Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование продуцентов рекомбинантных белков Р72, Р30 и Р54 вируса африканской чумы свиней

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование продуцентов рекомбинантных белков Р72, Р30 и Р54 вируса африканской чумы свиней"

Таблица 4 - Оценка специфичности рекомбинантных белков р72 и р72е в «сэндвич»-варнанте ТФ ИФА

п=3

Проба Тигр исследованной пробы

Лизат клеток клона pET23b(+)/ASFVp72e/cl. 2-12 BL21(DE3)pLysS 1:8-1:16

Лизат клеток клона pET23b(+)/ASFVp72Maeadi BL2 l(DE3)pLysS 1:8-1:16

Антиген специфический (положительный) культуральный 1:8-1:16

Антиген нормальный (отрицательный) культуральный 0

Лизат клеток Е. coli штамма BL2 !(DE3)pLysS 0

Примечание: 0 - отсутствие вирусспецифических антител.

Как видно из результатов, приведенных в таблице 4, в исследуемых в «сэндвич»-варианте ТФ ИФА препаратах рекомбинантных клонов выявлено наличие р72 в разведениях 1:8-1:16, что подтверждает специфичность Ree р72 и р72е и возможность использования полученных клонов рЕТр72е и pETp72Magadi в клетках Е. coli штамма BL21(DE3)pLysS в качестве продуцентов рекомбинантного р72 вируса АЧС. Поскольку растворение Ree р72 (72 кДа) проходило только в присутствии 8М мочевины, то возможности его использования в диагностических реакциях ограничены, и все дальнейшие исследования проводили только с р72е (17 кДа), для повышения растворимости которого требуется только 2М концентрация мочевины.

3.3 Усовершенствование продуцента конформационного эпитопа рекомбинантного белка рЗО (Ree рЗОе)

Поскольку сконструированные клоны экспрессировали полноразмерный рЗО преимущественно в нерастворимой фракции, то, с целью получения клона-продуцента, пригодного для разработки и постановки диагностических реакций, целесообразно было использовать полученную ранее В.О. Копытовым [11] рекомбинантную плазмиду рТТ9рЗО-9, кодирующую в своей нуклеотидной последовательности центральную область белка рЗО вируса АЧС штамма NVL-1.

Уровень накопления Ree рЗОе исходным клоном клеток К coli штамм М15 с плазмидой рТТ9рЗО-9, кодирующей рЗОе (14 кДа), при индукции IPTG составлял 1 мг с 1 л бактериальной культуры, время экспрессии - 2,5 ч при температуре 24±0,5°С [11].

С целью повышения продукции целевого АГ для трансфекции рекомбинантной плазмидой рТТ9рЗО-9 использовали штамм клеток Е. coli BL21(DE3)pLysS, экспрессия целевого гена в котором при индукции с IPTG и а-лактозой под контролем Т7 промотора достигает высокого уровня. В результате получили клоны pTT9/ASFVp30.

Поскольку в плазмиде рТТ9рЗО-9 имеется ген, кодирующий в структуре рекомбинантного белка CBD [11], то очистку белка проводили методом

ионообменной хроматографии на микрокристаллической целлюлозе, которую предварительно активировали в 0,5М растворе NaOH в течение 30 минут с последующей отмывкой ФБР до pH 8,0-8,5.

Таким образом, получили 12 серий очищенного Ree рЗОе. Выход составил 3,54,2 мг белка с 1 л бактериальной культуры, время экспрессии - 4,0-4,5 ч при температуре 28+0,5°С.

Штамм Е. coli BL21(DE3)pLysS клон pTT9/ASFVp30 отличается от прототипа уровнем экспрессии рекомбинантного антигена, в 2-4 раза превышающим уровень накопления целевого антигена исходным клоном-продуцентом; на указанный штамм получен патент.

3.4 Изучение возможности использования рекомбинантных белков р72е и рЗОе в диагностике вируса А ЧС

Специфичность Ree р72е и рЗОе и их пригодность для диагностических целей оценивали в непрямом варианте ТФ ИФА при выявлении антител к рЗО и р72 вируса АЧС в гипериммунных типоспецифических сыворотках крови свиней и сыворотках

вирусу; 0 - отсутствие антител к вирусу АЧС.

гена E183L идентична. Установлено, что максимальная степень гомологии нукпеотидной последовательности гена E183L исследуемых изолятов Armenia 2007, Krasnodar 2008, Elbrus 2008, Stavropol 2008, Orenburg 2009, Rostov 2009 составила 100% с последовательностью указанного гена изолятов Georgia 2007/1, Antani03, ChromeOl; штамма Magadi - 97% и 95% с последовательностями изолятов Kenya ¡950 и Uganda64, соответственно; штамма КК-262 - 99% с последовательностью гена E183L (р54) изолята Con09/Nil6.

С использованием филогенетического анализа нуклеотидной последовательности гена, кодирующего р54, показано, что исследованные изоляты и штаммы по степени гомологии распределяются по кластерам, соответствующим сероиммуногруппам вируса АЧС (рисунок 7, (Б)).

На основании полученных результатов установлена идентичность и/или высокая степень гомологии р54 гена у изолятов, принадлежащих одному сероиммунотипу, что позволяет рекомендовать анализ этой геномной области для предварительного определения серогруппы исследуемого изолята вируса АЧС.

Группирование различных изолятов и штаммов вируса АЧС по нуклеотидным последовательностям р54 позволяет установить филогенетическое родство между штаммами и изолятами вируса.

4 ВЫВОДЫ

1. Сконструированы продуценты рекомбинантных белков р72, рЗО и р54, которые по своей -антигенной активности идентичны • соответствующим вирусиндуцированным белкам вируса АЧС и пригодны для получения моноспецифических сывороток.

2. Полученные Ree р72 и р72е, экспрессируемые в Е. coli, по специфичности связывания не уступают соответствующему антигену вируса АЧС. Титры референс-сывороток 1-IV серотипов со специфическим культуральным и Ree р72 и р72е составляют в ТФ ИФА от 1:1 ООО до 1:16000.

3. Полученные Ree рЗО и рЗОе, экспрессируемые в Е. coli, по эффективности связывания не уступают специфическому антигену вируса АЧС. Титры референс-сывороток I-IV серотипа в ТФ ИФА с рекомбинантными антигенами рЗО и рЗОе в 4-8 раз превышают таковые для специфического антигена и составляют от 1:2000 до 1:32000.

4. Использование смеси Ree рЗОе и р72е в соотношении 1:1 позволяет выявлять в ТФ ИФА специфические антитела к вирусу АЧС в сыворотках крови свиней, зараженных низковирулентным штаммом вируса, на 7-10 сутки. Титр антител к рЗО к 10-15 суткам достигает максимального уровня 1:1280-1:5120, а титр антител к р72 -

2. Эпизоотическая ситуация по АЧС на территории Российской Федерации в 2012 г. (по данным на 15.10.2012 г.)/ Официальный сайт Россельхознадзора [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/asf/2012/15102012/06.pdf. - Загл. с экрана.

3. The CD2v protein of African swine fever virus interacts with the actin-binding adaptor protein SH3P7/ P.C. Kay-Jackson, L.C. Goatley, L. Cox, J.E. Miskin, R.M.E. Parkhouse, J. Wienands, L.K. Dixon// Journal of General Virology. - 2004. - №85. - P.l 19130.

4. General morphology and capsid fine structure of african swine fever virus particles/ J.L. Carrascosa, J.M. Carazo, A.L. Carrascosa [et al.]// Virology. - 1984. -Vol.132.-P. 160-172.

5. Escudero, R.G. Inducible Gene Expression from African Swine Fever Virus Recombinants: Analysis of the Major Capsid Protein p72/ R.G. Escudero, G. Andres, F. Almazan, E. Vinuela// J. Virol. - 1998. - Vol.72. - № 4. - P.3185-3195.

6. Andres, G. Characterization of two african swine fever virus 220-kDa proteins: a precursor of the major structural protein pi50 and an oligomer of phosphoprotein p32/ G. Andres, C. Simon-Mateo, E. Vinuela// Virology. - 1993. - Vol.194. - P.284-293.

7. The African Swine Fever Virus Proteins p54 and p30 Are Involved in Two Distinct Steps of Virus Attachment and Both Contribute to the Antibody-Mediated Protective Immune Response/ P. Gomez-Puertas, F. Rodriguez, J.M. Oviedo [et al.]// Virology. - 1998. - Vol.243. - P.461-471.

8. Characterization and molecular basis of heterogeneity of the african swine fever virus envelope protein p54 / F. Rodriguez, C. Alcaraz, A. Eiras [et al.]// J. Virol. - 1994. -Vol.68. - P.7244-7252.

9. High-level expression in Escherichia coli of the gene coding for the major structural protein (p72) of African swine fever virus/ J.M.P. Freije, M. Munoz, E. Vinuela, C. Lopez-Otin// Gene. - 1993. - Vol.123, №2. - P.259-262.

10. A solid-phase enzyme linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies, for the detection of african swine fever virus antigens and antibodies/ M.I. Vidal, M. Stiene, J. Henkel, U. Bilitewski, J.V. Costa, A.G. Oliva// J. Virol. Methods. - 1997. - Vol. 66, №2. -P. 211-218.

11. Копытов, В.О. Клонирование и экспрессия генов структурных белков рЗО и р72 вируса африканской чумы свиней: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.06: защищена 23.12.04/ Копытов Валерий Олегович. - Покров, 2004. - 140 с.

12. Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30, p54, and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection/ J.G. Neilan, L. Zsak, Z. Lu, T.G. Burrage, G.F. Kutish, D.L. Rock//Virology. -2004. - Vol.319. - P.337-42.

13. Vlasova, N.N. Perspective of using the recombinant DNA-technology to control the spread of the African swine fever/ N.N. Vlasova, V.M. Balyshev, A.S. Kazakova// Procedía in Vaccinology [Электронный ресурс]. - 2011. - №4. - P.92-99. - Шифр Информрегистра: doi: 10.1016/j.provac.2011.07.013. - Режим доступа: http://www.sciencedirect.com/scicnce/ioumal/1877282X. - Загл. с экрана.

7 СПИСОК ОСНОВНЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Использование рекомбинантного белка рЗО для выявления специфических антител к вирусу африканской чумы свиней/ A.C. Казакова, H.H. Власова, О.В. Капустина, О.М. Сгрижакова// Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения. Вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ветеринарно-санитарной экспертизы и биотехнологии: мат. Междупар. науч.-практ. конф./ УГСХА. - Ульяновск, 2009. - С. 124-127.

2. Казакова, A.C. Конструирование рекомбинантной плазмиды для диагностических тест-систем, выявляющих геном вируса африканской чумы свиней/ A.C. Казакова, H.H. Власова// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: мат. Междунар. конф./ ВНИТИБП. - Щелково, 2009. -С.297-301.

3. Казакова, A.C. Клонирование гена E183L (р54) вируса африканской чумы свиней/ A.C. Казакова, H.H. Власова// Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: "мат. П-ой Междунар. науч.-практ. конф./ УГСХА. - Ульяновск, 2010. - T.IV. - С.81-85.

4. Казакова, A.C. Сравнительный анализ последовательности гена, кодирующего гликопротеин р54, вируса африканской чумы свиней/ A.C. Казакова// Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: мат. Междунар. науч.-практ. конф./ УГСХА. - Ульяновск, 2011. - С.100-103.

5. Приготовление препаратов рекомбинантных белков вируса африканской чумы свиней/ Т.Э. Южук, A.C. Казакова, И.Ю. Хухорова, H.H. Власова// Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации: мат. Междунар. науч.-практ. конф./ ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2011. — С.224-229.

6. Методические положения по получению моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку рЗО вируса африканской чумы свиней (АЧС)/ H.H. Власова,

8 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген AT - антитела

АЧС - африканская чума свиней ВБА - вирус болезни Ауески ВБТ - вирус болезни Тешена ГАдЕ - гемадсорбирующая единица

ДСН-ПААГ электрофорез (SDS-PAGE) - электрофорез в полиакриламидном геле с

додецилсульфатом натрия (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

ЗФР - забуференный физиологический раствор

кДа - килодальтон

КЧС - классическая чума свиней

м.м. - молекулярная масса

ОП - оптическая плотность

ОРС (ORF) - открытая рамка считывания (open reading frame)

п.о. (bp) - пар оснований (base pairs)

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЗГАд - реакция задержки гемадсорбции

РН — реакция нейтрализации

РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции РРСС - репродуктивно-респираторный синдром свиней ТФ ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ ФБР - фосфатный буферный раствор

CBD - целлюлозосвязывающий домен (cellulose-binding domain) е - эпитоп (epitope)

IPTG - изопропил-p-D-l- тиогалактопиранозид (Isopropyl p-D-1-thiogalactopyranoside) Rec - recombinant (рекомбинантный)

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казакова, Анна Сергеевна, Покров

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

04201356456

На правах рукописи

Казакова Анна Сергеевна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Р72, РЗО И Р54 ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

03.02.02 Вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Власова Наталья Никифоровна

ПОКРОВ-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

1 ВВЕДЕНИЕ 8

1.1 Актуальность работы 8

1.2 Степень разработанности проблемы 9

1.3 Цели и задачи исследования 10

1.4 Научная новизна результатов исследований 11

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы 12

1.6 Апробация результатов работы 12

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности, по 13

которой она рекомендуется к защите

1.8 Публикации 13

1.9 Объем и структура диссертации 14

1.10 Основные положения, выносимые на защиту 14

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы 14

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15

2.1 Африканская чума свиней: историческая справка и проблемы 15 иррадикации

2.2 Структура вируса АЧС 22

2.3 Свойства белков вируса АЧС 25

2.4 Использование рекомбинантных белков в разработке 30 современных средств диагностики и специфической профилактики АЧС

2.5 Заключение по обзору литературы 36

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 38 3.1 Материалы 38

3.1.1 Штаммы вируса АЧС 38

3.1.2 Препараты вирусной ДНК 38

3.1.3 Плазмидные векторы и бактериальные штаммы 39

3.1.4 Культуры клеток 39

3.1.5 Образцы патологического материала 39

3.1.6 Сыворотки крови 39 3.1.7Моноклональные антитела 39

3.1.8 Антигены 40

3.1.9 Животные 40

3.1.10 Растворы и реактивы 40

3.1.11 Лабораторное оборудование 42

3.2 Методы 43

3.2.1 Молекулярно-биологические исследования 43

3.2.2 Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных 44 последовательностей

3.2.3 Методы белкового анализа 45

3.2.4 Получение специфических сывороток к рекомбинантным 45 белкам рЗО и р54 вируса А ЧС

3.2.5 Иммуноферментный анализ (ИФА) 46

3.2.6 Постановка реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) 46

3.2.7 Постановка реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд) 46

3.2.8 Статистическая обработка результатов исследований 46

3.3 Результаты собственных исследований 47

3.3.1 Клонирование и экспрессия генов В646Ь (р72), СР204Ь (рЗО) и 47 Е183Ь (р54) вируса А ЧС

3.3.1.1 Подбор праймеров и оптимизация условий ПЦР для синтеза 48 полноразмерных копий генов В646Ь, СР204Ь и Е183Ь вируса АЧС

3.3.1.2 Клонирование гена В646Ь вируса АЧС и его центрального 54 фрагмента

3.3.1.3 Клонирование гена СР204Ь вируса А ЧС 56

3.3.1.4 Клонирование гена Е183Ь вируса АЧС 58

3.3.1.5 Конструирование продуцентов полноразмерного 61 рекомбинантного белка р72 и его конформационного эпитопа (Р72е)

3.3.1.6 Конструирование продуцентов рекомбинантного белка рЗО 63

3.3.1.7 Конструирование продуцентов рекомбинантного белка р54 65

3.3.1.8 Экспрессия генов B646L, CP204L и E183L в Е. coli 67

3.3.1.9 Очисткарекомбинантных белковр72, р72е, рЗО ир54 73

3.3.2 Изучение возможности использования рекомбинантных белков 76 р72 up72е в диагностических целях

3.3.3 Усовершенствование продуцента конформационного эпитопа 77 рекомбинантного белка рЗО (Ree рЗОе)

3.3.4 Изучение возможности использования рекомбинантных белков 79 р 72е и рЗОе в диагностике А ЧС

3.3.5 Получение моноспецифических сывороток к рекомбинантным 83 белкам рЗО, рЗОе и р54 и изучение их свойств

3.3.5.1 Использование рекомбинантных белков рЗО, рЗОе и р54 для 83 получения моноспецифических сывороток

3.3.5.2 Изучение биологических свойств моноспецифических сывороток 87 к рЗ 0 и р54 in vitro

3.3.6 Филогенетический анализ нуклеотидных 91 последовательностей генов CP204L и E183L

3.4 Обсуждение собственных исследований 100

4 ВЫВОДЫ 106

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 108

6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109 ПРИЛОЖЕНИЯ 126

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБТС (ABTS) - 2,2'-азино-ди[3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота] (2,2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) АГ - антиген AT - антитело

АЧС - африканская чума свиней

БСА (ВSA) - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin)

ВАЧС - вирус африканской чумы свиней

ВБА - вирус болезни Ауески

ВБТ - вирус болезни Тешена

ГАдЕ - гемадсорбирующая единица

ГЛА - гидролизат лактальбумина

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук ДНК (DNA) - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН-ПААГ электрофорез (SDS-PAGE) - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия- (sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis)

ЗФР - забуференный физиологический раствор ИФА - иммуноферментный анализ ИЭОФ - иммуноэлектроосмофорез кДа - килодальтон

ККМС - клетки костного мозга свиньи

КРС - крупный рогатый скот

KT - комнатная температура, 25 ± 0,5°С

КТМБР-т - казеин-трис-мертиолятный буферный раствор с 0.05% Твин-20 КЧС - классическая чума свиней M - моль

м.м. - молекулярная масса

МГС - мультигенное семейство нм - нанометр

нт (nt) - нуклеотид (nucleotide) ОП - оптическая плотность

ОРС (ORF) - открытая рамка считывания (open reading frame) п.о. (bp) - пар оснований (base pairs)

ППК-666 - перевиваемая культура клеток почек поросёнка

ПХ - пероксидаза хрена

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РАСХН - Российская академия сельскохозяйственных наук РЗГАд - реакция задержки гемадсорбции РН - реакция нейтрализации

РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции РНК - рибонуклеиновая кислота мРНК - матричная РНК

РРСС - репродуктивно-респираторный синдром свиней

РФ - Российская Федерация

ТК~ - вирус, дефектный по гену тимидинкиназы

ТК - тимидинкиназа

т.п.о. - тысяч пар оснований

ТФ ИФА (ELISA) - твердофазный иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay)

ТЦД50 - 50%-ная тканевая цитопатическая доза

ФБР (PBS) - фосфатный буферный раствор (phosphate buffered saline)

ФБР-т - ФБР, содержащий 0.05% Твин-20

ФБР-т-БСА - ФБР, содержащий 0.05% Твин-20 и 1% БСА

ФИТЦ (FITC) - флюоресцеина изотиоцианат (Fluorescein isothiocyanate)

ФЦБР - фосфатно-цитратный буферный раствор

ЦПД - цитопатическое действие

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота (Ethylenediaminetetraacetic acid)

ЭПС (ЭР) - эндоплазматическая сеть (эндоплазматический ретикулум)

CBD - целлюлозосвязывающий домен (cellulose-binding domain)

CV-1 - перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки

е - эпитоп (epitope)

F - прямой праймер (forward)

IPTG - изопропил - (3 - D - 1- тиогалактопиранозид (Isopropyl P-D-1-thiogalactopyranoside)

lg - логарифм с основанием 10 (десятичный логарифм) dNTPs - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты R - обратный праймер (reverse) SOB-среда - Super optimal broth medium

TEMED - Ы,К,№,1Ч'-тетраметилэтан-1,2-диамин (N,N,N',N'-tetramethylethane-l,2-diamine)

TNF-a - фактор некроза опухоли a

X-Gal - 5-Бром-4-хлор-3-индолил-Ь-Б-галактозид

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность работы. Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная инфекционная болезнь диких и домашних свиней различных пород, характеризующаяся высокой летальностью и контагиозностью, сверхострым, подострым, острым и хроническим течением, передающаяся от больных животных и вирусоносителей контактным, алиментарным путём, а также трансплацентарно, вызывая аборты и гибель плодов у супоросных свиноматок.

В Российской Федерации (РФ) АЧС регистрируется с 2007 года и на протяжении последних лет страна является зоной стационарного неблагополучия по данному заболеванию [1, 4, 9, 10, 25, 41, 64].

Отсутствие надежных профилактических средств против АЧС обусловлено уникальностью структуры вируса и свойств его белков.

Для вируса характерно наличие как иммуносупрессирующих белков, так и белков - модуляторов морфогенеза [49, 100]. Кроме того, его геном содержит гены, отвечающие за своеобразную «мимикрию» вируса [161], а его CD2v белок [54], по данным P.C. Kay-Jackson и соавт. (2004), ответственен за повышение инвазивности макрофагов в отношении вируса [190].

Белок р72 является основным структурным компонентом капсида вириона и мажорным белком вируса АЧС, который продуцируется на поздних стадиях инфекции [105]. Исследованиями ультраструктуры вириона, проведенными R.G. Escudero и соавт. (1998), установлено, что р72 - основной капсидный белок, локализирующийся между двумя слоями липопротеидной оболочки во внеклеточных вирусных частицах [99].

Белок рЗО также входит в состав внутренней мембраны вирусной частицы и по структуре представляет собой фосфопротеин [59]. По данным Р. Gomez-Puertas с соавт. (1998), совместное введение белков рЗО и р54 вызывает образование протективных антител у животных. При экспериментальном заражении свиней, иммунизированных рекомбинантными белками, вирулентным вирусом (штамм

El5) наблюдались либо задержка течения инфекционного процесса, либо полное прекращение развития инфекции и выздоровление животных [189].

Структурный белок р54 -трансмембранный гликопротеин. Он является одним из поверхностных белков, и выявляется на позднем этапе репродукции вируса. Этот белок обеспечивает прикрепление вируса АЧС к клетке хозяина. Его молекулярная масса у различных изолятов варьирует от 24 до 28 кДа [77].

Во ВНИИВВиМ проведены значительные исследования по изучению биологии возбудителя. Н.И. Митиным, В.А. Бурлаковым, В.М. Балышевым и др. разработаны живые вакцины на основе аттенуированных штаммов против I-IV сероиммунотипов вируса АЧС. В.М. Колосовым, A.B. Киселевым и др. установлено, что вирус АЧС гетерогенен по составу генома, физико-химическим свойствам, патогенности, антигенности и способности индуцировать гемадсорбцию. И.В. Федорищевым, Ю.О. Селяниновым, С.Ж. Цыбановым разработаны методы классификации штаммов, основанные на генетических и фенотипических свойствах вируса.

Поскольку использование живых вакцин против АЧС может привести к длительной персистенции вируса среди свиней, основными мерами борьбы с распространением болезни являются ранняя диагностика, ликвидация очагов, вынужденный убой животных и строгие карантинные мероприятия [24]. При данном подходе к иррадикации АЧС разработка и совершенствование высокочувствительных методов ранней диагностики с использованием рекомбинантных белков являются первоочередными задачами.

1.2 Степень разработанности проблемы. Для диагностики АЧС методом ТФ ИФА во ВНИИВВиМ Л.Я. Цыбановой (1985) и В.О. Копытовым (2004) разработаны наборы на основе культуральных антигенов вируса АЧС («Набор диагностикумов для твердофазного иммуноферментного анализа при болезни свиней») и экспериментальный образец набора на основе рекомбинантного белка рЗО («Набор диагностических препаратов на основе рекомбинантного антигена вируса африканской чумы свиней для ТФ ИФА») соответственно.

Использование рекомбинантных антигенов для диагностики перспективное направление, преимуществом которого является биологическая и экологическая безопасность, относительная дешевизна, четкая воспроизводимость результатов и приближающаяся к 100% точность анализа. Возможность применения рекомбинантных белков для диагностики АЧС продемонстрировано J.M.P. Freije и соавт. (1993): вариант ТФ ИФА на основе рекомбинантного р72 позволил с 95% достоверностью дифференцировать положительные сыворотки от негативных [113].

Разработанный M.I. Vidal и соавт. (1997) конкурентный метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител к vp73 [65] дал возможность прижизненно выявлять персистентно инфицированных вирусом АЧС свиней по наличию антител в сыворотке крови. Его применение позволяет установить их присутствие даже в образцах с низким титром специфических антител.

Таким образом, конструирование продуцентов рекомбинантных белков: Ree р72, р72е и рЗО в векторе pET23b(+); Ree рЗО, Ree р54 на основе плазмиды рЕТ32Ь(+), анализ эффективности их применения для выявления антител к вирусу АЧС и изучения его морфогенеза является впервые разрабатываемым направлением.

1.3 Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось конструирование продуцентов рекомбинантных белков р72, рЗО и р54 вируса африканской чумы свиней и изучение их характеристик.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) сконструировать продуценты рекомбинантных белков р72, рЗО и р54;

2) получить рекомбинантные белки р72, рЗО и р54;

3) отработать параметры очистки полученных рекомбинантных белков;

4) изучить возможность использования Ree р72 и рЗО для определения антител в сыворотках и плазме крови и селезенке больных и инфицированных вирусом АЧС свиней в ТФ ИФА;

5) получить моноспецифические сыворотки к Rec рЗО и р54;

6) определить применимость полученных моноспецифических сывороток к Rec рЗО и р54 в реакциях непрямой иммунофлуоресценции и задержки гемадсорбции;

7) провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих рЗО и E183L (р54).

1.4 Научная новизна результатов исследований. Впервые в РФ клонированы гены B646L (р72) вируса АЧС штамма Magadi, CP204L (рЗО) изолята Krasnodar 2008 и штамма Magadi, E183L (р54) штаммов Magadi, NVL-1, КК-262 и изолята Armenia 2007 и сконструированы продуценты рекомбинантных белков вируса АЧС: Rec р54 (штаммов Magadi и NVL-1) на основе плазмид рЕТ23Ь(+) и рЕТ32Ь(+); полноразмерного Rec р72 и р72е (штамма Magadi) в векторе рЕТ23Ь(+); полноразмерного Rec рЗО (изолята Krasnodar 2008 и штамма Magadi) в векторе рЕТ32Ь(+).

Впервые определены и депонированы в GeneBank нуклеотидные последовательности гена E183L (р54) штаммов и изолятов вируса АЧС: Armenia

2007 (JQ771681), Krasnodar 2008 (JQ771683), Elbrus 2008 (JQ771682), Stavropol

2008 (JQ771686), Orenburg 2009 (JQ771684) и Rostov 2009 (JQ771685), и проведен сравнительный анализ их гомологии с использованием программ BioEdit 6.0.7. [68] и MEGA 5.05 [134].

При проведении филогенетического анализа установлено, что 102 исследуемых последовательностей гена, кодирующего р54 штаммов и изолятов вируса АЧС, группируются в субкластеры, соответстветствующие сероиммунотиповой классификации, разработанной во ВНИИВВиМ [38, 22, 35, 36, 199].

Получен клон клеток Е. coli pTT9/ASFVp30 для высокоэффективной экспрессии Rec рЗОе, пригодный для изготовления диагностических препаратов (патент на изобретение № 2463343, бюл. № 28 от 10.10.2012), депонированный в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (инв. № 2966).

Данная работа является одним из этапов изучения структурных и функциональных особенностей белков вируса АЧС: выяснения их роли в патогенезе болезни и использования в качестве компонентов диагностических наборов.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы. Получены продуценты рекомбинантных белков, позволяющие получить препаративные количества высокооочищенных Ree р72, р72е, рЗО, рЗОе и р54.

Подобраны условия сенсибилизации Ree рЗОе и р72е, позволяющие выявлять антитела к вирусу АЧС в полевых сыворотках и сыворотках от экспериментально зараженных вирусом АЧС свиней в непрямом варианте ТФ ИФА, повысить специфичность реакции и увеличить ее чувствительность в 4-8 раз по сравнению с таковой «Набора диагностикумов для твердофазного иммуноферментного анализа при африканской чуме свиней».

Разработана методика получения моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку рЗО вируса АЧС.

Получены моноспецифические сыворотки к Ree рЗОе и рЗО, пригодные для использования в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

1.6 Апробация результатов работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2008-2013 гг.), на Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА, Ульяновск, 2009 г.), на конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Покров, 2009 г.), на Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (ВНИТИБП, Щелково, 2009 г.), на 11-ой Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА, Ульяновск, 2010 г.), на 4 Международном конгрессе по вакцинам

(Австрия, Вена, 2010 г.), на Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА, Ульяновск, 2011 г.), на заседании в рамках Международного курса по трансграничным болезням животных в Центре по болезням животных (США, остров Плам, 2011 г.), на конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Владимир, 2012 г.).

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности, по которой она рекомендуется к защите. В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования вирусов, их химического состава, генетики, морфологии, морфогенеза, а также проблемы противовирусного иммунитета, разработку средств диагностики, вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований: изучение химического состава, структуры и строения вирусов, антигенных свойств вирусов; исследование