Клонирование и экспрессия генов структурных белков Р30 и Р72 вируса африканской чумы свиней

Копытов, Валерий Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клонирование и экспрессия генов структурных белков Р30 и Р72 вируса африканской чумы свиней
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов структурных белков Р30 и Р72 вируса африканской чумы свиней"

На правах рукописи УДК 619:616.98:579.852.11

КОПЫТОВ ВАЛЕРИЙ ОЛЕГОВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕИЭКСПРЕССИЯГЕНОВ СТРУКТУРНЫХБЕЛКОВР3ОИР72ВИРУСА АФРИКАНСКОЙЧУМЫСВИНЕЙ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров - 2004 г.

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ

РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,' профессор

кандидат ветеринарных наук

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ГНУ ВНИТИБП, г. Щёлково)

Защита состоится 23 декабря в 1З30 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, г.Покров, Владимирской области, ГНУ ВНИИВВиМ (тел./факс: (09243) 6 21 25).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института.

Автореферат 2004 г.

Цыбанов Содном Жамьянович

Рыбаков Сергей Сергеевич Капустина Ольга Владимировна

Ученый секретарь диссертационного совета, ^ л

кандидат биологических наук г / СавуковаВ.Я.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Вирус африканской чумы свиней (АЧС) - крупный оболочечный ДНК-содержащий вирус икосаэдральной симметрии, относящийся к семейству Asfarviiidae (Dixon L.K., 2000). По структуре и механизму репликации генома вирус АЧС имеет сходство с поксвирусами (Vinuela E., 1985).

Эффективные средства специфической профилактики при АЧС не разработаны. Во многом это объясняется биологическими свойствами вируса (высокие вариабельность, контагиозность и вирулентность). Выделение вируса с использованием чувствительных животных и культур клеток требует длительного времени и специально оборудованных помещений, имеющих определенный уровень защиты для работы с возбудителями особо опасных инфекций. Всё это обусловливает трудность борьбы с АЧС и необходимость совершенствования противоэпизоотических мероприятий на основе новейших научных достижений (Семенихин АЛ., 1992).

Выявление умеренно вирулентных изолятов вируса АЧС, основывается на обнаружении специфических антител (Escribano J.M., 1989; Pastor M.J., 1992). Однако, стандартизация диагностикумов на основе поликлональных антител, выделенных из сывороток крови гипериммунных свиней, часто бывает затруднительной, вследствие различия в физиологическом статусе доноров иммуноглобулинов, а также появления у них аутоантител (Wardley R.C., 1983). Производство таких препаратов

1 MCHAUiMM4MtA«|

I кимиотехА I

требует больших затрат и сопряжено с необходимостью создания жёстких санитарных условий при содержании инфицированных животных.

В связи с этим одним из основных путей оперативной и ретроспективной диагностики АЧС является разработка современных высоко специфических методов лабораторной диагностики, способных составить одно из определяющих звеньев комплексной программы по профилактике и контролю АЧС. Возможным решением этой задачи может стать разработка технологии получения рекомбинантных белков вируса АЧС в качестве компонентов диагностических наборов, имеющей следующие преимущества по сравнению с методами, базирующимися на выделении антигена из экстракта инфицированных клеток: исключается использование живого вируса для получения антигена (безопасность); компоненты культур клеток не контаминируют антиген; отпадает необходимость инактивации вируса, что сохраняет тем самым нативными конформационные эпитопы антигена. Технология рекомбинантных ДНК позволяет получить совершенно одинаковые молекулы антигена в больших количествах.

Цели и задачи исследования

В связи с выше изложенным основной целью исследований являлось клонирование и экспрессия рекомбинантных антигенов р30 и р72 вируса АЧС, являющихся облигатными индукторами антителогенеза, пригодных для использования в ИФА.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) Определить участки генов, кодирующих иммунореактивные последовательности мажорных антигенов р30 и р72 вируса АЧС;

2) Рассчитать праймеры и оптимизировать полимеразную цепную реакцию для получения ПЦР-продуктов, содержащих нуклеотидные последовательности генов р30 и р72 вируса АЧС;

3) Создать генно-инженерные конструкции, экспрессирующие белки р30 и р72;

4) Оптимизировать условия наращивания, выделения и очистки рекомбинантных белков р30 и р72 в прокариотическом векторе;

5) Оценить пригодность рекомбинантных белков для использования их в качестве антигена при постановке серологических реакций;

6) Определить возможность использования праймеров, комплементарных гену рЗО, для выявления ДНК вируса АЧС в различных вируссодержащих материалах.

Научная новизна

Получены рекомбинантные белки р30 и р72 вируса АЧС в составе плазмидного вектора рТТ9, содержащего целлюлозосвязывающий домен, который позволяет быстро выделить и очистить белок из клеток Е. coli с помощью сорбции на целлюлозной матрице.

Рекомбинантный антиген р30 пригоден для выявления антител к вирусу АЧС в непрямом варианте ТФ ИФА и не реагирует с сыворотками, специфичными к гетерологичным вирусам.

Показана возможность использования полимеразной цепной реакции, целевым геном которой является р30, для выявления ДНК вируса АЧС в различных вируссодержащих материалах.

Практическая значимость работы

Разработанная методика получения рекомбинантного антигена р30 вируса АЧС в прокариотическом векторе исключает использование для этой цели живого вируса и позволяет выявлять антитела против вируса АЧС в непрямом варианте ТФ ИФА. Антигенная активность и специфичность рекомбинантного белка рЗО была подтверждена комиссионно (акт № 18 от 24.10.03).

Оптимизация условий постановки ПЦР на основе амплификации последовательностей гена рЗО позволяет обнаруживать ДНК вируса АЧС у животных с хроническим и латентным течениями болезни, что свидетельствует о пригодности данного метода для экспресс-диагностики АЧС.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2002-2004 гг.).

Материалы диссертации доложены на IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.), Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института 24-26 сентября 2003 г. «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (г. Покров, 2003 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Личный вклад

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором в основном самостоятельно. В выполнении работы по разделам 4.2.3., 4.2.4., 4.2.5., 4.2.11., 4.2.13., 4.2.14. и 4.2.15. оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: Власова Н.Н., Цыбанова Л.Я., а также сотрудники ВНИИСБ: Лунин В.Г. и Колобова О.С.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Методика получения рекомбинантного антигена р30 вируса

АЧС.

2. Использование рекомбинантного белка р30 в качестве антигена для выявления специфических антител к вирусу АЧС непрямым вариантом твердофазного иммуноферментного анализа.

3. Оптимизация условий постановки полимеразной цепной реакции на основе амплификации последовательности гена рЗО для выявления ДНК вируса АЧС в вируссодержащих материалах.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и фотографиями, 10 таблицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы содержит 240 источников, в т.ч. 216 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе были использованы препараты ДНК вируса АЧС, выделенные из культур клеток ККМС и ПГЖ-66б и органов свиней (селезёнка, печень, лимфатические узлы, кровь), инфицированных вирулентными и авирулентными штаммами различных серотипов, полученные в лаборатории «Биофизики» ГНУ ВНИИВВиМ. Характеристика штаммов, ДНК которых использовали в работе, приведена в табл. 1.

Таблица 1.

Характеристика штаммов, препараты ДНК которых __использовались в работе.

Характеристика штаммов

Штамм Серотип Происхождение Гемад-сорбция Вирулентность Накопление в культуре клеток 1% ГАдЕ5о/см3 ил \ё ТЦДзо/см3 Накопление в органах ^ ГАдЕзо/см3 или ^ТЩЫсм3

Л-57 I Европа + + 6,0-7,5 5,5 -7,0

Л-50 + - 6,5-7,0 н/и

К-73 Африка + + 6,5-7,0 н/и

КК-262 П + - 7,0-7,5 1,5-3,5

НВЛ-1 - - 7,0-7,5 н/и

Моз-78 Ш Африка + + 7,0-7,5 н/и

МК-220 + - 7,0-7,5 2,7-4,5

Ф-32 IV Европа + + 6,0-7,5 н/и

ФК-135 + - 6,5 - 7,5 н/и

Киравира Нетипи-рован Африка + + 7,0-8,0 5,7-7,0

Примечание: н/и - не исследовано.

В качестве отрицательных контролен использовали пробы органов от здоровых подсвинков и от павших свиней, инфицированных вирусами КЧС (штамм Ши-Мынь), болезни Ауески (штамм БУК), а также ДНК вируса осповакцины (штамм ЛИВП). В качестве гетерогенных антител в ИФА использовали сыворотки к вирусам КЧС, ТГС, болезней Ауески и Тешена.

Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также моделирование рекомбинантных конструкций проводили с использованием пакетов прикладных программ DNAsis (версия 2.5) и Clone.

Полимеразная цепная реакция ПЦР проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл, содержащей 10-кратный буфер для амплификации, 200 JJM каждого dNTP, 10 пмоль каждого праймера, 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы, раствор ДНК. Поверх реакционной смеси наслаивали 30 мкл лёгкого минерального масла для предотвращения испарения. После проведения первой стадии ПЦР отбирали из-под масла 5 мкл пробы и использовали для реамплификации. Все манипуляции проводили в соответствии с рекомендациями Saiki R.K.; Mullis К. и Sambrook J. (Saiki R.K., 1985; Mullis К., 1986; Sambrook J., 1989).

Электрофорез ДНК Анализ фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в геле агарозы. Пробы ДНК (по 10 мкл) смешивали с 2 мкл буфера для нанесения и вносили пробы в лунки геля. По окончании электрофореза и окрашивания геля бромистым этидием на основании размеров фрагментов маркерных ДНК и расстояний их пробегов в геле (рестрицированная HindIII и Eco RI ДНК фага лямбда) вычисляли размеры исследуемых фрагментов ДНК.

Рестрикция ДНК Рестрикцию проводили в конечном объёме 10 мкл, содержащем 1 мкл 10-кратного рестрикционного буфера, 0,5 мкл каждой рестриктазы из расчета 1-5 ед/мкг ДНК. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1-1,5 часа.

Лигирование

Лигирование проводили в объеме 25 мкл, содержащем лигазный буфер, 0,1 М КС1,1 мМ АТР, 10 единиц ДНК-лигазы Т4,10 мкл векторной ДНК и 5 мкл ПЦР-продукта.

Электропорация

Трансформацию компетентных клеток методом электропорации осуществляли согласно рекомендациям фирмы Bio-Rad. При выполнении всех

подготовительных операций материалы предварительно охлаждали, а кюветы тщательно высушивали. Электропорацию проводили при силе тока 2,5 мА, а время его воздействия на клетки не превышало 4,2 сек.

Выделение плазмидной ДНК Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса из 5 мл культуры Е. coli (Birnboim H.C.,1983).

Электрофорез белков Для оценки экспрессии рекомбинантного белка проводили анализ суммарного клеточного белка с помощью электрофореза в 12%-ном SDS-PAGE по Laemmli U.K. (1970).

Иммуноферментный анализ В лунки микропанели вносили антиген, разведенный в 0.05М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9.6-9.7). Вносили на контакт исследуемые, положительные и отрицательные сыворотки в соотношении 1:30 в ФБР, рН 7.2, содержащим 0,05 % твин-20. После инкубации и промывки в каждую лунку добавляли конъюгат протеин А - пероксидаза хрена в рабочем разведении 1:800. Инкубировали микропанели при 37°С в течение 1 часа. Затем 5 раз промывали ФБР, рН 7.2, содержащим 0,05 % твин-20. Вносили в лунки по 200 мкл раствора хромогенного субстрата ABTS, предварительно добавив на каждый 1 мл рабочего раствора ABTS 80 мкл 1%-ной Н2О2. Инкубировали при комнатной температуре около 15-20 мин. Положительными считали сыворотки, давшие сине-зелёное окрашивание, чётко различимое визуально. В том случае, если положительный контроль не даёт четкого сине-зелёного окрашивания, использовали считывающее устройство. В этом случае положительными считали те сыворотки, чьи коэффициенты поглощения более чем в 2 раза превышали оптическую плотность отрицательного контроля.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

1. Разработка методики выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР с использованием праймеров, комплементарных гену рЗО.

В связи с отсутствием в базе данных Генбанка значительного количества данных о нуклеотидных последовательностях гена рЗО различных изолятов вируса АЧС, этот ген не является мишенью для выявления вирусной ДНК с помощью ПЦР. В качестве мишени для ПЦР-диагностикумов служат нуклеотидные последовательности детально изученного гена р72 (Steiger Y., 1992; King D.P., 2003; Aguero M., 2003).. Поэтому представляло интерес подобрать праймеры, комплементарные гену мажорного белка рЗО, оценить их пригодность для выявления ДНК вируса АЧС различных серотипов, чувствительность и специфичность детекции ДНК в сравнении с праймерами, комплементарными гену р72. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в этой работе, представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Нуклеотидные последовательности праймеров, фланкирующих _конформационные эпитопы белков рЗО ир 72 вируса А ЧС.

Праймер

Последовательность

Позиция

р30F

5'-aga atg ggg ate cat tct gca tgt get gtt tga-3'

210

p30R

5'-cta aaa ate egg atg tag gtg aga tta aag ctt a-3'

584

p72F

5'-tgt gcg egg ate ctg cat ccc agg gga taa aat g-3'

620

p72R

5'-aaa att ctc egg act aat cct ttt gcg atg caa gct-3'

1113

Расчётная длина ПНР-продуктов составила 374 п.о. для гена рЗО и 493 п.о. для гена р72. Для определения специфичности ПЦР в реакции использовали ДНК I, II, III, IV серотипов вируса АЧС и нетипированного изолята Киравира, а также нуклеиновые кислоты близких по структуре генома (покс- и герпесвирусы) и клиническим проявлениям болезни (вирус КЧС) гетерологичных вирусов. Результаты определения специфичности ПЦР с использованием праймеров, комплементарных гену р30, представлены на рис. 1.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис 1. Определение специфичности праймеров р30Р/Я. Электрофореграмма продуктов амплификации в 2% агарозном геле.

1- вирус АЧС I серотипа (штамм Л-57), 2 - вирус АЧС II серотипа (штамм НВЛ-1), 3 - вирус АЧС III серотипа (штамм МК-220), 4 - вирус АЧС IV серотипа (штамм ФК-135), 5 - вирус АЧС (изолят Киравира, нетипированный), 6 - вирус болезни Ауески (штамм БУК), 7 - вирус осповакцины (штамм ЛИВП), 8 - вирус КЧС (штамм Ши-Мынь).

Как видно из рис. 1, праймеры р30Б/Я чётко гибридизуются с ДНК вируса АЧС различных серотипов и не гибридизуются с нуклеиновыми кислотами гетерологичных вирусов.

Таким образом, праймеры р30Б/Я позволяют выявлять ДНК вирулентных и авирулентных, гемадсорбирующих и негемадсорбирующих, штаммов и изолятов вируса АЧС европейского и африканского происхождения (табл. 1).

Для определения порога чувствительности ПЦР готовили 10-кратные разведения ДНК авирулентного, негемадсорбирующего цитопатогенного штамма НВЛ-1 вируса АЧС с исходным титром 7,0 ^ Результаты исследований представлены в табл. 3 и на рис. 2.

Таблица 3.

Чувствительность выявленияДНКвируса АЧСметодомПЦРс праймерами, комплементарными гену р30вируса А ЧС.

п=5

Штамм Титр, ТЦД50/см3 Разведения исходной пробы ДНК

1/10 1/100 1/1000 1/10000 1/100000 1/1000000 1/10000000

НВЛ-1 7,0 + + + + + + -

Примечание: «+»- ДНК обнаружена; «-» - ДНК не обнаружена; «+*»- ДНК обнаружена, после реамплификации.

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Определение чувствительности ПЦР с образцами ДНК вируса АЧС с праймерами рЗОБ/Я. Электрофореграмма продуктов амплификации в 2% агарозном геле.

1 -разведение ДНК 1/10,2- 1/100,3 - 1/1000,4- 1/10000, 5 - 1/100000,61/1000000.

Представленные данные свидетельствуют о том, что описанная методика позволяет устойчиво обнаруживать ДНК вируса АЧС (штамм НВЛ-1) в образцах с минимальным титром инфекционной активности 100 ТЦДзо/см3, а после реамплификации в течение 20-ти циклов с этими же праймерами - 10 ТЦДзо/см3.

На следующем этапе нами были проведены исследования по сравнительной оценке эффективности выявления ДНК вируса АЧС в пробах органов инфицированных животных методом ПЦР с использованием праймеров р30Б/Я и р72Р/Я. В опытах использовали препараты ДНК, выделенные из органов павших и убитых в стадии агонии подсвинков, заражённых вирусом АЧС. В качестве отрицательных контролей использовали пробы органов, взятых от павших свиней, инфицированных вирусом КЧС

(штамм Ши-Мынь), вирусом болезни Ауески (штамм БУК) и пробы органов от здоровых подсвинков. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4.

ВыявлениеДНКвируса АЧСв пробахоргановинфицированныхживотных

спомощью ПЦР.

_,_,_,_п=5

Штамм, время забоя Наименование органов Титр, ГАДЕя/мл Результаты ПЦР

Праймеры р30Е/® Праймеры р72 Е/®

Киравира, 5-7 день Селезенка Печень Лимфоузлы Кровь 7,5 6,0 5,7 7,0 + + + + + + + +

Л-57 6-9 день Селезенка Печень Лимфоузлы Кровь 7,0 6,0 5,5 6,5 + + + + + + + +

МК-220 21 день Селезенка Печень Лимфоузлы Кровь 4,5 3,5 3,0 2,7 + + + + + +*

Контроль, норма Селезенка Печень Лимфоузлы Кровь -

Контроль, КЧС Селезенка Печень Лимфоузлы Кровь -

Контроль, вирус болезни Ауески Селезенка Печень Лимфоузлы Кровь -

Примечание: «+» - ДНК обнаружена; «-» - ДНК не обнаружена; «+ » - ДНК обнаружена после реамплификации.

Из данных, представленных в табл. 4, следует, что при различных формах течения болезни (острая форма при заражении изолятом Киравира и штаммом Л-57 и хроническая при заражении штаммом МК-220) выявление вирусной ДНК с помощью ПЦР было 100%-ным, как с праймерами рЗОР/Я, так и с праймерами р72Б/Я. При постановке ПЦР с праймерами, комплементарными гену р30, выявлено достоверное различие при сравнении чувствительности метода с праймерами, комплементарными гену р72. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что с помощью праймеров р30Б/Я можно выявлять животных с хроническим и бессимптомным течением болезни.

2. Конструирование генно-инженерных векторных систем, экспрессирующих рекомбинантные антигенные эпитопы белков р30 и

p72.

Для проведения ПЦР-амплификации использовали описанные вьппе праймеры p30F/R и p72F/R (табл. 2). На 5'- концах этих праймеров были вложены сайты рестрикции Ват HII и Bsp MII для клонирования ПЦР-продуктов в векторе рТТ9. Плазмида рТТ9 не содержит сайта Ват HI, но имеет сайт рестриктазы Bgl II, которая образует липкие концы, комплементарные липким концам, образованным Ват HI. ПЦР-продукты обработанные рестриктазами Bam HI, Bsp MII и ДНК вектора рТТ9, расщеплённой по Bgl II и Bsp MII сайтам, лигировали по липким концам. Схема конструирования генно-инженерных векторных систем, экспрессирующих рекомбинантные антигенные эпитопы белков р30 и р72, представлена на рис. 3.

i Щ, У +

на»»

JT2hp PCRpTI

еииквд <иц>(М)

S\ /т/,' V

U РЭ£! t'i I £2? V;

^ зялр jj I I «m* Г j

4 V --; о»

Рис. 3. Схема конструированиягенно-инженерныхвекторныхсистем. Amp - ген устойчивости к ампициллину; CelD-sp (G,S) - целлюлозосвязывающий домен типа D со спейсером, состоящим и остатков глицина и серина, и разделяющим пространственно целлюлозосвязывающий домен и встроенный ген.

Полученными рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки Е. coli методом электропорации, а затем подращивали в течение 1 часа при 37°С в жидкой среде LB. Скрининг рекомбинантных клонов проводили на 1,8%-ном L-arape, содержащем антибиотики.

В результате отбора получено около 200 клонов Е. coli, трансформированных рекомбинантной плазмидой со встройкой фрагмента гена р72, и около 300 клонов, трансформированных плазмидой со встройкой фрагмента гена рЗО.

На следующем этапе проводили отбор клонов, содержащих фрагменты генов рЗО и р72. Для этого из культур рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК, которую расщепляли по ВашШ и HindIII сайтам рестрикции, фланкирующим последовательности встроенных генов (рис. 4).

930 п.о.

1038 п.о.

603 п.о.

Рис. 4. Схема распределения в геле агарозы продуктов гидролиза по ВатШ и НтёШ сайтам исходной и рекомбинантных плазмид:

1 - штаммовая плазмида рЯер4 (3740 п.о.), тело плазмиды рТТ9 (3396 п.о.), фрагмент, не содержащий встройки (603 п.о.);

2 - штаммовая плазмида рЯер4 (3740 п.о.),. - тело плазмиды рТТ9 (3396 п.о,), фрагмент, содержащий встроенный ген р30 (930 п.о.);

3 - штаммовая плазмида рЯер4 (3740 п.о.), тело плазмиды рТТ9 (3396 п.о.), фрагмент, содержащий встроенный ген р72 (1038 п.о.).

Продукты рестрикции анализировали методом электрофореза в 1,5% геле агарозы. Фрагменты с встроенными последовательностями генов р30 и р72 имели размеры 930 (рис. 5) и 1038 п о. (рис. 6) соответственно. Выше тела плазмиды рТТ9, не содержащей встройки, расположена не имеющая сайтов рестрикции Hind III и ВатШ плазмида pRep4 размером 3740 п.о, экспрессирующая 1ас-репрессор.

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов рестрикции рекомбинантных плазмид, несущих фрагменты гена рЗО, в 1,5% агарозном геле. 1 - маркерная ДНК фага X, обработанная рестриктазами Hind III и Eco RI); 2-17 - рекомбинантные плазмиды pTT9p30/BamHI и Hindlll (клоны с 1-ого по 16-ый), 18 - исходная плазмида рТТ9 без встройки (не рестрицированная, 3999 п.о.)

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов рестрикции рекомбинантных плазмид, несущих фрагменты гена р72, в 1,5% агарозном геле. 1 - маркерная ДНК фага X, обработанная рестриктазами Hind III и Eco RI); 2-17 - рекомбинантные плазмиды pTT9p72/BamHI и Hindlll (клоны с 1-ого по 16-ый), 18 - исходная плазмида рТТ9 без встройки (не рестрицированная, 3999 п.о.).

На представленных электрофореграммах видно, что плазмиды рТТ9рЗО-2 и рТТ9рЗО-9 содержат последовательности гена рЗО, а рТТ9р72-10 - гена р72. В дальнейших исследованиях эти клоны были использованы для экспрессии рекомбинантных белков.

Для экспрессии рекомбинантного белка индуцировали промотор фага Т5, расположенный в плазмиде рТТ9, добавлением IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Для определения оптимального времени индукции отбирали по 1 мл культуры клеток через каждые 30 минут после добавления IPTG, осаждали и замораживали на -20°С. Затем выделяли белок с помощью сорбции на целлюлозе (MN-300 (Serva)) и оценивали экспрессию с помощью электрофореза в SDS-PAGE. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5.

Выходрекомбинантного белкавразличные периоды времени индукции

промотора.

Время, часы Выходрекомбинантного белка, мкг/мл

0,5 10

1,0 30

15 60

2,0 80

25 100

Из данных, представленных в табл. 5 следует, что оптимальный выход рекомбинантного белка (80-100 мкг/мл) достигался при периоде индукции не менее 2 часов.

Для оценки уровня экспрессии белков проводили анализ суммарного клеточного белка 2-х клонов Е. coli, содержащих встройки гена р30, и 1-го клона, содержащего встройку гена р72, в SDS-PAGE no Laemmli. Результаты представлены на рис. 7.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

рЗО Р72

CBD

Рис. 7. Электрофорез суммарного клеточного белка в 12% полиакриламидном геле до и после индукции отобранных клонов Е. coli. Треки: 1 - рТТ9 без встройки (индуцированный контроль); 2 - рТТ9рЗО-2 (неиндуцированный контроль); 3 - рТТ9р30-2 (после индукции); 4 -рТТ9р30-2 (нерастворимая фракции); 5 - рТТ9р30-2 (растворимая фракция); 6 - рТТ9р30-9 (неиндуцированный контроль); 7 - рТТ9р30-9 (после индукции); 8 - рТТ9рЗО-9 (нерастворимая фракции); 9 - рТТ9рЗО-9 (растворимая фракция); 10 - рТТ9р72-10 (неиндуцированный контроль); 11 - рТТ9р72-10 (после индукции); 12 - рТТ9р72-10 (нерастворимая фракции); 13 - рТТ9р72-10 (растворимая фракция)

Из приведённой электрофореграммы следует, что отобранные клоны экспрессируют рекомбинантные белки, которые отсутствуют в треках без индукции и контроле. Белок р30 в клонах рТТ9р30-2 и рТТ9р30-9 преимущественно накапливался в растворимой фракции, в то время как белок р72 в клоне рТТ9р72-10 - в нерастворимой. Затем белок выделяли с помощью специфической сорбции целлюлозосвязывающего домена, сшитого с рекомбинантными белками р30 и р72 (рис. 3), на целлюлозной матрице. В связи с тем, что белок р72 накапливался во нерастворимой фракции что скорее всего свидетельствует о его неправильной сборке, все дальнейшие исследования проводили только с клонами, экспрессирующими белок рЗО.

С целью определения оптимальной концентрации антигена для сенсибилизации пластин были испытаны следующие буферные растворы:

0.05М карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9.6-9.7) (КББ), 0.05М карбонатный буфер (рН 11.3-11.5) (КБ), 0.02М фосфатный буфер (рН 7.47.6) (ФБР) и 0.02М калий-фосфатный буфер (рН 5.0-5.3) (К-фосф.).

Рекомбинантный белок рЗО разводили в сравниваемых буферах, начиная с разведения 1:50 с двукратным шагом, вносили в лунки планшета и выдерживали при различном температурно-временном режиме (в течение 0.5, 1, 2, 3 часов при температуре 37°С; в течение 2, 16-18, 24 часов при температуре 4°С и при комнатной температуре). По титру антител положительной контрольной сыворотки судили о пригодности применяемых буферных систем. Полученные результаты суммированы в табл.6. Наибольшее разведение, дающее положительный сигнал с контрольной сывороткой, составило 1:200. Максимальная сенсибилизация рекомбинантного антигена обеспечивалась при использовании карбонатно-бикарбонатного буфера (рН 9.6) при инкубации в течение 24 часов при температуре 4°С.

Таблица 6.

Влияние состава буферногораствора и температурно-временного

режима на чувствительность ИФА

Режим инкубации Активность антигена рЗО (конечный титр)

Буферные растворы

ГС Время, часы КБ, рН 11.3 КББ, рН 9.6 ФБР, рН 7.6 К-фосф., рН 5.3

4 2 1:50 1:100 1:50 1:50

16-18 1:100 1:100 1:50 1:50

24 1:100 1:200 1:100 1:100

25 2 1:50 1:50 1:50 1:50

16-18 1:50 1:100 1:50 1:50

24 1:50 1:50 1:50 1:50

37 0,5 <1:50 1:50 <1:50 <1:50

1 1:50 1:100 <1:50 <1:50

2 1:50 1:50 1:50 1:50

3 1:100 1:50 1:100 1:100

Поскольку ранее во ВНИИВВиМ была разработана тест-система для выявления антител к вирусу АЧС с помощью ИФА (ТУ 4620-1186-85) представляло несомненный интерес провести испытания по сравнительной оценке чувствительности и специфичности непрямого варианта твердофазного ИФА с использованием рекомбинантного и стандартного антигенов. В опытах использовали 3 серии специфических к вирусу АЧС (I, II, Ш и IV серотипов) лиофилизированных сывороток, изготовленных в разные годы (серия №3, 1988г., серия №5, 1997 г., серия №7, 2001 г.), а также нормальные сыворотки и сыворотки к гетерологичным вирусам.

В результате проведённых исследований было установлено, что титры антител всех специфических к вирусу АЧС сывороток, выявляемые в ИФА с использованием рекомбинантного антигена, имели сходные значения с титрами, выявленными с использованием стандартного антигена. С антигенами контрольных образцов положительного сигнала не обнаружено.

Сыворотки к вирусу АЧС IV серотипа взаимодействовали со специфическим стандартным антигеном на одно разведение активнее, нежели с рекомбинантным. Результаты оценки чувствительности и специфичности непрямого варианта твердофазного ИФА с использованием рекомбинантного антигена представлены в табл. 7.

Отмечено, что при использовании рекомбинантного белка для титрования специфических сывороток методом ИФА отсутствует фон. Данное преимущество позволяет начинать разведение сывороток с низкой активностью, а также контрольных и гетерологичных сывороток с 1:5, а не с 1:125, как рекомендуется при использовании ранее разработанного набора для ИФА. Это предоставляет возможность выявлять заражённых животных в более ранние сроки.

Таблица 7.

Результаты оценки чувствительности и специфичности непрямого варианта твердофазного ИФА с испытуемым рекомбинантным антигеном и стандартным антигеном из набора для обнаружения антител вируса _АЧС.

№ Испытуемые сыворотки Серотип АЧС Титры в ИФА Титры в РЗГА

Реком. АГ Станд. АГ

1 Серия №3,1988 г. I 1:625 1:625 1:80

2 Серия №5,1997 г. 1:3125 1:3125 1:40

3 Серия№7,2001г. 1:3125 1:3125 1:80

4 Серия №3,1988 г. П 1:625 1:625 1:40

5 Серия №5,1997 г. 1:3125 1:3125 1:20

6 Серия №7,2001 г. 1:3125 1:3125 1:40

7 Серия №3,1988 г. III 1:625 1:625 1:80

8 Серия №5,1997 г. 1:3125 1:3125 1:20

9 Серия №7,2001 г. 1:3125 1:3125 1:40

10 Серия №3,1988 г. IV 1:625 1:625 1:80

И Серия №5,1997 г. 1:625 1:3125 1:40

12 Серия №7,2001 г. 1:15625 1:78125 1:40

13 Нормальная свиная сыв-ка - - -

14 Спец. сыв-ка КЧС - - -

15 Спец. сыв-ка вир. бол. Ауески - - -

16 Спец. сыв-ка ТГС - - -

17 Спец. сыв-ка вир бол. Тешена - - -

Таким образом, результаты проведённых исследований показали, что рекомбинантный антиген рЗО пригоден для выявления антител к вирусу АЧС в непрямом варианте ТФ ИФА.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлено клонирование и получена экспрессия рекомбинантных антигенов рЗО и р72 вируса АЧС в прокариотическом векторе.

2. На основе анализа профилей гидрофильности определены участки генов, кодирующие иммунореактивные последовательности мажорных антигенов р30 и р72 вируса АЧС, и отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с использованием праймеров p30F/R и p72F/R, фланкирующих конформационные эпитопы генов р30 и р72, размерами 374 и 493 п.о.

3. Получены три рекомбинантные плазмиды на основе вектора рТТ9, содержащие фрагменты генов структурных белков р30 и р72 штамма «НВЛ-1» вируса АЧС, обеспечивающие их экспрессию в клетках E.coli М15.

4. Оптимизированы условия наращивания, выделения и очистки рекомбинантных белков р30 и р72 в Е. coli M15. Наличие целлюлозосвязывающего домена в структуре рекомбинантных белков позволяет выделять их с помощью целлюлозного сорбента марки MN-300 (Serva) с выходом продукта 80-100 мкг/мл.

5. Оптимизированы условия постановки непрямого варианта ТФ ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка рЗО с активностью 1:200 при исходной концентрации 80-100 мкг/мл. Рекомбинантный антиген позволяет выявлять специфические к вирусу АЧС антитела в сыворотках крови животных и не реагирует с сыворотками, специфичными к гетерологичным вирусам.

6. Праймеры, комплементарные гену рЗО при температуре отжига 55° С, пригодны для выявления методом ПНР ДНК вирулентных и авирулентных штаммов вируса АЧС в пробах патматериала и заражённых культур клеток с минимальным титром инфекционной активности 100 ТЦД50/см3, а после реамплификации -10 ТЦД550/см3.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

- «Методические указания по выявлению ДНК вируса АЧС методом полимеразной цепной реакции» и «Методические указания по выявлению антител к вирусу АЧС методом ИФА с использованием рекомбинантного белка рЗО», утвержденные директором ВНИИВВиМ, могут быть использованы для обнаружения ДНК возбудителя в клинических образцах и специфических антител к вирусу АЧС в сыворотках крови при проведении научных и диагностических исследований;

- рекомбинантные плазмиды рТТ9рЗО-2, рТТ9рЗО-9 и рТТ9р72-10, содержащие фрагменты генов р30 и р72 вируса АЧС, и экспрессирующие рекомбинантные белки могут быть использованы для получения специфических антигенов вируса АЧС;

- методика индуцибельной экспрессии рекомбинантного белка р30 и его очистки для использования в качестве антигена при постановке ТФ ИФА с целью выявления антител к вирусу АЧС;

Полученные результаты использованы при подготовке 2 методик, которые комиссионно испытаны, одобрены Учёным советом и утверждены директором института.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Копытов В.О., Власова Н.Н., Цыбанов СЖ. Оптимизация условий ПЦР для получения полноразмерных генов фосфопротеина р30 и структурного белка р72 вируса африканской чумы свиней // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института, Покров, ВНИИВВиМ, 24-26 сентября 2003 года, - С. 432-437.

2. Копытов В.О., Колобова О.С., Анохина Е.Г. Экспрессия гена, кодирующего мажорный белок рЗО вируса африканской чумы свиней в клетках Е. coli // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Материалы Международной научной конференции

молодых учёных, 24-26 марта 2004 года / ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ ВНИИЗЖ). - Владимир, 2004. - С. 105-107.

3. Копытов В.О., Цыбанова ЛЛ. Репродукция вируса африканской чумы свиней в клещах (обзор) // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей: Материалы Международной научно-практической конференции 16-18 апреля 2002 г. -Покров, 2002. - С. 128-130.

4. Копытов В.О., Цыбанова Л.Я. Структурно-функциональная организация генома вируса африканской чумы свиней (обзор) // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей: Материалы Международной научно-практической конференции 16-18 апреля 2002 г. -Покров, 2002. - С. 130-133.

5. Копытов В.О., Цыбанова ЛЯ., Селянинов Ю.О., Цыбанов С.Ж Идентификация вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции, 22-24 октября 2002 г. -Москва, 2002. - С. 341-343.

Отпечатано в типографии отдела маркетинга ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тираж - 75 экз.

»264 ОГ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Копытов, Валерий Олегович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпизоотическая ситуация по АЧС.

2.1.1. Пути распространения вируса АЧС.

2.2. Патогенез и клинические проявления болезни.

2.3. Характеристика вириона.

2.3.1. Химические и физические свойства.

2.3.2. Геном вируса АЧС.

2.3.3. Полипептидный состав.

2.3.4. Таксономическая принадлежность вируса АЧС.

2.4. Лабораторная диагностика АЧС.

2.4.1. Генотипирование вируса АЧС.

2.5. Системы экспрессии для получения рекомбинантных белков.

2.5.1. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках Е. coli.

2.5.2. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей.

2.5.3. Эукариотические векторы, используемые в клетках животных.

2.5.4. Очистка и иммобилизация гибридных белков.

2.6. Применение рекомбинантных белков в диагностике АЧС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и экспрессия генов структурных белков Р30 и Р72 вируса африканской чумы свиней"

Вирус африканской чумы свиней (АЧС) - крупный икосаэдрический оболочечный ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Asfarviridae [87]. По структуре и механизму репликации генома вирус АЧС имеет сходство с поксвирусами [223].

АЧС является особо опасной болезнью домашних свиней, характеризующейся сильной лихорадкой, геморрагиями, слабостью, цианозом кожи ушных раковин, подгрудка, живота, пятачка и конечностей. Высоковирулентные штаммы вируса вызывают смертность, близкую к 100%. Болезнь протекает сверхостро, остро, подостро и хронически [1, 10, 22, 80, 83, 139, 150]. При сверхострой форме первым признаком болезни является внезапная гибель животных. При остром и подостром течении животные обычно гибнут через 2-14 суток после появления первых клинических признаков. Выжившие животные остаются в течение всей жизни вирусоносителями или хронически больными АЧС. Хроническая форма длится от 2 до 10 месяцев и сопровождается исхуданием, признаками пневмонии, артрита, обострениями болезни и гибелью [11, 80, 83, 150]. Вирус АЧС поражает клетки системы мононуклеарных фагоцитов, включая тканевые макрофаги и ретикулярные клетки селезёнки, лимфатических узлов, лёгких, почек и печени.

Средства специфической профилактики при АЧС не разработаны. Во многом это объясняется биологическими свойствами вируса. Полевые штаммы вируса АЧС обычно являются гетерогенными поликлональными популяциями, различающимися по вирулентности, гемадсорбирующим, антигенным и иммунобиологическим свойствам, что свидетельствует о его многотиповой вариабельности. Выделение вируса с использованием чувствительных животных и культур клеток требует длительного времени и специально оборудованных помещений, имеющих определенный уровень защиты для работы с возбудителями особо опасных инфекций. Всё это обусловливает трудность борьбы с АЧС и необходимость совершенствования противоэпизоотических мероприятий на основе новейших научных достижений [20].

Выявление умеренно вирулентных изолятов АЧС, вызывающих невысокий уровень смертности, но высокий уровень заболеваемости, часто основывается на обнаружении специфических антител [92, 160]. Однако, стандартизация диагностикумов на основе поликлональных антител, выделенных из сывороток крови гипериммунных свиней, часто бывает затруднительной, вследствие различия в физиологическом статусе доноров иммуноглобулинов, появления у них аутоантител. Производство таких препаратов требует больших затрат и сопряжено с необходимостью создания жёстких санитарных условий при содержании инфицированных животных.

В связи с этим одним из основных путей оперативной и ретроспективной диагностики АЧС, эпизоотологического мониторинга, изучения антигенной структуры и вариабельности вируса является разработка современных высоко специфических методов лабораторной диагностики, способных составить одно из определяющих звеньев комплексной программы по профилактике и контролю АЧС. Возможным решением этой задачи может стать технология получения рекомбинантных белков вируса АЧС, предоставляющая следующие преимущества по сравнению с методами, базирующимися на получении антигена из экстракта инфицированных клеток:

1) исключается использование живого вируса для получения антигена (безопасность);

2) компоненты культур клеток не контаминируют антиген;

3) отпадает необходимость инактивации вируса, что сохраняет нативными конформационные эпитопы антигена;

4) позволяет стандартизировать антиген.

Цели и задачи исследования

В связи с выше сказанным основной целью исследований являлось клонирование и экспрессия рекомбинантных антигенов рЗО и р72 вируса АЧС, являющихся облигатными индукторами антителогенеза, пригодных для использования в ИФА.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) Определить участки генов, кодирующих иммунореактивные последовательности мажорных антигенов рЗО и р72 вируса АЧС;

2) Рассчитать праймеры и оптимизировать полимеразную цепную реакцию для получения ПЦР-продуктов, содержащих нуклеотидные последовательности генов рЗО и р72 вируса АЧС;

3) Создать генно-инженерные конструкции, экспрессирующие белки рЗО и р72;

4) Оптимизировать условия наращивания, выделения и очистки рекомбинантных белков рЗО и р72 в прокариотическом векторе;

5) Оценить пригодность рекомбинантных белков для использования их в качестве антигена для постановки серологических реакций.

Научная новизна

Получены рекомбинантные белки рЗО и р72 вируса АЧС в составе плазмидного вектора рТТ9, содержащего целлюлозосвязывающий домен, который позволяет быстро выделить и очистить белок из клеток Е. coli с помощью сорбции на целлюлозной матрице.

Рекомбинантный антиген рЗО пригоден для выявления антител к вирусу АЧС в непрямом варианте ТФ ИФА и не реагирует с сыворотками, специфичными к гетерологичным вирусам.

Показана возможность использования полимеразной цепной реакции, целевым геном которой является рЗО, для выявления ДНК вируса АЧС в различных вируссодержащих материалах.

Практическая значимость работы

Разработанная методика получения рекомбинантного антигена рЗО вируса АЧС в прокариотическом векторе исключает использование для этой цели живого вируса и позволяет выявлять антитела против вируса АЧС в непрямом варианте ТФ ИФА. Антигенная активность и специфичность рекомбинантного белка рЗО была подтверждена комиссионно (акт № 18 от 24.10.03).

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Методика получения рекомбинантного антигена рЗО вируса АЧС.

2. Результаты использования непрямого варианта твёрдофазного иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного белка рЗО для выявления антител к вирусу АЧС.

Апробация работы

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Личный вклад

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Копытов, Валерий Олегович

6. ВЫВОДЫ

2. На основе анализа профилей гидрофильности определены участки генов, кодирующие иммунореактивные последовательности мажорных антигенов рЗО и р72 вируса АЧС и отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции, фланкирующих конформационные эпитопы генов рЗО и р72, размерами 374 и 483 п.о.

3. Получены три рекомбинантные плазмиды на основе вектора рТТ9, содержащие фрагменты генов структурных белков рЗО и р72 штамма «НВЛ-1» вируса АЧС, обеспечивающие экспрессию в клетках E.coli Ml5.

4. Оптимизированы условия наращивания, выделения и очистки рекомбинантных белков рЗО и р72 в Е. coli Ml 5. Наличие целлюлозосвязывающего домена в структуре рекомбинантных белков позволяет выделять их с помощью целлюлозного сорбента марки MN-300 (Serva) с выходом продукта 80-100 мкг/мл.

5. Оптимизированы условия постановки непрямого варианта ТФ ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка рЗО с активностью 1:200. Рекомбинантный антиген позволяет выявлять специфические антитела к вирусу АЧС в сыворотках крови животных и не реагирует с сыворотками, специфичными к гетерологичным вирусам.

6. Праймеры, комплементарные гену рЗО при температуре отжига

55°С, пригодны для выявления методом ПЦР ДНК вирулентных и « авирулентных штаммов вируса АЧС в пробах патматериала и заражённых культур клеток.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

- рекомбинантные плазмиды рТТ9рЗО-2, рТТ9рЗО-9 и рТТ9р72-10, содержащие фрагменты генов рЗО и р72 вируса АЧС, и экспрессирующие рекомбинантные белки могут быть использованы для получения специфических антигенов вируса АЧС;

- методика индуцибельной экспрессии рекомбинантного белка рЗО и его очистки для использования в качестве антигена при постановке ТФ ИФА с целью выявления антител к вирусу АЧС;

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Копытов, Валерий Олегович, Покров

1. Бакулов И.А. Африканская чума свиней // Эпизоотология / Под ред. Р.Ф. Сосова М.: Колос, 1969. - С. 287-290.

2. Бакулов И.А., Макаров В.В. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней // Вестник с/х науки. 1990. - № 12. — С. 122-128.

3. Балышев В.М., Книзе В.А., Цыбанов С.Ж и др. География АЧС и типовая гетерогенность возбудителя болезни // Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе: Тезисы докладов / МВА им. К.И. Скрябина. М., 1999. - С.92-94.

4. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. М., Эдиториал УРСС, 2002. - 320 с.

5. Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я., Карпов Г.М. Диагностика африканской чумы свиней. IV. Метод иммуноферментного анализа //

6. Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ по вопросам ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. РАСХН Покров, 1992. - С. 68-70.

7. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы / Пер. с англ. П.Л. Иванова, Л.Г. Николаева. М.: Мир,- 1988. - 538 с.

8. Ю.Коваленко Я.Р. Африканская чума свиней. М., «Колос», 1972. -200 с.

9. П.Козлова Д.И., Бесхлебнов В. А. Современные проблемы африканской чумы свиней. М.: ВНИИТЭИСХ, 1980.- 60 с.

10. Колонцов А.А. Вирус африканской чумы свиней: достижения последнего десятилетия 20 века // Молекул, генетика, микробиология и вирусология.- 2001.- № 2.- С. 3-8.

11. Колонцов А.А. Локализация мажорных полипептидов вируса АЧС и вирусассоциированных ферментов в структуре вирионов // Молекул, генетика, микробиология и вирусология.- 1995.-№ 3.- С. 34-38.

12. С.Херрингтон, Дж. Макги. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Пер. с англ. А.А. Лушниковой, Л.И. Новиковой, П.А. Сломинского М.: Мир, 1999. - 558 с.

13. Селянинов Ю.О., Балышев В.М., Цыбанов С.Ж. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов // Вестн. РАСХН.- 2000.- № 5.- С.75-76.

14. Селянинов Ю.О., Сенечкина Е.К. Физическое картирование генома вируса африканской чумы свиней // Доклады РАСХН.- 1995.- № 2.-С.37-39.

15. Семенихин А.Л., Вишняков И.Ф., Бакулов И.А. и др. Совершенствование противоэпизоотических мероприятий при АЧС // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ по вопросам ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. РАСХН-Покров, 1992.-С.71.

16. Сингер М., Берг П. Гены и геномы / Пер. с англ. Т.С. Ильиной, Ю.М. Романовой: В 2 т. М.: Мир, 1998. - Т. 1. - 373 с.

17. Сюрин В.Н. Африканская чума свиней // Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / М., Колос. 1972. - с. 416.

18. Чумак P.M. Таксономическая принадлежность вируса АЧС // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ по вопросам ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. РАСХН Покров, 1992. - С. 32-34.

19. Щелкунов С.Н. Клонирование генов. — Новосибирск: Наука, 1986. -228 с.

20. Afonso C.L, Zsak L., Carrillo С. et al. African swine fever virus NL \ gene is not required for virus virulence // J. Gen. Virol., 1998. - №79.1. P. 2543-2547.

21. Afonso C.L., Alcaraz C., Brun A. et al. Characterization of рЗО, a highly antigenic membrane and secreted protein of african swine fever virus // Virology. 1992. - № 189 (1). - P. 368-373.

22. Aguero M., Fernandez J., Romero L. et al. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of african swine fever virus in clinical samples // J. Clin. Microbiol. 2003. - № 41 (9). - P. 4431 - 4434.

23. Alcami A., Angulo A., Lopez-Otin G. et al. Amino acid sequence and structural properties of protein pi2, an african swine fever virus attachment protein // J. Virol. 1992. - № 66. - P. 3860 - 3868.

24. Alcaraz C.I, Brun A., Ruiz-Gonzalvo F. et al. Cell culture propagation modifies the african swine fever virus replication phenotype in macrophages and generates viral subpopulations differing in protein p54 // Virus Res. 1992. - №23. - P. 173-182.

25. Alcaraz C.I, Rodriguez F., Oviedo J.M. et al. Highly specific confirmatory western blot test of african swine fever virus antibody detection using the recombinant virus protein p54 // J. Virol. Methods. -1995.-№52.-P. 111-119.

26. Alcaraz C.I., De Diego M., Pastor M.J. et al. Comparison of a radioimmunoprecipitation assay to immunoblotting and ELISA for detection of antibody to an african swine fever virus // J. Vet. Diagn.• Invest. 1990. - № 2. - P. 191-196.

27. Alejo A., Andres G., Salas M.L. African swine fever virus proteinase is essential for core maturation and infectivity // J. Virol. 2003. - № 77(10).-P. 5571-5577.

28. Alejo A., Andres G., Vinuela E. et al. The african swine fever virus prenyltransferase is an integral membrane trans-geranylgeranyl-diphosphate synthase // J. Biol. Chem. 1999. - № 274(25). - P. 1803318039.

29. Almazan F., Rodriguez J.M., Andres G. et al. Transcriptional analysis of multigene family 110 of african swine fever virus // J. Virol. 1992. - № 66.-P. 6655-6667.

30. Almazan F., Rodriguez, J.M., Angulo A. et al. Transcriptional mappingof a late gene coding for the pi 2 attachment protein of african swine fever virus // J. Virol. 1993. - № 67. - P. 553-556.

31. Almendral J.M., Almazan P., Blasco R. et al. Multigene families in african swine fever virus: Family 110 // J. Virol. 1990. - № 64. - P. 2064-2072.

32. Alonso C., Miskin J., Hernaez B. et al. African swine fever virus protein p54 interacts with the microtubular motor complex through direct binding to light-chain dynein //J. Virol. 2001. - №75 (20). - P. 9819-9827.

33. Altschul S.F., Gish W., Miner W. et al. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. - № 215. - P. 403-410.

34. Anderson E.C, Hutchings G.H, Mukarati N. et al. African swine fever virus infection of the bushpig (Potamochoerus porcus) and its significance in the epidemiology of the disease // Vet. Microbiol. 1998. - № 62 (1). -P. 1-15.

35. Andres G., Alejo A., Salas J. et al. African swine fever virus polyproteins pp220 and pp62 assemble into the core shell // J. Virol. -2002. № 76 (24). - P. 12473-12482.

36. Andres G., Alejo A., Simon-Mateo C. et al. African swine fever virus protease, a new viral member of the SUMO-1-specific protease family // J. Biol. Chem. -2001. № 276 (1). - P. 780-787.

37. Andres G., Garcia-Escudero R., Salas M.L. et al. Repression of african swine fever virus polyprotein pp220-encoding gene leads to the assembly of icosahedral core-less particles // J. Virol. 2002. - № 76 (6). - P. 26542666.

38. Andres G., Simon-Mateo C., Vinuela E. Assembly of african swine fever virus: role of polyprotein pp220 // J. Virol. 1997. - № 71 (3). - P. 2331-2341.

39. Andres G., Simon-Mateo C., Vinuela, E. Characterization of two african swine fever virus 220-kDa proteins: a precursor of the major structural protein pi50 and an oligomer of phosphoprotein p32 // Virology. 1993.194.-P. 284-293.

40. Angulo A., Vinuela E. Alcami A. Comparison of the sequence of the gene encoding African swine fever virus attachment protein pl2 from field virus isolates and viruses passaged in cell culture // J. Virol. 1992. -№66.-P. 3869-3872.

41. Anon. Rapport sur la peste porcine africaine en Espagne, n. 1904 // Bull, off. internat. epizoot. 1977. - № 88. - P. 605-607.

42. Arias M., Pastor M., Escribano J.M. et al. African swine fever diagnosis. Role of the new tests // Proc. Workshop Coordinat. Agricult. Res.- Lisbon. 1993.- P.185-189.

43. Barderas M.G, Rodriguez F., Gomez-Puertas P. et al. Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant african swine fever virus proteins // Arch. Virol. 2001. - № 146 (9). - P. 16811691.

44. Barderas M.G, Wigdorovitz A., Merelo F. et al. Serodiagnosis of african swine fever using the recombinant protein p30 expressed in insect larvae // J. Virol. Methods. 2000. - № 89. - P. 129-136.

45. Bastos A.D., Penrith M.L., Cruciere C. et al. Genotyping field strains of african swine fever virus by partial p72 gene characterisation // Arch Virol. 2003. - № 148(4). - P. 693-706.

46. Baylis S.A, Dixon L.K., Vydelingum S. et al. African swine fever virus encodes a gene with extensive homology to type II DNA topoisomerases // J. Mol. Biol. 1992. - № 228(3). - P. 1003-1010.

47. Baylis S.A., Banham A.H., Vydelingum S. et al. African swine fever virus encodes a serine protein kinase which is packaged into virions // J. Virol. 1993. - № 67 (8). - P. 4549-4556.

48. Baylis S.A., Twigg S.R.F., Vydelingum S. et al. Three african swine fever virus genes encoding proteins with homology to putative helicases of vaccinia virus // J. Gen. Virol. 1993a. - №74. - P. 1969-1974.

49. Bech-Nielsen S., Arias M.L., Panadero J. et al. Laboratory diagnosisand disease occurrence in the current african swine fever eradication program in Spain 1989-1991 // Prevent Vet. Med. 1993. - № 17. - 225234.

50. Birnboim H.C. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA // Methods Enzymol. 1983. - № 100. - P. 243 - 255.

51. Black D.N., Brown F. Purification and physicochemical characteristics of african swine fever virus // J. Gen. Virol. 1976. - № 32. - P. 509-518.

52. Blasco R., Aguero M., Almendral J.M. et al. Variable and constant regions in african swine fever virus DNA // Virology. 1989. - № 168. -P. 330-338.

53. Blasco R., Lopez-Otin C., Munoz M. et al. Sequence and evolutionary relationships of african swine fever virus thymidine kinase // Virology. -1995.-№ 178.-P. 301-304.

54. Boinas F.S., Hutchings G.H., Dixon L.K. et al. Characterization of pathogenic and non-pathogenic african swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal // J. Gen. Virol. 2004. - № 85. - P. 2177-2187.

55. Boinas F.S., Wilkinson P.J. Transmission of african swine fever virus // African swine fever / Galo A. (Ed.), Proc. Workshop Coordinat. Agricult. Res. 1993.-P.211-222.

56. Borca M.V., Carrillo C., Zsak L. et al. Deletion of a CD2-like gene, 8-DR, from african swine fever virus affects viral infection in domestic swine // J. Virol. 1998. -№ 72 (4). - P. 2881-2889.

57. Borca M.V., Irusta P., Carrillo C. et al. African swine fever virus structural protein p72 contains a conformational neutralizing epitope // Virology. 1994. - № 201 (2). - P. 413-418.

58. Вогса M.V., Irusta P.M., Kutish G.F. et al. A structural DNA binding protein of african swine fever virus with similarity to bacterial histone-like proteins //Arch. Virol. 1996. - № 141 (2). - P. 301-313.

59. Borca M.V., Kutish G.F., Afonso C.L. et al. An african swine fevervirus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption // Virology. 1994. - № 199 (2). - P. 463-468.

60. Brookes S.M., Sun H., Dixon L.K. et al. Characterization of african swine fever virion proteins j5R and jl3L: immuno-localization in virus particles and assembly sites // J. Gen. Virol. 1998. - № 79 (Pt 5). - P. 1179-1188.

61. Brown J.P., Twardzik D.R., Marquardt H. et al. Vaccinia virus encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor and transforming growth factor // Nature. 1985. - № 313. - P. 491-492.

62. Brun A., Rivas C., Esteban M. et al. African swine fever virus gene A179L, a viral homologue of bcl-2, protects cells from programmed cell death // Virology. 1996. - № 225 (1). - P.227-230.

63. Caballero R.G., Tabares E. Application of pRPEL2 plasmid to detect african swine fever virus by DNA-DNA hybridization // Arch. Virol. -1986. -№87. -P. 119-125.

64. Camacho A., Vinuela E. Protein p22 of african swine fever virus: an early structural protein that is incorporated into the membrane of infected cells // Virology. 1991. - № 181. - P. 251 -257.

65. Campbell A. Bacteriophage X // Shapiro J.A. (Ed.), Mobile Genetic Elements. 1983. - P. 65-103.

66. Carrascosa A.L, Del Val M., Santaren J.F. et al. Purification and properties of african swine fever virus // J. Virol. 1985. - № 54. — P. 337-344.

67. Carrascosa A.L, Sastre I., Gonzalez P. et al. Localization of the african swine fever virus attachment protein pl2 in the virus particle by immunoelectron microscopy // Virology. 1993. - № 193. - P. 460-465.

68. Carrascosa A.L., Bustos M.J., Nogal M.L. et al. Apoptosis induced in an early step of african swine fever virus entry into Vero cells does not require virus replication // Virology. 2002. -№ 294 (2). - 372-382.

69. Carrascosa J.L, Carazo J.M., Carrascosa A.L. et al. General morphologyand capsid fine structure of african swine fever virus particles // Virology. 1984. - № 132.-P. 160-172.

70. Chacon M.R., Almazan F., Nogal M. et al. The african swine fever virus IAP homolog is a late structural polypeptide // J. Virol. 1995.- № 214 (2). - P.670-674.

71. Cistue C., Tabares E. Expression in vivo and in vitro of the major structural protein (VP73) of african swine fever virus // Arch. Virol. -1992.-№ 123.-P.l 11-124.

72. Cobbold C., Windsor M., Wileman T.A. Virally encoded chaperone specialized for folding of the major capsid protein of african swine fever virus // J. Virol. 2001. - № 75 (16). - P. 7221-7229.

73. Collins J., Hohn B. Cosmids: a type of plasmid gene-cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage X heads // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1978. - № 75. - P. 4242-4246.

74. De Boer С J, Pan J.C., Hess W.R. Immunology of african swine fever // J. Amer. Vet. Med. Ass. 1972. - v. 160, № 4. - p. 528-532.

75. De Tray D.E. African swine fever // Advances in Veterinary Science. -1963.-№8.-P. 299-333.

76. De Tray D.E., Scott G.R. Blood changes in swine with african swine fever//Amer. J. Vet. Res. 1957. - v. 18, № 68. - P. 484-490.

77. De Tray D.E., Zaphiro D., Hay D. Incidence of african swine fever in warthogs in Kenya. A preliminary report // J. Amer. Vet. Med. Ass. -1961.-v. 138, №2.-P. 78-80.

78. Dixon L.K. The structure and function of the african swine fever genome // Rev. Sci., tech. Off. int. Epiz. 1986. - v.5, № 2. - P. 469-475.

79. Dixon L.K., Baylis S.A., Vydeingum S., et al. African swine fever virus genome content and variability // Arch. Virol. 1993. - № 7. - P. 185199.

80. Dixon L.K., Twigg S.R.F., Baylis S.A. et al. Nucleotide sequence of a 55 kbp region from the right end of the genome of a pathogenic african swine fever isolate (Malawi LIL20/1) // J. Gen. Virol. 1994. - № 75. - P. 1655-1684.

81. Dixon L.K., Wilkinson P.J. Genetic diversity of african swine fever isolates from soft ticks (Ornithodoros moubata) inhabiting warthog burrows in Zambia // J. Gen. Virol. 1988. - № 69. - P. 2981-2993.

82. Enjuanes L., Carrascosa A.L., Vinuela E. Isolation and properties of the DNA of african swine fever virus // J. Gen. Virol. 1976. - № 32. - P. 479-492.

83. Escribano J.M., Pastor M.J., Sanchez-Vizcaino J.M. Antibodies to bovine serum albumin in swine sera: implication for false-positive reactions in the serodiagnosis of african swine fever // Am. J. Vet. Res. — 1989.-№50.-P. 1118-1122.

84. Fishman A., Levy I., Cogan U. et al. Stabilization of horseradish peroxidase in aqueous-organic media by immobilization onto cellulose using a cellulose-binding-domain 11 J. Mol. Catal. B-Enzym. 2002. - № 18. — P. 121-131.

85. Foord O.S., Rose E.A. Long-distance PCR // PCR Methods Applic. -1994. v.3, № 6. - P. 149-161.

86. Freije J.M.P., Munoz M., Vinuela E. et al. High-level expression in Escherichia coli of the gene coding for the major structural protein (p72) of african swine fever virus // Gene. 1993. - № 123 (2). - P. 259-262.

87. Galindo I., Vinuela E., Carrascosa A.L. Protein cell receptors mediate the saturable interaction of african swine fever virus attachment protein pl2 with the surface of permissive cells // Virus Res. 1997. - № 49(2). -P. 193-204.

88. Gayot G. African swine fever: isolation and identification in metropolitan France of epidemiological, clinical, anatomophato // Bull. Acad. vet. Fr. 1974. - v. 57, № 57. - P. 91-97.

89. Gilbert W., Villa-Komaroff L. Useful proteins from recombinant bacteria // Sci. American. 1980. - № 243. - P. 74-95.

90. Gomez-Puertas P., Rodriguez F., Oviedo J.M. et al. Neutralizing antibodies to different proteins of african swine fever virus inhibit both virus attachment and internalization // J. Virol. 1996. - № 70. - P. 56895694.

91. Gonzague M., Roger F., Bastos A. et al. Isolation of a non-haemadsorbing, non-cytopathic strain of african swine fever in Madagascar // Epidemiol. Infect. 2001. - № 126. - P. 453-459.

92. Gonzalez A., Talavera A., Almendral J.M. et al. Hairpin loop structure of african swine fever virus DNA // Nucleic Acids Res. 1986 - № 14. -P. 6835-6844.

93. Greig A. The localization of african swine fever virus in the tick Ornithodoros moubata porcinus // Arch. ges. Virusforsch. 1972. - v. 39, № 1-3.-P. 240-247.

94. Hess W.R. African swine fever virus // Virology monographs. 1971. -v. 9.-P. 1-33.

95. Hingamp P.M., Arnold J.E., Mayer R.J. et al. A ubiquitin conjugating enzyme encoded by african swine fever virus // EMBO J. 1992. - № 11(1).-P. 361-366.

96. Holland P., Abramson R., Watson R. et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' to 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - № 88. - P. 7276-7280.

97. Hopp T.P., Woods K.R. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1981. - № 78 (6). - 3824-3828.

98. Hulst M.M., Westra D.F., Wensvoort G. et al. Glycoprotein El of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera // J. Virol. 1993. - Vol. 67, № 9. p. 5435-5442.

99. King D.P., Reid S.M., Hutchings G.H., et al. Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of african swine fever virus // J. Virol. Methods. 2003. - № 107 (1). - P. 53-61.

100. Kleiboeker S.B., Burrage T.G., Scoles G.A. et al. African swine fever virus infection in the argasid host, Ornithodoros porcinus porcinus // J. Virol. 1998. - № 72 (3). - P. 1711-1724.

101. Kleiboeker S.B., Kutish G.F., Neilan J.G. et al. A conserved african swine fever virus right variable region gene, I11L, is non-essential for growth in vitro and virulence in domestic swine // J. Gen. Virol. 1998. -№ 79 (Pt 5). - P. 1189-1195.

102. Kleiboeker S.B., Scoles G.A. Pathogenesis of african swine fever virus in Ornithodoros ticks // Anim. Health Res. Rev. 2001. - № 2. - P. 121128.

103. Kleiboeker S.B., Scoles G.A., Burrage T.G. et al. African swine fever virus replication in the midgut epithelium is required for infection of

104. Ornithodoros ticks // J. Virol. 1999. - № 73 (10). - P. 8587-8598.

105. Klein P., Kanehisi M., De Lisi C. The detection and classification of membrane-spanning proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - № 815. -P. 468-476.

106. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - № 227. - P. 680-685.

107. Larenaudie В., Haag J., Carnero B. La purification du virus de la peste porcine africaine par le fluorocarbone // Bull. off. internat. epiz. 1965. -v. 63, №5-6.-P. 711-716.

108. Lewis Т., Zsak L., Burrage T.G. et al. An african swine fever virus ERV1-ALR homologue, 9GL, affects virion maturation and viral growth in macrophages and viral virulence in swine // J. Virol. 2000. - № 74 (3).-P. 1275-1285.

109. Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J. et al. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization // PCR Methods Appl. 1995. - № 4. - P. 357-362.

110. Lopez-Otin C., Freije J.M.P., Parra F. et al. Mapping and sequence of the gene coding for protein p72, the major capsid protein of african swine fever virus // Virology. 1990. - № 175. - P. 477-484.

111. Lucas A., Carnero R., Bresso M. Classification of african swine fever virus // C. R. Acad. Sci. 1968. - v. 266, № 17. - P. 1800-1801.

112. Maciejewski M.W., Shin R., Pan B. et al. Solution structure of a viral DNA repair polymerase // Nat. Struct. Biol. 2001. - № 8 (11). - P. 936941.

113. Mackett M., Smith G. L., Moss B. General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes // J. Virol. 1984. - № 49. - P. 857-864.

114. Mackett M., Smith G. L., Moss B. Vaccinia virus: A selectable eukaryotic cloning and expression vectors // Proc. Natl. Acad. Sci. 1982.-№79.-P. 7415-7419.

115. Manso Ribeiro J. Reappearance of african swine fever in Portugal // Bull. off. internat. epizoot. 1961. - v. 55, № 1-2. - P. 88-106.

116. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines, 4th edition, 2000.

117. Martinez-Pomares L., Simon-Mateo C., Lopez-Otin C., Vinuela E. Characterization of the african swine fever virus structural protein pi 4.5: a DNA binding protein // Virology. 1997. - № 229 (1). - P. 201-211.

118. Maurer F.D., Griesemer R.A., Jones T.C. The pathology of african swine fever. A comparison with hog cholera // Am. J. Vet. Res. 1958. -№ 19.-P. 517-539.

119. Maurice S., Dekel M., Shoseyov O. et al. Cellulose beads bound to cellulose binding domain-fused recombinant proteins; an adjuvant system for parenteral vaccination of fish // Vaccine. 2003. - № 21. - P. 32003207.

120. Medin J.A., Gathy K., Coleman M.S. Expression of foreign proteins in Trichoplusia ni larvae // Methods Mol. Biol. 1995. - № 39. - P. 265275.

121. Messing J., Vieira J. A new pair of M13 vectors for selecting either DNA strand of double-digest restriction fragments // Gene. 1982. - № 19.-P. 269-276.

122. Michaelis S., Beckwith J. Mechanism of incorporation of cell envelope proteins in Escherichia coli // Annu. Rev. Microbiol. 1982. - № 36. — P. 435-465.

123. Montgomery R.E. On a form of swine fever occurring in British East Africa (Kenya Colony) // J. Сотр. Pathol. 1921. - № 34. - P. 159-191.

124. Moore D.M., Zsak L., Neilan J.G. et al. The african swine fever virus thymidine kinase gene is required for efficient replication in swine macrophages and for virulence in swine // J. Virol. 1998. - № 72 (12). -P. 10310-10315.

125. Morrison T.B., Weis J.J., Wittwer C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification // BioTechniques. 1998. - № 24. - P. 954-958.

126. Moss В., Flexner C. Vaccinia virus expression vectors // Annual Review of Immunology. 1987. - № 5. - P. 305-324.

127. Mullis K., Faloona F., Scharf S. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro. The polymerase chain reaction // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986. - № 51. - P. 263-273.

128. Munoz M., Freije J.M.P., Salas M.L. et al. Structure and expression in E. coli of the gene coding for protein plO of african swine fever virus // Arch. Virol. 1993. - № 130. - P. 93-107.

129. Neilan J.G, Lu Z., Kutish G.F. et al. A BIR motif containing gene of african swine fever virus, 4CL, is nonessential for growth in vitro and viral virulence // Virology. 1997. - № 230 (2). - P. 252-264.

130. Neilan J.G., Lu Z., Afonso C.L. et al. An african swine fever virus gene with similarity to the proto-oncogene bcl-2 and the Epstein-Barr virus gene BHRF1 // J. Virol. 1993. - № 67. - P. 4391-4394.

131. Neilan J.G., Lu Z., Kutish G.F. et al. A conserved african swine fever virus I kappa В homolog, 5EL, is nonessential for growth in vitro and virulence in domestic swine // Virology. 1997. - № 235 (2). - P. 377385.

132. Neilan J.G., Zsak L., Lu Z. et al. Novel swine virulence determinant in the left variable region of the african swine fever virus genome // J. Virol. 2002. - № 76 (7). - P. 3095-3104.

133. Neitz W.O. African swine fever // Emerging disease of animal. -Rome, 1963.-P. 1-70.

134. Nickoloff J.A. Electroporation Protocols for Microorganisms // Methods in Molecular Biology. Totowa, New Jersey, 1995.

135. Pan I.C., De Boer C.J., Hess W.R. African swine fever: application of immunoelectroosmophoresis for the detection of antibody // Can. J. Сотр. Med. 1972. - № 36. - P. 309-316.

136. Pastey M.K., Samal S.K. Baculovirus expression of the fusion protein gene of bovine respiratory syncytial virus and utility of the recombinant protein in a diagnostic enzyme immunoassay // J. Clin. Microbiol. 1998. -№36.-P. 1105-1108.

137. Pastor M.J., Arias M., Alcaraz C. et al. A sensitive dot immunobindingassay for serodiagnosis of african swine fever virus with application in field conditions // J. Vet. Diagn. Invest. 1992. -№ 4 (3). - P. 254-257.

138. Pennock G.D., Shoemaker C., Miller L.K. Strong and regulated expression of Escherichia coli J3 galactosidase in insect cells with a baculovirus vector // Mol. Cell. Biol. - 1984. - № 4. - P. 399-406.

139. Pini A., Hurter D. African swine fever: an epizootological review with special reference to the South African situation //J. S. Afr. vet. Assn. -1975. v. 46, № 3. - P. 227-232.

140. Plowright W. Vector transmission of african swine fever virus // Hog «cholera, classical swine fever and african swine fever / Commission of the European Communities. EUR 5904 EN. 1977. - P. 575-587.

141. Plowright W., Brown F., Parker J. Evidence for the type of nucleic acid in african swine fever virus // Arch. ges. Virusforsch. 1966. - v. 19, № 3,-P. 289-304.

142. Plowright W., Parker J. The stability of african swine fever virus with particular reference to heat and pH inactivation // Arch. ges. Virusforsch. 1967. - v. 21, № 3/4, - P. 382-402.

143. Plowright W., Parker J., Pierce M.A. The epizootiology of african swine fever in Africa // Vet. Rec. 1969. - № 85. - P. 668-674.

144. Powell P.P., Dixon L.K., Parkhouse R.M. An I kappa В homolog encoded by african swine fever virus provides a novel mechanism for downregulation of proinflammatory cytokine responses in host macrophages // J. Virol. 1996. - № 70 (12). - P. 8527-8533.

145. Prados F.J., Vinuela E., Alcami A. Sequence and characterization ofthe major early phosphoprotein p32 of african swine fever virus // J. Virol. 1993. - № 67. - P. 2475-2485.

146. Ramiro-Ibanez F., Ortega A., Brun A. et al. Apoptosis: a mechanism of cell killing and lymphoid organ impairment during acute african swine fever virus infection // J. Gen. Virol. 1996. - № 77 (Pt 9). - P. 22092219.

147. Read S.J., Mitchell J.L., Fink C.G. Lightcycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system // J. Clin. Microbiol. 2001. - № 39. - P. 3056-3059.

148. Rennie L., Wilkinson P.J., Mellor P.S. Effects of infection of the tick Ornithodoros moubata with african swine fever virus // Med. Vet. Entomol. 2000. -№ 14 (4). - P. 355-360.

149. Rennie L., Wilkinson P.J., Mellor P.S. Transovarial transmission of african swine fever virus in the argasid tick Ornithodoros moubata // Med. Vet. Entomol. 2001. - № 15 (2). - P. 140-146.

150. Revilla Y., Cebrian A., Baixeras E. et al. Inhibition of apoptosis by the african swine fever virus bcl-2 homologue: role of the BH1 domain // Virology. 1997. - № 228 (2). - P. 400-404.

151. Rodriguez C.I., Nogal M.L., Carrascosa A.L. et al. African swine fever virus IAP-like protein induces the activation of nuclear factor kappa В // J. Virol. 2002. - № 76 (8). - P. 3936-3942.

152. Rodriguez F., Alcaraz C., Eiras A. et al. Characterization and molecular basis of heterogeneity of the african swine fever virus envelope protein p54 // J. Virol. 1994. - № 68. - P. 7244-7252.

153. Rodriguez J.M., Salas M.L., Vinuela E. Intermediate class of mRNAs in african swine fever virus // J. Virol. 1996. - № 70. - P. 8584-8589.

154. Rodriguez J.M., Salas M.L., Santaren J.F. African swine fever virus-induced polypeptides in porcine alveolar macrophages and in Vero cells: two-dimensional gel analysis // Proteomics. 2001. - Nov; 1(11). - 14471456.

155. Rojo G., Chamorro M., Salas M.L. Migration of mitochondria to viral assembly sites in african swine fever virus-infected cells // J.Virol. -1998.-Vol.72, № 9. P.7583-7588.

156. Rychlik W. Selection of primers for polymerase chain reaction // White B.A. (Ed.), PCR protocols: current methods and applications. -1993.-P. 31-40.

157. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual // 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. 1989.

158. Sanchez-Vizcaino J.M. African swine fever diagnosis // African Swine Fever / Becker Y. (ed.). Martinus Nijhoff, Boston, USA, 1987. - P. 6371.

159. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitirs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - № 74. - P. 5463-5467.

160. Schlafer D.H., Mebus C.A. Abortion in sows experimentally infected with african swine fever virus // Amer. J. Vet. Res. 1987. - vol. 48, № 2. -P. 246-254.

161. Schnitzler P., Darai G. Identification of the gene encoding the majorcapsid protein of fish lymphocystis disease virus // J. Gen. Virol. 1993. -№74.-P. 2143-2150.

162. Sela M. Antigens // Encyclopedia of Immunology / Roitt I.M., Delves P.J. (Eds.). Academic Press, London, 1992. - P. 128-133.

163. Showalter A.K., Byeon I.J., Su M.I. et al. Solution structure of a viral DNA polymerase X and evidence for a mutagenic function // Nat. Struct. Biol. 2001. - № 8 (11). - P. 942-946.

164. Shpigel E., Goldlust A., Eshel A. et al. Expression, purification and applications of staphylococcal protein A fused to cellulose-binding domain // Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. - № 31. - P. 197-203.

165. Simon-Mateo C., Andres G., Almazan F. et al. Proteolytic processing in african swine fever virus: evidence for a new structural polyprotein, pp62 // J. Virol. 1997. - № 71 (8). - P. 5799-5804.

166. Simon-Mateo C., Andres G., Vinuela E. Polyprotein processing in African swine fever virus: a novel gene expression strategy for a DNA virus // EMBO J. 1993. - № 12 (7). - P. 2977-2987.

167. Simon-Mateo C., Freije J.M.P., Andres G. et al. Mapping and sequence of the gene encoding protein pi7, a major african swine fever virus structural protein // Virology. 1995. - № 206. - P. 1140-1144.

168. Smith G.E., Summers M.D., Fraser M.J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector // Mol. Cell. Biol. 1983. - № 3. - P. 2156-2165.

169. Smith G.L., Mackett M., Moss B. Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis В virus surface antigen // Nature. -1983.-№25.-P. 21-28.

170. Sogo J.M., Almendral J.M., Talavera A. et al. Terminal and internal inverted repetitions in african swine fever virus DNA // Virology. 1984. - № 133.-P. 271-275.

171. Stassi D.L., Lacks S.A. Effect of promoters on the cloning in Escherichia coli of DNA fragments from Streptococcus pneumoniae //

172. Gene. 1982. - Vol. 18. - P. 319-328.

173. Steiger Y., Ackermann M., Mettraux C. et al. Rapid and biologically safe diagnosis of african swine fever vims infection by using polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - № 30 (1). - P. 1-8.

174. Stennicke H.R., Jurgensmeier J.M., Shin H. et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8 // J. Biol. Chem. 1998. - № 273. -P. 27084-27090.

175. Stennicke H.R., Salvesen G.S. Biochemical characteristics of caspase-3, -6, -7, and -8 // J. Biol. Chem. 1997. - № 272. - P. 25719-25723.

176. Studier W.F., Moffat B.A. Use a bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes // J. Mol. Biol. -1986. -№ 189.-P. 113-130.

177. Summers M.D., Smith G.E. A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures // Texas Agricultural Experiment Station Bulletin no. 1555. 1987.

178. Sun H., Jacobs S.C., Smith G.L. et al. African swine fever virus gene jl3L encodes a 25-27 kDa virion protein with variable numbers of amino acid repeats // J. Gen. Virol. 1995. - № 76 (Pt 5). - P.l 117-1127.

179. Sun H., Jenson J., Dixon L.K. et al. Characterization of the african swine fever virion protein j 18L // J. Gen. Virol. 1996. - № 77 (Pt 5). - P. 941-946.

180. Tabares E., Fernandez M., Salvador-Temprano E. et al. A reliable enzyme linked immunosorbent assay for african swine fever using the major structural protein as antigenic reagent // Arch. Virol. 1981. - № 70.-P. 297-300.

181. Tabares E., Martinez J., Martin E. et al. Proteins specified by africanswine fever virus. II. Analysis of proteins in infected cells and antigenic properties // Arch. Virol. 1980. - № 66. - P. 119-132.

182. Takamatsu H., Denyer M.S., Oura C. et al. African swine fever virus: a В cell-mitogenic virus in vivo and in vitro // J. Gen. Virol. 1999. - № 80 (Pt6).-P. 1453-1461.

183. Taylor W.P., Best J.R., Couquhoun I.R. Absence of african swine fever virus from Nigerian warthogs // Bull. Anim. Health Prod. Afr. 1977. -№25.-P. 196-197.

184. Terpstra C. Differential diagnosis between african swine fever and hog cholera // African Swine Fever / Becker Y. (Ed.). Martinus Nijhoff Publ., Boston / Dordrecht, 1987. - P. 73-80.

185. Terpstra C. Laboratory diagnostics of african swine fever in ASF-free and ASF-endemic countries // African swine fever / Galo A. (Ed.), Proc. Workshop for coordination of agricultural research. Lisbon, 1993: - P. 161-167.

186. The EMPRES transboundary animal disease bulletin. Update on african swine fever (ASF) in West Africa.

187. Thomson G.R. The epidemiology of african swine fever: the role of free-living hosts in Africa // Onderstepoort J. Vet. Res. 1985. - № 52. -P. 201-209.

188. Thomson G.R., Gainaru M.D., Van Dellen A.F. Experimental infection of warthog (Phacochoerus aethiopicus) with african swine fever virus // Onderstepoort J. Vet. Res. 1980. - № 47. - P. 19-22.

189. Tomme P., Boraston A., McLean B. et al. Characterization and affinity applications of cellulose-binding domains // J. Chromatogr. 1998. - № 715.-P. 283-296.

190. Vallee I., Tait S.W., Powell P.P. African swine fever virus infection of porcine aortic endothelial cells leads to inhibition of inflammatory responses, activation of the thrombotic state, and apoptosis // J. Virol. -2001.-№75 (21).-P. 10372-10382.

191. Vinuela E. African swine fever virus // African swine fever / Becker Y. (Ed.). 1987. -p. 31-49.

192. Von Heijne G. A new method for predicting signal sequence cleavage sites // Nucleic Acids Res. 1986. - № 14. - P. 4683-4690.

193. Wesley R.D., Tuthill A.E. Genome relatedness among african swine fever virus isolates by restriction endonuclease analysis // Prev. Vet. Med. 1984.-№2.-P. 53-62.

194. Whittall J.T, Parkhouse R.M. Changes in swine macrophage phenotype after infection with african swine fever virus: cytokine production and responsiveness to interferon-gamma and lipopolysaccharide // Immunology. 1997. - № 91 (3). - P. 444-449.

195. Wilkinson P.J. Transmission of the african swine fever virus // Prev. Vet. Med. 1984. - № 2. - P. 71.

196. Wu R., Grossman L. Expression vectors // Methods in Enzymology. -1987.-№ 153.-P. 385-563.

197. Yanez R.J., Boursnell M., Nogal M.L. et al. African swine fever virus encodes two genes which share significant homology with the two largest subunits of DNA-dependent RNA polymerases // Nucleic Acids Res. -1993. № 21 (10). - P. 2423-2427.

198. Yanez R.J., Rodriguez J.M., Boursnell M. et al. Two putative africanswine fever virus helicases similar to yeast 'DEAH' pre-mRNA processing proteins and vaccinia virus ATPases D11L and D6R // Gene. 1993. - № • 134 (2).-P. 161-174.

199. Yanez R.J., Rodriguez J.M., Nogal M.L. et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of african swine fever virus // Virology. — 1995. № 208 (1). - P. 249-278.

200. Yanez R.J., Vinuela E. African swine fever virus encodes a DNA ligase // Virology. 1993. - № 193 (1). - P. 531-536.

201. Young J.F., Hockmeyer W.T., Gross M. et al. Expression of Plasmodium falciparum circumsporozoite proteins in E. coli for potential use in a human malaria vaccine // Science. 1985. - № 228. - P. 958-962.

202. Yozawa Т., Kutish G.F., Afonso C.L. et al. Two novel multigene families, 530 and 300, in the terminal variable regions of african swine fever virus genome // Virology. 1994. - № 202 (2). - P. 997-1002.

203. Yu M., Morrissy С .J., Westbury H.A. Strong sequence conservation of african swine fever virus p72 protein provides the molecular basis for its antigenic stability // Arch. Virol. 1996. - № 141. - P. 1795-1802.

204. Zsak L., Caler E., Lu Z. et al. A nonessential african swine fever virus gene UK is a significant virulence determinant in domestic swine // J. Virol. 1998. - № 72 (2). - P. 1028-1035.

205. Zsak L., Lu Z., Burrage T.G. et al. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes are novel macrophage host range determinants // J. Virol. 2001. - № 75 (7). - P. 3066-3076.

206. Zsak L., Lu Z., Kutish G.F. et al. An african swine fever virus virulence-associated gene NL-S with similarity to the herpes simplex virus ICP34.5 gene // J. Virol. 1996. - № 70 (12). - P. 8865-8871.

207. Zsak L., Neilan J.G. Regulation of apoptosis in african swine fever virus-infected macrophages // Scientific World Journal. 2002. - № 2 (5). -P. 1186-1195.

Информация о работе

Копытов, Валерий Олегович
кандидата биологических наук
Покров, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Клонирование и экспрессия генов структурных белков Р30 и Р72 вируса африканской чумы свиней - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы