-антигенов: Обзор. 1994, 3, Биохимия, Вып. 12. -С. 1784-1851.

39. Королюк A.M. Применение реакции коагглютинации для обнаружения и быстрой идентификации возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза // Лаб. дело. 1984, № 4. - С. 250-252.

40. Королюк A.M., Головачева С.Н., Дулатова М.В. Серологическая диагностика кишечного иерсиниоза. Конструирование стабильного эритроцитарного препарата для реакции непрямой гемагглютинации // ЖМЭИ. 1989, № 3. - С. 30-34.

41. Королюк A.M., Головачева С.Н., Дулатова М.В. и др. Сухой эритроцитарный кишечноиерсиниозный диагностикум // Тр. ин-та им. Пастера. Ленинград, 1981. -Т. 56.- С. 67-70.

42. Королюк A.M., Михайлов Н.В., Мирошниченко И.В. Диагностическая ценность ПЦР при иерсиниозах //Материалы VII съезда Всерос. общ-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (28- 31 янв. 1997 г.). М., 1997. -Т. 1. - С. 380-381.

43. Королюк A.M., Стрелкова М.Р. Кишечный иереиниоз: современное состояние проблемы // Острые кишечные инфекции: Республиканский сб., Вып. 3. -Ленинград, 1979. С. 8-18.

44. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н., Китаев В.М. Выделение штаммов Yersinia intermedia с плазмидой молекулярной массы 82 мегадальтон в природных популяциях иерсиний // ЖМЭИ. 1990, № 11. - С. 12-16.

45. Кульберг А .Я. Регуляция иммунного ответа. М.: Медицина, 1986. - 223 с.

46. Кэбот Е.А., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. Пер. с англ. В.И. Левенсона. Под ред. д-ра биол. наук Н.В. Холчева. М.: Медицина, 1968. -684 с.

47. Марамович А.С., Лысанов Ю.И., Климов В.Т. и др. Эпидемиология иерсиниозов: Обзор литературы // Инфекционные и паразитарные болезни. Экспресс-информ. 1990. - Вып. 4. - С. 1-20.

48. Миронова Л.П., Меринов С.П., Коха A.M. Антигенные взаимосвязи у представителей рода Yersinia II Иерсиниозы: микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, иммунол.: Тез. Всес. науч.-практ. конф. 28-29 авг. 1986 г. Владивосток, 1986. - С. 51-53.

49. Митрикова Л.А., Ценева Г.Я., Куляшова Л.Б. и др. Распространенность иерсиний и их серологические варианты у больных острыми кишечными заболеваниями неустановленной этиологии в Ленинграде // ЖМЭИ. 1989, № 8. -С. 17-20.

50. Михайлов Л.М. Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам Brucella abortus 19ВА: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Саратов, 1999. 26 с.

51. Нагиева Ф.Г., Шафикова Р.А., Никулина В.Г. и др. Моноклональные антитела к Chlamidia psittaci: получение, характеристика и применение // ЖМЭИ. 1991. -№ 10.-С. 58-61.

52. Недугова Г.И. Количественный метод определения иммунных комплексов // Иерсиниозы: микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, лаб. диагностика: Тез. Всес. науч.-практ. конф. Владивосток, 1989. - Ч. 2. - С. 114.

53. Новоселова Е.Ю., Басова Н.Н., Разработка антигенных иерсиниозных эритроцитарных диагностикумов // Иерсиниозы: микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, иммунол.: Тез. Всес. науч.-практ. конф. 28-29 авг. 1986 г. Владивосток, 1986.-С. 90-91.

54. Образцова Е.М. Антигенные эритроцитарные препараты для обнаружения антител Yersinia enterocolitica сероваров 0:5; 0:7,8; 0:6,30 // ЖМЭИ. 1993, № 6. -С. 91-92.

55. Определение антигенов иерсиний в реакции коагглютинации при острых кишечных заболеваниях у взрослых // Острые кишечные инфекции: Республ. сб. -Ленинград, 1984. Вып. 8. - С. 119-121.

56. Плохинский Н.А. Биометрия. 2-е изд. (Пособие для ст-ов биол. специальностей ун-тов). М.: Изд-во Моск. ун-та, 1970. - 367 с.

57. Попов Ю.А. Конструирование и использование ДНК-зондов на представителях рода Yersinia II Генетика, микробиол. и совершенствование лаб. диагностики ООИ. Саратов, 1991. - С. 3-13.

58. Проценко С.Л. Биологические свойства возбудителя кишечного иерсиниоза из очагов чумы Кавказа и Закавказья: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 1990.- 14 с.

59. Путилина Н.Г. Сравнительное изучение растворимых антигенов и некоторых бактерий кишечной группы // Акт. вопр. эпидемиол. инф. болезней. М., 1980. -Вып. 8. - С. 37-39.

60. Путилина Н.Г., Кулагин П.П. Выделение видоспецифических антигенов бактерий иерсиния энтероколитика // Эпидемиология, клиника, диагностика и профилактика антропонозных и зоонозных инфекций (Мат. конф.). Астрахань, 1982.-С. 220-221.

61. Путилина Н.Г., Кулагин П.П., Буркин B.C. и др. Иммунохимическая характеристика водорастворимых антигенов Yersinia enterocolitica II ЖМЭИ. -1982, № 1.-С. 83-86.

62. Рамазанова Б.А., Бейлбаева M.JI. Изучение распространенности энтеротоксигенных стафилококков в родильных домах // "Бактериальные токсины": Тез. 2-й Всес. конф. (27-30 нояб. 1989 г.). Юрмала, 1989. - С. 109.

63. Реакции непрямой иммунофлюоресценции при иерсиниозах. Методические рекомендации / Сост.: Г.Я. Ценева, Г.Г. Гурлева. Ленинград, 1986. - 14 с.

64. Ройт А. Основы иммунологии. Пер. с англ. -М.: Мир, 1991. 328 с.

65. Рычнев В.Е., Притулина Ю.Г. Псевдотуберкулез и иерсиниоз в Воронежской области // Иерсиниозы: микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, иммунол.: Тез. Всес. науч.-практ. конф. 28-29 авг. 1986 г. Владивосток, 1986. - С. 63-64.

66. Самелия Ж.Г. Изучение антигенной структуры различных серовариантов возбудителя псевдотуберкулеза с использованием поли- и моноклональных антител: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2002. - 23 с.

67. Славчев Г. Доказване на Yersinia enterocolitica серотип 0:3 в мляко и млечни продукта посредством коаглутинационния тест//Вет. сбирка. 1989. - Т. 87, № 6. -С. 48-50.

68. Славчев Г., Димитрова 3. Доказване на Yersinia enterocolitica в мляко и млечни продукта чрез ензим-свързан иммуносорбенен метод // Вет. сбирка. 1988. - № 5. -С. 55-57.

69. Сладкова Н.В. Алл ер го диагностика кишечного иерсиниоза в методах in vivo и in vitro: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1991. - 20 с.

70. Сладкова Н.В. Морская свинка как биомодель кишечного иерсиниоза // Биотехнология, иммунология и биохимия ООИ. Саратов, 1989. - С. 163-165.

71. Сладкова Н.В., Дальвадянц С.М., Пономарев Н.Г. Аллергодиагностика иерсиниоза // Иерсиниозы: микробиол., эпидемиол., клиника, патогенез, лаб. диагностика: Тез. Всес. науч.-практ. конф. Владивосток, 1989. - Ч. 2. - С. 66-67.

72. Смирнов И.В., Горохов В.И. Диагностическая сыворотка с антителами к вирулентным иерсиниям // Лаб. дело. 1990. - № 10. - С. 66-68.

73. Соколова Е.Е. Изучение перекрестных серологических реакций, вызываемых Yersinia enterocolitica О 9 и бруцеллами: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1986.-21 с.

74. Сомов Г.П., Беседнова Н.Н. Иерсиниозы в СССР // Иерсиниозы: микробиол.,эпидемиол., клиника, патогенез, лаб. диагностика: Тез. Всес. науч.-практ. конф. -Владивосток, 1989. Ч. 1. - С. 3-6.

75. Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир, 1991. - 544 с.

76. Тимаков В. Д., Левашев B.C., Борисов Л.Б. Микробиология. М.: Медицина, 1983.-512 с.

77. Тимофеева Л.А., Миронова Л.П., Гайдукова Н.С. Характеристика штаммов Yersinia enterocolitica, выделенных от животных в Сахалинской области и Хабаровском крае // ЖМЭИ. 1975, № 7. - С. 130-131.

78. Тюменцев С.Н., Андреевская Н.М., Миронова Л.П. и др. Моноспецифичекие агглютинирующие сыворотки для идентификации штаммов иерсиний // Лаб. дело.-1991,№ 1.-С. 57-58.

79. Федорова В.А. Получение и научно-прикладное значение моноклональных антител к липополисахариду Yersinia pestis: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Саратов, 1994. 23 с.

80. Федорова В.А., Самелия Ж.Г., Девдариани З.Л. Получение и характеристика моноклональных антител к серовароспецифическим детерминантам Yersinia pseudotuberculosis II Chinese journal of control of endemic disease. 1999. - V. 14. -P. 181-182.

81. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М., Изд-во «Высшая школа». - 1969. -574 с.

82. Фролова Г.М., Горшкова Р.П., Калмыкова Е.Н. и др. Иммунохимическое изучение липополисахаридов Yersinia enterocolitica сероваров 0:5 и 0:5,27 // ЖМЭИ. 1988. - № 12. - С. 90-94.

83. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез (Пособие для врачей). Санкт-Петербург. - 1992. - 58 с.

84. Ценева Г.Я., Куляшова Л.Б. Новые иммуноглобулиновые тест-системы в диагностике псевдотуберкулеза и иерсиниоза // Иммунология и специфическая профилактика ООИ: Мат. Рос. науч. конф. (21-23 сент. 1993 г., Саратов). Саратов, 1993.-С. 243-244.

85. Ценева Г.Я., Смирнов И.В., Куляшова Л.Б. Вирулентность иерсиний и актуальные вопросы ранней диагностики иерсиниоза // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ: Тез. докл., Волгоград 21-22 окт. 1992 г. -Волгоград, 1992. С. 173.

86. Шарапова Т.А., Алексеева Н.Т. К биохимической характеристике штаммов Yersinia enterocolitica, выделенных в Приморском крае // ЖМЭИ. 1983, № 8. -С. 50-53.

87. Шпилюк Г.Ф., Головеткина Т.Н., Володина И.К. и др. Иммуноглобулиновые латексные препараты для экспресс-диагностики иерсиниозов // ЖМЭИ. 1993, № 6. - С. 92-93.

88. Ющенко Г.В. Актуальные вопросы эпидемиологии и клиники иерсиниоза // Эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания. М.: ВНИИМИ, 1984.-Вып. 4.-53 с.

89. Ющенко Г.В. Кишечные иерсиниозы / Науч. обзор под ред. В.И. Покровского. М., 1977. - 84 с.

90. Ющенко Г.В. Особенности эпидемического процесса при псевдотуберкулезе и иерсиниозе // Мат. VII съезда Всерос. общ-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 28-31 янв. 1997 г. М., 1997. - Т. 1. - С. 100-101.

91. Ющенко Г.В., Дунаев В.И. Об антигенном родстве возбудителя псевдотуберкулеза и иерсиний с некоторыми представителями семейства кишечных бактерий // Эпидемиол. и профил. киш. инф. Таллин, 1979. - С. 304305.

92. Ющенко Г.В., Дунаев В.И. Об антигенном родстве Yersinia enterocolitica с родом сальмонелл // Пищевые токсикоинфекции. Саратов, 1979. - С. 22-23.

93. Янькова В.И. Антигены Yersinia enterocolitica и разработка на их основе эритроцитарных диагностикумов: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Владивосток, 1990.-20 с.

94. Янькова В.И., Бениова С.Н., Андреева JI.A. и др. Разработка и характеристика эритроцитарных антигенных диагностикумов для выявления кишечного иерсиниоза // ЖМЭИ. 1991, № 4. - С. 83-84.

95. Acker G., Knapp W., Wartenberg К. et al. Localization of enterobacterial common antigen in Yersinia enterocolitica by the immunoferitin technique // J. Of Bacteriology. -1981,-V. 147, №2.-P. 602-611.

96. Ahvonen P., Jansson E. Cross-reaction between Brucella and a subtype of Yersinia enterocolitica // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968. - V. 21, suppl. № 101. - P. 57.

97. Ahvonen P., Jansson E., Aho K. Marced cross agglutination between Brucella and a subtype of Yersinia enterocolitica // Acta Path. Microbiol. Scand. 1969. - V. 75, №2.-P. 291-295.

98. Ahvonen P., Sievers S. Yersinia enterocolitica infectio associated with Brucella agglutinins // Acta med. scand. 1969. - V. 185. - P. 121-125.

99. Aleksis S., Bockemiihl J. Diagnostic importance of H-antigens in Yersinia enterocolitica and other Yersinia species // Contrib. Microbiol. Immunol. 1987. - V. 9. -P. 279-284.

100. Aleksis S., Bockemiihl J. Proposed revision on the Wauters et al. antigenic scheme for serotyping of Yersinia enterocolitica II J. Clin. Microbiol. 1984. - V. 20, № 1. -P. 99-102.

101. Aleksis S., Bockemiihl J., Lange F. Studies on the serology of flagellar antigens of Yersinia enterocolitica and related Yersinia species // Zbl. Bact. Hyg. А. 1986. -B. 261.-S. 299-310.

102. Aulisio C.G., Hill W.E., Stanfield J.T. et al. Evaluation of Virulence Factor Testing and Characteristics of Pathogenicity in Yersinia enterocolitica II Infect. Immunit. -1983.-V. 40, № 1.-P. 330-335.

103. Barea D., Watanabe I. Vibriocidal antibodies induced by Yersinia enterocolitica serotype 9 // J. Hyg. Camb. 1972. - V. 70, № 1. - P. 161-169.

104. Bolin J., Norlander L., Wolf-Watz H. Temperature inducible Other-Membrane Proteins of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica is associated with the virulence plasmid // Infect. Immunol. 1982. - V. 37, № 2. - P. 506 - 512.

105. Bottone E., Shechan D. Yersinia enterocolitica-Guidelines for serological diagnosis of Human infections // Rev. Infect. Dis. 1983. - V. 5, № 5. - P. 898-906.

106. Braduri S., Cottrell B. Screening and direct isolation of plasmid-bearing virulent serotypes of Yersinia enterocolitica from various foods // Nederlands Tijdschrift voor.

107. Medische Microbiologic: 7-th Int. Congress on Yersinia. 1998. - Suppl. II, V. 6. -Nijmegen, June 14-16, 1998. - P. 14.

108. Bundle D.R., Gidney M.A., Репу M.B. et al. Serological Comfirmation of Brucella abortus and Yersinia enterocolitica 0:9 O-Antigens by Monoclonal Antibodies // Infect. Immunit. 1984. - V. 46, № 2. - P. 389-393.

109. Cafferkey M.T., Buckley T.F. Comparison of Salin Agglutination, Antibody to Human Gammaglobulin, and Immunofluorescence Tests in the Routine Serological Diagnosis of Yersiniosis // J. Inf. Diseases. 1987. - V. 157, № 5. - P. 845-848.

110. Carlsson H.E., Hurvell В., Lindberg A.A. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for titration of antibodies against Brucella abortus and Yersinia enterocolitica II Acta Pathol. Microbiol. Scand. С. 1976. - V. 84. - P. 168-176.

111. Caugant D.A., Aleksis S., Mollaret H.H. et al. Clonal Diversity and Relationships among Strains of Yersinia enterocolitica II J. Of Clinical Microbiology. 1989. - V. 27, № 12.-P. 2678-2683.

112. Chacumpa W., Srimanote P., Sakolvaree Y. et al. Rapid diagnosis of cholera caused by Vibrio cholerae 0139 // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36 (12). - P. 3595-3600.

113. Corbel M. Immunogenological properties of an antigen from Yersinia enterocoliticaserotype 9 cross-reacting with Brucella species agglutinogens // Contrib. Microbiol. Immunol. 1973. № 2. - P. 150-156.

114. Corbel M. The relationship between the protective and cross-reacting antigens of Brucella spp., Yersinia enterocolitica 09 and Salmonella serotypes of Kauffmann -White group N // Contrib. Microbiol. Immunol. 1979. - № 5. - P. 50-63.

115. Corbel M. The serological relationship between Brucella spp., Yersinia enterocolitica serotype 09 and salmonella serotypes of Kauffmann White group N // J. Hyg. Camb. - 1975. - V. 75, № l.-P. 151-171.

116. Cripenberg M., Nissenen A., Valsanen E. et al. Demonstration of antibodies against Yersinia enterocolitica LPS in human sera by enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. 1979. - V. 10, № 3. - P. 279-285.

117. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Development, characterisation and diagnostic application of monoclonal antibodies against Yersinia pestis fibrinolysin and coagulase // J. Med. Microbiol. 2000. - V. 49. - P. 261-269.

118. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. New genes involved in Yersinia pestis fraction I biosynthesis // J. Med. Microbiol. 2001. - V. 50. - P. 969-978.

119. Feodorova V.A., Samelija J.G., Devdariani Z.L. Heat-stable serogroup-specific proteins of Yersinia pseudotuberculosis И J. Med. Microbiol. 2003. - V. 52. - P. 389395.

120. Fernandez-Lago L., Moriyon I., Toyos J. et al. Immunological identity of Brucella native hapten, polisaccharide B, and Yersinia enterocolitica serotype 9 native hapten // Infect. Immunit. 1982. - V. 38, № 2.- P. 778-780.

121. Fernandez-Lago L., Rodriguez-Nebreda M.S., Chordi A. Rapid serotyping of enteropathogenic Yersinia enterocolitica strains by co-agglutination //Ann. Inst. Pasteur. 1988. - V. 139, № 4. - P. 461-471.

122. Granfors K.V., Viljanen M.K., Ahvonen P. et al. Measurement of Ig M and Ig G Antibodies to Yersinia by Solid-Phase Radioimmunoassay // J. Inf. Dis. 1978. - V. 138, № 2. - P. 232-236.

123. Grant Т., Bennett-Wood V., Robins-Browne R.M. Identification of Virulence-Associated Characteristics in Clinical Virulence Markers // Infect. Immun. 1998. -V. 66, №3.-P. 1113-1120.

124. Hartland E.L., Bordun A.-M., Robins-Brown R.M. Contribution of YopB to Virulence of Yersinia enterocolitica И Infect. Immunit. 1996. - V. 64, № 6. - P. 23082314.

125. Hasan J.A., Huq A., Nair G.B. et al. Development and testing of monoclonal antibody-based rapid immunodiagnostic test kits for direct detection of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // J. Clin Microbiol. 1995. - V. 33 (11). - P. 2935-2939.

126. Heesemann J., Gross U., Schmidt N. Immunochemical Analysis of Plasmid-Encoded Proteins Released by Enteropathogenic Yersinia sp. Grown in Calcium-Deficient Media // Infect. Immunit. 1986. - V. 54, № 2. - P. 561-567.

127. Hoogkamp-Korstanje J.A.A., de Koning J., Samson J.P. Incidence of Human Infection with Yersinia enterocolitica Serotipes ОЗ, 08, and 09 and the Use of Indirekt Immunofluorescence in Diagnosis // J. Infect. Diseases. 1986. - V. 153, № 1. - P. 138141.

128. Hurvell В., Lindberg A.A. Serological cross-reactions between different Brucella species and Yersinia enterocolitica II Acta Pathol. Microbiol. Scand. B. 1973. - V. 81. -P. 113-119.

129. Kaneko S., Ishizaki N., Kokubo Y. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from pork using polymerase chain reaction // 6-th Int. Symp. on Yersinia, 26-28 Sept. 1994, Rome, Italy, 1994. P. 67.

130. Kaneko S., Maruyama T. Evaluation of Enzime Immunoassay for the Detection of Pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis Strains // J. Clin. Microbiol. 1989. - V. 27, № 4. - P. 748-751.

131. Kapperud G., Nesbakken Т., Aleksis S. et al. Comparison of Restriction Endonuclease Analysis and Phenotypic Typing Methods for Differentiation of Isolates // J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28, № 6. - P. 1125-1131.

132. Kapperud G., Vardund T. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in food, water, and faeces by nested polymerase chain reaction // 6-th Int. Symp. on Yersinia, 2628 Sept. 1994, Rome, Italy, 1994. P. 40.

133. Karlsson K., Hurvell В., Thai E. On the detection of Yersinia enterocolitica by the immunofluorescent method // Contrib. Microbiol. Immunol. 1973. - № 2. - P. 71-75.

134. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused celles secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - V. 256. - P. 495-497.

135. Kohler G., Milstein C. Derivation of specific antibody producing tissue culture and tumor lines by cell fusion // Eur. J. Immunol. - 1976. - V. 6. - P. 511-519.

136. Kooi C., Socol P. Characterization of monoclonal antibodies to Yersinia * enterocolitica iron-regulated protein // Can. J. Microbiol. 1995. - V. 41, № 7. - P. 562571.

137. Kwaga J., Iversen J.O., Mirsa V. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by polymerase chain reaction and digoxigenin-labeled polynucleotide probes // J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30, № 10. - P. 2668-2673.

138. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227, № 15. - P. 680-685.

139. Lahesmaa-Rantala R., Heesemann J., Lehtonen O.P. et al. Avidity of antibodies against released proteins of Yersinia spp: comparison of patients with or without reactive arthritis //Ann. Rhem. Diseases. 1989. -V. 48. - P. 1003-1005.

140. Lange S., Gunnarsson H., Larsson P. et al. Diffusion in gel enzymlinked immunosorbent assay (DIG-ELISA) for detection of antibodies to Yersinia enterocolitica ОЗ // Acta Pathol. Microbiol. Scand. -1981. V. 89, № 2. - P. 63-66.

141. Le Minor L., Chalon A.-M., Veron M. Recherches sur la presence de l'antigene commun des "Enterobacteriaceae" (antigene Kunin) chez les "Yersinia", "Levinia", "Aeromonas" et " Vibrio" // Ann. Inst. Pasteur. 1972. - V. 123, № 6. - P. 761-774.

142. Li S.-R., Dorrel N., Everest P.H. et al. Construction and Characterization of a Yersinia enterocolitica 0:8 High-Temperature Requirement (htrA) Isogenic Mutant // Infect. Immunit. 1996. - V. 64, № 6. - P. 2088-2094.

143. Maki-Ikola O., Heesemann J., Lahesmaa R. et al. Combined Use of Released Proteins and Lipopolysaccaride in Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Serologic Screening of Yersinia Infections // J. Inf. Dis. 1991. - V. 163, № 2. - P. 409-412.

144. Maki-Ikola O., Pulz M., Heesemann J. et al. Antibodies response against 26 and 46 kilodalton released proteins of Yersinia in Yersinia triggered reactive arthritis // Ann. Rheum. Dis. 1992. - V. 51, № 11. - Suppl. 1. - P. 1247-1249.

145. Mattila P.S., Valtonen V., Tuori M.-R. et al. Antibody responses in arthritic and uncomplicated Yersinia enterocolitica infections // J. Clin. Immunol. 1985. - V. 5. -P. 404-411.

146. Melby К. Detection of antibodies to Yersinia enterocolitica by single radial diffusion in gel and peroxidase labelled antibodies // Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C. 1985. - V. 93. - P. 225-227.

147. Miliotis M.D., Galen J.E., Kaper J.B. et al. Development and Testing of a Synthetic Oligonucleotide Probe for the Detection of Pathogenic Yersinia Strains // J. Clin. Microbiol. 1989. - V. 27, № 7. - P. 1667-1670.

148. Mittal K., Tizard J. Serologic Response of Pigs to Experimental Infection withi

149. Yersinia enterocolitica serotype 09 and Brucella abortus II Amer. J. Vet. Res. 1981. -V. 42, №3.-P. 443-446. j

150. Mollaret H.H., Nicolle P. Sur la frequence de la lysogenie dans l'espece nouvelle Yersinia enterocolitica II C.R. Acad. Sci. 1965. - V. 260. - P. 1027-1029.

151. Nakajaima H., Inoue M., Mori T. et al. Detection and identification of Yersinia pseudotuberculosis and pathogenic Yersinia enterocolitica by an improved polymerase chain reaction method // J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30, № 9. - P. 2484-2486.

152. Nakane P.K., Kawaoi AJ Peroxidase-labelled antibody: a new method of conjugation // J. Histochem. Cytodhem. 1974. - V. 22. - P. 1084-1091.

153. Naumann M., Hanski Ch., friedrich B. et al. A rapid in situ expression test forvirulence-associated proteins of tersinia enterocolitica II J. Micribiol. Meth. 1990. i1. V. 11,№2.-P. 83-93.

154. Nicolle P., Mollaret H.H., Brault J. Nouveux resultats sur la lysotypie de Yersinia enterocolitica portant sur plus de 4000 souches d'origines diverses // Rev. Epidem. et Sante Publ. 1976. - V. 24. - P. 479-496.

155. Nicolle P., Mollaret H.H., Brault J. Sur la parente lysotipique entre les souches humaines et des souches porcines de Yersinia enterocolitica II Int. Symp. on Pseudotuberculosis, Karger edit, Bale. 1968. - P. 357-360.

156. Nicolle P., Mollaret H.H., Hamon G. et al. Etude lysogenique, bacteriocinogenique et lysotipique de l'espece Yersinia enterocolitica //Ann. Inst. Pasteur. 1967. - V. 112. -P. 86-92.

157. Nielsen В., Heisel C. Detection of Yersinia enterocolitica 0:3 specific antibodies in pigs by an indirect LPS ELISA // 6-th Int. Symp. on Yersinia, 26-28 Sept. 1994, Rome, Italy, 1994. P. 34.

158. Nilehn B. Studies on Yersinia enterocolitica II Acta Path. Microbiol. Scand., suppl. 1969. - V. 206. - P. 1-48.

159. Nilehn В., Erison C. Studies on Yersinia enterocolitica bacteriophages liberated from chloroform treated cultures // Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 1969. - V. 75, № l.-P. 177-187.

160. Odinot P., Meis J., Hurk P.U.D. et al. PCR-based fingerprinting discriminates between different biotypes of Yersinia enterocolitica // 6-th Int. Symp. on Yersinia, 2628 Sept. 1994, Rome, Italy, 1994. P. 40.

161. Paerregaard A., Espersen F., Baek L. et ai. Crossed immunoelectrophoretic analysis of Yersinia enterocolitica serotype 0:3 antigens //APMIS. 1988. - V. 96. - P. 306-314.

162. Paerregaard A., Shand G.H., Gaarsbev K. Serodiagnosis of Yersinia enterocolitica 0:3 infection. Comparison of crossed immunoelectrophoresis enzyme linked immunosorbent assays and tube agglutination // J. Clin. Microbiol. 1991. - V. 29. -P. 302-309.

163. Perry R.D., Brubeker R.R. Vwa+ Phenotype of Yersinia enterocolitica II Infect. Immunit. 1983. - V. 40, № 1. - P. 166-171.

164. Qadri F., Hasan J.A., Hossain J. et al. Evaluation of the monoclonal antibody-based kit Bengal SMART for rapid detection of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal in stool samples // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33 (3). - P. 732-734.

165. Robins-Browne R.M., Miliotis M.D., Cianciosi S. et al. Evaluation of DNA Colony Hybridisation and Other Techniques for Detection of Virulence in Yersinia Species // J. Clin. Microbiol. 1989. - V. 27, № 4. - P. 644-650.

166. Roggenkamp A., Gieger A.M. Leitritz L. et al. Passive Immunity to Infection with Yersinia spp. Mediated by Anti-Recombinant V Antigen Is Dependent on Polymorphism of V Antigen // Infect. Immunit. 1997. - V. 65, № 2. - P. 446-451.

167. Roggenkamp A., Neuberger H.-R., Fltigel A. et al. Substitution of two histidine residues in YadA protein of Yersinia enterocolitica abrogates collagen binding, cell adherence and mouse virulence // Mol. Microbiol. 1995. - V. 16. - P. 1207-1219.

168. Ruckdeschel K., Roggenkamp A., Schubert S et al. Differential Contribution of Yersinia enterocolitica Virulence Factors to Evasion of Microbicidal Action of Neutrophils // Infect. Immunit. 1996. - V. 64, № 3. - P. 724-733.

169. Russmann H., Ruckdeschel K., Heesemann J. Translocation of Yersinia enterocolitica trough an Endothelial Monolaer by Polymorphonuclear Leukocytes // Infect. Immunit. 1996. - V. 64, № 3. - P. 1016-1019.

170. Sandulache R., Marx A. Immunochemical studies on a Yersinia enterocolitica 09 lipopolysaccharide cross-reacting with Brucella abortus and Vibrio cholerae extracts // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129B. - P. 425-435.

171. Schleifstein J., Coleman M.B. An unidentified microorganism ressembling B.Lignieri and Pasteurella pseudotuberculosis and pathogenic for man // N.Y. State J. Med. 1939. - V. 39. - P. 1749-1753.

172. Schmiel D.H., Wagar E., Karamanou L. et al. Phospholipase A of Yersinia enterocolitica. Contributes to Pathogenesis in a Mouse Model // Infect. Immun. 1998. -V. 66, №8.-P. 3941-3951.

173. Skurnik M., Toivanen P. Yersinia enterocolitica lipopolysaccharide: genetics and virulence // Trends. Microbiol. 1993. - V. 1, № 4. - P. 148-152.

174. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and someapplication // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

175. Wachter E., Brade V. Influence of Surface Modulations by Enzymes and Monoclonal Antibodies on Alternative Complement Pathway Activation by Yersinia enterocolitica И Infect. Immunit. 1989. - V. 57, № 7. - P. 1984-1989.

176. Wakerfield D., Stahleberg Т.Н., Toivanen A. et al Serological evidence of Yersinia infection in pations with anterior uveitis // Arch. Ophthalmol. 1990. - V. 108, № 2. -P. 219-221.

177. Wauters G. Antigens of Yersinia enterocolitica // Bottone E.J. (ed.) Yersinia enterocolitica CRC Press Luc., Boca Raton, E.L.A. 1981. - P. 41-53.

178. Wauters G., Le Minor L., Chalon A.M. Antigenes somatiques et flagellaires des Yersinia enterocolitica И Ann. Inst. Pasteur. 1971. - V. 120, № 5. - P. 631-642.

179. Wauters G., Le Minor L., Chalon A.M. et al. Supplement au schema antigenique de "Yersinia enterocolitica" И Ann. Inst. Pasteur. 1972. - V. 122, № 5. - P. 951-956.

180. Weninger J., Schoemer C., Wartenberg K. et al. Detection of cross-reacting epitopes on plasmid-encoded outer membrane proteins of enteropathogenic Yersinia by monoclonal antibodies I I Med. Microbiol. Immunol. 1989. - V. 178, № 1. - P. 45-51.

181. Weninger J., Wartenberg K., Rollinghoff M. Immunological characterization of Yersinia enterocolitica 0:9 and 0:3 LPS antigens by monoclonal antibodies // Zbl. Bacterid., Microbiol, und Hyg. 1988. - B. 269, № 3. - S. 298-313.

182. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharide. Extraction with phenol water and further applications of the procedure // Meth. Carbohydr. Chem. 1965. - V. 5. -P. 83-91.

183. White P.B. Observation on the polisaccharide complex and variants of Vibrio cholerae // Brit. J. exp. Pathol. 1936. - V. 17. - P. 229-234.

184. Winblad S. Yersinia enterocolitica (synonims: "Pasteurella X", Bacterium enterocoliticum 0:8) // Methods in Microbiol. 1978. - V. 12. - P. 37-50.

185. Wren B.W., Tabaqchali S. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by the polymerase chain reaction // Lancet. 1990. - V. 336. - P. 693.

186. Yamaguchi H., Yamamoto Т., Taguchi H. et al. Yersinia enterocolitica immunodominant 60 kDa antigen, common to a broad range of bacteria, is a heat-shock protein // J. Gen. Microbiol. 1990. - V. 136, № 6. - P. 1091-1097.

Информация о работе

Уткин, Денис Валерьевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Совершенствование иммунодиагностики кишечного иерсиниоза на основе моноклональных антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы