Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование способа получения моноклональных антител к структурному белку р30 вируса АЧС с использованием рекомбинантных конструкций

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование способа получения моноклональных антител к структурному белку р30 вируса АЧС с использованием рекомбинантных конструкций"

На правах рукописи

Першин Андрей Сергеевич

Совершенствование способа получения моноклональных антител к структурному белку рЗО вируса африканской чумы свиней с использованием рекомбинантных конструкций

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

12 СЕН 2013 005532884

Покров - 2013

005532884

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Научный руководитель:

кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Капустина Ольга Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор,

ведущий научный сотрудник

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Кушнир Анатолий Тимофеевич

доктор биологических наук, зав. лабораторией иммунологии

ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии Бздакова Ирина Юрьевна

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ГНУ ВНИТИБП), г. Щелково.

Защита диссертации состоится «17» октября 2013 г. в «Ю00» часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров. Тел/факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «29» августа 2013г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniiwim.ru и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ

Россельхозакадемии, кандидат биологических наук

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность работы

Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь, характеризующаяся контагиозностью и летальностью, получила в настоящее время широкое распространение на европейской территории Российской Федерации.

Одним из основных белков вируса АЧС является структурный белок урЗО входящий в состав внутренней мембраны вириона. урЗО имеет важное диагностическое значение, поскольку синтезируется на ранних и поздних стадиях инфицирования и является высококонсервативным белком, присущим большинству известных изолятов вируса АЧС. Данные факты объясняют перспективность получения и изучения моноклональных антител, специфичных к указанному белку.

В доступной литературе имеется ограниченное количество работ посвященных использованию ДНК-иммунизации для получения МкАт [14].

Обычно при получении МкАт в качестве иммуногена используют очищенные и концентрированные вирусные антигены. Однако даже при высокой степени их очистки не удаётся избавиться от примеси балластных контаминирующих антигенов, часто имеющих высокую иммуногенность [4].

Использование рекомбинантных конструкций для иммунизации мышей с целью получения МкАт заданной специфичности позволяет исключить недостатки использования вирусных антигенов, так как устраняет наличие контаминирующих антигенов, тем самым достигается стандартизация и чистота иммуногена. *

ДНК-иммунизация как метод доставки генетического материала имеет ряд преимуществ перед иммунизацией белками. Наиболее важным является запуск обоих ветвей иммунного ответа, что обеспечивает высокое качество В-лимфоцитов для слияния, а так же увеличивает долю антител, специфичных к конформационным эпитопам заданного белка.

S. Mazumder et al. (2011) при изучении индукции и длительности иммунного ответа у мышей линии BALB/c при различных комбинациях ДНК/белок показали преимущество иммунизации с праймированием ДНК-плазмидой и последующим введением белка в растворимой форме [9].

Использование рекомбинантных антигенов и моноклональных антител, полученных на их основе, также позволяет совершенствовать иммунодиагностику, причем, эти подходы фактически позволяют исключить использование высокопатогенных инфекционных агентов при производстве диагностических тест-систем.

1.2 Степень разработанности проблемы

Т.С. Whyard [11], А. Sanz [12] и рядом других зарубежных исследователей получены МкАт к вирусу АЧС.

Во ВНИИВВиМ Н.И. Митиным с соавт. получены гибридомы секретирующие МкАт к вирусу АЧС и разработаны диагностические иммуноферментные тест-системы на основе МкАт к мажорному вирионному белку р72 [3].

Т.Р. Кирюхиной отработан сэндвич вариант ТФ ИФА на основе МкАт к vp72 для тестирования антигена вируса АЧС в культуральных и органных материалах [2].

A.A. Пиря с соавт. получили 8 гибридных линий, продуцирующих МкАт к вирусным полипептидам, пять из которых специфичны к полипептиду с м.м. 31 кДа [4]. Однако их конформационные особенности не позволили использовать полученные МкАт в таких реакциях как иммуноцитохимия и иммунофлуоресценция.

Для получения моноклональных антител в данных исследованиях использовали классические подходы иммунизации хроматографически очищенными вирусными белками, без применения методов иммунизации рекомбинантными конструкциями и скринирования в реакции латекс-агглютинации.

1.3 Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось совершенствование методологии получения МкАт заданной специфичности, изучение их иммунохимических свойств и возможности использования в различных серологических реакциях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) подобрать оптимальные условия изготовления препаратов антигена белка урЗО вируса АЧС;

2) отработать оптимальную схему иммунизации мышей линии ВАЬВ/с доноров спленоцитов, используя комбинированное введение

ДНК/рекомбинантный белок;

3) получить стабильные линии гибридом, продуцирующие МкАт заданной специфичности;

4) отработать методы скрининга позволяющие тестировать клоны гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к урЗО вируса АЧС;

5) изучить иммунохимические свойства полученных МкАт.

1.4 Научная новизна результатов исследования

Впервые в Российской Федерации разработана схема иммунизации мышей линии ВАЬВ/с с использованием комбинированного введения плазмидной ДНК и рекомбинантного белка.

Впервые в Российской Федерации получены линии гибридом, секретирующие специфические моноклональные антитела к рекомбинантному белку рЗО вируса АЧС, специфически взаимодействующие как с рекомбинантным вирусспецифическим белком рЗО, так и с натуральным.

Определены изотип, конформационная и эпитопная специфичность полученных моноклональных антител клонов IV!, 2В7, 1С12, 5Ш1.

С помощью полученных МкАт установлено наличие на консервативном конформационном участке молекулы белка рЗО трех не

перекрывающихся антигенных сайтов. Один из них является конформационно зависимым.

С использованием полученных моноклональных антител показана динамика накопления фосфопротеина рЗО в чувствительной линии клеток CV-1, инфицированных вирусом АЧС штамм 691/88.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Усовершенствованная технология получения и скрининга МкАт на основе плазмидной ДНК, несущей ген белка рЗО вируса АЧС и рекомбинантного белка рЗО использована для получения МкАт заданной специфичности.

Разработаны «Методические положения по получению моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку рЗО вируса африканской чумы свиней (АЧС)», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 10.11.2011 г.

Разработаны «Методические положения по получению моноклональных антител к структурному белку рЗО вируса африканской чумы свиней с использованием метода «прайм-бустерной» иммунизации рекомбинантными конструкциями», которые рассмотрены на учёном совете и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым 12.03.2013 г.

Получены, охарактеризованы, паспортизированы и заложены на длительное хранение в музей гибридом ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии четыре клона гибридом - 7F7, 2В7, 1С12, 5D11, продуцирующие моноклональные антитела к белку рЗО вируса африканской чумы свиней взаимодействующие как с рекомбинантным белком рЗО, так и с вирусным антигеном.

Разработаны условия постановки ДАС ТФ ИФА, РНИФ, ИЦХ на основе МкАт к белку рЗО, предназначенные для обнаружения специфических антигенов вируса АЧС в инфицированном материале.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов приведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Научные положения и выводы диссертационной работы аргументировано отражают содержание работы.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании секции «Инфекционной патологии животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН (27 апреля 2011 г), на 2й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (Покров, 30 мая 2012г), Международной научно-практической конференции «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» ВНИИЗЖ (Владимир, 18 октября 2012г), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ (2011-2013 гг.), совещаниях научных сотрудников лаборатории «Биотехнологии» ВНИИВВиМ (20112013 гг.).

1.7 Публикации

По результатам исследований, выполненных по теме диссертации, опубликовано 4 научные работы, в том числе 3 в журналах, входящих в перечень ВАК.

1.8 Структура диссертации

Диссертация изложена на 119 листах машинописного текста по общепринятой схеме и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (229 источников, в том числе 26 - отечественных авторов). Работа иллюстрирована 10 таблицами, 17 рисунками и дополнена приложениями.

1.9 Основные положения диссертации, выносимые на защиту

- использование комплекса методов сочетанной ДНК иммунизации и введения рекомбинантного белка позволяет получить более 70% гибридом заданной специфичности;

- полученные моноклональные антитела к рекомбинантному белку рЗО взаимодействуют в различных серологических реакциях только с антигенными детерминантами урЗО вируса африканской чумы свиней и Лес рЗО;

- полученные моноклональные антитела позволяют установить наличие на консервативном конформационном участке молекулы белка урЗО по крайней мере, трех не перекрывающихся антигенных сайтов;

- полученные моноклональные антитела к рекомбинантному белку рЗО выявляют локализацию вирусспецифического антигена в инфицированных культурах клеток в иммуноцитохимической реакции.

1.10 Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объём исследований проведён автором самостоятельно. Отдельные этапы исследований выполнены при консультативной помощи сотрудников лабораторий Биохимии, Биофизики, Диагностики и Биотехнологии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Исследования проведены в лабораториях Биотехнологии и Биохимии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

Животные: в работе использовали мышей линии ВАЬВ/с 5-6-ти недельного возраста для иммунизации при получении моноклональных антител. Взрослых мышей линии ВАЬВ/с, мышей гибридов (ВАЬВ/с х БЛНМ) Р1 использовали в качестве доноров перитонеальных макрофагов.

Вирусы: авирулентный штамм 691/88 вируса АЧС (6,5 1§ ТЦДзо/см3), адаптированный к перевиваемой культуре клеток СУ-1, полученный из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии; вирус болезни Тешена, штамм «Закарпатский» (8,5 ^ ТЦЦ5о/см3); вирус болезни Ауески, штамм АС-21/07 (8,5 ^ ТЦД50/См3)-

Культуры клеток: в качестве партнера для слияния при получении гибридом использовали клетки мышиной миеломы линии SP2/0-Agl4 (SP2/0), дефектные по гену гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы.

Для культивирования вируса АЧС и накопления антигена использовали перевиваемые культуры клеток CV-1, катал.№ 43.3, и ППК-666, катал.№ 9.4 полученные из лаборатории Биотехнологии ВНИИВВиМ. В качестве сырья для получения препаратов нормальных антигенов использовали монослойные культуры клеток CV-1, PK-15, катал.№ 2.2 и ПСГК, катал.№ 25.2 (каталог ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Бактериальные штаммы: штамм клеток E.coli BL21 (DE3)pLysS, клон pTT9/ASFVp30, полученный во ВНИИВВиМ, содержащий рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена CP204L вируса африканской чумы свиней, кодирующего конформационный эпитоп белка рЗО.

Латекс: для создания специфического латексного диагностикума в качестве носителя использовали латекс AKPOJIAP-к (ТУ-6-09-10-1824-88) -монодисперсные полиакролеиновые частицы, имеющие средний диаметр 5-7 мкм и концентрацию альдегидных групп 30 мкмоль/гр, окрашенные сафранином Т в розовый цвет (Институт биоорганической химии, Москва).

2.2 Методы

2.2.1 Получение и очистка рекомбинантного белка

Рекомбинантный белок получали и очищали по методу, описанному Т.Э. Южук с соавторами [6].

2.2.2 Получение гибридом

Гибридомы получали по методу G. Köhler и С. Milstein [10] в модификации St.G. Fazekas и D. Scheidegger [8].

2.2.3 Получение препаратов нормальных антигенов

Культуры клеток однократно замораживали-оттаивали, осветляли центрифугированием при 2500 об./мин. в течение 30 мин. Надосадок отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 10 см3 бессывороточной среды Игла MEM.

2.2.4 Иммуноэлектрофорез

Иммуноэлектрофорез проводили по методу П.Н. Грабара и С. Уильямса в модификации J.J. Sheideger [1].

2.2.5 Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ)

Проводили согласно стандартной методике, рекомендованной

Международным эпизоотическим бюро и методике, описанной Р.Н. Bool et. al. (1970) и С. Sanchez-Botija et al. (1970) [7, 13]. В качестве антивидового конъюгата использовали ФИТЦ-конъюгат IgG козы к IgG мыши в рабочем разведении.

Учет реакции проводили в отраженном синем свете на люминесцентном микроскопе при увеличении 1 х90.

2.2.6 Непрямой вариант ТФ ИФА для скрининга МкАт

Скрининг и определение активности полученных МкАт, специфичных

к белку рЗО вируса АЧС проводили в непрямом варианте твердофазного иммуноферментного анализа и общепринятой методике, на полистироловых пластинах (Cliniplate, Dynatech microelisa) [5].

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Определение иммуногенности рекомбинантного рЗО

Перед получением МкАт к рекомбинантному антигену изучали его иммуногенность и способность полученных сывороточных антител реагировать, как с рекомбинантным белком, так и с вирусным антигеном.

В результате прайм-бустерной иммунизации кроликов препаратами рекомбинантной плазмиды (pTT9/ASFVp30) со встройкой участка гена CP204L вируса африканской чумы свиней, кодирующего конформационный эпитоп белка рЗО и очищенного рекомбинантного белка рЗО получены моноспецифические гипериммунные сыворотки крови. Анализ активности полученных сывороток проводили в реакции непрямого ТФ ИФА. Активность антител исследуемых сывороток со специфическим вирусным антигеном АЧС составила 1:256-1:1024, а с Rec рЗО достигала значений 1:1024-1:4096 (таблица 1).

Таблица 1 - Активность моноспецифических сывороток, полученных к рекомбинантному белку рЗО

Испытуемые сыворотки, Активность сывороток в ТФ ИФА с различными антигенами

Специфический культуральный антиген вируса АЧС Рекомбинантный антиген рЗО

ББ кроликов к рекомбинантному белку рЗО, п=5* 1:256- 1:1024 1:1024- 1:4096

БЗ крови свиньи к вирусу АЧС (гипериммунная) 1:8192 1:16384

ЫБ кролика 0 0

N8 крови свиньи 0 0

Примечания: ББ - специфическая сыворотка; ЫБ — нормальная сыворотка; знаком 0 обозначено отсутствие выявления вирусспецифических антител;

*- представлены средний диапазон величины активности полученных сывороток

При проведении детекции антигенов вируса АЧС иммуноцитохимическим методом ИФА с использованием сыворотки к рекомбинантному белку рЗО было установлено, что антитела сыворотки взаимодействовали с антигенами вируса африканской чумы свиней, в частности, белком рЗО, в разведениях с 1:20 до 1:160. Антитела сыворотки не взаимодействовали с антигенами интактной культуры клеток (рисунок 1).

Таким образом, можно заключить, что антитела, вырабатывающиеся к рекомбинантному белку рЗО, способны распознавать эпитопы специфического белка вируса АЧС и, следовательно, рекомбинантный белок пригоден для иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител к данному белку.

При исследовании моноспецифической сыворотки в иммуноэлектрофоретической реакции с препаратами рекомбинантного и специфического антигенов (рисунки 2 и 3) чёткость и яркость линии преципитации показывает чистоту полученного препарата рекомбинантного белка.

Рисунок 1 - Иммуноцитохимическая демонстрация выявления антигенных детерминант белка рЗО вируса АЧС в клетках СУ-1 с применением специфической сыворотки.

Примечание: А-В - гипериммунная сыворотка кролика к рекомбинантному белку рЗО, в разведениях 1:20, 1:40, 1:160 (соответственно). Г. - интактная культура. Д. -специфическая сыворотка свиньи; Е. - нормальная сыворотка кролика

Рисунок 2 - Иммуноэлектрофореграмма.

Примечание: в лунке препарат рекомбинантного белка рЗО. В канавке гипериммунная моноспецифическая сыворотка крови кролика к рекомбинантному белку рЗО

Рисунок 3 - Иммуноэлектрофореграмма.

Примечание: в лунке лизат инфицированных вирусом АЧС клеток СУ-1. В канавке гипериммунная моноспецифическая сыворотка крови кролика к рекомбинантному белку рЗО

3.2 Изготовление культурального препарата вирусспецифического антигена, содержащего урЗО вируса АЧС

Для получения препарата культурального антигена содержащего максимальное количество урЗО проводили изучение динамики накопления урЗО в клеточных культурах С\М и ППК-666, инфицированных вирусом АЧС штамм 691/88 (рисунок 4). Контроль уровня накопления проводили непрямым ТФ ИФА и ИЦХ ИФА на основе полученной моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку рЗО. Результаты представлены на рисунке 4.

Динамика накопления рЗО в культуре клеток С\/-1

Доза

заражения 0,001 ТЦД на клетку Доза заражения 0,01 ТЦД на клетку " Доза

заражения 0,1 ТЦД на клетку

Сутки после инокуляции культуры вирусом АЧС

Рисунок 4 - Динамика накопления антигена рЗО вируса АЧС при заражении культуры клеток СУ-1 штаммом 691/88.

Примечание: средние значения оптических плотностей для построения диаграммы рассчитывали на основании данных опытов, проведенных в 5 повторностях

Наибольшее накопление антигена вирусного белка рЗО получено в культуре клеток СУ-1 при множественности заражения 0,001 ТЦД50 на

клетку, времени инкубирования 72-96 часов при достижении 40% ЦПД. Лучший результат выхода антигена белка рЗО получен при обработке вируссодержащего материала 1,1,2-трифтортрихлорэтаном (фреон-113).

При изучении динамики накопления антигенов рЗО в культуре клеток СУ-1 в реакции ИЦХ ИФА максимальное специфическое окрашивание инфицированных клеток также наблюдали на 4е сутки (рисунок 5).

А Б

Рисунок 5 - Динамика накопления рЗО в культуре клеток СУ-1 в иммуноцитохимическом иммуноферментном анализе.

Примечание: А - взаимодействие специфического антигена АЧС инфицированной культуры с моноспецифической сывороткой через 24 часа после заражения.

Б - взаимодействие специфического антигена АЧС инфицированной культуры с моноспецифической сывороткой через 96 часов после заражения

3.3 Сравнительный анализ методов иммунизации животных

Так как ДНК-иммунизация относительно новый метод получения доноров иммунных лимфоцитов, и нет общепринятого протокола введения иммуногенных субстанций, было необходимо разработать и протестировать оптимальную схему иммунизации мышей линии ВАЬВ/с рекомбинантным белком рЗО и плазмидой, кодирующей продукцию этого белка.

Иммунизацию проводили по схеме, представленной в таблице 2. Схема иммунизации для первой группы предусматривала праймирование

рекомбинантной плазмидой, несущей целевой ген, и последующую трёхкратную иммунизацию рекомбинантным белком с равным по объёму количеством адъюванта Фрейнда (АФ). Схема иммунизации для второй группы состояла из праймирования и последующего трёхкратного введения рекомбинантного белка сорбированного на целлюлозе. Третья группа -четырёхкратное введение рекомбинантного белка в смеси с АФ. Интервал между введениями составлял 14 дней.

Таблица 2 - Схемы иммунизации мышей линии ВАЬВ/с

Номер группы Введение Тигр антител* Леср30(100 мкг/мышь) Титр антител Яеср30(100 мкг/мышь) Тигр антител ЯесрЗО (100 мкг/мышь) Тигр антител

С\"пси 0 10 10 20 24 34 3» 48

I в/м ДНК плазмкда 0 ПАФ, п/к 800-1600* НАФ, в/бр 1600 ПАФ, п/к 1600-3200

2 в/м ДНК плазчида 0 ЗФР, целлюлоза, в/м 800-1600 НАФ, в/бр 3200 ЗФР, целлюлоза, п/к 3200-6400

3 в/м рек.белка - ПАФ 400-800 НАФ, в/бр 1600 ПАФ, п/к 1600

Примечание: ПАФ, НАФ - полный и неполный адъювант Фрейнда; введение антигенов: п/к-

подкожное, а'м-внутримышечное, в/бр-внутрибрюшинное.*- обратные величины титров антител сывороток мышей в непрямом ТФ ИФА с рекомбинантным белком рЗО

В результате экспериментов, установлено, что активность сыворотки при иммунизации с праймированием ДНК значимо выше, чем при введении одного белка. Активность сыворотки при использовании целлюлозы в качестве адъюванта значимо выше, чем при использовании полного адъюванта Фрейнда.

Очевидно, что сорбция рекомбинантного белка рЗО на целлюлозе в значительной степени увеличивает размер вводимого антигена и усиливает иммунный ответ, значительно повышая эффект иммунизации.

3.4 Получение гибридом секретирующих МкАт к структурному белку рЗО вируса АЧС

За три дня до проведения процедуры гибридизации провели мышам внутриселезёночную инъекцию в дозе 100 мкг рекомбинантного белка рЗО на животное, активность сыворотки после этой инъекции составила 1:12800.

После скринирования полученных гибридом через 7-10 суток, продукция специфичных к рЗО иммуноглобулинов была зарегистрирована в

493 лунках, т.е. более 70% от числа рассаженных (672 лунки). В результате было отсажено более 1500 клонов.

Из общего количества гибридных клонов было отобрано 7 - 1С2, 1D12, 2В10, 5F5, 5D11, 2В7, 7F7, имеющие наивысший титр активности в непрямом ТФ ИФА с рекомбинантным белком рЗО и специфическим антигеном вируса АЧС. Клонированные клетки отобранных гибридом, культивировали in vitro в бессывороточной среде HSF Serum-Free Medium for Hybridoma Cells (Sigma, USA) в количестве достаточном для проведения дальнейших исследований. Уровень накопления специфичных иммуноглобулинов в культуре клеток составлял до 100-350 мкг/см3.

3.5 Скрининг и оценка диагностических свойств полученных МкАт в реакции латекс-агглютинации

Работу проводили при оказании научно-консультативной и практической помощи д.б.н. Пономарёвым В.Н.

В реакции латекс агглютинации (рисунок 6) выявили 486 положительных лунок, таким образом, РЛАГ показала 98% совпадение с непрямым ТФ ИФА (493 положительные лунки) при скрининге продукции антител клонами гибридом. Следовательно, учитывая время постановки реакции, равное 10-30 минутам, РЛАГ может быть использована для быстрого скрининга продукции МкАт гибридомами.

3.6 Использование реакции латекс-агглютинации для выявления гибридных клеток, продуцирующих специфические антитела

Наличие рецепторов иммуноглобулинов на поверхности В-лимфоцитов и гибридных клеток (миелома+лимфоцит), позволило изучить использование РЛАГ на основе рекомбинантного белка рЗО для отбора клонов, секретирующих МкАт к белку рЗО. В результате наблюдали агглютинацию частиц латекса присутствующими в культуральной жидкости антителами, а также адсорбцию частиц латекса на поверхности клеток (рисунок 7).

в

Рисунок 6 - Реакция латекс агглютинации с культуральными жидкостями гибридом

А_Б — продуцирующий авпгггла клон В .Г - не продуцирующий антитела клон

Рисунок 7 - Результаты взаимодействия латексного диагностикума и клеток гибридом

3.7 Определение полипептидной специфичности полученных моноклональных антител в иммуноблоттинге

При определении полипептидной специфичности МкАт полученных к рекомбинантному белку рЗО вируса АЧС было установлено, что они взаимодействовали со специфическим культуральным антигеном вируса АЧС штамма 691/88 (окрашивание реплики на уровне 30 кДа) и с лизатом клеток клона рТТЯ/АБРУрЗО, продуцирующего рекомбинантный белок рЗО (окрашивание реплики на уровне 14 кДа) и не взаимодействовали с нормальным культуральным антигеном, полученным из лизата перевиваемой культуры клеток СУ-1. Моноклональные антитела клона 2В7 взаимодействовали только с рекомбинантным белком и не взаимодействовали с культуральным антигеном, что, вероятно, обусловлено изменением конформации распознаваемых эпитопов при денатурации пробы во время электрофореза (рисунок 8).

70 кДа

40 кДа 25 кДа 15 кДа 10 кДа

Nar Sar рЗО: Nar Sar

рЗО

7

Nar Sar

Nar Sar рЗО

шЯКЯШШЯШЫш

Рисунок 8 - Полипептидная специфичность полученных МкАт.

Примечание: А - белковый электрофорез в 10% ПААГ (в качестве источника рекомбинантного белка рЗО использовали лизат клеток рекомбинантного клона pTT9/ASFVp30); Б — блоттограмма исследования культуральной жидкости клона 7F7; В — блоттограмма исследования клона 5D11; Г - блоттограмма исследования клона 2В7

3.8 Определение класса и подкласса моноклональных антител

Изотип секретируемых гибридомными клонами моноклональных антител определяли методом ТФ ИФА с использованием набора "Mouse

Monoclonal Antibody Isotyping Kit" (Sigma). В результате проведенных исследований установлено, что клоны МкАт 2В7, 7F7 и 5D11 имеют изотип IgGl, а клон 1С2 изотип IgG2a.

3.9 Изучение активности и специфичности моноклональных антител к рекомбинантному белку рЗО вируса АЧС в реакции непрямой иммунофлуоресценции

Полученные моноклональные антитела, продуцируемые клонами гибридом 7F7, 2В7 и 5D11, специфически взаимодействовали с антигеном вируса АЧС в РНИФ. Специфическую гранулярную цитоплазматическую флуоресценцию в инфицированных клетках (рисунок 9) наблюдали при использовании разведений проб трех клонов до 1:256. Титр МкАт, определенный в РНИФ составил 8 log2.

Рисунок 9 - Выявление вируса АЧС в инфицированной культуре клеток в РНИФ.

Примечание: А — нормальный культуральный тесг-препарат культуры клеток СУ-!, инкубированный с культуральной жидкостью клона 7Р7; Б - специфический культуральный тест-препарат, инкубированный с культуральной жидкостью клона 7Р7

ЗЛО Изучение динамики накопления белка рЗО в перевиваемых культурах клеток СУ-1 с использованием моноклональных антител

Полученные моноклональные антитела к рекомбинантному белку рЗО позволяют выявлять локализацию вирусного антигена в иммуноцитохимической реакции. Для определения оптимальных параметров постановки иммуноцитохимического ИФА с использованием МкАт

специфичных к белку рЗО вируса АЧС проводили изучение динамики накопления урЗО, в инфицированной культуре клеток СУ-1, используя полученные моноклональные антитела (рисунок 10).

А Б

Рисунок 10 - Динамика накопления рЗО в культуре клеток СУ-1 в иммуноцитохимическом иммуноферментном анализе.

Примечания: А - взаимодействие инфицированной культуры с моноклональными антителами клона IV! через 24 часа после заражения. Б - взаимодействие инфицированной культуры с моноклональными антителами клона через 96 часов после заражения

Окрашенные отдельные клетки и группы клеток выявляли через 18-24 часа после заражения, а через 48 часов окрашивание клеток приобретало массовый характер, достигая максимального уровня через 96 часов. МкАт пригодны для выявления антигена вируса АЧС в культуре клеток начиная с 18 часов после заражения. Оптимальное время для постановки реакции лежит в диапазоне 48-96 часов.

3.11 Изучение использования МкАт в иммуноферментном анализе

В непрямом ТФ ИФА моноклональные антитела отобранных клонов специфически взаимодействовали с антигеном вируса АЧС и с очищенным рекомбинантным белком рЗО и не взаимодействовали с отрицательными антигенами - с лизатом интактных культур клеток С\М, РК-15, ПСГК и лизатом клеток Е.соН штамма ВЬ21(ОЕЗ)рЬуз8. У МкАт клонов 1¥1, 2В7 и 5Э11 активность с препаратом рекомбинантного белка рЗО составила 1:1000,

со специфическим вирусным антигеном АЧС составила 1:1000, 1:500 и 1:2000 соответственно, что подтверждено комиссионными испытаниями.

Имея набор высокоактивных МкАт клонов 2В7, 1С2 и 7Р7, и конъюгатов с пероксидазой хрена на их основе исследовали различные сочетания пар МкАт при постановке двухсайтового "сэндвич" - варианта ТФ ИФА. На планшетах сенсибилизированных МкАт клона 7Р7, титровали препараты антигенов, выявляя их конъюгатом, приготовленным на основе МкАт клонов 2В7 либо 1С2. Такое сочетание обеспечивало выявление антигена вируса в максимальных титрах и одновременно не давало ложноположительных результатов с нормальным антигеном и антигенами гетерологичных вирусов и позволяло выявлять специфический антиген в разведении 1:1600.

В результате проведённых исследований разработана схема постановки ДАС ИФА для обнаружения антигена вируса АЧС с использованием полученных МкАт (таблица 3).

Таблица 3 - Схема постановки двухсайтового "сэндвич" - варианта ТФ ИФА для обнаружения антигена вируса АЧС

Основные этапы реакции:

Условия постановки реакции:

сорбция МкАт (7Р7)

18 часов при 4°С или 90 минут при 37°С по 100 мкл на лунку в концентрации 0,4 мкг/ лунку

процедура отмывки

ФБР-твин, 3 раза

блокирование свободных сайтов связывания

1%-ный раствор БСА на ФБР по 200 мкл лунку, инкубация 30 минут при 37°С

процедура отмывки

ФБР-твин, 3 раза

внесение антигена

внесение разведений антигена в объеме 100 мкл на лунку, инкубация 1 час при 37°С

процедура отмывки

ФБР-твин, 3 раза

пероксидазный коньюгат на основе МкАт клона 2В7

инкубация 1 час при 37°С по 100 мкл лунку в рабочем разведении

процедура отмывки

ФБР-твин, 5 раз

субстратный раствор АБТС

инкубация 20 минут при комнатной температуре по 100 мкл на лунку

учет результатов

используя "МиШэсап" при Я. = 405нм

4 ВЫВОДЫ

1. Совершенствование технологии получения МкАт заключающееся в праймировании и последующей стимуляции иммунной системы мышей линии ВАЬВ/с комбинированным введением плазмидной ДНК и рекомбинантного белка рЗО позволяет получить МкАт заданной специфичности и сократить время их получения до 2-3 месяцев.

2. Иммунизация рекомбинантным белком и кодирующей его плазмидной ДНК по разработанной схеме обеспечивает развитие гуморального иммунитета, позволяет получить сыворотки с титром вирусспецифических антител 1:3200 - 1:6400, а так же выход более 70% МкАт заданной специфичности.

3. Получены и охарактеризованы четыре линии гибридом 1С2; 5Э11; 7Р7 и 2В7, на протяжении 10-15 пассажей (срок наблюдения)

стабильно продуцирующие МкАт к антигенным детерминантам фосфопротеина рЗО вируса АЧС.

4. Подобраны оптимальные условия проведения скрининга МкАт к антигенным детерминантам белка рЗО вируса АЧС в реакции латекс-агглютинации: добавление в соотношении 1:10 0,5% суспензии на ФБР-Т-БСА, рН 7,4 частиц латекса, сенсибилизированных рекомбинантным белком рЗО в дозе 3-5 мкг/0,1см3 к культуральной жидкости тестируемых гибридом позволяет проводить предварительное скринирование их антителопродукции в течение 10-30 минут.

5. Экспериментально установлено, что полученные клоны гибридом 1С2, 5D11, 7F7 и 2В7 продуцируют МкАт, специфически взаимодействующие в различных вариантах иммуноферментного анализа с антигенными детерминантами специфического фосфопротеина рЗО вируса АЧС и не дают перекрёстных реакций с антигенами других вирусов -возбудителей болезней свиней.

6. С помощью полученных МкАт на консервативном участке молекулы фосфопротеина рЗО вируса АЧС установлено наличие трёх неперекрывающихся антигенных детерминант, одна из которых, выявляемая МкАт клона 2В7, является конформационно зависимой.

7. Полученные МкАт позволяют проводить исследования по выявлению антигенов вируса АЧС в различных вариантах иммуноферментного анализа: непрямом и ДАС ТФ ИФА, методом иммуноцитохимии, реакции непрямой иммунофлуоресценции и иммуноблоттинге.

8. Полученные МкАт специфичные к антигенным детерминантам фосфопротеина рЗО вируса АЧС пригодны для усовершенствования средств диагностики АЧС.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

«Методические положения по получению моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку рЗО вируса африканской чумы свиней

(АЧС)», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 10.11.2011г. и «Методические положения по получению моноклональных антител к рекомбинантному белку рЗО вируса африканской чумы свиней с использованием метода прайм-бустерной иммунизации», утверждённые директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым 12.03.2013 г., рекомендуются для применения при проведении научно-исследовательской работы в области гибридомной технологии и иммунологии.

Полученные клоны гибридом 7F7, 2В7, 1С12, 5D11, продуцирующие МкАт специфичные к антигенным детерминантам фосфопротеина рЗО вируса АЧС, заложенные на длительное хранение в музей гибридом ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, предлагаются для усовершенствования средств диагностики АЧС.

6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Иммунологические методы / под редакцией Г.Фримеля; пер. с нем. А.П. Тарасова. - М.: Медицина, 1987.472 с.

2. Кирюхина, Т.Р. Моноклональные антитела в совершенствовании твердофазного иммуноферментного анализа при африканской чуме свиней / Т.Р. Кирюхина, A.B. Киселёв, И.Ф. Вишняков // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы научной конференции ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней — неотложные проблемы науки и практики»,-Покров, 1995.-С. 146.

3. Митин, Н.И. Моноклональные антитела к полипептидам вируса АЧС / Н.И. Митин, С.И. Сидоров, Е.Г. Реутова // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Материалы научной конференции ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики» 9-11 ноября 1994 г. - Покров, 1995. - С. 137.

4. Пиря, A.A. Характеристика моноклональных антител к полипептидам вируса АЧС / A.A. Пиря, A.B. Устин, A.A. Колонцов, Е.Г.

Реутова, Н.И. Митин // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992.-Ч. 2.-С. 333.

5. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова -М.: Выс. шк., 1991.-288с.

6. Южук, Т.Э Приготовление препаратов рекомбинантных белков вируса африканской чумы свиней / Т.Э. Южук, А.С. Казакова, И.Ю. Хухорова, Н.Н. Власова // Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации: материалы Междунар. науч.-практ. конф./ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2011. - С. 224-229.

7. Bool, Р.Н. Le diagnostic par immunofluorescence de la peste porcine Africana/ P.H. Bool, A. Ordas, C. Sanchez-Botija // Rivista Del Patronato De Biologia Animal. - 1970. - Vol.14. - P.115-132.

8. Fazekas, St. G. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics / St. G. Fazekas, D. Scheidegger // J. Immunol.Meth.- 1980. - Vol. 35. - P. 1-21.

9. Mazumder, S. Potency, Efficacy and Durability of DNA/DNA, DNA/Protein and Protein/Protein Based Vaccination Using gp63 Against Leishmania donovani in BALB/c Mice / S. Mazumder [et. al.] // PLoS ONE -2011.-Vol. 6, No 2.

10. Milstein C, Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry // C. Milstein, A.C. Cuello // Nature - 1983. - P. 537-540.

11. Whyard, T.C. Monoclonal Antibodies against African Swine Fever Viral Antigens // Т. C. Whyard, S.H. Wool, G.J. Letchworth // Virology. -1985. - 142. -P. 416-420.

12. Sanz, A. Monoclonal Antibodies Specific for African Swine Fever Virus Proteins / A. Sanz [et. al.] // Journal of Virology. - 1985. - Vol. 54. - P. 199-206.

13. Sanchez-Botija, С. Diagnosis of African swine fever by immunofluorescence/ C. Sanchez-Botija// Bull. Off. Int. Epiz. - 1970. - Vol.73. -P. 1025-1044.

14. Zhang, C. Potent monoclonal antibodies against Clostridium difficile toxin A elicited by DNA immunization / C. Zhang, K. Jin, Y. Xiao // Human Vaccines & Immunotherapeutics. - 2013. - Vol. 9. - P. 16 - 23.

7 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Моноклональные антитела к рекомбинантному белку Р30 вируса африканской чумы свиней для диагностики АЧС / A.C. Першин, A.C. Казакова, H.H. Власова, О.В. Капустина // Научно-теоретический журнал вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.-2013.-№2.-С. 30-35.

2. Моноспецифическая сыворотка к рекомбинантному белку рЗО для изучения африканской чумы свиней (АЧС) / A.C. Казакова, A.A. Варенцова, A.C. Першин, С.А. Белянин, Т.Э. Южук, В.М. Лыска, С.П. Живодеров, H.H. Власова // Научный журнал КубГАУ. - 2011. - №71(07). [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/201 l/07/pdf/45.pdf

3. Першин, A.C. Иммуногистохимический метод выявления вируса АЧС с использованием гипериммунной сыворотки к рекомбинантному белку рЗО / A.C. Першин, A.C. Казакова, Е.Ю. Прудникова// Ветеринария и кормление. - 2011. - №6. - С. 39-40.

4. Получение моноклональных антитела к рекомбинантному белку рЗО вируса африканской чумы свиней с использованием метода прайм-бустерной иммунизации / A.C. Першин, A.C. Казакова, Т.Э. Южук, И.В. Лягоскин, О.В. Капустина, H.H. Власова // Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине: материалы конференции молодых учёных. -Покров, 2012 - С. 77-83.

8 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЧС - африканская чума свиней,

ВП — вирусный протеин,

ДАС ТФ ИФА - двойной антительный сэндвич вариант ТФ ИФА,

ИФА - иммуноферментный анализ,

ИЦХ ИФА - иммуноцитохимический вариант ИФА,

кДа — килодальтон,

МкАт - моноклональные антитела,

НАФ - не полный адъювант Фрейнда,

ОП — оптическая плотность,

ПАФ - полный адъювант Фрейнда,

РЛАГ — реакция латекс агглютинации,

РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции,

ТФ ИФА - твёрдофазный иммуноферментный анализ,

ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат,

vp30 - virus protein, 30 кДа,

Ree рЗО — рекомбинантный белок рЗО.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 80 экз.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Першин, Андрей Сергеевич, Покров

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

На правах рукописи

04201362389

Першин Андрей Сергеевич

Совершенствование способа получения моноклональных антител к структурному белку рЗО вируса АЧС с использованием рекомбинантных

конструкций

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель кандидат ветеринарных наук Капустина Ольга Владимировна

Покров - 2013 г.

Оглавление

Список сокращений...........................................................................................6

1 Введение.........................................................................................................8

1.1 Актуальность работы..................................................................................8

1.2 Степень разработанности проблемы.........................................................9

1.3 Цель и задачи исследования.......................................................................10

1.4 Научная новизна результатов исследования............................................10

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы.................................11

1.6 Степень достоверности и апробация работы...........................................11

1.7. Публикации.................................................................................................12

1.8 Структура диссертации...............................................................................12

1.9 Основные положения диссертации, выносимые на защиту...................12

1.10 Личный вклад автора в выполнение работы..........................................13

2 Обзор литературы.......................................................................................13

2.1 Африканская чума свиней........................................................................13

2.1.1 Характеристика, распространение и экономический ущерб...............13

2.1.2 Диагностика...........................................................................................17

2.2 Моноклональные антитела.........................................................................18

2.2.1 Открытие и применение гибридом продуцентов моноклональных антител................................................................................................................18

2.2.2 Развитие гибридомной биотехнологии.................................................23

2.2.2.1 Иммунизация для получения моноклональных антител...................23

2.2.2.2 Культивирование гибридом.................................................................26

2.2.2.3 Биспецифические МкАт.......................................................................27

2.2.2.4 Рекомбинантные МкАт.........................................................................28

2.2.2.5 Искусственные антитела.......................................................................32

2.3 Заключение по обзору литературы............................................................33

3 Собственные исследования........................................................................35

3.1 Материалы и методы...................................................................................35

3.1.1 Материалы.................................................................................................35

3.1.2 Методы......................................................................................................41

3.1.2.1 Получение и очистка рекомбинантного белка...................................41

3.1.2.2 Иммунизация и контроль иммунного ответа у мышей.....................42

3.1.2.3 Получение гибридом............................................................................43

3.1.2.4 Получение препаратов нормальных антигенов.................................43

3.1.2.5 Приготовление культуры клеток мышиных спленоцитарных макрофагов........................................................................................................43

3.1.2.6 Криоконсервирование гибридомных клеток и

восстановление их после хранения в замороженном состоянии..................44

3.1.2.7 Преципитация антител сульфатом аммония......................................44

3.1.2.8 Электрофорез в ДСН-ПААГ................................................................44

3.1.2.9 Иммуноэлектрофорез............................................................................45

3.1.2.10 Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).......................45

3.1.2.11 Приготовление коньюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена...........................................................................................45

3.1.2.12.1 Непрямой вариант ТФ ИФА для скрининга МкАт.......................46

3.1.2.12.2 Непрямой вариант иммуноцитохимии

(иммунопероксидазного метода).....................................................................46

3.1.2.12.3 "Сэндвич"-вариант иммуноферментного анализа для выявления антигена...........................................................................................46

3.1.2.13 Иммуноблоттинг.................................................................................47

3.1.2.14 Определение концентрации белка.....................................................48

3.1.2.15 Методы статистического анализа......................................................48

4 Результаты собственных исследований..................................................49

4.1 Изготовление препаратов специфических антигенов вируса АЧС

и их характеристика..........................................................................................49

4.1.1 Подготовка рекомбинантного белка для иммунизации

животных..........................................................................................................49

4.1.2 Определение иммуногенности рекомбинантного рЗО..........................49

4.1.3 Изготовление культурального препарата вирусспецифического антигена, содержащего урЗО вируса АЧС......................................................53

4.2 Получение гибридом...................................................................................56

4.2.1 Сравнительный анализ методов иммунизации животных...................56

4.2.2.2 Получение гибридом секретирующих МкАт к структурному

белку рЗО вируса АЧС.......................................................................................57

4.2.3 Скрининг антителопродуцирующихи клонов гибридом.....................60

4.2.3.1 Скрининг в ТФ ИФА.............................................................................60

4.2.3.2 Скрининг и оценка диагностических свойств полученных

МкАт в реакции латекс-агглютинации...........................................................63

4.2.3.3 Использование реакции латекс-агглютинации для выявления гибридных клеток, продуцирующих специфические антитела....................67

4.3 Изучение иммунохимических свойств полученных моноклональных антител................................................................................................................69

4.3.1 Определение полипептидной специфичности полученных моноклональных антител в иммуноблоттинге...............................................69

4.3.2 Определение класса и подкласса моноклональных антител............70

4.3.3 Изучение детерминантной специфичности полученных моноклональных антител..................................................................................71

4.3.4 Изучение активности и специфичности моноклональных антител к рекомбинантному белку рЗО вируса АЧС в реакции непрямой иммунофлуоресценции...................................................................73

4.3.5 Изучение динамики накопления белка рЗО в перевиваемых культурах клеток СУ-1 с использованием моноклональных антител.........75

4.3.6 Изучение использования МкАт в иммуноферментном анализе.........76

4.3.6.1 Получение конъюгатов МкАт с пероксидазой хрена........................77

4.3.6.2 Определение оптимальных сочетаний захватывающих и выявляющих МкАт............................................................................................77

4.3.6.3 Определение оптимальных вариантов постановки реакции............80

4.3.7 Изучение стабильности полученных гибридом....................................82

5 Обсуждение....................................................................................................84

6 Выводы...........................................................................................................89

7 Практические предложения.......................................................................91

8 Список цитированной литературы..........................................................92

Приложения.......................................................................................................120

Список сокращений

АБТС 2,2-азино-бис(3-этил) бензотиазолин-6-сульфоновая кислота

АГ антиген

АЖ асцитическая жидкость

АСС антигенсвязывающий сайт иммуноглобулина

АТ антитело

АЧС африканская чума свиней

БсАт бисайтспецифическое антитело

БсМкАт бисайтспецифическое моноклональное антитело

БЛНМ белые лабораторные нелинейные мыши

БСА бычий сывороточный альбумин

ВНИИВВи Всероссийский научно-исследовательский институт

М ветеринарной вирусологии и микробиологии;

ГГФРТ гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза

ДАБ 3,3"-диаминобензидин

ДМСО диметилсульфоксид

ДАС ИФА двойной антительный «сэндвич» вариант ИФА

ДСН додецилсульфат натрия

ЗФР-Т ЗФР, содержащий твин-20;

ЗФР-Т- ЗФР, содержащий твин-20 и бычий сывороточный альбумин

БСА (БСА);

ЗФР-Т-ка- ЗФР, содержащий твин-20 и молочный казеин крупного

зеин рогатого скота;

ИПЦР иммуно-полимеразная цепная реакция

ИФА иммуноферментный анализ

ИЦХ иммуноцитохимический анализ

КББ карбонат-бикарбонатный буфер, рН 9,5-9,6

кДа килодальтон

МкАт моноклональное антитело

НЦМ нитроцеллюлозная мембрана

ОП оптическая плотность

ПААГ полиакриламидный гель

ПАФ полный адъювант Фрейнда

ПСГК перевиваемая культура клеток почки сибирского горного козерога

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПХ пероксидаза из корней хрена

ПЭГ полиэтиленгликоль

РЛАГ Реакция латекс-агглютинации

РНИФ реакция непрямой иммунофлуоресценции

Трис- трис-(гидроксиметил)-аминометан

ТФ ИФА твердофазный вариант иммуноферментного анализа

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФБР 0.01 М фосфатно-буферный раствор, рН 7.2-7.4

ФИТЦ флюоресцеинизотиоцианат

Ва1Ь/с инбредная линия мышей

БМЕМ минимальная среда Игла в модификации Дульбекко

¥аЪ вариабельный фрагмент молекулы иммуноглобулина

¥с константный фрагмент антитела

¥у вариабельная область антитела, АСС

НТ (с англ. - аббр. - ГТ) гипоксантин, тимидин;

НАТ (с англ. - аббр. - ГАТ) гипоксантин, аминоптерин, тимидин;

НТ (с англ. - аббр. - ГТ) гипоксантин, тимидин;

НвРОТ гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза

Ы иммуноглобулин

1РТв изопропил-Р-О-1 -тиогалактопиранозид

МАЬв биспецифические моноклональные антитела

ОБ оптическая плотность

рН обратный десятичный логарифм концентрации ионов Н^

8Р-2/0 клетки миеломы мыши, дефектные по гену ГГФРТ

вБв-РАЛв в перев. с англ. аббр. ДСН-ПААГ (ПААГ-ДСН);

1 Введение

1.1 Актуальность работы

Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь, характеризующаяся контагиозностью и летальностью, получила в настоящее время широкое распространение на европейской территории Российской Федерации.

Одним из основных белков вируса АЧС является структурный белок урЗО входящий в состав внутренней мембраны вириона. урЗО имеет важное диагностическое значение, поскольку синтезируется на ранних и поздних стадиях инфицирования и является высококонсервативным белком, присущим большинству известных изолятов вируса АЧС. Данные факты объясняют перспективность получения и изучения моноклональных антител, специфичных к указанному белку.

В доступной литературе имеется ограниченное количество работ посвященных использованию ДНК-иммунизации для получения МкАт.

Обычно при получении МкАт в качестве иммуногена используют очищенные и концентрированные вирусные антигены. Однако даже при высокой степени их очистки не удаётся избавиться от примеси балластных контаминирующих антигенов, часто имеющих высокую иммуногенность [17].

Использование рекомбинантных конструкций для иммунизации мышей с целью получения МкАт заданной специфичности позволяет исключить недостатки использования вирусных антигенов, так как устраняет наличие контаминирующих антигенов, тем самым достигается стандартизация и чистота иммуногена.

ДНК-иммунизация как метод доставки генетического материала имеет ряд преимуществ перед иммунизацией белками. Наиболее важным является запуск обоих ветвей иммунного ответа, что обеспечивает высокое качество В-лимфоцитов для слияния, а так же увеличивает долю антител, специфичных к конформационным эпитопам заданного белка.

S. Mazumder et al. (2011) при изучении индукции и длительности иммунного ответа у мышей линии BALB/c при различных комбинациях ДНК/белок показали преимущество иммунизации с праймированием ДНК-плазмидой и последующим введением белка в растворимой форме [141].

Использование рекомбинантных антигенов и моноклональных антител, полученных на их основе, также позволяет совершенствовать иммунодиагностику, причем, эти подходы фактически позволяют исключить использование высокопатогенных инфекционных агентов при производстве диагностических тест-систем.

1.2 Степень разработанности проблемы

Т.С. Whyard [221], А. Sanz [187] и рядом других зарубежных исследователей получены МкАт к вирусу АЧС.

Во ВНИИВВиМ Н.И. Митиным с соавт. получены гибридомы секретирующие МкАт к вирусу АЧС и разработаны диагностические иммуноферментные тест-системы на основе МкАт к мажорному вирионному белку р72 [13].

Т.Р. Кирюхиной отработан сэндвич вариант ТФ ИФА на основе МкАт к vp72 для тестирования антигена вируса АЧС в культуральных и органных материалах [11].

A.A. Пиря с соавт. получили 8 гибридных линий, продуцирующих МкАт к вирусным полипептидам, пять из которых специфичны к полипептиду с м.м. 31 к Да [17]. Однако их конформационные особенности не позволили использовать полученные МкАт в таких реакциях как иммуноцитохимия и иммунофлуоресценция.

Для получения моноклональных антител в данных исследованиях использовали классические подходы иммунизации хроматографически очищенными вирусными белками, без применения методов иммунизации рекомбинантными конструкциями и скринирования в реакции латекс-агглютинации.

1.3 Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось совершенствование методологии получения МкАт заданной специфичности, изучение их иммунохимических свойств и возможности использования в различных серологических реакциях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) подобрать оптимальные условия изготовления препаратов антигена белка урЗО вируса АЧС;

2) отработать оптимальную схему иммунизации мышей линии ВАЬВ/с -доноров спленоцитов, используя комбинированное введение ДНК/рекомбинантный белок;

3) получить стабильные линии гибридом, продуцирующие МкАт заданной специфичности;

4) отработать методы скрининга позволяющие тестировать клоны гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к урЗО вируса АЧС;

5) изучить иммунохимические свойства полученных МкАт.

1.4 Научная новизна результатов исследования

Впервые в Российской Федерации разработана схема иммунизации мышей линии ВАЬВ/с с использованием комбинированного введения плазмидной ДНК и рекомбинантного белка.

Впервые в Российской Федерации получены линии гибридом, секретирующие специфические моноклональные антитела к рекомбинантному белку рЗО вируса АЧС, специфически взаимодействующие как с рекомбинантным вирусспецифическим белком рЗО, так и с натуральным.

Определены изотип, конформационная и эпитопная специфичность полученных моноклональных антител клонов IV!, 2В7, 1С 12, 5011.

С помощью полученных МкАт установлено наличие на консервативном конформационном участке молекулы белка рЗО трех не перекрывающихся антигенных сайтов. Один из них является конформационно зависимым.

С использованием полученных моноклональных антител показана динамика накопления фосфопротеина рЗО в чувствительной линии клеток CV-1, инфицированных вирусом АЧС штамм 691/88.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Усовершенствованная технология получения и скрининга МкАт на основе

плазмидной ДНК, несущей ген белка рЗО вируса АЧС и рекомбинантного белка рЗО использована для получения МкАт заданной специфичности.

Разработаны «Методические положения по получению моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку рЗО вируса африканской чумы свиней (АЧС)», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 10.11.2011 г.

Разработаны «Методические положения по получению моноклональных антител к структурному белку рЗО вируса африканской чумы свиней с использованием метода «прайм-бустерной» иммунизации рекомбинантными конструкциями», которые рассмотрены на учёном совете и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым 12.03.2013г.

Получены, охарактеризованы, паспортизированы и заложены на длительное хранение в музей гибридом ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии четыре клона гибридом - 7F7, 2В7, 1С 12, 5D11, продуцирующие моноклональные антитела к белку рЗО вируса африканской чумы свиней взаимодействующие как с рекомбинантным белком рЗО, так и с вирусным антигеном.

Разработаны условия постановки ДАС ТФ ИФА, РНИФ, ИЦХ на основе МкАт к белку рЗО, предназначенные для обнаружения специфических антигенов вируса АЧС в инфицированном материале.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов приведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Научные положения и выводы диссертационной работы аргументировано отражают содержание работы.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании секции «Инфекционной патологии животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН (27 апреля 2011 г), на 2й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (Покров, 30 мая 2012г), Международной научно-практической конференции «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» ВНИИЗЖ (Владимир, 18 октября 2012г), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ (2011-2013 гг.), совещаниях научных сотрудников лаборатории «Биотехнологии» ВНИИВВиМ